TUGAS RESPONSI

Variasi Karakteristik Morfometri Stroma Peritumoral pada Subtipe Karsinoma Sel Basal

Oleh :Mutiara Rizky AnandaG99141070

Pembimbing :Prasetyadi Mawardi, dr.,SpKK

KEPANITERAAN KLINIK ILMU KESEHATAN KULIT DAN KELAMINFAKULTAS KEDOKTERAN UNS / RSUD DR. MOEWARDISURAKARTA2015Variasi Karakteristik Morfometri Stroma Peritumoral pada Subtipe Karsinoma Sel Basal

Kyle Lesack dan Christopher Naugler

AbstrakLatar Belakang: Peran stroma peritumoral dalam pertumbuhan tumor saat ini masih kurang dipahami. Penelitian ini menyajikan variasi karakteristik morfometri dari subtipe karsinoma sel basal dan kaitan nya dengan stroma peritumoral.

Metode: Sembilan puluh delapan slide histologi karsinoma sel basal dikategorikan sebagai subtipe infiltratif, nodular, atau subtipe superfisial, kemudian dianalisis menggunakan kombinasi teknik manual dan teknik analisis menggunakan aplikasi komputer. Karakteristik morfometri sarang tumor dan stroma peritumoral diukur, dan timbulnya reaksi imun dan gambaran elastosis juga dicatat.

Hasil: Rasio tumor-stroma berbeda antara satu subtipe tumor dengan subtipe lain. Elastosis ditemukan dalam porsi yang besar pada tumor infiltratif.

Kesimpulan: Terdapat perbedaan kuantitatif stroma peritumoral pada tiap subtipe karsinoma sel basal. Penelitian lebih lanjut yang mengeksplorasi hubungan antara perbedaan-perbedaan morfometri dan variasi biokimia pada stroma peritumoral mungkin dapat meningkatkan pemahaman kita tentang perkembangan karsinoma secara biologis.

Latar BelakangKarsinoma (kanker yang berasal dari sel epitel) disertai dengan stroma peritumoral khusus yang memainkan peran penting, masih kurang dipahami dalam pertumbuhan dan metastasis tumor [1-4]. Stroma peritumoral yang sebagian besar terdiri dari fibroblas yang teraktivasi, sel-sel inflamasi serta pembuluh darah terlibat dalam mekanisme timbal balik yang kompleks pada proses perkembangan tumor. Interaksi tersebut diperkirakan dimediasi terutama oleh faktor parakrin terlarut [1-17].Modifikasi pada stroma peritumoral berupa perubahan sekresi protein matriks ekstraselular dan faktor pertumbuhan oleh fibroblas. Dan perubahan yang terpenting adalah ekspresi matriks metaloproteinase (MMP) oleh stroma, yang kemungkinan berefek luas pada pertumbuhan tumor, angiogenesis dan metastasis[17]. Sejumlah derivat faktor fibroblas terlarut telah terbukti menginduksi inisiasi dan perkembangan karsinoma, dimana faktor yang berperan paling menonjol adalah Wnt-1, HGF dan TGF-b[18]. Ekspresi dari gen yang mengisi stroma dan sel tumor pada model penelitian berupa manusia yang telah diinduksi dengan neoplasia menunjukkan bahwa pada saat pertumbuhan tumor jaringan epidermis merupakan jaringan pertama yang menunjukkan peningkatan ekspresi gen yang memediasi terjadinya biosintesis seluler, kemudian diikuti oleh peningkatan ekspresi gen yang mempromosikan proliferasi dan terakhir peningkatan ekspresi gen yang terlibat dalam renovasi matriks ekstraseluler dan peningkatan motilitas sel. Sebaliknya, ekspresi gen oleh stroma fibroblas menunjukkan pola yang berbeda dengan peningkatan awal ekspresi gen yang terlibat dalam angiogenesis [13].Selain faktor-faktor parakrin yang disekresikan oleh fibroblast, sel-sel inflamasi dalam stroma peritumoral juga mensekresi faktor pertumbuhan, serta spesies oksigen reaktif yang kemudian dapat berefek lebih lanjut pada pertumbuhan kanker [19]. Selain itu, interaksi yang kompleks yang melibatkan fibroblas teraktivasi dan tumor-associated macrophage juga dapat mengakibatkan terjadinya proses angiogenesis [10].Sebagai model penelitian, karsinoma sel basal (karsinoma sel basal) memiliki keunikan dan mempunyai kesempatan yang baik untuk digunakan sebagai model penelitian yang mempelajari interaksi antara sel epitel tumor dan stromanya. Selain merupakan tumor ganas yang paling banyak ditemukan, setidaknya di Kaukasia [20], struktur histologis karsinoma sel basal yang disertai dengan stroma peritumoral yang tampak jelas tentu menjadi kentungan tersendiri dalam penelitian ini. Peran stroma peritumoral dalam pertumbuhan karsinoma sel basal sangat menarik untuk diteliti karena beberapa studi telah menemukan bahwa karsinoma sel basal merupakan tumor yang pertumbuhannya bergantung pada stroma dan dibatasi oleh respon imun sel pejamu. Contohnya, transplantasi karsinoma sel basal dari manusia ke tikus hanya berhasil dilakukan pada sel T,sel B, dan sel NK pada tikus yang cacat [21-23]. Selain itu, berbagai morfologi subitipe pada tumor ini memberikan kesempatan untuk penelitian mengenai asosiasi antara variasi stroma dan struktur arsitektur tumor. Hasil penelitian sebelumnya tentang stroma peritumoral karsinoma sel basal telah menemukan beberapa kegunaan kualitatif jaringan stroma tersebut. Penelitian Humphreys et al. menunjukkan bahwa peningkatan jumlah sel mast dan dendrosit kulit yang mengekspresikan CD34 dan GP1b berhubungan dengan ukuran sarang tumor karsinoma sel basal, meskipun pada penelitian ini tidak dilakukan uji perbandingan pada tiap subtipe karsinoma sel basal [24]. Selain itu penelitian lain yang menggunakan pewarnaan imunohistokimia juga menyatakan bahwa pada tiga struktur histologis yang paling umum dari pertumbuhan karsinoma sel basal (nodular, infiltratif dan superfisial) terdapat perbedaan yang mencolok dalam ekspresi molekul glikoprotein CD44, dan yang memiliki ekspresi terbesar dari CD44 isoform adalah karsinoma sel basal subtipe infiltratif [25]. Dingemans et al. mengungkapkan temuan ini menunjukkan bahwa CD44 mungkin memainkan peran penting dalam pertumbuhan karsinoma sel basal secara biologis dan sekaligus menentukan pola pertumbuhan histologis dan derajat invasi tumor. Penelitian yang sama juga melaporkan bahwa kandungan positif -aktin otot halus (sebagai penanda diferensiasi myofibroblastik) cenderung tinggi pada tumor infiltratif [22]. Dari beberapa penelitian tersebut dapat disimpulkan bahwa mungkin terdapat perbedaan kualitatif dalam stroma peritumoral karsinoma sel basal yang berhubungan dengan variasi pola pertumbuhan histologis tumor.Beberapa karakteristik morfometrik karsinoma sel basal selain faktor biokimia juga telah diteliti. Studi yang dilakukan oleh Dixon et al. [26] dan Jacobs et al. [24] meneliti hubungan antara morfologi sarang tumor dengan agresivitas tumor. Hasil penelitian menyatakan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara sarang non-sirkular, derajat palisading perifer yang lebih kecil, dan agresivitas tumor. Dixon et al. [26] dan Jacobs et al. [27] juga menemukan bahwa stroma fibroblas berhubungan dengan tumor yang kurang agresif, sedangkan proses hialinisasi stroma muncul pada tumor yang lebih agresif. Beberapa studi juga telah mengeksplorasi hubungan antara morfometri inti sel dengan agresivitas tumor [28,29]. De Rosa et al. [28] menyatakan bahwa usaha untuk memperluas dan memperbesar keliling inti sel dapat menghasilkan peningkatan agresivitas sel tumor; Namun penelitian Appel et al. memiliki hasil yang berbeda dengan penelitian tersebut [29]. Dalam penelitiannya de Rosa et al. juga mengamati peningkatan insiden hialinisasi dalam stroma tumor yang agresif [28]. Menimbang bahwa penelitian sebelumnya banyak berfokus terutama pada sarang tumor, penyelidikan lebih lanjut terhadap hubungan antara stroma peritumoral dan tumor morfometri mungkin menarik untuk diteliti. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji penggunaan teknik analisis pencitraan canggih dalam mencari pola dan hubungan kuantitatif antara stroma peritumoral pada masing-masing subtype karsinoma sel basal.

MetodeSeleksi Kasus / Akuisisi Gambar Kasus dipilih dari kumpulan dokumen kasus klinis rutin penulis senior. 98 slide patri hematoxylin dan eosin didigitalisasi menggunakan Aperio CS-O slide scanner dengan pembesaran 80 kali, dan bagian yang mengandung karsinoma sel basal disimpan sebagai gambar JPEG (1072 902 piksel). Untuk menghindari kemungkinan efek perancu berupa perubahan lokasi biopsi dan penyembuhan luka pada penilaian morfologi subtipe tumor [30,31], kami eksklusikan setiap kasus yang sebelumnya sudah pernah menjalani biopsi. Kami tidak mengklasifikasikan stroma berdasar subtipenya dikarenakan tidak adanya skema klasifikasi stroma yang diakui secara global. Protokol penelitian ditinjau oleh Komite Layanan Laboratorium Penelitian Calgary dan dianggap merupakan proyek pengembangan metode yang tidak memerlukan persetujuan etika lanjut (CLS Kode Studi RS-11-504).Analisis PencitraanHasil cetak dari masing-masing 98 gambar karsinoma sel basal awalnya dievaluasi secara manual. Dalam setiap karsinoma sel basal ditentukan masing-masing lima gambar regions of interest (ROI) neoplastik, kemudian dilanjutkan dengan mengukur diameter dan jari-jari stroma dan tumor yang terdapat pada gambar. ROI dipilih berdasarkan kriteria berikut: (i) daerah harus bebas dari artefak teknis seperti variasi dalam pewarnaan dan pemotongan slide dan tidak harus menyertakan perbatasan sampel jaringan atau gambar, dan (ii) ROI harus mencakup hanya salah satu subtipe dari tumor (bukan transisi atau gabungan tumor). Bila mungkin setiap ROI dipilih dari sarang tumor yang terpisah. Beberapa ROI boleh diidentifikasi di sarang tumor yang sama hanya ketika jumlah total sarang tumor adalah kurang dari lima. Jari-jari dan diameter stroma dan tumor diukur langsung dari gambar yang dicetak untuk setiap ROI. Keterbatasan pendekatan ini muncul ketika terdapat beberapa sarang tumor yang berhimpitan satu sama lain dan ruang diantara sarang-sarang tersebut seluruhnya terdiri dari stroma peritumoural. Apabila hal tersebut terjadi, maka ditentukan bahwa stroma yang terdapat diantara dua sarang terdekat didefinisikan sebagai stroma kedua sarang tersebut. Dan yang terakhir, munculnya respon inflamasi dan gambaran elastosis dicatat, dan subtipe tumor untuk setiap slide dikategorikan dalam tiga subtipe: nodular, superfisial, atau infiltratif.Selain evaluasi manual, open source digital imaging dan perangkat lunak analisis ImageJ (versi 1.44p) digunakan untuk mengukur morfologi sarang tumor di setiap slide. Kebulatan bentuk sarang tumor diukur dari sirkularitas masing-masing sarang tumor dalam ROI. Pengukuran sirkularitas dalam ImageJ dihitung menggunakan rumus berikut:

Nilai 1 dalam sirkularitas menunjukkan bentuk sebuah lingkaran yang sempurna, sementara bentuk lingkaran yang lebih memanjang menghasilkan nilai sirkularitas yang lebih rendah [32]. Untuk menghindari nilai pengukuran sirkularitas yang rendah, sarang tumor yang terpotong secara luas atau terpotong di tepi dieksklusikan dari analisis ini.Klasifikasi Visual TumorGambar diklasifikasikan ke dalam subtipe tumor menurut definisi yang diberikan oleh Crowson [33]. 98 gambar yang diikutkan dalam penelitian terdiri dari 23 karsinoma sel basal superfisial, 60 karsinoma sel basal nodular dan 15 karsinoma sel basal infiltratif. Apabila ditemukan elastosis solar dan respon imun kronis yang bersamaan dalam satu tempat, maka kedua gambaran tersebut dianggap tidak ada. Apabila terdapat gambaran elastosis dan respon imun yang rendah, maka gambaran tersebut dianggap negatif, dan apabila ditemukan gambaran elastosis dan respon imun yang sedang dan kuat maka gambar tersebut dianggap positif.Analisis StatistikAnalisis data dilakukan dengan menggunakan IBM SPSS Statistics v19. Box plot dari statistik morfometrik dan bar plot dari statistik kategoris dibuat menggunakan R v2.13.0. Uji yang dilakukan adalah uji non-parametrik, sesuai dengan hasil perhitungan awal yang menunjukkan distribusi data yang abnormal. Analisis varians dilakukan dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis, dan uji Mann-Whitney dilakukan apabila terdapat perbedaan signifikan antar kelompok yang ditemukan. Variabel kategori dianalisis menggunakan uji Chi-square. Interaksi efek antara variabel kontinyu dan kategori diuji menggunakan regresi logistik biner.

HasilContoh subtipe karsinoma sel basal yang digunakan dalam penelitian ini diilustrasikan pada Gambar 1. Secara statistik terdapat perbedaan signifikan angka median jari-jari tumor (p = 0,005), diameter stroma (p = 0,008), dan rasio stroma-tumor (p = 0,000006) pada masing-masing subtipe tumor. Uji perbandingan post hoc berpasangan menunjukkan terdapat perbedaan angka median jari-jari tumor (p = 0,0009) dan diameter stroma (p = 0,003) antara subtipe infiltratif dengan nodular. Perhitungan rasio stroma-tumor pada tiap subtipe juga diperoleh hasil yang berbeda (infiltratif-nodular p = 0,00006, infiltratif-superfisial p = 0,006, nodular-superfisial p = 0,005). Maka terdapat bukti statistik yang cukup untuk menyimpulkan bahwa terdapat variasi sirkularitas pada masing-masing subtipe tumor (nilai p = 0,3). Hasil uji perbandingan morfometri diringkas dalam Gambar 1 dan Tabel 1.Timbulnya gambaran elastosis berkorelasi dengan subtipe tumor (p = 0,033), pada delapan dari lima belas (53%) infiltratif, dua belas dari enam puluh (20%) nodular, dan enam dari dua puluh tiga (26%) tumor superfisial ditemukan gambaran elastosis. Sedangkan respon imun pada tiap subtipe tumor tidak ditemukan perbedaan yang signifikan (p = 0,1). Statistik kategoris diringkas dalam Tabel 2. Kemungkinan hubungan antara elastosis dermal (signifikan di analisis univariat) dan variabel kontinu dieksplorasi menggunakan regresi logistik biner. Secara statistik tidak ada asosiasi signifikan yang ditemukan dengan pendekatan ini (analisis tidak ditampilkan).Gambar 1. Contoh subtype karsinoma sel basal yang dipakai dalam penelitian ini; (a) nodular, (b) superfisial, (c) infiltratif

Rerata rasio tumor-stromaRerata diameter stroma (micron)Rata rata jari jari tumor (micron)

DiskusiPenelitian ini menilai hubungan morfometrik antara subtipe karsinoma sel basal dan stroma peritumoralnya. Teknik manual dan teknik analisis dengan aplikasi komputer digunakan untuk menghitung ukuran dan bentuk statistik pada karsinoma sel basal subtipe infiltratif, nodular, dan superfisial. Munculnya respon inflamasi dan elastosis juga dicatat pada setiap subtipe.Perbedaan signifikan ditemukan pada angka median jari-jari dan diameter stroma tumor subtipe infiltratif dan subtipe nodular. Subtipe infiltratif dikaitkan dengan stroma yang tebal, jari-jari tumor yang lebih kecil, dengan rasio stroma-tumor yang kecil. Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya bahwa perbedaan biokimia pada subtipe infiltratif dibandingkan subtipe lain karsinoma sel basal mungkin disertai dengan perubahan kuantitatif pada stroma peritumoralnya.Temuan penting lain adalah gambaran elastosis secara signifikan muncul dalam proporsi yang lebih tinggi pada subtipe infiltratif. Penjelasan yang mungkin dapat digunakan sebagai alasan temuan ini adalah adanya kerusakan kulit akibat paparan sinar matahari yang luas berkontribusi pada perubahan fenotipe pada karsinoma sel basal, dimana predisposisinya cenderung mengalami peningkatan pada subtipe infiltratif. Mekanisme hubungan tersebut masih berupa spekulasi yang belum tentu kebenarannya, tetapi mungkin terdapat perbedaan karakteristik difusi atau ekspresi faktor parakrin pada kulit yang rusak akibat paparan sinar matahari. Argumen serupa dapat digunakan sebagai alasan timbulnya repon imunitas kronis terkait dengan karsinoma sel basal infiltratif: limfosit yang teraktivasi dapat mengubah beberapa karakteristik tumor atau limfosit mungkin mengeluarkan faktor yang mempengaruhi fenotipe karsinoma sel basal.Di luar dugaan, hasil penelitian ini tidak menemukan pengaruh yang signifikan dari sirkularitas sarang tumor terhadap subtipe tumor. Hal ini mungkin dikarenakan oleh adanya sarang tumor nodular dalam beberapa slide subtipe infiltratif, sehingga terdapat rata-rata yang lebih tinggi dan lebih bervariasi pada pengukuran sirkularitas sarang tumor subtipe infiltratif. Atau adanya varians dari pengukuran sirkularitas antara sarang tumor pada slide yang sama dapat memberikan hasil yang berbeda pada satu subtipe tumor. Selain itu, penggunaan bentuk metrik yang berbeda mungkin dapat memberikan hasil yang sangat berbeda pada satu gambaran sarang tumor pada satu morfologi. Pertanyaan-pertanyaan ini dapat dieksplorasi dalam penelitian selanjutnya.Penelitian ini memiliki beberapa keunikan. Pertama, sebuah penekanan yang lebih besar ditempatkan pada hubungan dari morfometri tumor dan stromanya. Banyak penelitian sebelumnya yang telah berfokus terutama pada tumor itu sendiri dan justru mengabaikan faktor penting dalam pertumbuhan tumor. Kelebihan lain dari penelitian ini adalah penggunaan metode statistik yang dihitung menggunakan open-source pencitraan digital dan program analisis digital. Hal ini selanjutnya dapat menjadi acuan penelitian selanjutnya, misalnya penggunaan ImageJ yang tersedia secara bebas dan mampu memberikan pengukuran sirkularitas dengan standar yang baik. Manfaat lebih lanjut dari menggunakan perangkat lunak untuk mengukur bentuk sarang tumor adalah hilangnya subjektivitas yang dihasilkan dari pengelompokkan bentuk tumor secara kualitatif. Penelitian lebih lanjut dapat memperbaiki penelitian ini dalam beberapa cara. Salah satu kekurangan pada penelitian ini adalah tidak disertakannya subtipe karsinoma sel basal yang jarang ditemukan. Juga seperti yang telah disebutkan sebelumnya, yang selalu terjadi dalam studi observasional adalah fakta bahwa studi ini tidak mungkin digunakan sebagai acuan untuk menentukan apakah perbedaan stroma mempengaruhi arsitektur tumor atau arsitektur itu sendiri yang menyebabkan terjadinya perbedaan stroma. Keterbatasan lain dari penelitian ini menyangkut penerapan temuan kami untuk keganasan lainnya. Pada dasarnya karsinoma sel basal berbeda dari berbagai kanker lainnya, dimana sel pada karsinoma sel basal menunjukkan potensi metastasis yang terbatas dan jarang ditemukannya fitur umum yang digunakan sebagai penanda untuk keganasan lainnya seperti aneuploidi [34].Penelitian sebelumnya yang melakukan penilaian morfometri pada karsinoma sel basal telah berfokus pada hubungan karakteristik tumor dan agresivitasnya. Sedangkan penelitian ini telah difokuskan pada hal yang lebih jauh lagi, yaitu hubungan antara tumor dengan stromanya. Akibatnya, tidak mungkin untuk langsung membandingkan temuan yang disajikan pada penelitian ini dengan temuan-temuan pada studi morfometri karsinoma sel basal sebelumnya. Disamping itu, penelitian sebelumnya telah menemukan bahwa tumor agresif memiliki karakteristik morfometrik yang berbeda daripada tumor non-agresif. Hal ini mungkin berkaitan dengan morfologi yang berbeda seperti yang ditemukan pada subtipe yang berbeda dalam penelitian ini. Hasil yang diperoleh pada penelitian ini juga sejalan dengan temuan perbedaan biokimia yang dilaporkan sebelumnya. Sebagaimana yang telah dibahas, Humphreys et al. [24] menyatakan bahwa ekspresi glikoprotein CD44 berbeda antara tumor subtipe infiltratif, nodular, dan subtipe superfisial, dengan subtipe infiltratif menunjukkan ekspresi CD44 tertinggi. Ekspresi CD44 mungkin berhubungan dengan diameter stroma yang lebih besar dan jari-jari yang lebih kecil pada subtipe infiltratif seperti yang ditemukan dalam penelitian kami. Humphreys et al. [24] juga melaporkan kandungan positif -aktin otot halus dalam tumor infiltratif lebih besar, dan Papanikolaou [35] menunjukkan ekspresi integrin-linked kinase (ILK) yang berlebih pada tumor infiltratif, yang mungkin juga telah berkontribusi terhadap perbedaan morfologi.

KesimpulanDalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa terdapat perbedaan kuantitatif stroma peritumoral pada tiap subtipe karsinoma sel basal. Penelitian yang akan datang diharapkan dapat fokus pada proses integrasi antara perbedaan morfometrik dengan perbedaan biokimia, seperti yang telah dijelaskan pada penelitian ini, terjadi pada microenvironments stroma antara tiap-tiap subtipe karsinoma sel basal.

DAFTAR PUSTAKA

1. Folkman J, Shing Y: Angiogenesis. J Biol Chem 1992, 267:10931-10934.2. Kalluri R, Zeisberg M: Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer 2006, 6:392-401.3. Tlsty TD, Coussens LM: Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol 2006, 1:119-150.4. Bhowmick NA, Moses HL: Tumor-stroma interactions. Curr Opin Genet Dev 2005, 15:97-101.5. Tang Y, Kesavan P, Nakada MT, Yan L: Tumor-stroma interaction: positive feedback regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) expression and matrix metalloproteinase-dependent generation of soluble EMMPRIN. Mol Cancer Rev 2004, 2:73-80.6. Saijo Y, Tanaka M, Miki M, Usui K, Suzuki T, Maemondo M, Hong X, Tazawa R, Kikuchi T, Matsushima K, Nukiwa T: Proinflammatory cytokine IL- 1 beta promotes tumor growth of Lewis lung carcinoma by induction of angiogenic factors: in vivo analysis of tumor-stromal interaction. J Immunol 2002, 169:469-475.7. Samoszuk M, Tan J, Chorn G: Clonogenic growth of human breast cancer cells co-cultured in direct contact with serum-activated fibroblasts. Breast Cancer Res 2005, 7:R274-R283.8. Yashiro M, Ikeda K, Tendo M, Ishikawa T, Hirakawa K: Effect of organspecific fibroblasts on proliferation and differentiation of breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2005, 90:307-313.9. Sironen RK, Tammi M, Tammi R, Auvinen PK, Anttila M, Kosma VM: Hyaluronan in human malignancies. Exp Cell Res 2011, 317:383-391.10. Kitadai Y: Cancer-stromal cell interaction and tumor angiogenesis in gastric cancer. Cancer Microenviron 2010, 3:109-116.11. Whiteside TL: The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene 2008, 27:5904-5912.12. Mueller MM, Fusenig NE: Friends or foesbipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer 2004, 4:839-849.13. Reuter JA, Ortiz-Urda S, Kretz M, Garcia J, Scholl FA, Pasmooij AM, Cassarino D, Chang HY, Khavari PA: Modeling inducible human tissue neoplasia identifies an extracellular matrix interaction network involved in cancer progression. Cancer Cell 2009, 15:477-488.14. Littlepage LE, Egeblad M, Werb Z: Coevolution of cancer and stromal cellular responses. Cancer Cell 2005, 7:499-500.15. Wadlow RC, Wittner BS, Finley SA, Bergquist H, Upadhyay R, Finn S, Loda M, Mahmood U, Ramaswamy S: Systems-level modeling of cancer-fibroblast interaction. PLoS One 2009, 4:e6888.16. Ichise T, Adachi S, Ohishi M, Ikawa M, Okabe M, Iwamoto R, Mekada E: Humanized gene replacement in mice reveals the contribution of cancer stroma-derived HB-EGF to tumor growth. Cell Struct Funct 2010, 35:3-13.17. Lynch CC, Matrisian LM: Matrix metaloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation 2002, 2:161-174.18. Bhowmick NA, Neilson EG, Moses HL: Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature 2004, 432:332-337.19. Coussens LM, Werb Z: Inflammation and cancer. Nature 2002, 420:860-867.20. MacKie RM: Epidermal skin tumours. In Textbook of Dermatology. Volume2. 5 edition. Edited by: Champion RH, Burton JL, Ebling FJG. Oxford: Blackwell Scientific Publications; 1992:1488-1495.21. Hales SA, Stamp G, Evans M, Fleming KA: Identification of the origin of cells in human basal cell carcinoma xenografts in mice using in situ hybridization. Br J Dermatol 1989, 120:351-357.22. Carlson JA, Combates NJ, Stenn KS, Prouty SM: Anaplastic neoplasms arising from basal cellcarcinoma xenotransplants into SCID-beige mice. J Cutan Pathol 2002, 29:268-278.23. Kaur P, Mulvaney M, Carlson JA: Basal cell carcinoma progression correlates with host immune response and stromal alterations: a histologic analysis. Am J Dermatopathol 2006, 28:293-307.24. Humphreys TR, Monteiro MR, Murphy GF: Mast cells and dendritic cells in basal cell carcinoma stroma. Dermatol Surg 2000, 26:200-203.25. Dingemans KP, Ramkema MD, Koopman G, Van Der Wal AC, Das PK, Pals ST: The expression of CD44 glycoprotein adhesion molecules in basal cell carcinomas is related to growth pattern and invasiveness. Br J Dermatol 1999, 140:17-2524.26. Dixon AY, Lee SH, McGregor DH: Factors predictive of recurrence of basal cell carcinoma. Am J Dermatopathol 1989, 11:222.27. Jacobs GH, Rippey JJ, Altini M: Prediction of aggressive behavior in basal cell carcinoma. Cancer 1982, 49:533-537.28. De Rosa G, Vetrani A, Zeppa P, Zabatta A, Barra E, Gentile R, Fulciniti F, Troncone G, di Benedetto G, Palombini L: Comparative morphometric analysis of aggressive and ordinary basal cell carcinoma of the skin. Cancer 1990, 65:544-549.29. Appel T, Bierhoff E, Appel K, Lindern JV, Berg S, Niederhagen B: Predictive variables for the biological behaviour of basal cell carcinoma of the face: relevance of morphometry of the nuclei. Br J Oral Maxillofac Surg 2003, 41:147-150.30. Swetter SM, Yaghmai D, Egbert BM: Infiltrative basal cell carcinoma occurring in sites of biopsy-proven nodular basal cell carcinoma. J Cutan Pathol 1998, 25:420-425.31. Swetter SM, Boldrick JC, Pierre P, Wong P, Egbert BM: Effects of biopsyinduced wound healing on residual basal cell and squamous cell carcinomas: rate of tumor regression in excisional specimens. J Cutan Pathol 2003, 30:139-146.32. Ritter N, Cooper J: New resolution independent measures of circularity. J Mathematical Imaging and Vision 2009, 35:117-127.33. Crowson AN: Basal Cell Carcinoma: Clinical features, Histology, and Biology. In Biopsy Interpretation of the Skin. Edited by: Crowson AN, Magro CM, Mihm MC. Wolters Kluwer: Philadelphia; 2009:204-210.34. Janisson-Dargaud D, Drurlach A, Lorenzato M, Grange F, Bernard P, Birembaut P: Aneuploidy, but not Ki-67 or EGFR expression, is associated with recurrances in basal cell carcinoma. J Cutan Pathol 2008, 35:916-921.35. Papanikolaou S, Bravou V, Gyftopoulos K, Nakas D, Repanti M, Papadaki H: ILK expression in human basal cell carcinoma correlates with epithelialmesenchymal transition markers and tumour invasion. Histopathology 2010, 56:799-809.