INTRODUCCIÓN

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas”, también conocido como ELISA, es tal vez el método de diagnóstico más reconocido vía inmunoanálisis, llamado “laboratorio húmedo”, que es usado por la mayoría de empresas bioquímicas en actualmente. ELISA utiliza el método de inmunoanálisis para ver si los organismos o virus que provocan enfermedades están presentes en una muestra líquida; por eso es llamado laboratorio húmedo. Elisa podrá determinar la presencia del “analito” usando reactivos líquidos y sustancias químicas en el análisis que más adelante pueden ocasionar una marca que calificará y también, evaluará el “analito” en la muestra. ELISA es vital para determinar la presencia de una enfermedad y buscar formas para curarla o eliminarla.

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CONCEPTO

La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran los métodos directo e indirecto. El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos. En ambos métodos, la reacción enzimática puede ser detectada espectrofotográficamente con un lector ELISA.

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.

La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:

-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.

-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.

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-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.

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GENERACIONES DE ELISAS

Primera generación: Las pruebas de ELISA de primera generación miden anticuerpos dirigidos contra una proteína de fusión recombinante que incluye la secuencia NS4 unida a una superóxido dismutasa bacteriana; el antígeno es llamado "antígeno c100-3"

Segunda generación: Los ELISA de segunda generación incluyen antígenos sintéticos adicionales y detectan anticuerpos que reaccionan con la proteína central (denominado antígeno "c23-3") y la proteína no estructural NS3 (antígenos "c33-C" ó "c-200"). Aunque C es una proteína estructural, los ELISA no miden anticuerpos dirigidos contra la superficie del virión.

Tercera generación: Los ELISA de tercera generación que miden anticuerpos contra la región NS5 aún están bajo estudio.

Aún no existen pruebas que permitan evaluar los anticuerpos neutralizantes por lo señalado en párrafos anteriores. Las pruebas antes descritas permiten realizar un escrutinio inicial en la búsqueda de enfermedad aunque esto debe tomarse con reserva debido a que algunos anticuerpos aparecen primero que otros y esto hace necesario que el paciente sea seguido en la búsqueda de la respuesta serológica (por ejemplo, los anticuerpos contra los antígenos C y NS3 aparecen antes que los anticuerpos contra c100-3) hasta por 12 meses. Por tal razón se han desarrollado las pruebas confirmatorias tales como los RIBA (iniciales en inglés de los ensayos de inmonoblot recombinantes).

La sensibilidad de las pruebas de ELISA de segunda generación actualmente disponibles es del 88%, lo cual apoya aún más la necesidad de realizar pruebas serológicas aún después de haber superado la fase aguda.

Cuarta generacion: Se adicionó el p24.Elisa directo para la detecciónde antígeno p24 y un ELISA indirecto para detectar anticuerpos, reduce la ventana diagnóstica en 4 días.

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FASES DE UN ENSAYO ELISA

Las 4 fases del método de ELISA son las siguientes:

1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina):

El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sándwich,etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

2. Unión del antígeno(o del anticuerpo) a los pocillos:

La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

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3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos:

En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo). Este segundo método permite la amplificación de la señal el poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

4. Revelado de la reacción enzimática:

Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad Óptica mediante espectrometría.

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DISPOSITIVOS EMPLEADOS EN ELISA

Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plásticos tratado para aumentar su capacidad de absorción(fenómeno de superficie) de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.

Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de “screening” masivo de los sistemas robotizados.

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados

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CLASIFICACIÓN

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

Anticuerpos Marcados

ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sandwich

Doble (DAS) Heterologo (HADAS)

Antígenos Marcados

ELISA Competitivo

1) ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas): Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas pero en las que se tengan la certeza de la ausencia del antígeno buscado.Asimismo se incluyen controles positivos(soluciones dende se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

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2) ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a ña unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de anticuerpos.

3) ELISA sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich):

Consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente

patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte)conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea.

Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

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4) ELISA Sándwich “HADAS”: Consta de las siguientes etapas:

Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte),los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.

Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminarlos anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea.

Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

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5) ELISA Competitivo: Consta de las siguientes etapas:

Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados.

Adición enconcentración conocida de una mezcla de antígenosdel anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcadoscon una enzima y antígenos desconocidos objeto deestudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenosdel anticuerpo usado en el paso anterior, marcadoscon una enzima. Lavar para eliminar los antígenos queno hayan reaccionado.

Adición de un substrato sobreel que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea.

Lectura visual ocolorimétrica del producto final coloreado de ambaspruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudiono tienen nada que ver con los anticuerposempleados para tapizar el soporte. Si haydiferencia en las lecturas de ambos pocillos, elantígeno objeto de estudio, está relacionadoserológicamente con el anticuerpo empleado paratapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica,es proporcional a la concentración del antígenoproblema en la muestra.

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MARCADORES ENZIMÁTICOS MAS COMUNMENTE UTILIZADOS EN ELISA

La enzima escogida como marcador debe unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa; a continuación se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una así como los substratos que se emplean con cada una de ellas.

Las operaciones de marcado o conjugación, llevan implícitas dos etapas:

• Purificación de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitación generalmente salina de las proteínas del antisuero, seguida de una diálisis y purificación de la fracción de anticuerpos mediante filtración molecular, cromatografía o separación en gradiente de densidad mediante ultracentrifugación. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mg/mL.

• Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehído o el del periodato sódico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales).

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Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la detección de IgGs y es la utilización de proteína A o G marcadas con peroxidasa. Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilización; esta conservación se suele realizar mediante liofilización, congelación a –70°C o filtrado estéril y conservación a -20°C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado estéril.

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La búsqueda de la concentración óptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado; para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antígeno a concentración idónea Aquella dilución del conjugado que produzca menor reacción inespecífica(menor color de fondo o “background”) con muestras negativas e implique una clara distinción de las muestras positivas, será la óptima. La elección de una concentración de conjugado óptima va completamente ligada a planteamientos económicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro del conjugado aún a costa de aumentar el tapizado.

La elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparación, así como estabilidad después de la parada de reacción.

CARACTERÍSTICAS QUE DEBEN REUNIR LAS ENZIMAS PARA ELISA

o Debe ser económica y obtenerse con un alto grado de pureza

o Elevada actividad específica

o Estable en condiciones de almacenamiento y prueba

o Soluble

o Sencilla, sensible y medible con gran rapidez

o No debe estar presente en el medio analizado

o Sustratos inhibidores no deben interferir con el ensayo

o No perder actividad cuando se conjuga

o Debe conservar la actividad en condiciones de ensayo

LIMITACIONES DEL ELISA

Anticuerpos solo son producidos en centros especializados. Anticuerpos necesitan tener propiedades correctas. ELISA necesita ser validado para cada aplicación. ELISA necesita estar acoplado con confirmación de identidad.

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INTERPRETACION DE RESULTADOS

La prueba ELISA VIH puede resultar:

1. No reactiva: (o negativa) Significa que no se encontraron anticuerpos detectables en el momento de la prueba. Es necesario tener en cuenta el llamado "período de ventana" y analizar la necesidad o conveniencia de repetir la prueba posteriormente. Si este periodo de ventana inmunológica aún no ha transcurrido totalmente es necesario realizarse otra prueba a los 3 meses para tener la plena seguridad de que esta primer prueba no es lo que se llama un -falso negativo- es decir que salga negativo porque el cuerpo aún no ha reaccionado a la presencia del virus, es decir no ha creado anticuerpos contra el virus vih y la prueba de sangre lo que analiza es si ya hay o no hay anticuerpos contra el virus, la prueba no ve al virus, lo que ve son los anticuerpos, por ello la prueba de Elisa para vih se denomina prueba indirecta.

Para ser aún más claro y especifico si se encuentran en el examen anticuerpos para el vih, significa que existe el vih en el organismo si no se encuentran anticuerpos significa que el virus no esta en el organismo o también puede significar que el organismo aún no ha dado respuesta a la presencia del virus creando estos anticuerpos (es decir que esta en el periodo de ventana inmunológica) y por lo tanto en la muestra de sangre no se pudo ver si existía o no el vih, entonces se requiere darle al organismo ese tiempo aproximado de los 3 meses para que responda y cree los anticuerpos que serán los que se verán en la prueba de Elisa. Si una segunda prueba que se haga a los 3 meses sale negativa significa que usted definitivamente no tiene el virus vih; la sugerencia es continuar con el uso del condón, que es la única forma de prevenir la infección por vih.

2. Reactiva: (positiva) Significa que se detectaron anticuerpos contra el vih y es necesario confirmar su especificidad pues la prueba puede ser realmente reactiva o falsamente reactiva. Normalmente se debe realizar otra prueba EIA de detección de anticuerpos, y si esta resulta reactiva se debe hacer una prueba confirmatoria como el Western blot.

Los resultados del ELISA son expresados de forma diversa respecto al IFI.

 

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Resultado test ELISA Nivel anticuerpos

Negativo< 10 %

Duduso10-13%

Positivo> 13 %

Positividad al test ELISA Nivel anticuerpos

Nivel bajo <80%Nivel medio 80-150%Nivel alto 150-300%

APLICACIONES DEL ELISA.

1. Diagnóstico de enfermedades virales

-Rubéola-Citomegalovirus-Herpes virus en RN y embarazadas-HIV (Ver más adelante...)

2. Diagnóstico de enfermedades parasitarias

-Malaria-Tripanosomiasis-Esquistosomiasis-Tripanosoma cruzi en fase crónica (no en la fase aguda, durante la cual el diagnóstico se efectúa por detección de parásitos en sangre!!!)

3. Respuesta humoral en enfermedades autoinmunes

Se desarrollaron sistemas ELISA para analizar Ac contra:-ADN-Hsitona -TiroglobulinaY para detectar:-Complejos inmunes-Factor reumatoideo

4. Endocrinología

Hormonas proteicas-Gonadotrofina coriónica humana (HCG)-Hormona luteinizante-Hormona folículo estimulante-Insulina

Hormonas esteroideas-Estrógenos-Progesterona-Testosterona-Cortisol

5. Cuantifiicación de algunos medicamentos

6. Detección de proteínas oncofetales

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MÉTODO DE ELISA EN EL DIAGNOSTICO VIRAL

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.

Elisa en métodos directos: Detecta la presencia de antígenos virales.

Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas varía. En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro que en su forma oxidada tiene un color característico.

En el caso de la fosfatasa la desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color. Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotómetros especialmente diseñados, siendo entonces una técnica más objetiva.

Elisa en métodos indirectos: Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del huésped.

Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los últimos años al diagnóstico de anticuerpos virales.

Tiene las ventajas de ser un método versátil, relativamente económico, sensible y de lectura objetiva (instrumental).

La metodología es la siguiente: Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (esferita, policubetas para microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotómetro y en algunos casos de forma visual.

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ELISA APLICADA EN LA RUBEOLA

Significación y aspectos generales

La rubéola es una infección viral contagiosa de carácter leve que afecta principalmente a los niños y los adultos jóvenes . Se caracteriza por un exantema eritematoso maculopapuloso de dos o tres días de duración. Sin embargo, más del 50% de las infecciones por este virus no son evidentes desde el punto de vista clínico. Otros síntomas de la rubéola son febrícula, síntomas leves de las vías respiratorias superiores y adenopatías linfáticas suboccipitales. En los adultos jóvenes son síntomas frecuentes las artralgias y artritis transitorias, mientras que las complicaciones más graves, como la encefalitis y la púrpura trombocitopénica, son muy raras. Aunque la rubéola en el niño y el adulto suele ser una enfermedad benigna y autolimitada, la infección del feto durante el primer trimestre de gestación puede causar aborto espontáneo, mortinato o defectos congénitos de nacimiento. Los sujetos que adquieren la infección dentro del útero pueden nacer con defectos del nacimiento evidentes o, lo que es más frecuente, pueden parecer normales y permanecer normales o experimentar más adelante complicaciones.

El síndrome de la rubéola congénita se conoce desde hace mucho tiempo y se caracteriza por la presencia de cardiopatía congénita, sordera neurosensorial, retraso mental y retraso del crecimiento intrauterino. Tras una epidemia de rubéola en 1964, se identificaron otras manifestaciones clínicas de la rubéola congénita, tales como púrpura trombocitopénica, hepatitis, lesiones óseas y meningoencefalitis en el recién nacido. Además, la diabetes mellitus y la panencefalitis rubeólica progresiva son manifestaciones tardías de la rubéola congénita recientemente identificadas. La rubéola es endémica en todo el mundo . En los países que carecen de programas de vacunación, entre el 10 y el 25% de las mujeres en edad fértil son seronegativas y susceptibles a la infección.

Si la mujer adquiere la rubéola durante el embarazo, especialmente durante el primer trimestre, el feto puede tener riesgo de infectarse. La infección aguda por el virus de la rubéola puede confirmarse analizando simultáneamente pares de sueros (fase aguda y fase de convalecencia) y comprobando si existe seroconversión o una elevación al cuádruplo de los títulos de anticuerpos IgG, o detectando anticuerpos IgM específicos del virus de la rubéola. La presencia de IgM específica del virus de la rubéola en el neonato o la persistencia de un título elevado de anticuerpos IgG durante más tiempo del que cabe esperar para los anticuerpos adquiridos de forma pasiva (6 meses) confirma el diagnóstico de rubéola congénita.

La inhibición de la hemaglutinación (IH), la primera técnica de uso extendido para la detección de anticuerpos frente al virus de la rubéola, ha sido el estándar de

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referencia con el que se han comparado métodos más nuevos. Sin embargo, la prueba IH es laboriosa y difícil de realizar, ya que es preciso pretratar las muestras de suero para eliminar la lipoproteína-beta. La prueba ELISA ha demostrado ser un método sensible y fiable para la detección de anticuerpos frente al virus de la rubéola.

La prueba ELISA es menos incómoda y más aplicable al análisis de grandes cantidades de muestras, puesto que las determinaciones se realizan en una sola dilución de suero que no requiere pretratamiento. Además, los resultados de la prueba ELISA se basan en una lectura objetiva de absorbencia que puede correlacionarse con los títulos de IH .

Fundamento de la prueba elisa

El sistema de pruebas Rubella IgG ELISA de Zeus está diseñado para detectar anticuerpos de tipo IgG contra la rubéola en suero humano. Los pocillos de las tirillas de micropocillos de plástico se sensibilizan mediante adsorción pasiva con antígeno del virus de la rubéola. El procedimiento de la prueba comprende tres pasos de incubación:

1. Los sueros de la prueba (debidamente diluidos) se incuban en micropocillos revestidos de antígeno. Los anticuerpos contra antígeno específico que existan en la muestra se fijarán al antígeno inmovilizado. La placa se lava para eliminar el anticuerpo no fijado y otros componentes séricos.

2. Se agrega anti-IgG humana (específica de la cadena γ) de cabra conjugada con peroxidasa a los pocillos y se incuba la placa. El conjugado reaccionará con el anticuerpo tipo IgG inmovilizado en la fase sólida del paso 1. Se lavan los pocillos para eliminar el conjugado que no haya reaccionado.

3. Los micropocillos que contienen conjugado de peroxidasa inmovilizado se incuban con solución de sustrato de peroxidasa. La hidrólisis del sustrato por la peroxidasa produce un cambio de color. Transcurrido un tiempo, se detiene la reacción y se mide fotométricamente la intensidad del color de la solución. La intensidad del color de la solución depende de la concentración de anticuerpos en la muestra original analizada.

CONCLUSIONES

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El enzimoinmunoanálisis es una de las técnicas inmunoquímicas más importantes desarrollada en los últimos años.

Esta técnica presenta como requisito que los Ac o los Ag se puedan ligar a una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunológica como la enzimática.

Las enzimas consideradas hasta ahora más satisfactorias son: Peroxidasa del rábano picante, Glucosa oxidasa, Beta-galactosidasa, Fosfatasa alcalina (FAL).

El ELISA puede utilizarse para el análisis de cualquier Ac siempre que el Ag adecuado se pueda inmovilizar convenientemente en la fase sólida.

ELISA es una técnica de bajo costo, estabilidad de los reactivos, seguridad, sensibilidad, facilidad de realización.

BIBLIOGRAFÍA

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-Craig, J.C. et. al. Journal of Biological Standardization. 17; 1989; 125-135.

-Engvall, E. and Perlmann, P.Immunochemistry. 8:871; 1971.

-Gardas, A. and Lewartowska, A. Journal of Immunological Methods. 106; 1988; 251-255.

-http://www.guiadelasalud.info/articulo.php?art=93&id=245

-http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf

-http://www.alimentacioncanina.com/salud-mascotas/que-es-el-test-de-elisa-para-leishmaniosis/

-Torfason EG, Galindo R, Keyserling HL. Comparison of five ELISA assays for IgG antibodies against Coxsackievirus B1. J Med Virol 1988;25:53-60.

-http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf

-Voller, A., Barlett, A. y Bidwell, D. E. Enzyme- immunoassays for parasitic diseases. Trans R Soc Trop Med Hyg 70:98-106, 1976

-http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo30_parte1.pdf

-http://www.cocmed.sld.cu/no12/n12ori5.htm

-http://www.indetectable.org/pages/noticias/examenes.htm

-http://www.vet.unicen.edu.ar/html/Areas/Inmunologia/Documentos/2006/TP4%2020061.pdf

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