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Motilidade do Citoesqueleto de Macrófagos e sua Relação ... · PDF fileMotilidade do Citoesqueleto de Macrófagos e sua Relação com o Processo de Fagocitose Estudados Através

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  • Motilidade do Citoesqueleto de Macrfagos e suaRelao com o Processo de Fagocitose Estudados

    Atravs de Microscopia de Desfocalizao

    Jos Coelho Neto

  • Motilidade do Citoesqueleto deMacrfagos e sua Relao com oProcesso de Fagocitose Estudados

    Atravs de Microscopia deDesfocalizao

    Jos Coelho Neto

    Orientador: Prof. Oscar Nassif de Mesquita

    Tese apresentada Universidade Federal de Minas Gerais como requisitoparcial para a obteno do grau de Doutor em Cincias Fsica.

    Belo HorizonteMaro de 2005

  • Dedicado aos meus pais,Jos Coelho e Maria Antnia,

    minha esposa, amiga, scia, cmplice e amante, Juliana,e ao meu mais novo amor, Jssica Freitas Coelho.

  • v

    Sumrio

    Agradecimentos viii

    Resumo x

    Abstract xi

    1 Introduo 11.1 Motivao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Descrio do Trabalho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

    2 Macrfagos & Citoesqueleto 42.1 Macrfagos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.2 O Citoesqueleto Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    2.2.1 Filamentos Intermedirios . . . . . . . . . . . . . . . . 82.2.2 Microtbulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.2.3 Filamentos de Actina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

    3 Estrutura e Dinmica do Citoesqueleto de Actina 153.1 Organizao dos Filamentos de Actina no Crtex Celular . . . 153.2 Dinmica de Formao e Degradao de Filamentos de Actina

    no Crtex Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.3 Motilidade Celular Baseada na Polimerizao de Actina . . . . 19

    3.3.1 A Catraca Browniana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.3.2 A Catraca Browniana Elstica . . . . . . . . . . . . . . 233.3.3 A Catraca Browniana Elstica com Filamentos Aderidos 26

  • SUMRIO vi

    4 Metodologia Experimental e de Anlise de Dados 284.1 Preparao de Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

    4.1.1 Macrfagos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284.1.2 Parasitas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

    4.2 Tcnicas Experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294.2.1 Microscopia de Desfocalizao . . . . . . . . . . . . . . 294.2.2 Pina ptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314.2.3 Montagem Experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . 324.2.4 Procedimentos Bsicos de Medida . . . . . . . . . . . . 35

    4.3 Experimentos Realizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374.4 Mtodos de Anlise de Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

    4.4.1 Autocorrelao Temporal e Espacial da Curvatura . . . 394.4.2 Distribuio da Curvatura . . . . . . . . . . . . . . . . 404.4.3 Comprimento, Frequncia de Ocorrncia e Perfil de

    Curvatura de Ruffles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414.4.4 Tempo de Fagocitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414.4.5 Curvatura Quadrtica Mdia em Torno de Uma Regio 42

    5 Resultados Obtidos 435.1 Caracterizao das Flutuaes de Curvatura a 37oC . . . . . . 43

    5.1.1 Flutuaes Aleatrias de Curvatura (FAC) . . . . . . . 435.1.2 Ruffles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465.1.3 Proporo entre FAC e ruffles . . . . . . . . . . . . . . 50

    5.2 Efeito de Frmacos e Tratamentos Diversos Sobre as Flutua-es de Curvatura a 37oC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

    5.3 Efeito de Mudanas na Temperatura Sobre as Flutuaes deCurvatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

    5.4 Comportamento das Flutuaes de Curvatura Durante Even-tos de Fagocitose a 37oC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

    5.5 Efeito de Mudanas na Temperatura Sobre o Processo de Fa-gocitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

    6 Discusso dos Resultados Obtidos 666.1 Sobre as caractersticas de FAC e ruffles a 37oC . . . . . . . . 66

  • SUMRIO vii

    6.2 Frmacos e tratamentos diversos . . . . . . . . . . . . . . . . 706.3 Relao entre ruffles e o processo de fagocitose . . . . . . . . . 706.4 A influncia da temperatura e a origem comum de FAC, ruffles

    e do processo de fagocitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

    7 Concluso 74

    A Projeto Inicial: Medida Dinmica Do Comprimento de Per-sistncia de Uma Molcula de DNA 76

    B Protocolos de Extrao e Cultivo de Clulas e Composiodos Meios de Cultura Celular 79B.1 Extrao de Clulas Tronco e Cultura Primria de Macrfagos 79B.2 Composio do Meio de Cultura Padro . . . . . . . . . . . . 80B.3 Composio do Meio de Cultura para Macrfagos . . . . . . . 81B.4 Obteno do Fator de Crescimento (M-CSF) para Macrfagos 81

    C Calibrao do Sistema de Vdeomicroscopia 82

    D Artigos Publicados 84Revista Physica A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85Revista Experimental Cell Research . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

    Lista de Figuras 108

    Lista de Tabelas 110

    Referncias Bibliogrficas 111

  • viii

    Agradecimentos

    Nestes pouco mais de 22 anos passados como estudante, do primeiro dia nojardim de infncia at o trmino do doutorado, muita coisa mudou (como,alis, no poderia deixar de ser). Ainda assim, mesmo considerando o uni-verso de todas as escolhas feitas ao longo de todos estes anos, um fator foisempre constante: a presena de caminhos bem definidos frente de cadaescolha possvel. Ao chegar ao fim do que pode ser considerado o caminhofinal, na medida em que representa o maior grau de estudo possvel nosmoldes professor-aluno, gostaria de agradecer:

    Aos meus pais, principais incentivadores e patrocinadores de todos oscaminhos que percorri, do jardim de infncia at aqui;

    Juliana, pela pacincia, compreenso, colaborao e suporte em todasas horas;

    Jssica, por estar a toda hora me lembrando, ainda que inconsciente-mente, que tudo comea (e recomea) ao aprendermos as coisas mais simples;

    A todos os professores que tive ao longo destes anos, por toda a contribui-o que deram para a construo de minha formao acadmica, em todosos nveis do ensino;

    Ao Oscar, no somente pela orientao, mas tambm por toda a experi-ncia, maturidade e segurana transmitidas;

    Aos companheiros de laboratrio, principalmente Aline, Bira, Nathan eMrcio, por todas as produtivas discusses, palpites e conselhos, sem deixarde lado a conversa fiada;

    Ao professor Ricardo Gazzinelli e todo o pessoal do laboratrio de imu-noparasitologia do Departamento de Bioqumica e Imunologia do ICB, prin-cipalmente Eneida, Brulia, Oscar Romero e Diogo, pela pacincia ao trans-mitir a um fsico um pouco da experincia necessria para trabalhar na rea

  • SUMRIO ix

    biolgica;A todos os amigos, professores, funcionrios e alunos do DF, por pro-

    piciarem um ambiente agradvel de trabalho e sempre estarem dispostos aajudar;

    Ao CNPq, pela concesso da bolsa de estudos e financiamento dos labo-ratrios onde este trabalho foi desenvolvido, juntamente com a FAPEMIG,FINEP e o Instituto do Milnio de Nanocincias;

    ... pois o fim do caminho no significa o fim da jornada.

  • x

    Resumo

    Neste trabalho aplicamos a tcnica de microscopia de desfocalizao, recen-temente desenvolvida em nosso laboratrio, ao estudo quantitativo in vivodas caractersticas morfolgicas e dinmicas das estruturas formadas na su-perfcie da membrana plasmtica de macrfagos derivados da medula sseade camundongos. Dois tipos distintos de flutuaes de formato da membranaforam detectadas e estudadas: pequenas flutuaes aleatrias, presentes, demaneira uniforme, sobre toda a superfcie da clula, em todos os instantes,e grandes estruturas localizadas, conhecidas como ruffles, que se propagamsobre a membrana. A partir dos dados obtidos destas flutuaes pudemos de-terminar o mdulo de curvatura da membrana e a viscosidade do citoplasmados macrfagos. O efeito de vrios frmacos e tratamentos sobre o com-portamento das estruturas estudadas tambm foi avaliado. Atravs do usocombinado das tcnicas de microscopia de desfocalizao e pinamento p-tico, pudemos estudar o comportamento da membrana durante a fagocitosede parasitas (Leishmania amazonensis). A anlise das mudanas observadasna quantidade de ruffles presente em regies da membrana perifricas aosfagosomos em formao indicou que estas estruturas podem estar associadas acelerao do processo de fagocitose. A investigao dos efeitos da reduoda temperatura sobre as flutuaes observadas e a fagocitose de parasitasresultou em dados que demonstram como estes fenmenos compartilham amesma origem comum, diretamente relacionada dinmica do citoesqueletocelular.

  • xi

    Abstract

    Defocusing microscopy, a novel, recently developed, approach on quantita-tive analysis of bright field optical microscopy images, was used for real-timein vivo observation and quantification of both morphological and dynamicalcharacteristics of the structures formed on the membrane surface of murinebone marrow macrophages. Two distinct types of membrane shape fluc-tuations were detected and studied: small, random fluctuations, uniformlydistributed over all membrane surface at any time, and large, localized, prop-agating structures, commonly referred as membrane ruffles. Data collectedfrom these fluctuations allowed determination of membrane bending modu-lus and cytoplasm viscosity of the macrophages. The effects of several drugsand treatments on the behavior of the structures studied were also investi-gated. The combined use of defocusing microscopy and optical tweezers al-lowed membrane surface dynamics to be followed closely during phagocytosisof parasites (Leishmania amazonensis). Analysis of the changes in rufflingactivity in a large area of membrane around the forming phagosomes indi-cated that ruffles may be related to the acceleration of the engulfment of theparasites. Investigation of temperature decrease effects on the fl