Archiv fiir Mikrobiologie 60, 285--302 (1968)

Morphologie, Stoffwechselphysiologie und Charakterisierung der Malic-Enzym-Aktivit it

L-Apfels iure-abbauender Bakterien* P]~TEI~ FLESCH

Pharmazeutisches Institut und Institut ffir Weinforschung

der Johannes Gutenberg-Universit~t Mainz

Eingegangen am21. Augus~ t967

Morphology, Physiology and Characterisation o/ Malic Enzyme Activity el Bacteria, Decomposing z-Malie Acid

Summary. Six strains of bacteria, which all have the ability of fermenting L-malic acid to lactic acid and carbon dioxide, were investigated. Their morphology, properties of assimilation and their enzyme activities were determined. The shape and size of the ceils and the demand of nutriments of the strains was found to be different. Besides malic acid some strains decompose citric, fumaric and tartaric acids. Malic acid is an intermediate of the dissimilation of citric and tartaric acids by L. plantarum. All strains need glucose and fructose as earbone source. Its turn- over is accelerated by the presence of malic acid. The typical bacteria, dissimilating maIie acid, can be adapted to the conditions of the natural acid substances by increasing the (H+) ion concentration step by step.

All strains which were investigated possess malie enzyme and oxalacetate decarboxylase activity, ttomofermentative strains have a very distinct malic enzyme activity. The ratio of oxalacetate decarboxylase to malic enzyme activity is about one; with heterofermentative strains this ratio is noticeably lower than one. The pH optima of the enzymes of the several strains are little different; they are pH 3,9 and 3,6 for L-malate and oxalacetate respectively. Only the less typical strains P/-1 and L. plantarum, which utilize citric acid, need higher pH values for the maximal dissimilation of malate.

Zusammen]assung. Sechs t~akterienarten, denen die F~higkeit der Umwandlung yon L-Apfe]s~ure in MilchsEure und Kohlendioxyd gemeinsam ist, werden hinsicht- lich ihrer morphologischen Merkmale, der stoffwechselphysiologischen Eigenschaf- ten und der Enzymausstattung untersucht. Die einzelncn Arten unterscheiden sich hinsichtlich der Form und Gr6Be der Zellen sowie des N~hrstoffbedarfs. Aul]er JkpfelsEure werden yon cinigen St~mmen CitronensEure, Fumars~ure und auch WeinsEure assimilicrt. Metabolit der CitronensEure- und WeinsEureumsetzung durch L. plantarum ist ~pfelsEure. Von den Kohlenhydraten werden bei allen St~mmen Glucose und Fructose verbraucht. Die Geschwindigkeit des Umsatzes ist erh6ht, wenn .~pfelsEure zugegen ist. Die ,,typischen" Jkpfels~ureabbaubakterien lassen sich an die Milieubedingungen der natiirliehen sauren Substrate durch stufenweise Erh6hung der (H+)-Ionen-Konzentration adaptieren.

* I. Mitteilung zum Problem des biologischen SEureabbaues. D-ber adaptive and konstitutivc fermentchemisehe Eigenschaften L-~pfelsEure-abbauender Bakterien.

286 P. FLESC~:

Alle getesteten Bakterienarten besitzen eine Malic-Enzym- und eine Oxalacetut- Decarboxylase-Aktivit~t. Die Malic-Enzym-Aktivit~t ist besonders ausgepr~gt bei den Homofermentativen. Das Verh/~ltnis der Oxalacetat-Decarboxylase- zur Malic- Enzym-Aktivit/it ist bei den letzteren etwa 1, bei den tteterofermentativen merkbar kleiner als 1. Die pH-Geschwindigkeitsmaxima der Enzyme gegenfiber z-Malat bzw. Oxa]aeetat unterseheiden sich bei den einzelnen Arten geringffigig; sic liegen bei 3,9 bzw. 3,6. Nur die weniger ,,typischen" St/imme P/-1 und L. plantarum, die aueh gute Citronens~ureverwerter sind, benStigen zur maximalen Malat-Dissimilation etwas hOhere pH-Werte.

Die Begriffe adaptive und konstitutive Enzyme wurden erstmals yon K~L- S~SM (!930, 1938) benutzt. INach ihm ist unter einem adaptiven Enzym ein solehes zu verstehen, das sich infolge der chemischen Reizwirkung eines Substrates gebildet hat. Ein konstitutives Enzym dagegen sell bei seiner Bildung unabh~ngig von der Reizwirkung eines Substrates sein. Adaptiv sind beispielsweise die Galaktocym- ase yon B~ickerhefe und die Aminos/iure-Decarboxylasen und -Desaminasen yon B. cell, konstitutiv die Hefeenzyme Saecharase, Raffinase und Melibiase.

Einige Autoren fassen die Enzymadapt~tion nicht als Neubildung, sondern als Umbildnng oder auch als Anpassung eines vorhandenen Fermentes auf. Dennoch gibt es F/ille, we ein Enzym erst in Gegenwart des zu spaltenden Stoffes entsteht, z. B. die Tam~ase yon A. niger (A. RIPF]~L u. KES~J~G, 1930) und Pectase yon A. niger (GXv~A~N u. BS~NI, 1947). Die ad~ptiven Eigenschaften zeigen sieh dann teilweise oder ganz reversibel. An Galaktose gewShnte Here verliert die gesamte Galaktose-Aktivit/~t, wenn ihr Glucose als Substrat geboten wird (STEP~ENSON U. YUDKI~, 1936). W~hrend die konstitutiven Enzyme in ihrer Aktivit~t durch ~ui~ere Einflfisse, wie den pit-Weft der N~hrlSsung, nur wenig beeinflul3bar sind, passen sieh die adaptiven Enzyme den jeweiligen Bedingungen leiehter an. So baut A. acre- genes Brenztraubens~ure auf zwei Wegen ab : zu Essigs~ure und Ameisens~ure im basischen und zu Acetylmethylcarbinol im sauren Milieu (SILvVRMANN U. WERK- ~AN~r 1941). Iqaeh GALE U. EPPs (1942) bfldet B. cell in Gegenwart yon S/~uren vor- nehmlich Aminosi~ure-Deearboxylasen und yon Basen Aminos~ure-Desaminasen.

Es gibt aueh einen der enzymatisohen Induktion (Adaptation) entgegengesetzten Effekt, der darin besteht, dal~ die Gegenwart eines Zuekers im N~hrmedium, z. ]3. der Glucose, vornehmlieh bei Bakterien die Synthese einiger Enzyme ganz oder teilweise unterdrfickt (DIENV,~T, 1900; STEPKENSO~r U. YUD~N, 1936; GALE, 1943). Dieser Effekt kann sich abet aueh auf konstitutive Enzyme auswirken (Mo~r 1959). Spezifische Hemmeffekte auf die Biosynthese yon Enzymen werden aber auch yon den Reaktionsprodukten und strukturanalogen Verbindungen ausgefibt. Als Beispiel sei hier die Hemmung der Tryptophan-Synthetase durch Tryptophan angeffihrt (MONOD u. COHE~-]~AZIEE, 1953). MO~COD (1959) folgert daraus, dal~ die Mutation eines Informator-Gens die Y~higkeit zur Synthese eines Enzyms aus- schalten oder wiederherstellen kann, bei induzierbaren (adaptiven) Systemen erst die Zugabe eines Induktors (Substrat) zur Synthese des aktiven Proteins ffihrt und die Zugabe eines Metaboliten in anderen F~llen die Synthese hemmt. Der Stoff wirkt dann als Represser. Den repressorischen Effekt yon Glucose erkl~rt man so, dal~ Glucose die Vorstufe eines internen Repressors darstellt.

Eine neuere Auffassung fiber die Synthese der Enzyme besagt, da$ man grund- s~tzlieh eine Substratinduktion anzunehmen habe. Durch Mutation am Regulator- Gen entst~nden Mutanten, die auch in Abwesenheit eines Induktors Enzyme bilden kSnnten, die dann konstitutiv seien. Untersuchungen an der fl-Galaktosidase haben dies bestgtigt (Come u. Mo~coD, 1953). Fiir die Regulation der Enzymsynthese gibt es demnach ein bestimmtes Gen, welches die Xontrolle fiber die Mutation adaptiv-->

l~alie-Enzym-Aktivit~t L-J[pfelsaure-abbauender Bakterien 287

konstitutiv ausiibt. Ein zweiter Weg zur konstitutiven Enzymsynthese ist gegeben, wenn der Operator infolge Mutation nicht mehr mit dem l~epressor reagieren kann. Mutanten mit veriindertem 0perator-Gen sind iso]iert worden (JAcoB u. hr (1960). Die Struktur eines Operators wurde von JAcoB u. ~o~oD (1959) wegen der Existenz eines Repressors gefordert. Die Wirkungsweise eines l%epressors wird nun so erkl~rt, dab dieser mit dem Operator-Gen reagiert. Der Startpunkt ffir die RNS- Synthese ist dadurch blockiert (JAcoB u. 1VIO~OD, 1961)1.

Als Objekt fiir die Erforschung adaptiver und konstitutiver ferment- chemischer Eigenschaften bot sich eine Gruppe yon Bakterien an, die natiirlicherweise in Fruchtsaften und Weinen vorkommen und yon PS.YNACD U. Do~EaQ (1961) als J, pfelss bezeich- net werden. Sie ffihren in diesen den sogenannten biologischen Ss abbau durch, d. h. formen ~pfelsaure in Milchsaure und Kohlendioxyd urn. Der Reaktionsmechanismus des Vorganges konnte im Falle des ,,B. gracile" durch J~XaCH~L et al. (1956) aufgeldart werden, wobei ein doppelter Mechanismus fiir den ~pfels/iureabbau festgestellt worden ist. Der eine Weg wird katalysiert vom Malie-Enzym, der andere yon den Fermenten Malat-Dehydrogenase und Oxalessigsg, ure-Decarboxylase. Fiir beide Systeme ist auBerdem die Wirksamkeit einer Lacta~-Dehydro- genase erforderlieh. Malie-Enzym war zuvor yon KO~KES u. OCHOA (1948) beim L. plantarum (arabinosus 17--5) aufgedeckt worden.

Wie sieh zeigte, kann mit in kiinstlichen N~hrlSsungen geziichteten Bakterien durch blokes TJberimpfen in den sauren Weinen normaler- weise kein S~ureabbau herbeigefiihrt werden, da Vermehrung und Fer- mentaktivitat gehemmt sind. Es wurden deshalb Arbeitsteehniken angewendet, die es ermSglichten, die Bakterien an die jeweiligen Sub- strafe zu adaptieren ( J ~ c g ~ L u. FL~SCH, i959; Fn~sc~ u. J~zc~T, , 1960b). Eine wissenschaftliche Bearbeitung der Adaptierungsvorgs wurde nicht vorgenommen.

In der vorliegenden Arbeit sollte bei einer Anzahl Xpfelss ab- bauender Bakterienstgmme in vergleichenden Untersuchungen und unter Anwendnng enzymkinetischer Methoden geklgrt werden, ob die vorhandenen Enzymsysteme im Hinblick auf das Substrat L-Xpfelss adaptiv oder konstitutiv sind. Fiir das Malic-Enzym yon L. plantarum hatten BLANCHAI~D et~ a]. (1950) adaptiven Charaktcr naehgewiesen. Es war weiterhin festzustellen, unter welchen Bedingungen sieh die Bakterien und damit ihre Xpfelsgure-Enzyme an hShere (H+)-Ionen- Konzentrationen adaptieren lassen. Insbesondere sollte der Aminosaure- bedarf der Zellen und die Zusammensetzung der Zellsubstanz an freien und gebundenen Aminosguren beim Eingehen einer pH-Adaptation verfolgt werden. Auch war die Wirkung yon Glucose auf die Ferment- aktivitgt, tier Zusammenhang zwischen Glykolyse und Xpfels~ture-

Einen ~berblick der genetisehen Verh~ltnisse der Enzymsynthese, die hier nicht ausfiihrlicher behandelt werden kSnnen, gibt S~AX~L~]SR (1963).

288 P. FLESC~:

D i s s i m i l a t i o n sowie die H e m m w i r k u n g d e r s c h w e f l i g e n S/~ure a u f die

B a k t e r i e n z u u n t e r s u c h e n .

A. Methodik

Herstellung der He/eextrakt-Niihrl6sung

Bierhefe und Weinhefe warden durch mahrmaliges Zentrifugieren und Auf- nehmen in Leitungswasser get rennt gewaschen, sodann je 50 g (zusamman 100 g) mi t 110 ml Wasser und 3- -4 Tropfen verdiinntar Sehwafels~ure 10 rain lang gekocht. Nach dam Erkal ten wird zentrifugiart. Man erhKlt 100 ml Extrak$, welcher im Verh/iltnis 1 : 3 mit Leitungswasser zu verd~nnen ist. Zur allgemainen Verwendung werden 10,0 g/] Glucose und 6,0 g/1 DL-Xpfels~ure zugesetz~ und dar pH-Wer t mi t K O g auf 5,2 eingestellt. Nach der ersten Sterilisation im Autoklaven (1,1 atii, 20 rain) wird untar Varwendung yon Kiesalgur vom Niederschlag abfiltriert.

Papierchromatographischer Mannitnachweis Papier: Schl. & Sch. 2043 b mgl, Laufmit tel : n-Butanol/Ameisens~ure/Wasser

(10:2:2), Bespriihungsmittal nach HAIS u. MA6]~K (1958). Nach dem Trocknen und

Schema der Ge/difl/i~llungen zur manometrischen Bestimmung der Malic-Enzym- Aktivitiit yon Enzyml6sungen, Substrat L-~p]elsdiure

Temparatur 24~ als Gas: Luf t ; Flfissigkeitsvoluman 4 ra]

Ansatz-Nr. 1 2 3 4 5 6 Molarit~t

L-Xpfals~ure m/5, pH 6,0 0,5 -- 0,5 0,5 0,5 0,5 2,5 �9 10 -2 Phosphatpuffer m/15 2,6 2,6 2,5 2,6 2,3 2,4 Wasser -- 0,5 0,3 0,3 - - - - MnSO 4 �9 4 H20 m/10 0,2 0,2 -- 0,2 0,2 0,2 5,0" 10 -8 NAD (0,8 mg/ml) a 0,3 0,3 0,3 -- 0,3 0,3 8,3 �9 10 -5 EnzymlSsung b 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Malons~ure m/2, p t t 6,0 . . . . 0,3 - - 3,86 �9 10 -2 D-Xpfels~ure m/2, pH 6,0 . . . . . 0,2 2,5 �9 10 -2

Schema der Ge]difi]i2llungen zur manometrischen Bestimmung der Malic-Enzym-Aktivi- tdit (Oxalessigsdiure-Decarboxylase) in Enzyml6sungen, Substrat OES �9

Temperatur 24~ als Gas: Luf t ; Flfissigkeitsvoluman 4 ml

Ansatz-Nr. 1 2 3 4 5 6 Molarit~t

OxalessigsKure m/4, pi t 4,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3,3 �9 10 -2 Enzyml6sung b 0,5 - - 0,5 0,5 0,5 - - Acetatpuffer loH 4,5 2,1 2,3 2,0 2,0 2,1 2,1 Phosphatpuffer m/15, p t I 4,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Wasser 0,2 0,5 - - - - 0,4 0,9 MnSOa �9 4 H20 m/50 0,2 0,2 0,2 0,2 - - - - 1,0 �9 1O -a L-~pfels/iure m/2, pH 4,5 -- - - 0,3 -- - - - - 3,86 �9 10 -2 ~Ialonsaure m/2, pH 4,5 - - - - - - 0,3 -- - - 3,86 �9 10 -2

a Folgende Abkfirzungen wurden verwendet: OES = Oxalessigs/~ure, MDH = 1Vfalat-Dehydrogenase, LDI-I = Laetat-Dehydrogenase, NAD = Nicothlamid-ade- nin-dinucleotid, L-_•S = L-_Apfals~ure.

b Der Proteingehalt der EnzymlSsungen ist in den Legenden dar graphisahen Darstellungen wiedergegeben.

Malic-Enzym-Aktivitiit L-J~pfelsgure-abbauender Bakterien 289

]~espriihen des Chroma~ogramms erscheint ein gelber Mannitfleck, R~-Wert 0,1, Empflndlichkeit der Methode 40 y.

Herstellung der Bakterien-EnzymlSsungen zur Messung der NIalic-Enzym-pI-I- Aktivit~tsmaxima und zur Testung der B{n ++- und NAD-Abh~ngigkeit der ~.-Apfel- siiure-Dissimilation some der N_n++-Abh~ngigkeit der Oxalessigs~ure-Decarboxy- lierung: Die Bakterien werden in je 600 ml Birnensaft/Hefcextrakt/Caseinpepton- N~hrlSsung pH 5,2 (J~Ro~L et al., 1956) gezfichtet und am 5. T~gc nach Feststel]en der Keimzahl yon der N~hrlSsm~g abzen~rffugiert, anschliegend zweimal mit phy- siologischer KochsalzlSsung gewaschen, mit wenig Alcoa-Pulver (Fa. Aluminium- Company of America, Pittsburgh Pa., USA) aufgenommen and mit MSrser und Pistill 30 mix lang scharf verrieben. Man versetzt zur Extraktion je 0,2 g feuchte Bakterienmasse mit 1,0 ml Phosphatpuffer pH 6,0 und l~Bt fiber Nacht im Kfihl- schrank bei ~- 4~ stehen. Am folgenden Tag wird yore Rfickstand bei 23000 g abzentrifugiert und die erhaltene klare EnzymlSsung 24 Std lang gegen m/150 Phosphatpuffer bei ~- 4~ dialysiert. Die Bestimmung des Proteingehaltes erfolgt nach W ~ B u ~ e u. C m ~ s w ~ (1942).

Bei Einsatz yon intaktcn B~kterien wird bei 4000 g abzentrifugiert, mit physio- logischer KochsalzlSsung gewaschen und in der fiir den Versuchsansa~z erforderli- ehen 3{enge physiologischer KoehsalzlSsung aufgenommen.

B. Morphologische und stoffweehselphysiologische Untersuchungen a) Morphologie und Niihrsto]/beclar/

Verschiedene aus Wein isolierte Apfels~ure abbauende Bakterienarten sol]ten zun~chst einer vergleichenden Untersuchung hinsichtlich ihrer Morphologie und ihres N~hrstoffbedarfs unterzogen werden. Neben zwei St~mmen aus Pf~lzer Wein, n~mlich Leuconostoc ,,r" und L. r var. alactosus (JEac~L e~ al., 1956) ~, sSanden zwei weitere Isolierungen aus dem Gebiet yon Bordeaux, QT 1--6 und La Louvi~re ~, sowie der Stature P]-I ~ aus der Schweiz zur Verffigung. Diesen mehr oder weniger unbekannten Sti~mmen wurde der L. plantarum 5 gegenfibergestel]t, der yon KooK,s et al. (1950) wegen seines VermSgens J~pfels~ure abzubauen in enzymchemischer Hinsicht eingehend untersucht worden ist.

Die Zfichtung der Bak te r i en erfolgte in B i rnensa f t /He feex t r ak t / Caseinpepton-Niihr lSsung bei p i t 5,2. Angabe n fiber die Ausmessungen der Zellen sowie fiber F o r m und Anfi~rbbarkeit s ind in Tab. 1 zusammen- gestel l t .

Bei den einzelnen A r t e n hande l t es sieh u m St / ibehen oder lgngliche Kokken , die bei Leucono~'toc ,,r ~ und P]-I zu K e t t e n zusammenge lager t sind. Der Einflul3 der N~hrlSsung auf die F o r m e n sowie das Verha l t en

In frfiheren Arbeiten mit ,,B. gracile r" und ,,B. gracile a" (Mi~L~R-TmYRea~ U. OST]~W~DWR, 1913) bezeiehnet. Die systematische Einordnung yon ,,B. gracile a" wurde yon P~X~CAVD u. Do~E~cq (1967) vorgenommen. ~ber Versuche, die ~pfelsgure abbauenden Bakterien des Weins in Bergey's Manual einzuordnen, berichtet RADL]~ (1958b; 1962; 1966).

8 Ffir die Uberlassung dieser Isolierungen sei Herrn Prof. Dr. E. P~,Y~Am), Bordeaux, bestens gedankt.

a Stamm P]-I stellte entgegenkommenderweise Herr Dr. H. LifT.x, W~denswfl/ Schweiz, zur Verfiigung.

Eine Abimpfung des Stammes L. plantarum (arablnosus 17--5) verdanke ich I-Iernl Dr. E. F. MSLL~R, Heidelberg.

290 P. FL~SC~:

in ~pfelsgure freiem Milieu werden in den spgteren Ausffihrungen be- handelt.

I m Rahmen der stoffwechselphysiologischen Untersuchungen wurde zungchst die Verwertbarkei t verschiedener organischer Sguren und Zucker gepriift. Da nach frtiheren Feststellungen das Wachs tum der Apfels/~ure-Milchsgurebakterien in synthetischen Nghrl6sungen bei Fehlen von verggrbaren Kohlenhydra ten unzureichend ist (J~CHWL et al., 1956), wurde als Grundnghrl6sung ein HefeexSrakt verwendet. Die in Tab .2 zusammengestel l ten Versuchsergebnisse wurden mit tIilfe papierchromatographischer Analysenmethoden (FLwscrr u. JW~CH]~L, 1955; Jv.~CH~L et al., 1956) ermittelt. Die Herstel lung der Hefeextrakt- Nghrl6sung und der Mannitnachweis sind im experimentellen Tell be- schrieben.

Tabelle 1. Morphologische Untersuchungen an A'p/elsiiure abbauenden Bakterien

Bakterienstamm Liinge ~ Breite ~ Form Gramfiirbung

Leuconostoc ,,r" 2,2 1,2--1,5 kokkoid pos. L. casei 1,0--3,0 0,7--1,5 Kurzst~bchen pos. QT 1--6 1,5 0,9 Kurzstabchen pos. La Louvi~re 2,2--3,0 1,2-- 1,5 kokkoid pos. P/-1 1,2-- 1,5 1,0-- 1,5 kokkoid pos. L. plantarum 3,0--8,0 0,9--1,5 Langst~bchen pos.

Tabelle 2. Niihrsto//bedar] und Mannitbildung bei ~p]els~iure abbauender~ Bakterlen Es bedeuten: - t - + + = kr~ftiger, +~- = mittlerer, + = schwacher, (+) = sehr

schwacher und -- = kein Umsatz

Zeuc.,,r" L. easel QT 1--6 P]-I La Louv. L. plant.

L-~pfelsgure -~ -1- +-1- -~ -t- + Citronensgure -- (+) (-t-) - ~ - ~ - -- ~- ha-{ - DL-Weinsiiure -- -- (~-) (~-) -- -[- + Fum~rs~ure (+) (-{-) -}--1- (-4-) -- -?-?-}- Glucose + + + + + + + + + + + ~'ructose + + + @-I- (+) ++-}- -}--5+ @ + Saccharose + + -- + (+) - 5+ + -5 Lactose -- -- -- (-f-) -}- @ Maltose + + -- + + + + + + + T,-Arabinose -- -- -- -4- (+) -5 Galaktose -]- -[- -? -}- ( + ) -~ -}- -? -}- -{- -}- 1Kamfitbildung + + -- -- + + -[- @ + --

Wie man der Tab.2 entnehmen kann, ist der Nghrstoffbedarf der untersuchten Stgmme reeht unterschiedlich. Nur ein Tefl bau t Citronen- sgure ab, vornehmlieh P] . I und L. plantarum, ebenso ist es bei Wein- sgure, wghrend Fumarsgure yon allen S tgmmen mit Ausnahme des

Malic-Enzym-Aktivit~t L-Apfels~ure-abbauender Bakterien 291

La Louvi~re assimiliert wird. Auff~llig is~ auch hier das verh~ltnismgBig geringe AbbauvermSgen gegenfiber L-s bei Fehlen von Kohlen- hydrat . Der Fructoseumsatz ist b d Leuconostoc ,,r", La Louvi&e und P]-I mit einer Mannitbildung verbunden, auch ~_rd aus Glucose Kohlen- dioxid gebfldet, weshalb man diese Stgmme als heterofermentativ ansehen kann.

Der Aminosgurestoffwechsel der Bakterien lieB sich in der komplet ten Hefeextrakt-NghrlSsung verfolgen. Der Gehalt der NghrlSsung an Amino- sguren wurde vor der Beimpfung papierchromatographiseh ermittelt und der Tab. 3 entspreehend erg/s Die Versuchsauswertung erfolgte nach 6 und nach 15 Tagen. Wie aus der Tabelle ersichtlich, verhalten sich die einzelnen St/~mme nicht einheitlich.

Tabelle 3. Aminos~iuresto]]wechset Ap]el.~gure abbauender Bakterieu Es bedeuten:-4-++ ~ kr~ftiger, + + = mittlerer, + = schwacher, ( + ) = sehr

schwacher und -- = kein Umsatz

Leuc.,,r" L. casei QT1--6 La Louv. P]-I L. plant.

DL-Alanin + (+) -~-1- + -1-++ + -{- DL-Serin 27 + + 27 + ~- -4- + GlykokoU + + + + + + + + DL-Threonin + + + + -4- + + T,(+)-Glutaminsgure + + + + + + + + + (+) + + L(--)-Prolin + -- + + -- + L(-}-)-Arginin + + + + + q - + + + (+) L(--)-Asparagins~ure + + + + + + + + + + + 7-Aminobutters~ure + (+) + + ? (+) DL-Valin + + @ -t- + + (-{-) -{- D(--)-Leucin + + + + + + + + DL-Lysin + -+- + + -- --

I n weiteren Arbeiten wurde versuoht, Metabolitcn der Citronensgure-, Weinsgure- und Fumarsgure-Dissimilation aufzufinden. Aus Citronen- sgure entsteht, wie papierchromatographiseh festgestellt wurde, bei QT 1--6, P]-I und L. plantarum als Nebenprodukt Milchsgure, bei L. plantarum aul~erdem Apfels/~ure, die naeh vSlligem Abbau der Citronen- sgure wieder assimiliert wird.

Aus Weins/s werden dureh L. plantarum aul3er Milchsgure kleine Mengen Apfelsgure gebildet, bei @T 1- -6 und P]-I konnte nur eine Spur Milchsgure gefaSt werden. Die Bfldung yon Apfelsguro dureh L. plan. tarum als Metabolit der Citronensgure- und Weinsgureassimilation kann ~ls ein ttinweis fiir m6gliche Reaktionsmechanismen gewertet werden. Bei P]-I ist keine Apfelsgure nachzuweisen.

Beim Abbau yon Fumarsgure ist bei allen Stgmmen J~pfelsgure als Metabolit zu fassen. Das lgl~t auf die Aktivitgt einer Fumarase schlieBen.

2l Arch. Mikrobiol., Bd. 60

292 P. FL~sc~:

KORKES et al. (1950) sowie BLAlVCHARD et al. (1950) haben bei L. arabino. sus 17--5 eine schwache Fumarase-Aktiviti~t nachgewiesen und ~pfel- si~ure als m6glichen Metabolitcn hingestcllt. Eine teilweise Anreieherung einer Fumarase aus einem J~pfels~ure-lVIilchs~urebakterium (Stature ,,L") ist V6ssn~ (1964) gelungen.

b) ~p/elsiiureabbau und Kohlenhydratassimilation Wie schon erws ist der Apfels~ureumsatz in einer Nhhrl6sung

bei Fehlen yon verg~rbarem Kohlenhydrat wesentlich schwi~cher als in einer kompletten NghrlSsung (siehe auch RADLE~, 1958 a; 1966; FL~SC~ u. J~CH]~L, 1960a). Dies wird auf die ungenfigende Vermehrung der Bakterien zurfickgefiihrt. Auf der anderen Seite kann bei heterofermenta- riven St~mmen die J~pfels~ureabbau-Aktivit~t ,,ruhender" Zellen yon Glucose gehemmt werden, ttomofermentative Sti~mme verhalten sich anders (RADLER, 1966). Auf die Glucosewirkung wird noch zuriickzu- kommen sein.

Hier ging es darum, den EinfluB yon Apfelsgure auf die Aktivit~t sich vermehrender Zellen gegenfiber Glucose oder Fructose festzustellen. Die Versuche wurden in Hefeextrakt-N~hrl6sung ptI 5,2 durchgeffihrt. Wie sich zeigte, geht mit Xpfelsi~ure bei allen St~mmen der Glucoseabbau anfi~nglich schneller vonstatten als ohne ~pfels~ure. Fehlt Apfels~ure im Medium, so wird bei l~ngerer Versuchsdauer yon L. plantarum und QT1--6 die Glucose langsamer abgebaut. Bei Leuconostoc ,,r" und La Louvi~re ist dies nicht festzustellen.

Untersucht man nun die ~pfels/iureabbau-Aktivit/it der Bakterien in Abh/ingigkeit von vorhandener Glucose, so stellt man fest, dab schon nach zweit/igiger Zfiehtungsdauer bei allen Arten die L-~pfels/ture v611ig verbraucht ist. Bei Fehlen yon Glucose sind nach diesem Zeitraum nur L. plantarum und QT 1 - 6 gegenfiber J~pfelss etwas aktiv. Nach 14--19 Tagen zeigen auch die fibrigen St~mme Aktivit~t. Es ist auffgllig, dab L. Tlantarum und QT 1--6, welche bei Fehlen yon )[pfels/~ure die Glucose zSgernder abbauen, bier die ~pfels/~ure starker angreffen. Wie es scheint, bcstehen zwischen der Zucker- und J~pfelsi~ure-Assimilation bei den untersuchten St/immen verschiedenartige Beziehungen.

Eine Wiederholung der Versuche wurde mit dem Leuconostoc-Stamm ,,r" unter Verwendung der L. arabinosus-Ng~hrl6sung naeh W~IO~T u. SK~QaS (1944) durehgeffihrt, der 5 7/1 Biotin, 1 ml pankreatinverdautes Casein sowie erforderlichenfalls Glucose und ~pfcls~ure zugesetzt worden waren. Die Impfbakterien waren in einer Dffco-N~hrl6sung (FLv, sc~I u. J~nCH~L, 1961) fiber neun Passagen yon ~pfels/iure desadaptiert worden. Zu den Versuchsergebnissen ist zu sagen, dab in der Dffeo-NghrlSsung eine deutliche Desadaptation der Bakterien yon J~pfels~ure stattgefun- den hatte. Die volle :4pfelsaure-Aktivit/it warde yon den Bakterien am

Malic-Enzym-Aktivitit u-~pfels~ure-abbauender Bak~erien 293

9. Ziiehtungstage wieder erreicht. Anf&nglich zeigten sic aber auch eine geringere Glueose-Aktivitit. Die tibrigen Ergebnisse deckten sich mit denen des Vorversuches.

In der kompletten Hefeextrakt-Nihrl6sung hat L. l)lantarum die hSchste ~pfels~ureabbau-Aktivit/~t, P]-I die geringste. Wird ~pfels/~ure dureh Citronens/~ure ersetzt, so erweisen sich die St~mme P]-I und L. plantarum als gute Citronensiure-Verwerter. Leuconostoc ,,r" und La Louvi~re bauen Citronens~ure nicht ab. Die Aktivitgt der ~brigen Sts ist nur sehwaeh ausgepr/~gt.

Liegen in der ttefeextrakt-NghrlSsung neben J~pfelss Glucose und Fructose vor, so wird yon Leuconostoc ,,r", La Louvi~re und P[-1 Fructose bevorzugt; sie bilden daraus Mannit. Q,T 1--6 und L. l~lantarum bevorzugen Glucose.

c) Zibhtung unter ver5nderten Milieubedingungen (A daptierungsversuche)

1. Adaptierung an die Faktoren der natiirlichen Substrate. ~pfels/iure- Milchsiurebakterien lassen sich in den verschiedenen Ns bei ptt-Werten zwischen 4,0 und 5,5 optimal zfichten, stellen aber beim Einbringen in ein natiirliches saures Substrat wie Wein sofort ihre Ver- mehrung ein (FL~sc~ u. JE~C~L, 1959, 1960@ Durch normales Be- impfen ist deshalb in den in Frage kommenden Weinen kein biologischer Siureabbau einzuleiten. Es wurde nun versucht, die Impfbakterien vor ihrer Verwendung an die als hemmend erkannten Faktoren der natfir- lichen Substrate zu adaptieren, an bestimmte (tt+)-Ioneu-Konzentratio- nen, an schwefHge S/~ure und an Alkohol. Dazu wurden die Bakterien in Ni~hrl6sungen oder Weinen stufenweise ungiinstigeren Bedingungen ausgesetzt. In Dffeo-N~hrlSsung beispielsweise butte sieh Leuconostoc ,,r" nach neun Passagen an einen pit-Weft yon 3,2 adaptiert. In Wein verlief die pIt-Adaptierung sehr viel schwieriger; der Ausgangs-ptt-Wert der zu diesem Zweck uuf pH 4,5 gestellten Weine wurde nicht erreicht.

Beimpfte man mit den in der Dffco-Nihrl6sung an pH 3,2 gew6hnten Bakterien Weine, deren pit-Weft bei 3,2 bzw. 3,4 lag, so kormte dennoch kein biologischer Si~ureabbau beobachtet werden.

Die Adaptierung der Bakterien an schweflige Si~ure mit Hilfe einer Versuehsreihe, deren Ans~tze steigende 5Iengen dieser S~ure enthielt, erwies sich als mSglich. Desgleichen konnten Bakterien erhalten werden, die sich bei einem Alkoholgehalt der N/~hrl6sung yon 10 Vol-~ mit kaum verminderter Aktivitiit vermehrten. Aber auch solchermal~en geziichtete Bakterien waren ftir die Beimpfung eines sauren Weins ungeeignet.

Eine M6glichkeit zur Ziichtung yon ~pfels&ure abbauenden Bakte- rien in Wein wurde bei frfiheren Arbeiten gefunden, als sieh heraus- stellte, dug eine Kultivierung dann gelingt, wenn man vor der Beimpfung

21"

294 P. FL~sc~:

des Weines dessen pIt-Wert genfigend hoeh einstellt, z. B. auf 5,0 oder 5,5 und spgter den Ansatz kontinuierlich oder diskontinuierlieh mit unvergndertem Wein versetzt (FLEsc~ u. JwRCHwL, 1959, 1960b). Dieses Verfahren l ~ t sich auch auf die fibrigen hier untersuchten ,,typisehen" ~pfelsgure-Milchsgurebakterien fibertragen, nieht aber auf P/-1 und L. plantarum.

Die so gezfiehteten Bakterien sind streng milieuspezifisch, wachsen normalerweise nicht in einem zweiten Wein, kSnnen aber in eine Ni~hr- lSsung zuriiekfiberimpft werden, in der sie bei gleichtiefer Lage des pH- Wertes weitergedeihen.

Der Vitamin- und Wuchsstoffbedarf der ~pfelsgureabbaubakterien (K. RrerwL, 1950; l ~ s c K u. JE~c~L, 1958; RADL~, 1958e) ist unter natfirliehen Bedingungen somit in Verbindung mit der (I-I+)-Ionen- Konzentration des Milieus zu betrachten. Ist die (I~+)-Ionen-Konzentra- tion optimal, so reichen auch in einem sonst ungiinstigen Substrat die vorhandenen Wuchsstoffe aus, d.h. adaptive Vorggnge dfirften begfinstigt ablaufen. Liegt die (H+)-Ionen-Konzentration weit yore optimalen Bereieh entfernt, so scheinen Adaptationen nicht mSglieh zu sein. Mit der Vergnderung des pH-Wertes hat man es jedenfalls in der Hand, ohne weitere Manipu]ationen die Bakterien in nicht optimalen, sauren Sub- straten zur Vermehrung und zum Abbau der fipfelsgure zu bringen.

2. Desadaptierung von Jp/elsiiure. In der weiteren Arbeit sollte ver- sucht werden, die bei den ~pfelsiiure-Milchsiiurebakterien ablaufenden adaptiven Vorggnge in bezug auf die Apfelsgure-Enzyme aufzukliiren. Eine zentrale Stellung nimmt dabei die Charakterisierung des Malic- Enzyms ein. Abet auch die ,,klassischen" Fermente der Apfelsgure- Dissimilation, Malat-Dehydrogenase, 0xalessigsgure-fl-Decarboxylase und Lactat-Dehydrogenase waren zu berficksichtigen (J]~RC~EL et al., 1956; JEzebeL u. SCEMID% 1958). Zuni~chst war es bei den zur Verffigung stehenden Stgmmen angebracht zu prfifen, ob sie sich yon Apfelsiiure desadaptieren lassen. Dazu zfichtete man sie in versehiedenen NghrlSsun- gen mit und ohne Zusatz yon Apfelsgure und zwar in der tIefeextrakt- 57ghrlSsung, der Dffco- und L. arabinosus-NghrlSsung.

Wie Keimzahlbestimmungen ergeben haben, ist die Wachstumsdichte der ,,typischen" Apfelsgureabbau-Bakterien in den ~pfelsgure freien l~i~hrlSsungen kleiner als in den mit ~pfelsiiure versetzten, besonders in der Dffco-NghrlSsung und der L. arabinosus-NghrlSsung. Bei Zfichtung ohne J~pfels/iure kommen aueh morphologisehe Vergnderungen an den Bakterien vor. Beispielsweise sind die Zellen yon La Louvi~re und P]-I in Itefeextrakt wesentlich grSBer, und der Bodensatz ist allenthalben dunkler gefgrbt. Es wurde auch festgestellt, dab das Waehstum der Bakterien in N/~hrlSsungen mit J~pfelsgure bei tieferen pH-Wer~en ein- setzt als ohne Apfelsgure ( R A D ~ , 1966).

Malic-Enzym-Aktivit~t r-.~,pfels~ure-abbauender Bakterien 295

In den folgenden Untersuchungen wurde zur Kultivierung der Bakterien normalerweise die Hefeextrakt-Ns benutzt, da bei ihr das Fehlen yon Apfels~ure den geringsten Einflul3 auf die Vermehrung hatte.

C. Fermentchemische Untersuchungen am Malic-Enzym der Bakterien a) Vergleichende Bestimmung der Malic-Enzym-Aktivit~t

Nachdem KORKES et al. (1950) den Nachweis erbracht batten, da6 L. arabinosus zum Abbau von ~pfelsaure ein adaptives Malic-Enzym synthetisiert, lag es nahe anzunehmen, dab auch andere ~pfelsaure abbauenden Bakterien dieses Enzym enthalten. Inzwischen ist das experimentell bestatigt worden, zuerst yon J~CHEL et al. (1956). Das Enzym katalysiert folgende Reaktionen:

Mn++ 000I-I--CHOH--CH2--C00H Jr NAD + \ \ COOH_GO_CH a i A- CO 2

4- NADH 4- H + (I) l~n ++

C00H~CO--CH2--C00H ~- -" C00H--C0--CI-I3 + C02 (II)

Der eindeutigste Nachweis fiir das Vorhandensein von Malic-Enzym- Aktivit~t in einer EnzymlSsung ist die Testung der Mn++-Ionen- und NAD-Abh~ngigkeit. Daneben kSnnen Hemmreaktionen wie solche mit

5

,so

C02

100 / / ' . "

10 20 30 40 50 60min Zeit

Abb.1. l~Ialic-Enzym-Aktivit&~ yon Leuconostoo ,,3rt"-Enzym]Osung gegenfiber L-~pfels~ure

Anfangs-pH-Werte 6,0; Proteingehalt je Manometer 130,8 ~. Kurve 1 : komplettes System Kurve 5: komplettes System mit Kurve 2: System ohne Apfels~ure Malons~ure Kurve 3. System ohne Mn++ Kurve 6: komplettes System mit •- Kurve 4: System ohne NAD + ~pfels~ure

250 i cmnq

i

200

296 P. FLESCm

Malons~ure oder D-f4pfels~ure zur weiteren Ch~rakterisierung herange- zogen werden. I m Unterschied zum Malic-Enzym ist Malat-Dehydro- genase nicht Mn++-Ionen abh~ngig; auch hemmen Malons~ure, wie noch zu beschreiben sein wird und D-J~pfels/iure die MDH-Aktiviti i t nicht. Die Prfifung auf adaptives und konstitutives Verhalten dieser Enzyme kann ein weiteres Unterseheidungsmerkmal liefern.

30o c m m

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cm: I 60

C02

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20

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. / / S ~ " "

200

C02

100

20 40 min 60 0 Zeit

Abb. 2 Abb.2. Malie-Enzym-Aktivit~t (OES-Decarboxylase) yon Leuconostoc ,,3rl"-

EnzymlSsung gegeniiber OES Anfangs- und End-pH-Werte 4,5; Proteingehalt je Manometer 163 y.

Kurve 1 : komplettes System Kurve 4: kompl. System + Malon- Kurve 3 : kompl. System + L-_&pfel- s~ure

s~ure Kurve 5: System ohne Mn ++

Abb. 3. Malie-Enzym-Aktivit~t yon L. plantarum-EnzymlSsung gegeniiber •-Apfel- s~ure

Anfangs-pH-Werte 6,0; Proteingeha]t je Manometer 98,5 y. Kurve 1 : komplettes System Kurve 4: System ohne NAD+ Kurve 2: System ohne .~pfelsgure Kurve 5: komplettes System mit Kurve 3: System ohne Mn ++ Malons~ure

J ' .b-

. / . j

�9 / J

20 40 rnin 60 Zeit

Abb. 3

Die in Birnensaft-N~hrlSsung pI-I 5,2 geztichteten Bakterien wurden, wie im experimentellen Tefl angegeben ist, zu einer EnzymlSsung auf- gearbeitet mad diese zur Entfernung yon Metallionen und NAD gegen verdiinnten Phosphatpuffer dialysiert. Sodann wurde in bekannter

Malic-Enzym-Aktivit~it L-Apfelsgure-abbauender Bakterien 297

Weise und zu verschiedenen Bedingungen im Warburg-Gerat die Aktivi- ta t der EnzymlSsung gegeniiber L-Xpfels&ure bei pH 6,0 und Oxalessig- s/~ure bei ptI 4,5 ermittelt. Die Schemata der Gefi~Bftillungen sind eben- falls im experimentellen Tefl angegeben. Bei der OES-Decarboxylierung wurde mit Manometer 2 die chemische Decarboxylierung der OES in Anwesenheit von Mn++-Ionen und mit Manometer 6 dieselbe ohne Mn ++- Ionen gemessen. Auf diese Weise konnte bei den Messungen das durch

200

cmm ' I

0 10 20 30 40 50 60min Zeit

Abb.4. Malie-Enzym-Aktiviti~t yon L. plantarum-Enzym]6sung gegeniiber OES- Anfangs-pH-Werte 4,5; Proteingehalt je Manometer 98,5 ~.

Kurve 1 : komplettes System Xurve 4: kompl. System 4- Malon- Kurve 3: kompl. System -t- T,-Xpfel- saure

s~ure Kurve 5: System ohne Mn++ End-pH-Werte: 1: 4,7; 3: 4,7; 4: 4,7; 5: 4,5.

spontane Decarboxylierung aus OES entstandene Kohlendioxid elimi- niert werden. Bei der Xpfels~ture-Dissimilation wurde am Versuehsende das retinierte COs, welches bei pH 6 merkliche Betrage annimmt, durch Zukippen von 2 n Schwefels~ure ausgetrieben. Die Abb. 1--4 geben die Messungen mit dem Leuconostoc-Stamm ,,3r1" 6 und L. plantarum wieder.

Wie aus den Abbildungen zu entnehmen ist und wie auch die iibrigen Messungen ergeben haben, besteht eine ausgepr/igte Mn++-Ionen- und NAD-Abhgngigkeit der L-Xpfels~iure-Dissimilation. Mit Malons/~ure und auch mit D-Xpfelsaure wird eine Hemmung verursacht. Die OES- Deearboxylierung zeigt sich in noch hSherem Mal3e abhangig yon Mn++. Ionen. Auch die Hemmung mit Malonsaure ist ausgepr&gter, wohin- gegen L-J~pfels/ture weniger stark hemmt als Malons&ure.

Beim Stamm Leuconostoc ,,3r1" handelt es sich um eine durch Gefriertrock- hung konservierte Charge von Leuconostos ,,r".

298 P. FLESC~:

Alle diese Befunde stehen in Ubereinstimmung mit Angaben yon KORKES et al. 1950 fiber das Malic-Enzym aus L. arabinosus 17--5. Nieht in ~bereinstimmung steht die Beobachtung, dab bestimmte Bakterien- st~mme und zwar die heterofermantativen Arten Leuconostoc , , 3 h " , La Louvi~re und P/-1 fiber eine deutlieh hShere Aktivitiit gegenfiber L-J~pfels/iure als gegenfiber 0ES verffigen (Tab. 4). Ein ~hnlieher Befund wurde schon yon PILZ (1958) mit elektrophoresierten Auszfigen yon ,,B. gracile" erhalten. Bei dieser ,,iibersehiissigen" Aktivit~t gegenfiber L-J~pfels~ure kann es sich praktisch nicht um MDtI-Aktivit~t handeln, da dieses Enzym in zellfreier Form nur im alkalischen Milieu eine me~- bare Aktivit~t aufweist, worauf noeh zurfickzukommen sein wird. Bei den homofermentativen Arten ist die aus L-J~pfelsi~ure und OES ent- wiekelte CO~-Menge nieh~ so unterschiedlieh; der Quotient C02(o~s)/ COe(~4s) liegt in der NiChe yon 1.

Tabelle4. z-~p/elsgure-Disslmilationsverm6gen und OES-Decarboxylierungsver- mSgen yon ~p/elsdure abbauenden Bakterien

L-~pfels~ure Oxalessigs~iure Stamm C02"Entw" OES

Protein Protein L-J~S nach rain cram CO 2 (y) cmm CO s (?)

L. plant. 20 93 98,5 74 98,5 0,80 Z. easel 15 106 34,5 144 43,1 1,09

(133) (43,1) QT 1--6 15 112 60,8 101 76,0 0,72

(140) (76,0) Leuc. ,,3r1" 20 78 130,8 41 163,0 0,42

(97) (163,0) La 15ouv. 30 40 60,4 33 75,5 0,66

(50) (75,5) 1)/-1 30 88 64,8 39 64,8 0,44

Die der Tab.4 zugrunde gelegten C02-Werte sind den Messungen 15--30 rain naeh Versuchsbeginn am linearen Kurvenstfick entnommen. Das bei liingerer Versuchszeit zu berfieksiehtigende retinierte CO 2 kann in diesem Bereieh vernachliissigt werden.

Aufgrund der Untersuchungen yon SIMON (1964) war anzunehmen, dal~ es Apfels~ure abbauende Bakterien gibt, deren Malie-Enzyme keine OES-deearboxylierende Wirkung haben. Ffir diejenigen St~mme, die neben Malie-Enzym noeh eine MDH-Akbivit~t enthalten, ist eine freie 0ES-Deearboxylase zu fordern. Aueh in tierisehen Geweben wurden Malie-Enzyme identifiziert, die nur eine geringe oder keine Aktivit~b gegenfiber OES aufweisen (SAz u. HUBBA~]), 1957 ; UT~v~ u. K V ~ A S H I , 1954).

M~lic-Enzym-Aktivit~tt L-Apfels~ure-abbauender B~kterien 299

b) Bestimmung der pH-A ktivitiitsmaxima gegeni~ber z- A p] elsiiure und Oxalessigsiiure

Zur weiteren Identifizierung des Malie-Enzyms wurden die pH- Aktivit~tsmaxima bestimmt. Kom~Es et al. (1950) fanden mit Enzym- zubereitungen aus L. arabinosus 17--5 fiir dis oxydative Deearboxy- lierung yon L-~pfelss das Maximum bei pH 6,0 und ffir die Decarboxy- lierung yon OES bei ptI 4,5. Ffir den eigenen L. plantarum-Stamm wur- den folgende Werte ermittelt :

L-d~pfels~ure-Dissimilation pH 5,9 -- 6,1, Oxalessigs~iure-Deearboxylierung pH 4,5--4,6.

Vergleiehsweise wurde mit Leuconostoc ,,r"-Enzyml6sung gefunden:

L-Apfels~ure-Dissimilation pi t 5,9--6,3, Oxalessigs/~ure-Deearboxylierung pi t 4,4--4,6.

Wie zu erkennen ist, stimmen die Befunde mit den Angaben von KoRK~s et al. gut iiberein.

Im folgenden sollte festgestellt werden, bei welehen pH-Werten der maximale Umsatz der intakten (ruhenden) Bakterien gegenfiber L-24pfel- s/~ure und OES liegt. Diese Fragestellung ist aueh ffir teehnologisehe Belange yon Interesse. Das mehr oder weniger groBe ]~pfelss lationsvermSgen der einzelnen Arten im natfirliehen, sauren Milieu kSnnte dureh eine untersehiedliehe Lage der pIt-Aktivit~tsmaxima erM/~rt werden. Es interessierte aueh festzustellen, in welehem MaBe die intakten Zellen unempfindlieher gegenfiber der (H+)-Ionen-Konzentra- tion der Umgebung sind als die freien Enzyme.

Aueh von BLANCttARD et al. (1950) sind intakte Zellen vom L. plan- tarum im Zustand der Ruhe (resting state) zur Bestimmung der Malie- Enzym-Aktivitgt eingesetzt worden. Indessen gibt es bei intakten Zellen keine Gewghr daffir, dab nicht aueh MDtt-Aktivits miterfagt wird, falls sie in den Bakterien enthalten ist und L-~xpfels~ure als Substrat geboten wird. Vergleiehende Messungen der aus L-J4pfelsgure frei werden- den C02-Menge, die einerseits mit einer bestimmten Menge intakter Bakterien bei p t t 4,0, andererseits mit der aus einer gleiehen Menge her- gestellten EnzymlSsung bei pH 6,0 durehgeffihrt worden sind, ergaben fiir die Messung mit intakten Zellen etwa zehnfaeh hShere CO~-Werte. Dieser Befund wnrde auch bei den Sts gemaeht, die keine MDtI- Aktivitgt enthalten wie L. plantarum. Man ist daher bereehtigt, die mit intakten Bakterien im pH-Bereieh yon 4,0 enthaltene Aktivitgt gegen~ fiber L-Apfels/~ure im wesentliehen als Malie-Enzym-Aktivit/tt aufzu- fassen. Neuere Untersuehungen haben diese Annahme best~tigt (FLEsc~ u. ItOLBACH, 1967).

300 P. FLEsc~:

Die Versuchsergebnisse in T a b . 5 zeigen, dal~ die p H - M a x i m a bei V e r w e n d u n g i n t a k t e r B a k t e r i e n wesen t l i ch n iedr iger l iegen als bei E n z y m l 6 s u n g . Dar / ibe r h i n a u s e r k e n n t m a n , dal~ sich die M a x i m a ffir die

O E S - D e c a r b o x y l i e r u n g bei d e n e inze lnen B a k t e r i e n s t ~ m m e n n i c h t sehr un t e r sche iden . Bei der J~pfe lsaure-Diss imi la t ion g ib t es zwei S t / imme,

Tabelle 5. pH-Werte der Geschwindigkeitsmaxima yon intakten ffp/elsiiure-Milch- siiurebakterien und yon L. plantarum

Stamm Reaktion I (L-Apfels~ure) Reaktion I I (Oxalessigs~ure)

Leuc. ,,r" 3,8 3,5 -- 3,6 L. casei 3,8-- 3,9 3,5 QT 1--6 4,0--4,1 3,5--3,6 La Louvi~re 3,9--4,1 3,7--3,8 P/.1 4,8--5,0 3,4--3,6 JL. plantarum 4,2--4,4 3,6

die sich m i t r e l a t i v h o h e n W e r t e n deu t l i ch h e r a u s h e b e n : L. plantarum

u n d P/-1. Beide St/frame bes i t zen wie schon angef f ihr t gegenf iber Citro- nens / iure eine verhi~ltnism/igig hohe Ak t iv i t / i t u n d ]assen sich n i c h t a n natf ir] iche, saure S u b s t r a t e adap t i e ren .

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Priv.-Dozent Dr. P. FLESC~ Institut for Weinforschung der Universitgt 6500 Mainz