Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 7: 463-474 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(7): 463-474 www.vnua.edu.vn
463
MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG PEDV
(PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) PHÂN LẬP Ở LỢN NUÔI TẠI HƯNG YÊN
Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Huỳnh Thị Mỹ Lệ*
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
*Tác giả liên hệ: [email protected]
Ngày nhận bài: 19.05.2020 Ngày chấp nhận đăng: 02.06.2020
TÓM TẮT
Kể từ khi được phát hiện vào năm 2009, đến nay, PEDV lưu hành ở cả 3 miền Bắc, Trung và Nam và gây ra
những thiệt hại không nhỏ cho ngành chăn nuôi ở Việt Nam. Để góp phần hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra, việc chế
tạo và sử dụng vacxin phù hợp chủng là cần thiết. Nhằm cung cấp thêm thông tin về đặc tính sinh học của PEDV
gây bệnh ở Việt Nam, nghiên cứu này đã phân tích đặc tính sinh học phân tử gen mã hóa tiểu phần S1 của một
chủng PEDV phân lập ở Hưng Yên năm 2017. Kết quả nghiên cứu cho biết chủng phân lập PEDV_HY2017 thuộc
genogroup G2 của PEDV và có mức tương đồng với các chủng PEDV của Việt Nam là 90-91% (genogroup G1)
95,7-98,2% (genogroup G2). Chủng PEDV_HY2017 mang 2 vùng đột biến thêm - xóa ở đoạn gen mã hóa tiểu phần
protein S1 và giống với các chủng PEDV genogroup G2 của Việt Nam.
Từ khóa: Porcine Epidemic Diarrhea Virus, đặc tính sinh học phân tử, Việt Nam.
Molecular Characterizations of Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) Isolated in Hung Yen Province
ABSTRACT
Since the first detection in 2009, PEDV has been circulating in the North, Centre and the South of Vietnam. The
disease has caused significant damages to the pig production sector. In order to mitigate the economic damage
caused by diseases, the manufacture and use of field- matching vaccines are necessary. Aimed at providing more
information on the biology of pathogenic PEDV strains in Vietnam, this study analyzed the molecular biology of the
gene encoding S1 domain of one PEDV isolate detected in Hung Yen in 2017. The results showed that the field
isolate, PEDV_HY2017, is genogroup G2 PEDV. The virus shared nucleotide similarity with PEDV strains of Vietnam
in the ranges of 90-91% and 95.7-98.2% in compared to genogroup G1 and genogroup G2, respectively. The
PEDV_HY2017 strain carries two regions of insertion-deletion mutations in the gene segment encoding the S1
domain of the Spike protein. This characteristic was similar to the other Vietnamese PEDV genogroup G2 viruses.
Keywords: Porcine Epidemic Diarrhea Virus, molecular characterizations, Vietnam.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch tiêu chây cçp ở lợn (Porcine Epidemic
Diarrhea - PED) là müt bệnh truyền nhiễm cÿa
loài lợn, do müt loäi virus thuüc hö Coronaviridae
gây ra. Trên thế giới, dịch PED læn đæu tiên được
phát hiện ở Anh vào nëm 1971 (Oldham, 1972)
và hiện lưu hành ở hæu hết các nước chën nu÷i
lợn trên thế giới (Chen & cs., 2012; Song & Park,
2012; Carvajal & cs., 2015; Grasland & cs., 2015;
Theuns & cs., 2015; Boniotti & cs., 2016). Dựa
vào trình tự gen, mặc dù chî có 1 serotype duy
nhçt, PEDV được chia làm 2 genogroup: nhóm
G1 cú điển (G1, classical) và nhóm mới núi G2
(field epidemic/pandemic) (Lee, 2015). Trước nëm
2013, vacxin phòng bệnh PED đều được sân xuçt
từ chÿng PEDV thuüc genogroup G1; sự xuçt
hiện và lưu hành cÿa PEDV thuüc nhóm mới núi
đã làm giâm hiệu lực cÿa vacxin (Song &
cs., 2015).
Một số đặc tính sinh học phân tử của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập ở lợn nuôi tại Hưng Yên
464
Ở Việt Nam, dịch PED được phát hiện læn
đæu tiên vào cuùi nëm 2008, đæu nëm 2009 (Do
Tien Duy & cs., 2011; Nguyễn Tçt Toàn & Đû
Tiến Duy, 2012; Nguyễn Tçt Toàn & cs., 2012).
Đến nay, PED được xác định có mặt ở câ 3 miền
Bíc, Trung, Nam (Nguyễn Trung Tiến & cs.,
2015; Le & cs., 2016) và thuüc về 2 nhóm di
truyền, trong đó nhóm mới núi thuüc genogroup
G2 chiếm ưu thế (Nguyễn Trung Tiến & cs.,
2015; Diep & cs., 2018). Về vacxin phòng bệnh,
cho đến nay, vacxin lưu hành ở Việt Nam được
sân xuçt dựa vào các chÿng thuüc nhóm cú điển
G1, chưa có vacxin chế täo từ chÿng virus thuüc
nhóm mới núi G2. Do sù lượng các nghiên cứu về
PEDV ở Việt Nam chưa nhiều, việc phân lêp
virus, làm rõ đặc tính sinh höc phân tử cÿa
chÿng PEDV thực địa là cæn thiết. Bài báo này
nhìm cung cçp thông tin kết quâ nghiên cứu
xác định müt sù đặc tính sinh höc phân tử cÿa
chÿng PEDV (ký hiệu PEDV_HY2017) phân lêp
được từ méu bệnh phèm cÿa lợn nuôi täi Hưng
Yên nëm 2017. Kết quâ này góp phæn cung cçp,
hoàn thiện thông tin về đặc tính sinh höc phân
tử cÿa chÿng PEDV phân lêp; qua đó làm cơ sở
cho việc phát triển vacxin phòng bệnh PED phù
hợp với các chÿng gây bệnh täi miền Bíc.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được thực hiện täi phòng thí
nghiệm Bü môn Vi sinh vêt - Truyền nhiễm
(VSV-TN), Khoa Thú y, Höc viện Nông nghiệp
Việt Nam, từ tháng 2/2017 đến tháng 6/2018.
2.1. Nguyên liệu
- Chÿng virus PEDV_HY2017 phân lêp vào
nëm 2017 từ ruüt non cÿa lợn sơ sinh míc bệnh
tiêu chây cçp ở tînh Hưng Yên, được xác định
chî dương tính với PEDV.
- Dòng tế bào Vero do bü môn VSV-TN
cung cçp.
- Hóa chçt tách, tinh säch ARN túng sù:
TRIzol (ThermoFisher Scientific, 15596026),
chloroform (Merck, 102445), 2-propanol (Merck,
109634), ethanol (Merck, 108543).
- Bü kít túng hợp cDNA (M-MLV Reverse
Transcriptase, ThermoFisher Scientific,
28025013), bü kít PCR (Maxime PCR PreMix,
25165, iNtRON, Hàn Quùc).
- Cặp møi đặc hiệu (Bâng 1) dùng giâi trình
tự gen S (Gao & cs., 2013; Tian & cs., 2013).
Bảng 1. Bộ mồi dùng cho giải trình tự gen S
Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Vị trí bắt đầu* Kích thước (bp)
W20F GTTACCTGATGGCATTATGTTT 19.837 2382
W20R AACGAGATTGGCACTACTAAGAC 22.218
W21F TTCAGGTTTCTGGACCATAGC 21.933 1068
W21R CTCATACTAAAGTTGGTGGGAAT 23.000
W22F TAGGGAGTTGCCTGGTTTC 22.812 1039
W22R CAGTCGGGAATAAATGTCATCAATA 23.850
W23F GTTTGAACACTGTGGCTCATG 23.708 1637
W23R TTCGCAACAGATGTAGGTCAG 25.344
PEDVS1-P1 CCATTAGTGATGTTGTGTTAG 20.535 1031
PEDVS1-P2 GCACAGCAGCTCCATT 21.565
PEDVS2-P1 CCACATACCAGAAGGTTTTAG 21.372 1146
PEDVS2-P2 CCAGTAATCAACTCACCCTT 22.517
PEDVS3-P1 CCCTGAGTTTGGTAGTGG 22.446 1154
PEDVS3-P2 CATCCGTCTGTAGAGCAAG 23.599
PEDVS4-P1 CTCATCGGTGGTATGGTGCT 23.497 1355
PEDVS4-P2 AGCAGACTTTGAGACATCTTTGAC 24.851
Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Huỳnh Thị Mỹ Lệ
465
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp cấy chuyển virus
Chÿng giùng PEDV được cçy chuyển trên
m÷i trường tế bào Vero chuèn bị sau 24 giờ, dựa
vào phương pháp c÷ng bù trước đåy (Chung & cs.,
2015). Sau khi gây nhiễm huyễn dịch virus 1 giờ,
tiến hành loäi bô dịch gây nhiễm và rửa thâm tế
bào 2 læn bìng dung dịch PBS 1x. Nuôi thâm tế
bào sau gây nhiễm virus bìng m÷i trường với các
thành phæn sau: (i) DMEM, (ii) tryptose
phosphate broth 0,3%, (iii) yeast extract 0,05%
và (iv) 10 µg/ml trypsin. Theo dõi bệnh tích tế
bào hàng ngày (vêt kính 10x). Thu tế bào sau gây
nhiễm 48 giờ. Huyễn dịch được đ÷ng tan 3 læn (ở
-80C), ly tâm 4.000 vòng/phút/4C trong 15 phút
để loäi bô cặn tế bào.
2.2.2. Phương pháp tách ARN
ARN túng sù được tách chiết bìng TRIzol,
theo hướng dén cÿa nhà sân xuçt. Các bước thực
hiện được tóm tít dưới đåy. (i) Ly giâi méu: bú
sung 750µl dung dịch TRIzol vào 250µl huyễn
dịch virus, vortex. Ủ ở nhiệt đü phòng 5 phút.
(ii) Tách pha chứa ARN: bú sung 200µl
Chloroform, vortex mänh trong 15 giây. Ly tâm
12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4C. (iii) Tÿa
ARN: chuyển 450µl pha trên có chứa ARN vào
ùng Eppendorf mới, bú sung 450µl 2-propanol.
Tÿa ở -20C/10 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút
trong 10 phút ở 4C, bô dịch trên, thu tÿa ARN.
(iv) Rửa tÿa ARN: thêm 1ml ethanol 75%, đâo
nhẹ để trün đều. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong
10 phút ở 4C. Loäi bô cøn và hong khô ở nhiệt
đü phòng. (v) Hoàn nguyên ARN: hòa tÿa ARN
trong 30µl nước cçt 3 læn đã xử lý loäi Rnase và
bâo quân ở -70C cho tới khi sử dụng.
2.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
Trước khi thực hiện phân ứng PCR, cæn
chuyển ARN thành ADN (sợi đơn) bìng phân
ứng túng hợp cDNA. Thành phæn phân ứng được
tóm tít ở bâng 2.
2.2.4. Phương pháp thực hiện phản ứng PCR
Thành phæn cÿa phân ứng PCR gøm: 17µl
i-Star Master mix solution + 1µl møi xuôi + 1µl
møi ngược + 1µl cDNA. Chu trình nhiệt tùi ưu
cÿa các phân ứng PCR trình bày ở bâng 3.
Sân phèm PCR được phân tích bìng
phương pháp điện di trong thäch agarose 2%, có
bú sung RedSafe Nucleic Acid Staining Solution
(1x). Sân phèm PCR đặc hiệu được tinh säch và
giâi trình tự gen 2 chiều bìng cặp møi tương
ứng täi Công ty 1st BASE (Malaysia).
Bảng 2. Thành phần và nhiệt độ phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích (µl) Nhiệt độ (C)
ARN tổng số 10 65C/ 5phút;
Giữ ở 4C Random primer (10 pmole) 2
dNTPs (40mM) 1 25C/ 5 phút;
37C/ 60 phút;
72C/ 10 phút;
Giữ ở 4C
DTT (0,1M) 2
First strand buffer (5x) 4
M-MLV (200 U/µl) 1
Bảng 3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR nhân gen S
Giai đoạn phản ứng Nhiệt độ (C) Thời gian (giây) Số vòng lặp
Tiền biến tính 94 180 1
Biến tính 94 15 40
Bắt mồi 56 20
Kéo dài 72 120
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Một số đặc tính sinh học phân tử của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập ở lợn nuôi tại Hưng Yên
466
22220 22230 22240..|....|....|....|....|
W20R GTCTTAGTAGTGCCAATCTCGTT
KT941120_Vietnam ...A....G.......C..TA..
KJ960180_Vietnam ...A....G.......C..TA..
KJ960179_Vietnam ...A....G.......C..TA..
KJ960178_Vietnam ...A....G.......C..TA..
KJ645682_USA A..A....G.......C..TA..
KR610992_Thailand .C.A...GG.......C..TA..
KF804028_USA ...AA...G.......C..TA..
KJ645639_USA ...A....GA......C..TA..
KY007140_China ...A....G.......C...A..
LT898444_Germany ...A....G.......C..TA.C
AF353511_Belgium ...A....G.......C..TA..
LC063847_Japan ...A....G.....G.C...A..
KJ645653_USA ...A....G.....G.C..TA..
KP403954_Ukraine ...C....G.......C..TA..
KR153326_China ...C.G..G.......C..TA..
JX560761_China ...G....G.......C..TAC.
KJ645696_USA ...G....G.......C..TA..
KY111278_Italy .......................
KU982974_USA ........G.......C..TA..
KM609213_China ........G..........TAC.
KU558702_USA ..TA....G.......C...A..
KY019623_Slovenia ..TA....G.......C..TA..
EF185992_China ..TC....G.......C.....C
KJ588064_Korea N..A....G.......C..TA..
19840 19850...|....|....|....|...
W20F GTTACCTGATGGCATTATGTTT
KT941120_Vietnam .G....................
KJ960180_Vietnam .........A............
KJ960179_Vietnam .........A............
KJ960178_Vietnam .........A............
KR610994_Thailand .........A............
KY007140_China .........C............
KJ623926_Korea ...........A..........
KY111278_Italy ......................
KC140102_China T.....................
21940 21950
..|....|....|....|...
W21F TTCAGGTTTCTGGACCATAGC
KT941120_Vietnam ...T.....T...........
KJ960178_Vietnam .....................
KJ960179_Vietnam .....................
KJ960180_Vietnam .....................
KU836638_UK C....................
KR265769_USA .....A...T...........
AF353511_Belgium .....................
KC189944_China ................G....
KJ020932_China ...............T.....
KY019624_Slovenia .........T...........
KX812524_China ...C.....T...........
MF577027_Russia ...T..G........T..T..
KP890336_China ...T....A............
KM609204_China ...T.................
KY111278_Italy ...T.....T...........
KJ645700_Mexico ...T.....T.........T.
23000 23010 23020
|....|....|....|....|..
W21R ATTCCCACCAACTTTAGTATGAG
KT941120_Vietnam .......................
KJ960180_Vietnam .......................
KJ960179_Vietnam .......................
KJ960178_Vietnam .......................
MF577027_Russia ..A..T.TG..T....C....G.
KU847996_China ..C....................
KJ645705_USA ..G....................
KY111278_Italy .......................
KU836638_UK .....T............G....
KX058033_China G......................
5’ 3’
W2
0F/R
W2
1F/R
22820 22830...|....|....|....|
W22F TAGGGAGTTGCCTGGTTTC
KJ960178_Vietnam ...................
KJ960179_Vietnam ...................
KJ960180_Vietnam ...................
KT941120_Vietnam ..A................
KC189944_China C..................
KJ645697_USA ..A................
KR265802_USA ...A...............
KY111278_Italy ...................
KP403954_Ukraine ......T............
MF577027_Russia .GTCC..GCT...A....T
23850 23860 23870
|....|....|....|....|....
W22R TATTGATGACATTTATTCCCGACTG
KJ960178_Vietnam ...............C........T
KJ960179_Vietnam ...............C........T
KJ960180_Vietnam ...............C........T
KT941120_Vietnam ...............C.........
KX064280_China ............C..C..T......
KC210146_China ...............CA........
KC189944_China ...............C.........
KM609204_China ...............C........T
KY111278_Italy ...............C..T......
KJ020932_China ...............C..T..G...
KF384500_China ...............C.TT.....T
AF353511_Belgium .........................
KR265824_USA ..................T......
KR818832_China ..........G....C..T......
MF577027_Russia C..A.....T......GGTA....T
23710 23720
..|....|....|....|...
W23F GTTTGAACACTGTGGCTCATG
KT941120_Vietnam .....................
KJ960178_Vietnam .....................
KJ960179_Vietnam .....................
KJ960180_Vietnam ........G............
KR061458_Italy ................A....
LT900500_Germany ................C....
KX064280_China ...................A.
KY111278_Italy .....................
KX981440_China .......T.............
LT898443_Germany ......G..............
MF577027_Russia ..C.CTGG..A..A...G...
25350 25360.|....|....|....|....
W23R CTGACCTACATCTGTTGCGAA
KT941120_Vietnam ..........G..........
KJ960178_Vietnam .....................
KJ960179_Vietnam .....................
KJ960180_Vietnam .....................
KX839250_China ---------------------
KF761675_China .A........G..........
KY007139_China .C........G..........
KY111278_Italy ..........G..........
LT898436_Germany ..........GT.........
AF353511_Belgium .....................
MF577027_Russia ...........T.........
KX981440_China .....T....G..........
KY793536_China ....T.....G..........
KU836638_UK T....................
W2
3F/R
W2
2F/R
W2
0F
19
.83
7W
20
R2
2.2
18
W2
1F
21
.93
3W
21
R2
3.0
00
W2
2F
22
.81
2W
22
R2
3.8
50
W2
3F
23
.70
8W
23
R2
5.3
44
S g
en
e
A B
5’ 3’
Ghi chú: (A) Vị trí tương đối của 4 cặp mồi giâi trình tự toàn bộ gen S; (B) So sánh trình tự mồi và trình tự gen
các chủng PEDV của Việt Nam (đóng khung màu đỏ) và trên thế giới.
Hình 1. Kết quả phân tích trình tự bộ mồi số 1 dùng giải trình tự gen S
2.2.5. Phương pháp phân tích trình tự gen
Các bước phân tích trình tự gen và xây
dựng cây phâ hệ được tóm tít như sau: (i) Trình
tự müt phæn gen S được bít cặp so sánh với các
trình tự tương ứng cÿa PEDV được công bù trên
GenBank; (ii) Síp xếp, cën chînh trình tự
nucleotide cÿa các chÿng PEDV theo cüt trên
cơ sở bü ba mã hóa (codon - based alignment) bìng
phæn mềm BioEdit (phiên bân 7.2.6.1); (iii) Xây
dựng cây phâ hệ bìng thuêt toán neighbor-
joining được tích hợp trong chương trình
MEGA7 (Kumar & cs., 2016). Mức tin cêy cÿa
các nhánh phân chia ở mûi nþt (node) được
biểu thị bìng giá trị bootstrap (lặp läi 1.000
læn); (iv) Biểu diễn, cây phâ hệ bìng phæn
mềm FigTree.
Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Huỳnh Thị Mỹ Lệ
467
PEDVS1-P120.535
PEDVS1-P221.565
PEDVS2-P121.372
PEDVS2-P222.517
PEDVS3-P122.446
PEDVS3-P223.599
PEDVS4-P123.497
PEDVS4-P224.851
S gene
20540 20550
|....|....|....|....|
PEDVS1-P1 CCATTAGTGATGTTGTGTTAG
KJ960178_Vietnam .....................
KJ960179_Vietnam .....................
KJ960180_Vietnam .....................
KT941120_Vietnam .....................
KY111278_Italy .....................
KX550281_China .T...................
MF577027_Russia ....ATCG........TA.T.
21570 21580
|....|....|....|
PEDVS1-P2 AATGGAGCTGCTGTGC
KJ960178_Vietnam ................
KJ960179_Vietnam ................
KJ960180_Vietnam ................
KT941120_Vietnam ................
KC189944_China ..C.....C....C..
MF737355_Korea ..C......A...C.T
JN547228_China ..C.......T....A
KR265770_USA .........A......
KU836638_UK ..........A....A
KM609212_China ..........A.....
KU982980_USA ...........A....
KY111278_Italy .............C..
KY007139_China ................
AF353511_Belgium ...............G
KM609211_China ............TC..
KY928065_China .........T...C..
KR265785_USA .C..............
MF577027_Russia .....TTA.T.GTC.A
21380 21390...|....|....|....|..
PEDVS2-P1 CCACATACCAGAAGGTTTTAG
KT941120_Vietnam .....................
KJ960178_Vietnam .........C...........
KJ960179_Vietnam .........C...........
KJ960180_Vietnam .........C...........
LC063813_Japan .............A.......
KY111278_Italy .....................
KR265823_USA ...........G.........
KJ645638_USA ...........T.........
KR610994_Thailand .........C...........
AF353511_Belgium ...T.................
KX839247_China ...T.........T.......
KU836638_UK ...T........T........
MF577027_Russia ..TG..T..TCC.TCC..C..
22520 22530...|....|....|....|.
PEDVS2-P2 AAGGGTGAGTTGATTACTGG
KT941120_Vietnam ....................
KJ960178_Vietnam ....................
KJ960179_Vietnam ....................
KJ960180_Vietnam ....................
KU836638_UK ..A..A..............
AF353511_Belgium ..A.................
KY111278_Italy ....................
KR265812_USA ........K...........
KJ645650_USA ........T...........
KJ645636_USA ..T.................
JX088695_China .C..................
KY007139_China G...................
MF577027_Russia G.T........T..A..A..
22450 22460 22470....|....|....|....|....|....|
PEDVS3-P1 CCCTGAGTTTGGTAGTGG------------
KT941120_Vietnam ......T...........------------
KJ960178_Vietnam ..................------------
KJ960179_Vietnam ..................------------
KJ960180_Vietnam ..................------------
KT323980_China ..A..........G...T------------
KU982975_USA ....C.T...........------------
KJ526096_China ......C.A.........------------
JN547228_China .........C..C...A.------------
KC189944_China .........C........------------
KU982978_USA ................A.------------
LC063821_Japan ................CC------------
KJ645651_USA .................A------------
KY111278_Italy ..................------------
KJ645640_USA .................T------------
KY007140_China ...............ACAACAGTCCATTGG
KM609205_China .............G....------------
KR265779_USA ......T..........A------------
LT898436_Germany ......T...........------------
AF353511_Belgium .....C...C........------------
KP890336_China .....C............------------
KR061458_Italy .....CT...........------------
MF577027_Russia ---.CCAGC.....A...TCCTGG------
KU836638_UK T...TCT..........A------------
23590....|....|....|....
PEDVS3-P2 CTTGCTCTACAGACGGATG
KT941120_Vietnam ...................
KJ960178_Vietnam ...................
KJ960179_Vietnam ...................
KJ960180_Vietnam ...................
KX791060_China ..A................
KY111278_Italy ...................
KP890336_China ......G............
AF353511_Belgium ......T............
MF577027_Russia G....A.....A..T....
KR265844_USA G..................
23500 23510...|....|....|....|.
PEDVS4-P1 CTCATCGGTGGTATGGTGCT
KT941120_Vietnam ....................
KJ960178_Vietnam ....................
KJ960179_Vietnam ....................
KJ960180_Vietnam ....................
AF353511_Belgium .....A..........C...
KY420075_China ................C...
KY111278_Italy ....................
KU836638_UK .....T..........C...
KC189944_China ...C............C...
JN547228_China ..T.............C...
MF577027_Russia ..TG.T...A.C.....AT.
24830 24840 24850
..|....|....|....|....|.
PEDVS4-P2 GTCAAAGATGTCTCAAAGTCTGCT
KT941120_Vietnam ........................
KJ960178_Vietnam ..............T........C
KJ960179_Vietnam ..............T........C
KJ960180_Vietnam ..............T........C
KM609211_China ......A.................
KR809885_China ........C...............
JN547228_China ...........A..G........C
KY928065_China ............G.T........C
KX791060_China .......................C
KY111278_Italy ........................
JQ282909_China .................T......
KU982980_USA ................G.......
KC189944_China ..............G........C
AF353511_Belgium ..............G.......TC
KX839247_China ..............G.......T.
KM609204_China ..............T........C
LT898426_Germany .............T..........
KU982970_USA ...........T............
KU836638_UK ...........T..C.......T.
KC140102_China ...........T..T........C
PED
VS1
-P1
/P2
PED
VS2
-P1
/P2
PED
VS4
-P1
/P2
PED
VS3
-P1
/P2
A
B
5’ 3’ 5’ 3’
Ghi chú: (A) Vị trí tương đối của 4 cặp mồi giâi trình tự toàn bộ gen S; (B) So sánh trình tự mồi và trình tự gen
các chủng PEDV của Việt Nam (đóng khung màu đỏ) và trên thế giới.
Hình 2. Kết quả phân tích trình tự bộ mồi số 2 dùng giải trình tự gen S
Một số đặc tính sinh học phân tử của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập ở lợn nuôi tại Hưng Yên
468
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả lựa chọn cặp mồi dùng giải
trình tự gen S
Nghiên cứu đã giâi mã gen S để làm rõ müt
sù đặc điểm sinh höc phân tử cÿa chÿng
PEDV_HY2017. Do hiện tượng thêm - xóa, để
làm cơ sở lựa chön bü møi phù hợp nhçt, nghiên
cứu này trước tiên so sánh trình tự møi với 28
chÿng đäi diện (gøm 4 chÿng cÿa Việt Nam) có
trình tự bü gen hoàn chînh ở ngân hàng gen.
Hình 1 và hình 2 là phân tích về sự phù hợp
giữa trình tự møi và trình tự gen cÿa 28 chÿng
PEDV đäi diện, trong đó có chÿng PEDV cÿa
Việt Nam. Đùi với bü møi sù 1 (Hình 1), 7/8 møi
có trình tự täi vị trí bít møi khác với trình tự
nucleotide cÿa 4 chÿng PEDV cÿa Việt Nam
(đánh dçu màu xám). Đáng chþ ý, møi W20R có
tới 5/23 nucleotide sai khác so với 4 chÿng cÿa
Việt Nam, đặc biệt là täi đæu 3’ cÿa møi. Ngoài
ra, møi W23R có vị trí gín møi nìm trong vùng
đüt biến xóa nucleotide cÿa 1 chÿng virus (mũi
tên, hình 1). Đùi với bü møi sù 2 (Hình 2), 3/8
møi có trình tự täi vị trí bít møi khác với trình
tự nucleotide cÿa 4 chÿng PEDV cÿa Việt Nam
(đánh dçu màu xám). Tuy nhiên, các vị trí sai
khác này không nìm trong khoâng 3-5
nucleotide täi đæu 3’ cÿa møi. Từ 2 so sánh kể
trên, bü møi sù 2 được chön.
Do kích thước lớn cÿa gen S (khoâng hơn
4.000bp), nghiên cứu đã têp trung giâi mã 2
trong 4 vùng gen mã hóa receptor bám vào thụ
thể trên bề mặt tế bào vêt chÿ (S10 và S1A)
thuüc tiểu phæn protein S1 (nucleotide 1-1533,
đánh sù theo chÿng tham chiếu CV777,
AF353511). Các výng receptor này được chứng
minh là đích tçn công cÿa kháng thể trung hòa
(Li & cs., 2017). Phân tích kết quâ giâi trình tự
gen bìng phæn mềm BioEdit đã thu được trình
tự müt phæn gen S gøm 1533 nucleotide (bao
gøm vùng S10 và S1A).
KR941555_VN01141_Vietnam_2013
KR
94
15
55
_V
N0
11
41
_V
ietn
am
_2
01
3
KX982554_VN02_Vietnam_2013
KX
98
25
54
_V
N0
2_
Vie
tna
m_
20
13
KR941556_GF04131_Vietnam_2013
KR
94
15
56
_G
F0
41
31
_V
ietn
am
_2
01
3
KJ960180_KCHY310113_Vietnam_2013
KJ9
60
18
0_
KC
HY
31
01
13
_V
ietn
am
_2
01
3
KJ960179_VAP1113_Vietnam_2013
KJ9
60
17
9_
VA
P1
11
3_
Vie
tna
m_
20
13
KJ960178_JFP1013_Vietnam_2013
KJ9
60
17
8_
JF
P1
01
3_
Vie
tna
m_
20
13
KX708900_HUAPED117_Vietnam
KX
70
89
00
_H
UA
PE
D1
17
_V
ietn
am
KX708899_HUAPED118_Vietnam
KX
70
88
99
_H
UA
PE
D1
18
_V
ietn
am
KX708898_HUAPED115_Vietnam
KX
70
88
98
_H
UA
PE
D1
15
_V
ietn
am
KX708897_HUAPED114_Vietnam
KX
70
88
97
_H
UA
PE
D1
14
_V
ietn
am
KX708896_HUAPED113_Vietnam
KX
70
88
96
_H
UA
PE
D1
13
_V
ietn
am
KX708895_HUAV2_Vietnam
KX
70
88
95
_H
UA
V2
_V
ietn
am
KX708894_HUAM17_Vietnam
KX
70
88
94
_H
UA
M1
7_
Vie
tna
m
KX708903_HUAPED111_Vietnam
KX
70
89
03
_H
UA
PE
D1
11
_V
ietn
am
KP455313_HUAPED45_Vietnam
KP
45
53
13
_H
UA
PE
D4
5_
Vie
tna
m
KP455314_HUAPED47_Vietnam
KP
45
53
14
_H
UA
PE
D4
7_
Vie
tna
m
KX708901_HUAPED88_Vietnam
KX
70
89
01
_H
UA
PE
D8
8_
Vie
tna
m
KX708902_HUAPED86_Vietnam
KX
70
89
02
_H
UA
PE
D8
6_
Vie
tna
m
KX982569_VN297_Vietnam_2014
KX
98
25
69
_V
N2
97
_V
ietn
am
_2
01
4
KX708907_HUAPED96_Vietnam
KX
70
89
07
_H
UA
PE
D9
6_
Vie
tna
m
KT941120_HUA14PED96_Vietnam
KT
94
11
20
_H
UA
14
PE
D9
6_
Vie
tna
m
KX708906_HUAPED94_Vietnam
KX
70
89
06
_H
UA
PE
D9
4_
Vie
tna
m
KX982576_VNTH15_Vietnam_2015
KX
98
25
76
_V
NT
H1
5_
Vie
tna
m_
20
15
KX982570_VN344_Vietnam_2014
KX
98
25
70
_V
N3
44
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982561_VN97_Vietnam_2013
KX
98
25
61
_V
N9
7_
Vie
tna
m_
20
13
KX982572_VN385_Vietnam_2014
KX
98
25
72
_V
N3
85
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982557_VN12_Vietnam_2013
KX
98
25
57
_V
N1
2_
Vie
tna
m_
20
13
KX982553_VN01_Vietnam_2013
KX
98
25
53
_V
N0
1_
Vie
tna
m_
20
13
KX982566_VN270_Vietnam_2014
KX
98
25
66
_V
N2
70
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982577_VNJafa_Vietnam_2015
KX
98
25
77
_V
NJa
fa_
Vie
tna
m_
20
15
KX982575_VNK28_Vietnam_2015
KX
98
25
75
_V
NK
28
_V
ietn
am
_2
01
5
KX982574_VNK23_Vietnam_2015
KX
98
25
74
_V
NK
23
_V
ietn
am
_2
01
5
KX982567_VN288_Vietnam_2014
KX
98
25
67
_V
N2
88
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982563_VN112_Vietnam_2013
KX
98
25
63
_V
N1
12
_V
ietn
am
_2
01
3
KX982562_VN101_Vietnam2012
KX
98
25
62
_V
N1
01
_V
ietn
am
20
12
KX982560_VN44_Vietnam_2013
KX
98
25
60
_V
N4
4_
Vie
tna
m_
20
13
KX982558_VN15_Vietnam_2013
KX
98
25
58
_V
N1
5_
Vie
tna
m_
20
13
KX982556_VN11_Vietnam2012
KX
98
25
56
_V
N1
1_
Vie
tna
m2
01
2
KX982555_VN06_Vietnam_2013
KX
98
25
55
_V
N0
6_
Vie
tna
m_
20
13
KX982559_VN19_Vietnam_2013
KX
98
25
59
_V
N1
9_
Vie
tna
m_
20
13
Q3Q5_Vietnam_2017
Q3
Q5
_V
ietn
am
_2
01
7
KX982573_VNK2_Vietnam_2015
KX
98
25
73
_V
NK
2_
Vie
tna
m_
20
15
KX708905_HUAPED106_Vietnam
KX
70
89
05
_H
UA
PE
D1
06
_V
ietn
am
KX708904_HUAPED103_Vietnam
KX
70
89
04
_H
UA
PE
D1
03
_V
ietn
am
KX982571_VN367_Vietnam_2014
KX
98
25
71
_V
N3
67
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982568_VN292_Vietnam_2014
KX
98
25
68
_V
N2
92
_V
ietn
am
_2
01
4
KR941554_VN60514_Vietnam_2014
KR
94
15
54
_V
N6
05
14
_V
ietn
am
_2
01
4
KR941552_VN20514_Vietnam_2014
KR
94
15
52
_V
N2
05
14
_V
ietn
am
_2
01
4
KR941553_VN10514_Vietnam_2014
KR
94
15
53
_V
N1
05
14
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982565_VN262_Vietnam_2014
KX
98
25
65
_V
N2
62
_V
ietn
am
_2
01
4
KP455319_HUAPED67_Vietnam
KP
45
53
19
_H
UA
PE
D6
7_
Vie
tna
m
KP455316_HUAPED58_Vietnam
KP
45
53
16
_H
UA
PE
D5
8_
Vie
tna
m
KP455317_HUAPED60_Vietnam
KP
45
53
17
_H
UA
PE
D6
0_
Vie
tna
m
KP455315_HUAPED55_Vietnam
KP
45
53
15
_H
UA
PE
D5
5_
Vie
tna
m
KP455318_HUAPED63_Vietnam
KP
45
53
18
_H
UA
PE
D6
3_
Vie
tna
m
KP455320_HUAPED68_Vietnam
KP
45
53
20
_H
UA
PE
D6
8_
Vie
tna
m
KX982564_VN232_Vietnam_2013
KX
98
25
64
_V
N2
32
_V
ietn
am
_2
01
3
Pairwise identity (%)
100
99
98
97
96
94
93
92
91
90
89
KR941555_VN01141_Vietnam_2013
KR
94
15
55
_V
N0
11
41
_V
ietn
am
_2
01
3
KX982554_VN02_Vietnam_2013
KX
98
25
54
_V
N0
2_
Vie
tna
m_
20
13
KR941556_GF04131_Vietnam_2013
KR
94
15
56
_G
F0
41
31
_V
ietn
am
_2
01
3
KJ960180_KCHY310113_Vietnam_2013
KJ9
60
18
0_
KC
HY
31
01
13
_V
ietn
am
_2
01
3
KJ960179_VAP1113_Vietnam_2013
KJ9
60
17
9_
VA
P1
11
3_
Vie
tna
m_
20
13
KJ960178_JFP1013_Vietnam_2013
KJ9
60
17
8_
JF
P1
01
3_
Vie
tna
m_
20
13
KX708900_HUAPED117_Vietnam
KX
70
89
00
_H
UA
PE
D1
17
_V
ietn
am
KX708899_HUAPED118_Vietnam
KX
70
88
99
_H
UA
PE
D1
18
_V
ietn
am
KX708898_HUAPED115_Vietnam
KX
70
88
98
_H
UA
PE
D1
15
_V
ietn
am
KX708897_HUAPED114_Vietnam
KX
70
88
97
_H
UA
PE
D1
14
_V
ietn
am
KX708896_HUAPED113_Vietnam
KX
70
88
96
_H
UA
PE
D1
13
_V
ietn
am
KX708895_HUAV2_Vietnam
KX
70
88
95
_H
UA
V2
_V
ietn
am
KX708894_HUAM17_Vietnam
KX
70
88
94
_H
UA
M1
7_
Vie
tna
m
KX708903_HUAPED111_Vietnam
KX
70
89
03
_H
UA
PE
D1
11
_V
ietn
am
KP455313_HUAPED45_Vietnam
KP
45
53
13
_H
UA
PE
D4
5_
Vie
tna
m
KP455314_HUAPED47_Vietnam
KP
45
53
14
_H
UA
PE
D4
7_
Vie
tna
m
KX708901_HUAPED88_Vietnam
KX
70
89
01
_H
UA
PE
D8
8_
Vie
tna
m
KX708902_HUAPED86_Vietnam
KX
70
89
02
_H
UA
PE
D8
6_
Vie
tna
m
KX982569_VN297_Vietnam_2014
KX
98
25
69
_V
N2
97
_V
ietn
am
_2
01
4
KX708907_HUAPED96_Vietnam
KX
70
89
07
_H
UA
PE
D9
6_
Vie
tna
m
KT941120_HUA14PED96_Vietnam
KT
94
11
20
_H
UA
14
PE
D9
6_
Vie
tna
m
KX708906_HUAPED94_Vietnam
KX
70
89
06
_H
UA
PE
D9
4_
Vie
tna
m
KX982576_VNTH15_Vietnam_2015
KX
98
25
76
_V
NT
H1
5_
Vie
tna
m_
20
15
KX982570_VN344_Vietnam_2014
KX
98
25
70
_V
N3
44
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982561_VN97_Vietnam_2013
KX
98
25
61
_V
N9
7_
Vie
tna
m_
20
13
KX982572_VN385_Vietnam_2014
KX
98
25
72
_V
N3
85
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982557_VN12_Vietnam_2013
KX
98
25
57
_V
N1
2_
Vie
tna
m_
20
13
KX982553_VN01_Vietnam_2013
KX
98
25
53
_V
N0
1_
Vie
tna
m_
20
13
KX982566_VN270_Vietnam_2014
KX
98
25
66
_V
N2
70
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982577_VNJafa_Vietnam_2015
KX
98
25
77
_V
NJa
fa_
Vie
tna
m_
20
15
KX982575_VNK28_Vietnam_2015
KX
98
25
75
_V
NK
28
_V
ietn
am
_2
01
5
KX982574_VNK23_Vietnam_2015
KX
98
25
74
_V
NK
23
_V
ietn
am
_2
01
5
KX982567_VN288_Vietnam_2014
KX
98
25
67
_V
N2
88
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982563_VN112_Vietnam_2013
KX
98
25
63
_V
N1
12
_V
ietn
am
_2
01
3
KX982562_VN101_Vietnam2012
KX
98
25
62
_V
N1
01
_V
ietn
am
20
12
KX982560_VN44_Vietnam_2013
KX
98
25
60
_V
N4
4_
Vie
tna
m_
20
13
KX982558_VN15_Vietnam_2013
KX
98
25
58
_V
N1
5_
Vie
tna
m_
20
13
KX982556_VN11_Vietnam2012
KX
98
25
56
_V
N1
1_
Vie
tna
m2
01
2
KX982555_VN06_Vietnam_2013
KX
98
25
55
_V
N0
6_
Vie
tna
m_
20
13
KX982559_VN19_Vietnam_2013
KX
98
25
59
_V
N1
9_
Vie
tna
m_
20
13
Q3Q5_Vietnam_2017
Q3
Q5
_V
ietn
am
_2
01
7
KX982573_VNK2_Vietnam_2015
KX
98
25
73
_V
NK
2_
Vie
tna
m_
20
15
KX708905_HUAPED106_Vietnam
KX
70
89
05
_H
UA
PE
D1
06
_V
ietn
am
KX708904_HUAPED103_Vietnam
KX
70
89
04
_H
UA
PE
D1
03
_V
ietn
am
KX982571_VN367_Vietnam_2014
KX
98
25
71
_V
N3
67
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982568_VN292_Vietnam_2014
KX
98
25
68
_V
N2
92
_V
ietn
am
_2
01
4
KR941554_VN60514_Vietnam_2014
KR
94
15
54
_V
N6
05
14
_V
ietn
am
_2
01
4
KR941552_VN20514_Vietnam_2014
KR
94
15
52
_V
N2
05
14
_V
ietn
am
_2
01
4
KR941553_VN10514_Vietnam_2014
KR
94
15
53
_V
N1
05
14
_V
ietn
am
_2
01
4
KX982565_VN262_Vietnam_2014
KX
98
25
65
_V
N2
62
_V
ietn
am
_2
01
4
KP455319_HUAPED67_Vietnam
KP
45
53
19
_H
UA
PE
D6
7_
Vie
tna
m
KP455316_HUAPED58_Vietnam
KP
45
53
16
_H
UA
PE
D5
8_
Vie
tna
m
KP455317_HUAPED60_Vietnam
KP
45
53
17
_H
UA
PE
D6
0_
Vie
tna
m
KP455315_HUAPED55_Vietnam
KP
45
53
15
_H
UA
PE
D5
5_
Vie
tna
m
KP455318_HUAPED63_Vietnam
KP
45
53
18
_H
UA
PE
D6
3_
Vie
tna
m
KP455320_HUAPED68_Vietnam
KP
45
53
20
_H
UA
PE
D6
8_
Vie
tna
m
KX982564_VN232_Vietnam_2013
KX
98
25
64
_V
N2
32
_V
ietn
am
_2
01
3
Pairwise identity (%)
100
99
98
97
96
94
93
92
91
90
89
Ghi chú: Vị trí của chủng PEDV_HY2017 được đánh dấu bởi mũi tên. Tỷ lệ % tương đồng được biểu thị bởi màu
sắc (thang màu đính kèm).
Hình 3. Mức tương đồng giữa chủng PEDV_HY2017 với PEDV ở Việt Nam
Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Huỳnh Thị Mỹ Lệ
469
3.2. Đặc điểm tương đồng trình tự nucleotide
Hình 3 trình bày kết quâ phån tích tương
đøng cÿa toàn bü phån đoän gen S (1533
nucleotide) giữa chÿng PEDV_HY2017 với 56
chÿng PEDV cÿa Việt Nam. Kết quâ cho thçy
chÿng PEDV_HY2017 có 2 mức tương đøng
nucleotide so với 56 chÿng PEDV cÿa Việt Nam:
tương đøng 90-91% (vùng màu xanh lam) và từ
95,7-98,2% (výng màu vàng). Tương đøng ở từng
vị trí nucleotide giữa chÿng PEDV_HY2017 so
với các chÿng PEDV ở Việt Nam được trình bày ở
hình 4.
Trong khoâng nucleotide 1-721 (Hình 4),
chÿng PEDV_HY2017 (i) Có sự tương đøng thçp
(<0,9) đùi với 8 chÿng PEDV ở Việt Nam là:
HUAPED55, HUAPED58, HUAPED60,
HUAPED63, HUAPED67, HUAPED68, VN232,
VN262 và (ii) Có sự tương đøng cao (>0,9) đùi
với 48 chÿng còn läi. Kể từ nucleotide 721 đến
1533, chÿng PEDV_HY2017 có mức tương đøng
cao (>0,9) đùi với 56 chÿng PEDV thu được. Sự
dao đüng về mức tương đøng trên döc chiều dài
gen S cÿa các chÿng PEDV lưu hành ở Việt
Nam (trình bày ở hình 4) cũng đã được biết đùi
với müt sù chÿng PEDV lưu hành trên thế giới,
trong đó có Trung Quùc (Chen & cs., 2016a). Kết
quâ so sánh tương đøng trình tự gen (Hình 3 và
4) cho thçy có ít nhçt 2 nhóm di truyền cÿa
PEDV ở Việt Nam.
3.3. Kết quả xây dựng cây phát sinh
chủng loại
Để làm rõ đặc điểm này, cây phát sinh
chÿng loäi đã được xây dựng dựa vào trình tự
đoän gen S gøm 1533 nucleotide (Hình 5). Cây
phát sinh chÿng loäi dựa vào müt phæn gen S
cho biết các chÿng PEDV trên thế giới và ở Việt
Nam bao gøm 2 genogroup là G1 và G2. Trong
56 chÿng PEDV ở Việt Nam được phân tích, có
8 chÿng thuüc về genogroup G1 và 48 chÿng
(bao gøm chÿng phân lêp PEDV_HY2017)
thuüc về genogroup G2 (Hình 5). Kết quâ phân
tích kể trên là phù hợp với các công bù trước
đåy về phân nhóm PEDV gây bệnh ở Việt Nam
(Nguyễn Trung Tiến & cs., 2015; Vui & cs.,
2015; Diep & cs., 2018). Mặc dù thuüc cùng
genogroup G2, nhưng 48 chÿng PEDV ở Việt
Nam nìm ở các nhánh khác nhau cÿa cây phát
sinh chÿng loäi. Chÿng PEDV_HY2017 (thu
thêp nëm 2017, Hình 6) được xác định thuüc
cùng phân nhóm với 8 chÿng PEDV thu thêp
từ nëm 2014-2015 (HUAPED106,
HUAPED103, VNK2, VN367, VN292,
VN20514, VN10514, VN60514).
0.5
0.7
0.9
10
1
16
1
22
1
28
1
34
1
40
1
46
1
52
1
58
1
64
1
70
1
76
1
82
1
88
1
94
1
10
01
10
61
11
21
11
81
12
41
13
01
13
61
14
21
Mứ
c tư
ơn
g đ
ồn
g
Vị trí nucleotide trung tâm*
Ghi chú: Trục Ox biểu diễn vị trí nucleotide trung tâm của mỗi nhóm gồm 200 nucleotide; mức tương đồng từ
cao-thấp (0-1) được biểu diễn ở trục Oy.
Hình 4. Mức tương đồng theo vị trí nucleotide giữa chủng PEDV_HY2017
với các chủng PEDV của Việt Nam
Một số đặc tính sinh học phân tử của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập ở lợn nuôi tại Hưng Yên
470
Việt Nam
G2
G1
Q3Q5
100%
100%
Ghi chú: các nhánh dẫn tới chủng PEDV ở Việt Nam được đánh dấu màu xanh, chủng PEDV_HY2017 được
đánh dấu màu đỏ. Giá trị bootstrap ở mỗi nút (node) được hiểu thị cho 2 nhánh chính.
Hình 5. Cây phát sinh chủng loại của PEDV dựa vào một phần gen S
3.4. Đặc điểm đột biến thêm - xóa
Trên cơ sở síp xếp trình tự nucleotide theo
cüt và so sánh, vùng gen S cÿa chÿng
PEDV_HY2017 có đüt biến thêm - xóa đã được
xác định (Hình 7). Trong 56 chÿng PEDV ở Việt
Nam, có 5 vị trí cÿa đoän gen mã hóa tiểu phæn
protein S1 mang đüt biến thêm - xóa. Các vùng
thêm- xóa thường ngín, chî gøm 1-2-4 codon,
ngoäi trừ chÿng KX982576 (nucleotide 1135-
1140) có đüt biến thêm 8 codon. So với chÿng
tham chiếu CV777 (chÿng virus thường được
dùng sân xuçt vacxin phòng bệnh do PEDV),
chÿng phân lêp PEDV_HY2017 có 2 vị trí mang
đüt biến xóa (nucleotide 172-177 và nucleotide
469- 480). Đüt biến thêm- xóa cÿa chÿng
PEDV_HY2017 phân lêp được nëm 2017 giùng
với 5 chÿng PEDV ở Việt Nam xuçt hiện vào
nëm 2014- 2015 (VNK2, HUAPED106,
HUAPED103, VN367, VN292).
Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Huỳnh Thị Mỹ Lệ
471
Đüt biến thêm - xóa täi các vị trí khác nhau
cÿa gen S đã được phát hiện ở nhiều chÿng
PEDV lưu hành ở nhiều quùc gia, với sù lượng
nucleotide thêm- xóa rçt đa däng: từ 1 đến 11
nucleotide (Marthaler & cs., 2014; Wang & cs.,
2014), hoặc từ 582- 648 nucleotide (Diep & cs.,
2017). Hiện nay, vai trò cÿa đüt biến thêm - xóa
trong cơ chế sinh bệnh cÿa PEDV chưa được làm
sáng tô. Kết quâ phân tích trình tự gen cÿa
chÿng PEDV nhược đüc hóa trên m÷i trường tế
bào (TC-PC177) thçy xuçt hiện đüt biến xóa 197
aa ở đæu N cÿa protein S. Đüt biến này đã được
chứng minh không ânh hưởng tới tính hướng tú
chức nhưng làm giâm đüc lực cÿa chÿng virus
(Hou & cs., 2017). Kết quâ so sánh trình tự gen
S giữa 56 chÿng PEDV cÿa Việt Nam nói chung
và chÿng phân lêp PEDV_HY2017 nói riêng cho
thçy výng mang đüt biến thêm - xóa từ vùng sù
1 đến vùng sù 4 (Hình 7) nìm hoàn toàn trong
výng đüt biến xóa 197 aa, do đó vai trò cÿa các
đüt biến thêm - xóa ở các chÿng PEDV lưu hành
ở Việt Nam cæn được làm rõ bìng thực nghiệm.
Trên protein S, có 3 vùng quyết định kháng
nguyên kích thích sân sinh kháng thể trung
hòa: COE từ aa 499-638 (Chang & cs., 2002),
S1D từ aa 636-789 (Sun & cs., 2007) và 2C10 từ
aa 1368-1374 (Cruz & cs., 2008). Đüt biến thêm
- xóa cÿa chÿng PEDV_HY2017 trong nghiên
cứu xây ra täi codon mã hóa aa ở các vị trí (so
với chÿng CV777) là: 58-59 (vùng 1), 158-159
(vùng 4) và đều nìm ngoài 3 epitop trung hòa
kể trên. Do đó, các đüt biến thêm - xóa được dự
đoán kh÷ng ânh hưởng tới đáp ứng miễn dịch.
Thực nghiệm in vitro đã chứng minh khâ nëng
trung hòa chéo giữa chÿng PEDV có đüt biến
thêm - xóa và những chÿng không có đüt biến
này (Chen & cs., 2016b).
20
15
20
14
2017
Ghi chú: Nhánh dẫn tới chủng PEDV ở Việt Nam được đánh dấu màu xanh, chủng PEDV_HY2017 được đánh
dấu màu đỏ. Giá trị bootstrap ở mỗi nút (node) được hiểu thị cho các phân nhánh.
Hình 6. Nhánh cây sinh học phân tử của PEDV dẫn tới chủng PEDV_HY2017
Một số đặc tính sinh học phân tử của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập ở lợn nuôi tại Hưng Yên
472
Ghi chú: Vị trí nucleotide được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 (AF353511).
Hình 7. Đột biến thêm - xóa ở một phần gen S của chủng virus PEDV_HY2017
5. KẾT LUẬN
- Đã xác định được bü møi theo nghiên cứu
cÿa Tian & cs. (2013) là phù hợp để giâi mã gen
chÿng PEDV_HY2017.
- Chÿng phân lêp PEDV_HY2017 thuüc
genogroup G2 và có mức tương đøng về trình tự
gen mã hóa tiểu phæn protein S1 với các chÿng
PEDV cÿa Việt Nam là 90%- 91% (genogroup
G1) 95,7%- 98,2% (genogroup G2).
- Chÿng PEDV_HY2017 mang 2 výng đüt
biến thêm- xóa ở đoän gen mã hóa tiểu phæn
protein S1 và giùng với các chÿng PEDV
genogroup G2 cÿa Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Boniotti M.B., Papetti A., Lavazza A., Alborali G.,
Sozzi E., Chiapponi C., Faccini S., Bonilauri P.,
Cordioli P. & Marthaler D. (2016). Porcine
Epidemic Diarrhea Virus and Discovery of a
Recombinant Swine Enteric Coronavirus, Italy.
Emerg Infect Dis. 22(1): 83-7.
Carvajal A., Arguello H., Martinez-Lobo F.J., Costillas
S., Miranda R., de Nova P.J.D. & Rubio P. (2015).
Porcine epidemic diarrhoea: new insights into an
old disease. Porcine Health Manag. 1(1): 12.
Chang S.H., Bae J.L., Kang T.J., Kim J., Chung G.H.,
Lim C.W., Laude H., Yang M.S. & Jang Y.S.
(2002). Identification of the epitope region capable
of inducing neutralizing antibodies against the
Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái, Huỳnh Thị Mỹ Lệ
473
porcine epidemic diarrhea virus. Mol Cells.
14(2): 295-9.
Chen X., Yang J., Yu F., Ge J., Lin T. & Song T. (2012). Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) samples from field cases in Fujian, China. Virus Genes. 45(3): 499-507.
Chen F., Ku X., Li Z., Memon A.M., Ye S., Zhu Y.,
Zhou C., Yao L., Meng X. & He Q. (2016a).
Genetic characteristics of porcine epidemic
diarrhea virus in Chinese mainland, revealing
genetic markers of classical and variant virulent
parental/attenuated strains. Gene. 588(1): 95-102.
Chen Q., Thomas J.T., Gimenez-Lirola L.G., Hardham
J.M., Gao Q., Gerber P.F., Opriessnig T., Zheng
Y., Li G., Gauger P.C., Madson D.M., Magstadt
D.R. & Zhang J. (2016b). Evaluation of serological
cross-reactivity and cross-neutralization between
the United States porcine epidemic diarrhea virus
prototype and S-INDEL-variant strains. BMC Vet
Res. 12(1): 70.
Chung H.C., Nguyen V.G., Moon H.J., Lee J.H., Park
S.J., Lee G.E., Kim H.K., Noh Y.S., Lee C.H.,
Goede D. & Park B.K. (2015). Isolation of Porcine
Epidemic Diarrhea Virus during outbreaks in
South Korea, 2013-2014. Emerg Infect Dis.
21(12): 2238-40.
Cruz D.J., Kim C.J. & Shin H.J. (2008). The
GPRLQPY motif located at the carboxy-terminal
of the spike protein induces antibodies that
neutralize Porcine epidemic diarrhea virus. Virus
Res. 132(1-2): 192-6.
Diep N.V., Norimine J., Sueyoshi M., Lan N.T. &
Yamaguchi R. (2017). Novel Porcine Epidemic
Diarrhea Virus (PEDV) Variants with Large
Deletions in the Spike (S) Gene Coexist with
PEDV Strains Possessing an Intact S Gene in
Domestic Pigs in Japan: A New Disease Situation.
PLoS One. 12(1): e0170126.
Diep N.V., Sueyoshi M., Izzati U., Fuke N., Teh A.P.P., Lan N.T. & Yamaguchi R. (2018). Appearance of US-like porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) strains before US outbreaks and genetic heterogeneity of PEDVs collected in Northern Vietnam during 2012-2015. Transbound Emerg Dis. 65(1): e83-e93.
Do Tien Duy, Nguyen Tat Toan, Puranaveja S. & Thanawongnuwech R. (2011). Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks. Thai Journal of Veterinary Medicine. 41(1): 55-64.
Gao Y., Kou Q., Ge X., Zhou L., Guo X. & Yang H.
(2013). Phylogenetic analysis of porcine epidemic
diarrhea virus field strains prevailing recently in
China. Arch Virol. 158(3): 711-5.
Grasland B., Bigault L., Bernard C., Quenault H.,
Toulouse O., Fablet C., Rose N., Touzain F. &
Blanchard Y. (2015). Complete genome sequence
of a porcine epidemic diarrhea s gene indel strain
isolated in france in december 2014. Genome
Announc. 3(3): e00535-15.
Hou Y., Lin C.M., Yokoyama M., Yount B.L.,
Marthaler D., Douglas A.L., Ghimire S., Qin Y.,
Baric R.S., Saif L.J. & Wang Q. (2017). Deletion
of a 197-amino-acid region in the N-terminal
domain of spike protein attenuates porcine
epidemic diarrhea virus in piglets. J Virol.
91(14): e00227-17.
Kumar S., Stecher G. & Tamura K. (2016). MEGA7:
molecular evolutionary genetics analysis version
7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol.
33(7): 1870-4.
Le V.P., Le D.Q., Than D.D., Nguyen T.T., Nguyen
B.H., Choi S.E. & An D.J. (2016). Genetic
diversity of the spike gene of the porcine epidemic
diarrhea virus collected from the central and
northern Vietnam during 2013-2016, 19th
Federation of Asian Veterinary Associations
Congress. pp. 113-117.
Lee C. (2015). Porcine epidemic diarrhea virus: An
emerging and re-emerging epizootic swine virus.
Virol J. 12(1): 193.
Li C., Li W., Lucio De Esesarte E., Guo H., Van Den
Elzen P., Aarts E., Van Den Born E., Rottier P.J.
M. & Bosch B.J. (2017). Cell attachment domains
of the porcine epidemic diarrhea virus spike
protein are key targets of neutralizing antibodies. J
Virol. 91(12): e00273-17.
Marthaler D., Bruner L., Collins J. & Rossow K.
(2014). Third strain of porcine epidemic diarrhea
virus, United States. Emerg Infect Dis.
20(12): 2162-3.
Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy (2012). Đặc trưng
kiểu gien của virus gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV)
trên heo ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ. Tạp
chí Khoa học Kĩ thuật Thú y. 19(7): 34-41.
Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Đình Quát, Trịnh Thị Thanh
Huyền, Đỗ Tiến Duy, Trần Thị Dân, Nguyễn Thị
Phước Ninh & Nguyễn Thị Thu Năm (2012). Phát
hiện virus gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) trên heo
ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ. Tạp chí Khoa học
Kĩ thuật Thú y. 19(5): 23-28.
Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ
Lệ, Nguyễn Bá Hiên & Lê Văn Phan (2015). Một
số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch
tiêu chảy cấp ở lợn (porcine epidemic diarrhea-
PED) tại Quảng Trị, Thái Nguyên và Thái Bình tự
năm 2013-2014. Tạp chí Khoa học và Phát triển.
13(7): 1089-1100.
Oldham J. (1972). Letter to the editor. Pig Farming. p. 10.
Một số đặc tính sinh học phân tử của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập ở lợn nuôi tại Hưng Yên
474
Song D., Moon H. & Kang B. (2015). Porcine epidemic diarrhea: a review of current epidemiology and available vaccines. Clin Exp Vaccine Res. p. 4.
Song D. & Park B. (2012). Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines. Virus Genes. p. 44.
Sun D.B., Feng L., Shi H.Y., Chen J.F., Liu S.W. & Chen H.Y. (2007). Spike protein region (aa 636-789) of porcine epidemic diarrhea virus is essential for induction of neutralizing antibodies. Acta Virol. p. 51.
Theuns S., Conceicao-Neto N., Christiaens I., Zeller M., Desmarets L.M., Roukaerts I.D., Acar D.D., Heylen E., Matthijnssens J. & Nauwynck H.J. (2015). Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus from a novel outbreak in
belgium, january 2015. Genome Announc. 3(3): e00506-15.
Tian Y., Yu Z., Cheng K., Liu Y., Huang J., Xin Y., Li
Y., Fan S., Wang T., Huang G., Feng N., Yang Z.,
Yang S., Gao Y. & Xia X. (2013). Molecular
characterization and phylogenetic analysis of new
variants of the porcine epidemic diarrhea virus in
Gansu, China in 2012. Viruses. 5(8): 1991-2004.
Vui D.T., Thanh T.L., Tung N., Srijangwad A.,
Tripipat T., Chuanasa T. & Nilubol D. (2015).
Complete genome characterization of porcine
epidemic diarrhea virus in Vietnam. Arch Virol.
160(8): 1931-8.
Wang L., Byrum B. & Zhang Y. (2014). New variant
of porcine epidemic diarrhea virus, United States.
Emerg Infect Dis. 20(5): 917-9.