Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS 2 plaka - 192 72481 SERUM VEYA İNSAN PLASMASINDA İMMÜNOENZİMATİK BİR TEKNİKLE TOPLAM ANTİ-HAV ANTİKORLARI ÖLÇME VE ALGILAMA KİTİ

883674 - 2014/02

2 [TR]

İÇİNDEKİLER

1. DOZAJ AMACI 2. TEST PRENSİBİ 3. KİTİN İÇİNDEKİLER 4. GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN DONANIM 5. HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI 6. ÖNLEMLER 7. NUMUNELER 8. REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI- SON KULLANIM TARİHİ -

SAKLAMA 9. ÇALIŞTIRMA MODU - NİTEL TEKNİK - NİCEL TEKNİK 10. ADAPTASYON SİSTEMİ 11. HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ- NİTEL TEKNİK 12. HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ- NİTEL NİCEL 13. NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK

YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ 14. TEST PERFORMANSLARI 15. TEST LİMİTLERİ 16. KAYNAKÇA

3 [TR]

1 - DOZAJ AMACI Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS kiti, immünoenzimatik teknikle serum ve insan plazmasındaki toplam anti-HVA antikorlarını algılama ve ölçme kitidir. Test, hepatiti A (VHA) virüsünün yol açtığı bir enfeksiyonun teşhisinde yardımcı olarak kullanılabilir. Bunun yanı sıra, aşı öncesi immüniter durumu tanımlamak ve VHA'ya karşı aşılama sonrasında immüniter yanıtın izlenmesinde kullanılabilir. Hepatit A'ya karşı bir aşı sonrasında, anti-HVA antikorları yaklaşık 2 hafta sonra ve genellikle uzun yıllar boyunca algılanabilir. en anti-HAV bakımından konsantrasyon düzeyleri WHO Anti-Hepatitis A'ya göre düzenlenebilir. Immunoglobulin 2nd International Standard,1 998. Milimetre başına (mUI/ml) Uluslararası Birimin Binde birlik oranları cinsinden ifade edilirler. 20 mUI/mL'lik bir konsantrasyon genellikle VHA'nın yol açtığı enfeksiyonla karşı karışa kalan deneğin immünitesine garanti altına alaneşik olarak değerlendirilir. Bunun için 20 mUI/mL'lik ölçünün ortalama absorbansı (İkinci Standart Uluslar Arası İmmünoglobüline göre ayarlanmış AntiOMS'nin Hepatit A'sı, 1998) kitin analitil eşik değeri olarak seçilmiştir. 2 - TEST PRENSİBİ Oeroksida (yabani turp) ile konjugat oluşturulan VHA'ya karşı fare monoklonal antikorları ile oluşturulmuş enzimatik bir markörün ikinci süresinde mikroplak, VHA antijenin ve numune üzerine sabitlenmiş VHA'ya karşı yürütülen monoklonal antikorların kullanımı üzerine kurulmuş olan inhibisyon halinde immünoenzimatik bir dozajdır. 1. İlk inkübayonda, numuneler veya kontroller ve VHA'nın antijeni 37°C sıcaklıkta

bir saat boyunca inkübe edilir. Anti VHA antikorlarının numunede gösterildiği durum içinde, bir fare anti-VHA monoclonal antikoruna karşı duyarlı mikroplak haznesi üzerine veya kısmen kendisine sabitlenen VHA'nın antijeni üzerine sabitlenirler.

2. İlk inkübasyon sonunda aşırı miktardaki numunenin elimine edilmesine olanak sağlar, VHA ive anti VHA antikorları arasındaki serbest VHA'nın antijeni .

3. Peroksidaz (yabani turp) ile konjugat oluşturan ve VHA'yekarşı yöneltilen fare monoklonal bir antikor içeren enzimatik markör her mikroplak haznesinde 37C° sıcaklıkta bir saat boyunca bırakılır. VHA antijeni ve bunun sonucu olan enzimatik aktivite ile katı safhaya bağlanan enzimatik markörün miktarı, numune veya kontrolde görünen toplam antVHA antikor miktarına orantılı olarak terstir.

4. Aşırı enzimatik markör bir yıkama döngüsüyle elimine edilir ve her hazneye bir TMB kromojen/substrat solüsyonu bırakılır.

5. Laboratuar sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon ve reaksiyonun durmasından sonra, okuma işlemi 450/620-700 nm'de spektrometrede gerçekleştirilir.

Bir numune için ölçülen absorbans test edilen numunedeki toplam anti VHA varlığını veya miktarının hesaplanmasına izin verir.

4 [TR]

3 - KİTİN İÇİNDEKİLER

Etiketleme Reaktiflerin doğası Tanıtım 72481

R1 Microplate Mikroplak Anti VHA monoklonala duyarlı 8 kaplık 12 şerit 2 plaka

R2 Concentrated washing solution (20X)

Konsantre yıkama solüsyonu (20X) Tampon Tris NaCl pH 7,4 Koruyucu: ProClin™ 300 (%0,04)

1 şişe 235 ml

R3 Negative control

Negatif kontrol İnsan serumu, ac ant-VHA bakımından negatif, HBS antijeni,Ac anti-VHC veAc anti-VIH 1/2 bakımından negatif Koruyucu: Sodyum azotür (< 0,1%)

1 şişe 1,5 ml

R4 Positive cut-off

Pozitif kalibratör eşiği - 20 mUI/ml İnsan serumu, ac ant-VHA bakımından pozitif, HBS antijeni, Ac anti-VHC veAc anti-VIH 1/2 bakımından negatif Koruyucu: Sodyum azotür (< 0,1%)

1 şişe 3 ml

R5 Positive control

Pozitif kontrol – 80 mUI/ml İnsan serumu, Ac ant-VHA bakımından pozitif, HBS antijeni,Ac anti-VHC ve Ac anti-VIH 1/2 bakımından negatif Koruyucu: Sodyum azotür (< 0,1%)

1 şişe 1 ml

R6 Specimen diluent

Viral antijen Renkli bir gösterge ilave edilmiş viral VHA lisatı içeren proteinli Tampon Tris Koruyucu: Proclin™ 300 (% 0,1)

1 şişe 28 ml

R7 HAV viral antigen

Konjugat Peroksidaza işareki, renkendirici bir gösterge eklenmiş anti VHA bir konjugat içeren proteinli Tampon Tris Koruyucu: Proclin™ 300 (% 0,1)

1 şişe 26 ml

R8 Substrate buffer Substrat tamponu %0,015 H202 ve % 4,0 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren sitrik asit ve sodyum asetat solüsyonu

1 şişe 60 ml

R9 Chomogen: TMB solution (11X)

Kromojen Tetrametil benzidin (TMB) içeren solüsyon

1 şişe 5 ml

R10 Stopping solution Durdurma solüsyonu 1 N sülfürik asit solüsyonu

1 şişe 28 ml

5 [TR]

4 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER • Damıtık veya tamamen demineralize su. • Çamaşır suyu veya sodyum bikarbonat. • Emici kâğıt. • Tek kullanımlık eldivenler. • Koruyucu gözlük. • Tek kullanımlık borular. • 50 µl, 100 µl, 200 µl ve 1 ml'lik hacimler dağıtabilen ayarlanabilir veya sabit,

otomatik veya yarı otomatik pipetler • 10 ml, 200 ml et 1000 ml'lik dereceli deney tüpleri. • Vorteks tipi çalkalayıcı. • Mikroplakalar için otomatik*, yarı otomatik* veya manüel yıkama sistemi. • 37°C ± 1°C sıcaklıkta termostatlı ben mari veya kuru inkübatör • Kontamine atık konteyneri • Mikroplaka okuma* cihazı (450/620-700 nm filtrelerle donatılmış). (*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek

için bize danışınız. 5 - HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI Kitteki tüm reaktifler "in vitro" teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir. • Test ismi ve test özel tanıtım numarası her mikroplaka çerçevesinin üzerinde

belirtilmiştir. Bu özel tanıtım numarası her şeridin üzerinde de yer alır. Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS: Özel Tanıtım Numarası = 59. Bu tanıtım numarası her kullanımdan önce kontrol edilmelidir. Test numarası

bulunmayan veya gerçekleştirilen testin numarasından farklı olan her şerit, kullanılmamalıdır.

• Reaktifler ve numuneleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin ve söz konusu maddeleri kullandıktan sonra ellerinizi özenle yıkayın.

• Ağzınızla pipetlemeyin. • Negatif (R3) ve pozitif (R5) kontrollerin ve pozitif eşik kalibratörünün (R4)

hazırlanmasında kullanılan insan kökenki malzeme test edilmiş ve HBs antijeni, antiVHC antikorları ve anti-HIVB antikorları bakımından non reaktif bulunmuşlardır. Hiçbir test yönetiminin bulaşıcı ajanların mutlak olarak bulunmadığını garanti etmediği için, reaktifleri hasta numunelerini potansiyel olarak bulaşıcı gibi değerlendirin ve kullanım tedbirlerine dikkat ederek işleyin.

• Numuneler ve insan kaynaklı reaktifler ile doğrudan temas eden malzemeyi ve ayrıca yıkama solüsyonlarını kontamine ürünler addedin.

• Numunelerin veya bunları içeren solüsyonların sıçramasına engel olun. • Kirlenen yüzeyler % 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile temizlenecektir. Bulaşan

sıvı bir asit ise, kirlenen yüzeyler önceden sodyum bikarbonat ile nötrleştirilecek, ardından çamaşır suyu ile temizlenecek ve emici kâğıt ile kurutulacaktır. Temizleme işleminde kullanılan malzeme kirlenmiş atıklar için öngörülmüş özel bir konteynere atılmalıdır.

• İnsan kaynaklı numuneler ve reaktifler ve kontamine malzeme ve ürünler, bulaşıcı özellikleri giderildikten sonra atılacaktır: - Bu işlem ya 30 dakika boyunca % 5 sodyum hipoklorit son konsantrasyonlu

çamaşır suyuna, - ya da minimum 2 saat boyunca 121 °C'de otoklavlama vasıtasıyla

gerçekleştirilir. DİKKAT: SODYUM HIPOKLORIT IÇEREN SOLÜSYONLARı OTOKLAVıN IÇINE

SOKMAYıN.

6 [TR]

• Substrat tamponunun, kromojenin ve durdurma solüsyonunun cilt ve mukozalar ile hiçbir şekilde temas etmesine izin vermeyin.

• Solüsyonları veya yıkama atık sıvılarını veya biyolojik numuneler içeren herhangi bir sıvıyı lavaboya atmadan önce, nötrleştirmeyi ve/veya otoklavlamayı unutmayın.

• Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası www.bio-rad.com adresinde bulunabilir.

6 - ÖNLEMLER Elde edilecek sonuçların kalitesi aşağıdaki laboratuar uygulamalarına tam olarak uyulmasına bağlıdır: Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. • Aynı deney sırasında farklı partilere ait reaktifleri birbirine karıştırmayın. DİKKAT: Aynı deney boyunca hep aynı lotu kullanmak kaydıyla, kitte teslim

edilenlerden farklı yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2), substrat tamponu (mavi TMB buf. ibaresi ile tanıtılan, R8), kromojen (menekşe rengiTMB 11X. ibaresi ile tanıtılan, R9) ve durdurma solüsyonu (kırmızı 1N ibaresi ile tanıtılan, R10) kullanmak mümkündür. Bu reaktifler şirketimizin diğer ürünleri ile birlikte kullanılabilir. Ayrıca, belli bir deneyde bir tek karışımın kullanımın kullanılması kaydıyla, yıkama solüsyonu(etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2) düzgün bir şekilde yeniden oluşturulan farklı Bio-Rad reaktif kitlerine dahil edilmiş diğer iki yıkama solüsyonundan biri ile (etiketin üzerindeki mavi bir 10X veya turuncu bir 10X ibaresi ile tanıtılan, R2) karıştırılabilir. Ayrıntılı bilgi edinmek için teknik servislerimizle irtibat kurunuz.

• Reaktiflerin ortam sıcaklığında dengelenmesi için, kullanımdan önce 30 dakika bekleyin.

• Her türlü kontaminasyonu önleyerek, reaktifleri özenle tekrar oluşturun • Konjugatların enzimatik faaliyetini bozabilecek reaktif buharlar (asitler, alkaliler,

aldehitler) veya tozlar mevcut iken test yapmayın. • Damıtık su ile mükemmel bir şekilde yıkanmış cam aletler veya tercihen tek

kullanımlık donanım kullanın. • Yıkama işleminin sonu ile reaktiflerin dağıtımı arasında geçen sürede

mikroplakanın kurumasına izin vermeyin. • Enzimatik reaksiyon tüm metallere ve metal iyonlarına karşı duyarlıdır.

Dolayısıyla, hiçbir metal unsur, konjugatı veya substrat solüsyonunu içeren farklı solüsyonlar ile temas etmemelidir.

• Developman solüsyonu (Substrat tampon + kromojen) pembe renkte olmalıdır, rekonstitüsyonu izleyen dakikalarda bir başka rengin ortaya çıkması reaktifin kullanılamaz olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir.

Bu preparat için tercihen, tek kullanımlık plastik veya önceden 1 N klorhidrik asit, ardından damıtık su ile yıkanmış ve kurutulmuş cam kaplar veya dağıtım malzemeleri kullanın. Bu solüsyonu güneş ışınlarına maruz bırakmayın.

• Her serum için yeni bir dağıtım konisi kullanın. • Kapların yıkanması, yapılan işlemler açısından önemli bir aşama teşkil eder:

tavsiye edilen yıkama döngüleri sayısına uyun ve tüm kapların tamamen doldurulup, ardından tamamen boşaltılmasına özen gösterin. Kötü bir yıkama işlemi yanlış sonuçlar elde edilmesine yol açar.

• Konjugatı ve developman solüsyonunu dağıtmak için asla aynı kabı kullanmayın.

7 [TR]

7 - NUMUNELER Olağan uygulama yöntemleriyle bir kan numunesi alın. Testler sulandırılmamış serum veya plazma numuneleri üzerinde yapılacaktır (numuneler EDTA, heparin, sitrat, ACD gibi antikoagülanlar ile alınır). Agrega içeren numuneler testten önce santrifugasyon ile arıtılmalıdır. Süspansiyon halindeki partiküller veya fibrin agregaları yanlış sonuçlar elde edilmesine yol açabilir. Tarama 7 gün içinde yapılır ise, numuneler 2-8°C sıcaklıkta saklanacaktır veya -20°C sıcaklıkta dondurulmuş olarak saklanabilecektir. Dondurma/Çözdürme işlemlerini tekrarlamaktan kaçının. Eğer numuneler taşınacak ise, bunları etyolojik ajanlar konusundaki mevzuata uygun şekilde ambalajlayın ve tercihen dondurulmuş olarak taşıyın. KONTAMİNE, HİPERLİPEMİK VEYA HİPERHEMOLİZE SERUMLARI KULLANMAYIN. DİKKAT: 60 gr/l'ye kadar albumin ve 100 mg/l'ye kadar bilirubin içeren numunelerde ve ayrıca 36 gr/l'ye kadar trigliserit içeren lipemik numunelerde ve 5 gr/l'ye kadar hemoglobin içeren numunelerde hiçbir etkileşim ispatlanamamıştır. Anti VHA antikorlarının bulunmasına yönelik negatif ve pozitif numuneler dondurma çözme döngülerinden 3 dakika önce ve sonra test edilmişlerdir. Bu tedavi antikorların algılamasını etkilemez. 8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI- SON KULLANIM TARİHİ - SAKLAMA Monolisa™ Anti-HAV PLUS Sürüm 2 kitinde bulunan reaktifleri kullanmadan önce, 30 dakika ortam sıcaklığında bırakarak dengelenmesini sağlayın. 1) Kullanıma hazır reaktifler Mikroplaka (R1) 12 şerit içeren her taşıyıcı çerçeve kapalı alüminyum poşet içine konulmuştur. Poşeti makas veya bıçak ile birleşme noktasının 0,5 ila 1 cm üzerinde kesin. Poşeti açın ve çerçeveyi poşetten çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar poşetin içine yerleştirin. Poşeti özenle kapatın ve yeniden +2-8°C sıcaklıkta muhafaza edin. Negatif kontrol (R3) kullanıma hazır Negatif eşik kalibratörü (R4) kullanıma hazır Pozitif kontrol (R5) kullanıma hazır Viral anijeni (R6) kullanıma hazır Konjugat (R7) kullanıma hazır Kullanımdan önce reaktifleri voteks yardımıyla homojenize edin. 2) Yeniden oluşturulacak reaktifler Konsantre yıkama solüsyonu (20X): R2 Solüsyonu damıtık su ile 20 kez sulandırın.. Bu şekilde, kullanıma hazır yıkama solüsyonu elde edilir. 12 şeritten oluşan bir plaka için 800 ml hazırlayın. Enzimatik developman solüsyonu (R8 + R9) Reaktif R9'u reaktif R8'in içinde 1/11 oranında sulandırın (örnek: 10 ml reaktif R8 artı10 ml reaktif R9) 12 şeridi işlemek için 10 ml'nin gerekli ve yeterli olduğunu bilin. Homojenleştirin. 3) Nicel test için reaktifleri sulandırın Nicel teste, R3'te 1/2 oranında R4 ve R5'lerin sulandırılmasıyla 40 ve 10 mUI/ml gam uçları hazırlayın. Kalibrasyon gamı aşağıdaki noktalardan oluşacaktır:

8 [TR]

Cal 80 = 80 mUI/ml'lik kalibratör = R5 Cal 40 = 40 mUI/ml'lik kalibratör = R5'de (100 + 100 µl) 1/2 oranında sulandırılmış R3 Cal 20 = 20 mUI/ml'lik kalibratör = R4 Cal 10 = 10 mUI/ml'lik kalibratör = R4'de (100 + 100 µl) 1/2 oranında sulandırılmış R3 Cal 0 = 0 mUI/ml'lik kalibratör = R3 4) Geçerlilik Kit +2-8°C sıcaklıkta saklanmalıdır. +2-8°C sıcaklıkta saklanan kitteki her unsur kutunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir (özel bir uyarı bulunmadığı takdirde). R1: Vakumlu poşetin açılmasından sonra, +2-8°C sıcaklıkta muhafaza edilen ve özenle kapatılan orijinal ambalajlarındaki şeritler 1 ay dayanabilir. R2: Sulandırılmış yıkama solüsyonu +2-30°C sıcaklıkta 2 hafta saklanabilir. Konsantre yıkama solüsyonu (R2) +2- 30°C sıcaklıkta muhafaza edilebilir. R8 + R9: Yeniden oluşturulduktan sonra, karanlıkta saklanan reaktifler ortam sıcaklığında (18-30°C) 6 saat boyunca kullanılabilir. 9 - ÇALIŞMA MODU NİTEL TEKNİK - NİCEL TEKNİK • Önerilen protokole kesinlikle uyun. • Testin kalitesini doğrulamak için, test her �uygulandığında negatif ve pozitif

kontrol serumlarını kullanın. • Doğru laboratuar uygulamalarını kullanın. Protokol 1) Numune dağıtım ve tanıtım planını özenle hazırlayın. 2) R2 sulandırılmış yıkama solüsyonunu hazırlayın. 3) Taşıyıcı çerçeveyi ve şeritleri (R1) koruyucu ambalajdan çıkarın. 4) Plakı ön yıkamadan doğrudan ardı ardına yerleştirin: - Her kapta 100 µl viral AG (R6) Nitel bir test için A1'de 50 µl negatif kontrol (R3) 50 µl B1,C1, D1'de 50 µl pozitif eşik kalibratörü E 1'de 50 µl pozitif kontrol (R5), F1'de 50 µl ilk numune, G1'de 50 µl ikinci numune, vb... Nicelbir test için A1, B1'de 50 µl CAL 0 C1, D1'de 50 µl CAL 10 E1, F1'de 50 µl CAL 20 mUI/ml G1, D1'de 50 µl CAL 40 mUI/mk A2, B2' de 50 µl CAL 80 mUI/ml C2'desafveyasulandırılmış 50 µl ilk numune D2'de, vb 50 µl ikinci numune, vb... Numuneler negatif R3 kontrolü (Cal 0mUI/ml) ile sulandırılabilirler). Numunelerin dağıtımı 10 nm'yi aşarsa, test edilecek numunelerden sonra

negatif ve pozitif kontrollerin dağıtılması önerilir. Kullanılan sisteme bağlı olarak, göstergelerin konumlarını değiştirmek mümkündür.

9 [TR]

NB: Numunenin eklenmesinden sonra viral lisat + numune (veya kontroller) içeren hazne kırmızıdan turuncaya döner. 490 nm'de spektrofotometrik ölçüm yapılarak kaplarda numune olup olmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).

5) Sızdırmazlık sağlamak için, mümkünse üstünü yapışkan bir film ile örterek, tüm yüzeyin üzerine iyice basın.

6) Mikroplağı termostatlı ben-mari veya kuru mikroplak inkübatöründe 37°C ± 1 °C'de 60 ± 5 dakika.

7) Yapışkan filmi çıkarın. Tüm kapların içeriğini kontamine atıklar için öngörülmüş (sodyum hipoklorit içeren) bir konteynere çekin ve kaplardan her birinin içine minimum 370 µl yıkama solüsyonu ilave edin. Yeniden çekin. Her dağıtım-çekme safhası arasında 30 saniyelik aralıklarla yıkama işlemini 2 kez (minimum 3 yıkama) tekrarlayın. Artık hacim 1 0 µl'den az olmalıdır (gerekirse plakayı emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun).

Otomatik bir yıkayıcınız var ise, aynı işlem döngüsünü uygulayın. 8) Tüm kaplara konjugat 1 00 µl konjugat solüsyonundan hızlı bir şekilde dağıtın.

Konjugat kullanımdan önce çalkalanmalıdır. Yeni bir filmle örtün ve inkübe edin: 60 ± 37°C ± 1°C'de5 dakika boyunca inkübe edin.

NB: Konjugat mor bir renktedir. 620 nm'de spektrofotometrik ölçüm yapılarak kaplarda numune olup olmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).

9) Yapışkan filmi çekin bütün kapları çekerek boşaltın ve önceki gibi 10) 4 kez yıkayın. Developman solüsyonunu hazırlayın (bkz. bölüm 8, reaktif R8 +

R9). 11) Önceden hazırlanmış 80 µl'lik enzimatik faaliyet developman solüsyonunu

(R8+R9) tüm kaplara hızla dağıtın. Reaksiyonun ortam sıcaklığında (1 ila 30°C) 30 ± 5 dakika boyunca karanlıkta gerçekleşmesini sağlayın. Bu inkübasyon sırasında, yapışkan film kullanmayın.

N.B.: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir kap ile pembemsi renkte developman solüsyonu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. (otomatik kontrol için paragraf 13'e başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).

12) Developman solüsyonu ile aynı sıra ve dağıtım temposunu kullanarak 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin.

N.B.: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için) kaplardan kaybolur.

13) Plakaların altını özenle silin. Durdurma solüsyonunun dağıtılmasından en az 4 dakika sonra ve reaksiyonun sona ermesinden sonraki 30 dakika içinde, bir plaka okuyucusu yardımıyla 450/620-700 nm'de optik yoğunluğu okuyun.

14) Sonuçları kayda geçirmeden önce, okuma işlemi ile plaka ve numunelerin dağıtım ve tanıtım planının birbirleriyle uyumlu olduğunu kontrol edin.

10 - UYARLAMA SİSTEMİ YIKAMA: Azami test performanslarını elde edebilmek için yıkama prosedürlerine uymak önemlidir. Bazı aygıtlar için döngü sayısını ve kabul edilebilir geçerlilik kriterlerine ulaşmak için yıkama hacimlerini adapte etmek gerekli olabilir.

10 [TR]

11 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ - NİTEL TEST Anti-VHA antikorlarının bulunuşu veya eksikliği her numune için eşik değer göre bir oranın hesaplanmasıyla belirlenir. 1. R4 pozitif eşik kalibratörü için ölçülen absorbasn ortalamasını hesaplayın Örnek: Pozitif kalibratör R4 Hazne Optik yoğunluk B1 0.689 C1 0.673 D1 0.680 DO Toplam 2.042 Toplam Optik Yoğunluk 2.042 DO ortalama R4 = VS = ------------------------------- = -------- = 0.680 3 3 2. Her numune için oranı hesaplayın Numune oranı = Numunenin DO ortalaması R4 / DO 3. Doğrulama kriterleri aşağıdaki gibidir a) R3 Negatif kontrol için: Ölçülen absorbans 1,0'ın üzerinde olmalıdır. b) R4 pozitif eşik kalibratör için: Her R4'ün ölçülen absorbansı 0.350'nin üzerinde

olmalıdır. R4 pozitif kalibratörün ayrı değerlerinden biri aşağı yukarı ortalamanın %30'nu

geçerse, geri çekin ve kalan iki pozitif kontrol değeri ile hesaplama işlemini yeniden yapın.

Negatif R3 (DO ortalaması R4 / DO R3 negatif kontrol) kontrolün DO'suyla bölünen pozitif R4 kalibratörün ölçülen absorbans ortalaması 0,6'nın altında olmalıdır.

c) R5 negatif kontrol için: Ölçülen absorbans 0,300'ın altında olmalıdır. R5 pozitif kontrolün oranı (DO ortalaması R4 / DO R5 pozitif kontrol) 1,5'in

üzerinde olmalıdır. Kriterlerden birine uyulmazsa test geçersizdir. 4. Sonuçların Yorumlanması Oranı 0,9'in altındaki numuneler Monolisa ™ Total Anti-HAV PLUS'a göre negatif olarak değerlendirilirler. Oranı 1,1'ie denk veya altındaki numuneler Monolisa ™ Total Anti-HAV PLUS'a göre negatif olarak değerlendirilirler. Oranı 0,9'a denk ve 1,1'in altında olan numuneler dikkatle yorumlanmalıdır ve basitçe tekrar test edilmelidirler. Testin tekrarlanmasından sonra, oran 1,1'e denk veya üzerinde ise numune Monolisa™ Total AntiHAV PLUS testine göre pozitif olarak değerlendirilir. Numune oran 0,9'ın altındaysa negatif olarak değerlendirilir. Tekrarlanan testin oranı 0,9'a denk ve 1,1'in altında ise, numune yorumlanamaz ve sonraki örnek test edilmelidir.

11 [TR]

12 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ - NİTEL TEST 1. Her gam noktası için ölçülen absorbans ortalamasını hesaplayın Örnek: CAL 40 mUI/ml Hazne Optik yoğunluk G1 0,295 H1 0,292 DO Toplam 0,587 Toplam Optik Yoğunluk 0,587 DO ortalaması cal 40 mUI/ml = --------------------------------- = ---------- = 0,2935 2 2 2. Doğrulama kriterleri aşağıdaki gibidir a) R3 negatif kontrol için (Cal 0 mUI/ml): Her R3'ün ölçülen absorbansı 0.1'in üzerinde olmalıdır. b) R4 pozitif eşik kalibratörü için (Cal 20 mUI/ml): Her R4'ün ölçülen absorbansı 0.350'nin üzerinde olmalıdır. Negatif R3 (DO ortalaması R4 / DO R3 negatif kontrol) kontrolün DO'suyla

bölünen pozitif R4 kalibratörün ölçülen absorbans ortalaması 0,6'nın altında olmalıdır.

c) R5 pozitif kontrol için (Cal 80 mUI/ml): Her R5'ün ölçülen absorbansı 0.300'ün altında olmalıdır. R5 pozitif kontrolün oranı (DO ortalaması R4 / DO R5 pozitif kontrol) 1,5'un

üzerinde olmalıdır. d) DO ortalaması Cal 0 > DO ortalaması Cal 1 0 mUI/ml DO ortalaması Cal 10 > DO ortalaması Cal 20 0 mUI/ml DO ortalaması Cal 20 > DO ortalaması Cal 40 0 mUI/ml DO ortalaması Cal 40 > DO ortalaması Cal 80 0 mUI/ml Kriterlerden birine uyulmazsa test geçersizdir. 3. Sonuçların Yorumlanması Her gam noktasının DO'su, X ekseni üzerinde mUI/ml cinsinden ifade edilen Anti-VHA antikor konsantrasyonuna bağlı olarak Y ekseni üzerinde noktalı grafik olarak bildirilir. Her numunenin Anti-VHA antikorlar halindeki konsantrasyonu, eşantiyonun ölçülen absorbans değeri ile elde edilen eğrinin X kesişme noktasına göre okunabilir. Test edilen numuneler ile ilgili eğri üzerindeki konsantrasyonları okuyun. Numune sulandırılmışsa, sulandırma faktörü ile elde edilen konsantrasyonu arttırın. Konsantrasyonu 18' mUI/ml'nin altındaki numuneler Monolisa ™ Total Anti-HAV PLUS'a göre negatif olarak değerlendirilirler. Konsantrasyonu 22' mUI/ml'ye denk veya üzerindeki numuneler Monolisa ™ Total Anti-HAV PLUS'a göre negatif olarak değerlendirilirler. Konsantrasyonu 18'a denk ve 2,2'in altında olan numuneler dikkatle yorumlanmalıdır ve basitçe tekrar test edilmelidirler. Testin tekrarlanmasından sonra, konsantrasyon 18 mUI/ml'nin altındaysa negatif olarak değerlendirilir, Numune MonoLisa™ Total Anti-HAV PLUS testine göre konsantrasyon 22 mUI/ml'ye denk veya üzerinde ise pozitif olarak değerlendirilir. Tekrarlanan testin konsantrasyonu18 mUI/ml'ye denk ve 22 mUI/ml'nin altında ise, numune yorumlanamaz ve sonraki örnek test edilmelidir.

12 [TR]

13 - NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ) İLK AŞAMA SIRASINDA VİRAL ANTİJENİN (R6) VE NUMUNELERİN ÇÖKELTİSİNİN KONTROL EDİLMESİ Viral anitijen (R6) varlığı ardından numune 490 nm'de spektrofotometrik bir okuma ile doğrulanabilir. Viral antijen (R6) içeren her hazne 0,500'e denk veya üzerinde optik bir yoğunluk sergilemelidir. Bir numune eklenmesinden sonra her hazne için DO artışı en az 0.100 olmalıdır. Numune çökeltisinin kontrolü R6'nın ve numunenin ajitasyonu / homojenleştirilmesi halinde kullanılamayabilir. DİKKAT: Numune eklenmesinden sonra, viral antijen solüsyonu (R6) kırmızıdan turuncuya dönüşür. İKİNCİ AŞAMA SIRASINDA KONJUGAT (R7) ÇÖKELTİSİNİN KONTROL EDİLMESİ Dikkat: Konjugat (R7) mor renktedir. Konjugatın (R7) kaplarda mevcut olduğu 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir: Her kap için ölçülen DO değeri 0,500'e denk veya üzerinde olmalıdır. DEVELOPMAN SOLÜSYONU İLAVESİNİN KONTROL EDİLMESİ 490 nm'de yapılan bir okuma ile pembemsi developman solüsyonunun mevcut olup olmadığı kontrol edilebilir: Developman solüsyonu içeren bir kap 0.100'nin üzerinde optik bir yopunluğa sahip olmalıdır (bir DO daha zayıf bir yoğunluk developman solüsyonunun kötü bir dağıtımını gösterir). DİKKAT: Boş bir kap ile pembemsi renkte developman solüsyonu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. 14 - TEST PERFORMANSLARI Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS'un performansları, seçilmemiş kan donörlerinin numuneleri, hastaneden tedavi gören hasta numuneleri ve sekrokonversiyon panelleri ile birlikte aşıyı takibeden ticari numunelerden başlayarak 3 farklı alan üzerinde belirlenmişlerdir. A - Özgüllük İncelemesi Seçilmemiş 561 kan donöründeki özgüllük %95 [%99.47-%100] oranında bir Güven Aralığı (IC) ile birlikte 561/561=%100'e denk olarak tespit edilmiştir. Bunun yanı sıra, 700 hasta (donmuş veya çözülmüş) numunesi analiz edilmiştir. Özgüllük 700/700 = %100'denk, IC 95 [%99.57-%100] bulunmuştur. Farklı patolijiler veya Hepatit A ile ilgisi olmayan durumlar (gebe kadınlar, rumatoid faktör, anti nükleer antikor, fare anti-lg'si, viral veya bakteriyel enfeksiyonlar) gösteren 192 hasta ticari EIS testi ile karşılaştırmalı olarak birlikte teste tabi tutulmuşlardır. 2 test arasındaki örtüşme 191/192=%99,48'e denk bulunmuştur. Özgüllük 95/95=%100'e denk bulunmuştur. Gribe karşı aşı olan bir şahıstan alınan 1 numune kullanılan ticari EIA testi ile pozitif, Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS ile karşılaştırıldığında ise negatif tespit edilmiştir.

13 [TR]

B - Duyarlılık İncelemesi Duyarlılık kan donörlerinden alınan 424 pozitif numune ve 3 faklı alandan alınan 1274 pozitif hasta numunesi üzerinde değerlendirilmiştir. Toplam 1698 numune Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS ile test edilmiş ve ticari bir EIA testi ile karşılaştırılmıştır. Duyarlılığın hastalar ve kan donörlerin her ikisinde %100'e denk olduğu tespit edilmiştir. 3 VHA ticari serokonversiyon paneli ve aşıyı takip eden 12 panel aynı şekilde incelenmiş ve ticari bir EIA testi ile karşılaştırılmıştır. Bu panellere yönelik 2 test arasındaki örtüşme%100 olmuştur. C - Kesinlik Kantitatif sonuçlar mUI/mL cinsinden ve aşağıdaki uluslararası referans preparata göre kalibrasyonu yapılmış olarak verilir: WHO Anti- Hepatitis A Immunoglobu lin 2. Uluslar Arası Standardı 1998. WHO uluslararası standardının sulandırılması ile elde edilen 0, 10, 20, 400 ve 40 mUI/mL konsantrasyonları teste tabi tutularak, kitin içinde verilen kalibratörlere göre bir korelasyon incelemesi yapılmıştır. Korelasyon katsayısı ve elde edilen korelasyon doğrusunun eğimi karşılıklı olarak 0,98 ila 1,04'dür. D - Testin tekrarlanabilirliği ve yeninden üretilebilirliği Monolisa™ Total Anti-HAV PLUS testinin kesinliği 4 numunenin analiz edilmesi ile belirlenmiştir: VHA antikorlarında 1 pozitif numune ve 3 negatif numune (zayıf, orta ve güçlü). Tekrarlanabilirlik (deney içi) aynı işleme boyunca 30 kez test edilen 4 numune örneğinin analizi ile değerlendirilmiştir. Yeniden üretilebilirlik (deney içi) bu her gün ayrı 2 deneme karşılığında 20 gün boyunca iki kez test edilen bu 4 aynı numunenin analizi ile değerlendirilmiştir. Sonuçlar aşağıdaki tablolarda gruplandırılmıştır: Tablo 1: Deney içi tekrarlanabilirlik Numune Negatif Zayıf pozitif Orta pozitif Güçlü pozitif Oran ortalaması 0,43 2,25 3,08 4,29 DS 0,02 0,15 0,19 0,19 CV% 4,87 6,50 6,29 4,47

Numune Negatif Zayıf pozitif Orta pozitif Güçlü pozitif Ortalama konsantrasyon 2,78 39,96 67,33 >80

DS 1,21 2,69 5,26 ND CV% 43,53 6,72 7,81 ND Tablo 2: Deney içi yeniden tekrarlanabilirlik Numune Negatif Zayıf pozitif Orta pozitif Güçlü pozitif Oran ortalaması 0,45 2,13 3,43 4,80 DS 0,03 0,29 0,33 0,49 CV% 6,31 13.68 9,61 10,23

14 [TR]

Numune Negatif Zayıf pozitif Orta pozitif Güçlü pozitif Ortalama konsantrasyon 3,10 38,91 71,88 >80

DS 1,24 3,65 4,13 NA CV% 39,96 9,38 5,75 NA 15 - TEST LİMİTLERİ Bulaşıcı bir hastalığın teşhisi tek bir dozaja göre düzenlenmemelidir.. Hastanın geçmişi ve semptomolojisi ve ayrıca selojik testler dikkate alınarak yapılmalıdır. Numunelere bakteri bulaşması absorbans değerleri ile modifiye edilebilir. 16 - KAYNAKÇA • Costa-Mattioli Mauro, Di Napoli A, Ferré V, Billaudel S, Perez-Bercoff R, Cristina

J : Genetic variability of hepatitis A virus. Journal of General Virology (2003), 84, 3191-3201

• Normann A, Jung C, Vallbracht A, Flehmig B : Time course of Hepatitis A Viremia and Viral Load in the Blood of Human Hepatitis A Patients. Journal of Medical Virology 9999 :1-7 (2003)

• Lutz G. Guertler : Virus safety of human blood, plasma, derived products. Thrombosis Research 107 (2002)S39-S45

• Jennifer A. Cuthbert : Hepatitis A : Old and New. Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2001, p. 38-58

• Morag Ferguson, Dawn Sands, Nico Lelie : Hepatitis A Immunoglobin : An International Collaborative Study to Establish the Second Intertional Standard. Biologicals Vol. 28, Issue 4, December 2000, p. 233-240

• World Health Organization, departement of communicable Disease Surveillance and Response : Hepatitis A. Who/cds/csr/edc/2000.7 (http://www.who.int/emc)

• Centers for Disease Control and Prevention (CDC) : Prevention of hepatitis A through active or passive immunization, recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP). MMWR october 01, 1999 /48(RR12) ;1-37

• Rosa M. Pinto, Juan F. Gonzalez-Dankaart, Gloria Sanchez, Susana Guix, M. Jose Gomara, Monica Garcia, Isabel Haro, Albert Bosch : Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bearing a VP3 epitope of hepatitis A virus. FEBS Letters 438 (1998) 106-110

• Stanley M. Lemon : Type A viral hepatitis : epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistry 43 :8(B) 1494-1499 (1997)

• Stanley M. Lemon and Leonard N. Binn : Serum neutralizing antibody response to hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseseases Vol. 148, no. 6 December 1983

• Bertram Flehmig, Michael Ranke, Hans Berthold, Hans-Joachim Gerth : A Solid-Phase Radioimmunoassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseases Vol. 140, no. 2 August 1979

15 [TR]

16 [TR]

17 [TR]

18 [TR]

19 [TR]