MÉTODO DE ENSAYO: DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN

OFICINA DE CENTROS DE DIAGNÓSTICO Y PRODUCCIÓN

Unidad del Centro de Control de Insumos y

Residuos Tóxicos

MET-UCCIRT/Res-15 MÉTODO DE ENSAYO: DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A

EN ALIMENTOS POR CROMATOGRAFÍA LIQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASA EN TANDEM

(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 1 de 21

Esta versión está vigente, en tanto esté publicada en la Intranet. En caso de imprimir este documento con fines didácticos, una vez utilizado debe destruirlo, bajo responsabilidad.

TABLA DE CONTENIDO:

Introducción

1. Objetivo

2. Campo de aplicación

3. Referencias

4. Definiciones

5. Metodología

6. Antecedentes

7. Anexos



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 2 de 21


INTRODUCCIÓN

La contaminación de los alimentos con ocratoxinas es producida por ciertos hongos o

mohos, particularmente del genero Aspergillus y Penicillium que crecen sobre productos

agrícolas de áreas templadas (cereales, uvas, paprika etc.) y de áreas tropicales (café,

cacao, etc.), cuando éstos alimentos no han sido tratados correctamente después de su

cosecha y contienen mucha humedad, o cuando se humedecen durante su transporte o

almacenamiento.

La legislación Europea (UE 105/2010) ha establecido recientemente límite máximo de 30

ug/kg para ocratoxina A en especias.

Los métodos analíticos frecuentemente utilizados para la cuantificación de micotoxinas

incluye la cromatografía liquida con detector de fluorescencia y más recientemente el uso de

detectores de masa para la cuantificación simultanea de varios tipos de micotoxinas,

incluyendo aflatoxina y ocratoxinas.

Es un método modificado a partir de Aplication Note-paprika- Ocratoxina A, Extraction

method, Ref No. A-3-P14.V.4 May 2009, R. Biopharm Rhône Ltd, el cual ha sido validado en

el informes IVA-008-10, IVA-008-13 y IVA-008-15.

1. OBJETIVO

Describir los pasos para la detección y cuantificación de Ocratoxinas en alimentos por

Cromatografía Liquida acoplada a Espectrometría de Masa en Tandem (LC-MS/MS).

2. CAMPO DE APLICACIÓN

Aplica para la determinación de Ocratoxina A en muestras de páprika en polvo y entera,

cereales y café verde en concentraciones de 0.5 a 200 ug/kg (ppb), para

concentraciones mayores tomar menor cantidad de muestra o diluir.

Las actividades establecidas en el presente método de Ensayo aplican tanto a las

colaboradoras como a los colaboradores en la UCCIRT, de la OCDP, sin distinción de

género y promoviendo la interculturalidad.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 3 de 21


3. REFERENCIAS

Aplication Note-paprika- Ocratoxina A, Extraction method, Ref No. A-3-P14.V.4 May

2009, R. Biopharm Rhône Ltd.

AOAC OFFICIAL METHOD OF ANALYSIS (2000). AOAC Official Method 2000.03

Ocratoxina A in barley.

REGLAMENTO UE) N o 105/2010 DE LA COMISIÓN de 5 de febrero de 2010 por el

que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos

alimenticios.

Directiva 2002/657/CE DE LA COMISIÓN del 12 agosto de 2002

Directiva 96/23/CE relativa a las medidas de control aplicables respecto de

determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos.

ITR -UCCIRT/Res-017 Manejo del Sistema de Cromatografía Líquida de Ultra

performance Acquity UPLC/Xevo TQ-S

ITR-UCCIRT/Lab-07 Lavado de material de vidrio UCCIRT.

ITR-UCCIRT/Lab-06 Manejo del Sistema de Gases y de la Unidad de Vacío de la

UCCIRT.

REG-UCCIRT/Lab-29 Registro de materiales de referencia.

REG-UCCIRT/Lab-30 Registro de verificación de la balanza.

REG-UCCIRT/Lab-61 Hoja de trabajo de ensayo

REG-UCCIRT/Res-10 Registro de toma de muestra.

4. DEFINICIONES

4.1. Ocratoxina A.

Ocratoxina A es una sustancia tóxica producida por ciertos tipos de hongos (o

mohos), particularmente de los géneros Aspergillus y Penicillium



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 4 de 21


4.2. Columnas de inmunoafinidad

Las columnas de inmunoafinidad contienen anticuerpos capaces de “atrapar” y

purificar micotoxinas en sustratos difíciles como el café, especias, algodón, cerveza y

otros.

La alta especificidad lograda con estos anticuerpos permite obtener extractos limpios

para su posterior detección por métodos cromatográficos (TLC, HPLC) o fluorometría.

5. METODOLOGÍA

El método es ejecutado por especialista o técnico autorizado en el registro Listado de Personal Autorizado para Realizar Ensayos REG-UCCIRT/Cal-11

5.1. Principio

La porción de muestra homogenizada es extraída con una solución acuosa de bicarbonato de sodio al 1% o Acetonitrilo:agua (60:40). El extracto es filtrado y purificado con una columna de inmunoafinidad. La columna retiene interferencias tales como grasa, compuestos proteicos y carbohidratos extraídos a partir de las muestras de alimentos; la Ocratoxina A es eluída de la columna con metanol:ácido acético 98:2 v/v y cuantificadas por cromatografía liquida de alta performance acoplada a espectrometría de masa tandem cuadrupolar usando electrospray positivo (+)

5.2. Precauciones de seguridad

5.2.1. Se requieren mandil, guantes y anteojos de protección

5.2.2 La ocratoxina A debe manejarse con extremo cuidado y evitar el contacto, inhalación e

ingestión, es potencialmente carcinógeno a los seres humanos (Grupo 2B).

5.3 Precauciones de Operación

5.3.1 Es muy importante la limpieza del material de vidrio utilizado en este procedimiento para

evitar interferencias durante el análisis. Todo material es descontaminado manteniéndolo

toda la noche en solución de hipoclorito de sodio al 2 %. Luego se prosigue con el

procedimiento de lavado del instructivo ITR-UCCIRT/Lab-07. Finalmente se enjuaga

con metanol.

5.3.2 Columnas de inmunoafinidad Ocraprep debe almacenarse a una temperatura de 2-8 °C.

http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/Carcinogen

http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/List_of_IARC_Group_2B_carcinogens



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 5 de 21


5.3.3 Se utiliza reactivos de grado analítico o de grado plaguicida que cumplan con las normas

internacionales de calidad (ACS, ISO).

5.3.4 Cuando se prepara un reactivo o muestra de control se debe llenar el registro

correspondiente REG-UCCIRT/ Lab-46 disponible en PRO-UCCIRT/Lab-06 Control de

datos.

5.3.5 Se consulta el manual de operación del equipo HPLC-MS-Ms para el buen manejo,

mantenimiento preventivo y el manual de referencia del software para el manejo de los

datos cromatográficos.

5.4 Equipos y materiales

5.4.1 Equipos:

a. Robot Coupe Blixer 3

b. Balanza analítica Digital (marca A & D, modelo GR 200)

c. Vortex Mixer (Marca : Barnstead Thermolyn , modelo: Maxi Mix II 8294c50 ).

d. Centrífuga (Marca : Thermoelectron, modelo : Multi RF )

e. Columna LC: C-18 – 150 x 2.1 mm id, 5 µm.

f. Cromatógrafo Líquido de Alta performance (HPLC): con bomba cuaternaria,

auto sampler con control de temperatura, horno de columna y desgasificador. (Marca : Waters, Modelo : Alliance 2695 XE.

g. Espectrómetro de masas en tandem con sonda ESI en modo de operación positivo. Marca: Micromass, Modelo :Quatro Premier XE.

h. Software del LC-MSMS :Masslynx 4.1

i. Espectrofotómetro UV-Visible Nicolet evolution 300.

j. Cromatógrafo Líquido de Ultra performance (UPLC). Marca Waters , Modelo: Acquity.

k. Espectrómetro de masas en tandem con sonda ESI en modo de operación positivo Marca: Micromass Xevo TQS

l. Columna cromatográfica Fase reversa C18, 100 mm x 2,1 mm, 1,7 um



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 6 de 21


m. Software del LC-MSMS :Masslynx 4.1

n. Equipo de filtración con bomba de vacío, para filtrar fase móvil.

5.4.2 Materiales

a. Guantes de nitrilo.

b. Pipetas Pasteur.

c. Matraz erlenmeyer 250 mL o frascos de 250 y frascos de 500 ml.

d. Gradilla para tubos de 50 ml.

e. Pipetas volumétricas de 5, 10 y 15 ml.

f. Embudo de vidrio

g. Filtros de jeringa de PTFE de 0.22 m de diámetro de poro.

h. Viales de 1.5 ml para autosampler HPLC.

i. Tubos de ensayo de borosilicato de 15x85 mm

j. Papel de filtro de 12.5 cm, cualitativo.

k. Columnas de inmunoafinidad OCHRAPREP.

l. Insertos de 300 µl

m. Filtro de membrana 47mm de diámetro 0.45 µm de tamaño de poro

Para verificar la performance del cartucho, pasar a través del cartucho 20 ml de

solución PBS conteniendo un total de aproximadamente 20 ng de Ocratoxina A. La

recuperación debe ser >80%.sólo se realiza si se cambia de marca de columna de

inmunoafinidad, evaluando mínimo tres recuperaciones en diferentes matrices.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 7 de 21


5.5 Reactivos

Por lo general el tiempo de preservación de los reactivos es un año como máximo, salvo que se indique lo contrario. Todos los reactivos se deben almacenar en recipientes adecuados, provistos de etiquetas con el nombre del reactivo, concentración, medio, fecha de preparación, fecha de vencimiento e iniciales del analista. En caso de preparar un reactivo, se debe llenar el registro correspondiente, asimismo mantener un registro de la temperatura del refrigerador donde se almacenan los reactivos estándares.

5.5.1. Sustancias Químicas

a) Agua grado HPLC.

b) Metanol grado HPLC.

c) Acetonitrilo grado HPLC.

d) Acido acético Glacial 100%.

e) Bicarbonato de sodio NaHCO3

f) Cloruro de potasio grado KCl ACS.

g) Fosfato de dihidrógeno de potasio KH2PO4

h) Disodio hidrógeno fosfato Na2HPO4

i) Cloruro de sodio NaCl ACS.

j) Ocratoxina A.

k) Tween 20.

l) Tolueno grado GC.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 8 de 21


5.5.2 Soluciones:

a) Solución de Elución: Metanol/ acido acético 98:2 v/v.

Se mezcla 98 mL de metanol y 2 mL de ácido acético glacial 100%. Mezclar por

inversión.

b) Solución Acetonitrilo : Agua : Acido acético 51:47:2 v/v/v (Fase Móvil A)

Se mezcla 510 ml acetonitrilo, 470 ml de agua HPLC y 20 ml de ácido acético

glacial.

c) Solución de extracción bicarbonato de sodio al 1%

Se pesa 10 g de bicarbonato de sodio en un matraz aforado de 1 L y completar

a volumen con agua.

d) Solución PBS:

Se pesa 0.2 g de KCl, 0.2g KH2PO4, 1.16 g Na2HPO4 y 8 g de NaCl, y se

disuelve en 900 ml de agua, se ajusta a pH 7.4 con 0.1M HCl o NaOH. Se

completa a volumen con agua en un frasco volumétrico de 1000 ml.

e) Solución PBS: 0.01% Tween 20.

Se pesa 0.02 g de Tween 20 en un frasco volumétrico de 200 ml y se enrasa con

solución de PBS (d).

f) Solución PBS: 0.1% Tween 20.

Se pesa 0.2 g de Tween 20 en un frasco volumétrico de 200 ml y se enrasa con

solución de PBS (d).

g) Solución de extracción acetonitrilo:agua 60:40%

Se mezcla 600 ml de acetonitrilo y 400 ml de agua HPLC.

h) Solución de tolueno: ácido acético 99:1.

Se mezcla 99 ml de tolueno y 1 ml de ácido acético glacial.

5.5.3 Soluciones de Estándares:

a) Solución Stock de Ocratoxina A 1000 ug/ml.

Disponible comercialmente en solución o preparadas a partir de Ocratoxina A en

tolueno:ácido acético 99:1%.

b) Solución Intermedia de Ocratoxina A 20 ug/ml



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 9 de 21


Se diluye 0.2 ml de la solución stock de 1000 ug/ml en un frasco volumétrico de

10 ml y se lleva a volumen con tolueno:acido acético 99:1. Determine la

concentración exacta seguir paso 5.6.1.

c) Solución patrón de Ocratoxina A 2 ug/ml o 1 ug/ml

Se pipetea un 1 ml de la solución intermedia de 20 ug/ml en un vial o frasco

volumétrico, se evapora en un rotaevaporador de nitrógeno hasta sequedad, y

se reconstituye con 10 ml de metanol.

La solución de ocratoxina A 1 ug/ml disponible comercialmente y con certif icado

de análisis.

d) Soluciones de la Curva de Calibración

Se diluye la solución patrón en solución de elución metanol/Acido acético (98:2,

v/v) para preparar una solución de aproximadamente 10 ng/ml, a partir de esta

solución se prepara la secuencia de soluciones estándar de calibración de

acuerdo al siguiente cuadro, con la concentración de aproximadamente 2 a 10

ng/ml.

Nivel Solución 10 ng/ml.

(ml)

Volumen final, ml.

Concentración ng/ml

1 0.25 10 0.5

2 0.50 10 1.00

3 1.00 10 2.00

4 2.00 10 5.00

5 0.100* 10 10.00

* volumen tomado de solución patrón de 1 ug/ml, ó 0.05 ml de la solución patrón de 2 ug/ml.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 10 de 21


5.6 Procedimiento

5.6.1. Determinación de la concentración del estándar de ocratoxina A,

(20ug/ml).

a) Se registra la curva de absorción entre las longitudes de onda de 300 nm y 370

nm, con una celda de cuarzo de 1 cm, se utiliza un blanco de referencia de

tolueno:ácido acético 99:1%.

b) Se identifica la longitud de onda de máxima absorción y se registra la

absorbancia a esta longitud onda.

c) Se calcula la concentración de ocratoxina A de la siguiente ecuación:

Dónde:

Am: es la absorción determinada a la máxima longitud de onda (normalm. 333nm)

M: es la masa molar en gramos por mol de ocratoxina A (M=403.8 g/mmol)

ε: es el coeficiente de absorción molar en metros cuadros por mol de ocratoxina A

en la mezcla de solvente (ε=544m2/mol)

b: es la longitud de paso óptico, en cm de la celda de cuarzo.

Nota 1: no se realiza este paso si se adquiere la solución patrón de 1 ug/ml con

certificado de análisis.

Nota 2 Se realiza la lectura de concentración cada 3 meses ó si se prepara un

nuevo estándar.

5.6.2 Preparación de muestra para paprika y nuez

a) Se pesa 10 g de muestra homogenizada dentro de un matraz erlenmeyer de

250 mL.

b

M A = C

mOTA

100



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 11 de 21


b) Se agrega 200 mL de la solución de extracción, bicarbonato de sodio al 1%.,

Se agita en un homogenizador a alta velocidad por 3 minutos o por agitador

horizontal durante 30 minutos.

c) Se filtra a través de papel de filtro y recolecta el extracto.

d) Se transfiere 20 ml del extracto (equivalente a 1 g de muestra) y se pasa a

través de Columna de inmunoafinidad Ocraprep, a un flujo de 2-3 ml por

minuto.

e) Se lava la columna con 20 ml de solución de PBS:0.01 % Tween 20. A un flujo

aproximado de 5 ml por minuto, se elimina completamente la solución de lavado

f) Se coloca un nuevo tubo debajo de la columna y se eluye con 1.5 ml

metanol:ácido acético 98:2 v/v, colectados por gravedad, durante la elución

realice tres veces el cambio de dirección de flujo (back flushing) con ayuda de

una jeringa.

g) Se colecta las últimas gotas de eluato y se adiciona a la columna 0.5 ml de

metanol:ácido acético 98:2: y se recibe en el mismo tubo, para dar un volumen

final de 2 ml (equivalente a 0.5 g de muestra por ml)

h) Se tapa y agita suavemente en Vortex por aproximadamente 30 segundos para

mezclar el contenido de los tubos.

i) Se filtra la solución a través de filtros de jeringa de PTFE de 0.22 µm.

j) Se Inyecta 20ul del filtrado en el LC-MS/MS en modo ESI+ .ó 2 µl en el UPLC-

Ms/Ms.

5.6.3 Preparación de muestra para cereales

a) Se pesa 50 g (o 25 gramos) de muestra homogenizada dentro de un matraz

erlenmeyer de 500 mL.

b) Se agrega 200 mL(o 100 ml) de la solución de extracción acetonitrilo:agua

60:40%, (o solución de 86:14 cuando se realiza OTA y aflatoxina en la muestra)

Se agita en un homogenizador a alta velocidad por 3 minutos o por agitador

horizontal durante 30 minutos.

c) Se filtra a través de papel de filtro rápido y recolecta el extracto.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 12 de 21


d) Se transfiere 2.0 ml del extracto (equivalente a 0.5 g de muestra) y se diluye con

22 de PBS, luego se pasa a través de Columna de inmunoafinidad Ocraprep, a

un flujo de 2-3 ml por minuto.

e) Se lava la columna con 20 ml de solución de PBS a un flujo aproximado de 5 ml

por minuto, se elimina completamente la solución de lavado


metanol:acido acético 98:2 v/v, colectados por gravedad, durante la elución

realice por tres veces el cambio de dirección de flujo (back flushing) con ayuda

de una jeringa.







k) Se Inyecta 20ul del filtrado en el LC-MS/MS en modo ESI+ .ó 2 µl en el UPLC-

Ms/Ms.

5.6.4 Preparación de muestra para café verde y cacao

a) Se pesa 5.0 g o 10 g de muestra homogenizada dentro de un matraz erlenmeyer

de 250 mL.

b) Se agrega 100 mL de la solución de extracción o 200 ml si se usa 10 gramos de

muestra, bicarbonato de sodio al 1%., Se agita en un homogenizador a alta

velocidad por 3 minutos o por agitador horizontal durante 30 minutos.

c) Se filtra a través de papel de filtro rápido y recolecta el extracto.

d) Se transfiere 10.0 ml del extracto (equivalente a 1.0 g de muestra) y se diluye

con 10 ml de PBS: 0.01% Tween 20, luego se pasa a través de Columna de

inmunoafinidad Ocraprep, a un flujo de 2-3 ml por minuto.

e) Se lava la columna con 20 ml de solución de PBS: 0.01% Tween 20. A un flujo

aproximado de 5 ml por minuto, se elimina completamente la solución de lavado



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 13 de 21



metanol:acido acético 98:2 v/v, colectados por gravedad, durante la elución

realice por tres veces el cambio de dirección de flujo (back flushing) con ayuda

de una jeringa.







l) Se Inyecta 20ul del filtrado en el LC-MS/MS en modo ESI+ . ó 2 µl en el UPLC-

Ms/Ms.

5.6.5 Condiciones que se verifican del Cromatógrafo Liquido

Para el sistema cromatografico HPLC:

Equipo: Alliance 2695.

Columna: X Terra®MS C18 5µm, 2.1 x 150 mm.

Volumen de inyección: 20 µL

Isocratico

Solvente A= acetonitrilo : agua : ácido acético 51:47:2 v/v/v

Reequilibrio de 2 minutos antes de la próxima inyección.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 14 de 21


Para el Sistema Cromatográfico UPLC

Columna cromatográfica Fase reversa C18, 100 mm x 2,1 mm, 1,7 um

Fase Móvil Fase Móvil A: acetonitrilo : agua : ácido acético 51:47:2 v/v/v

Condición de flujo : isocratico

Flujo: 0.3 ml/min

Volumen de inyección 2 uL

Temperatura 40°C±10°C

Secuencia de inyección:

1- Bco. solventes

2- Bco. de tejido

3- Estándar 1 ng/mL






9- Control o fortificación

10- muestras



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 15 de 21


5.6.6 Condiciones que se verifican del Espectrómetro de Masa en Tandem (MS/MS) previo

al análisis:

Equipo: Quattro Premier XE (Waters, Milford, MA, USA). Polaridad: ES positivo

Voltaje del Capilar (kV): 3.0

Voltaje de Cono (V): 30

Extractor (V):

Lentes RF 1 (V): 0.1

Temperatura de la fuente (ºC): 120

Temperatura de desolvatación (ºC): 350

Flujo del gas de desolvatación (L/h): 800

Flujo del gas de cono (L/h):

Resolución LM 1: 13.50

Resolución HM 1: 13.50

Energía del ión 1(eV): -0.1

Entrada: 1

Colisión: 25

Salida: 1

Resolución LM2: 11.00

Resolución HM2: 11.00

Energía del ión 2 (eV): 1



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 16 de 21


Condiciones MRM:

Para cada Ocratoxina se utiliza dos transiciones MRM, uno para cuantificación y otro para confirmación:

Tabla 2: Condiciones MRM

Compuesto

Transición MS/MS

Dwell Time

(s)

Voltaje de cono

(V)

Energía de colisión

(eV)

Modo de Ionización

Ocratoxina A 404.0 >239.2 (1)

404.0 >358.1 (2) 0.2

30

30

25

15

ESI+

ESI+

(1) Transición principal MRM utilizada para la cuantificación

(2) Transición secundaria MRM utilizada para la confirmación.

Nota: las condiciones del equipo pueden variar de acuerdo a las calibraciones

realizadas al equipo

Micromass Xevo TQS

Fuente de Ionización Electrospray

(ESI)

Modo de Ionización Positivo

[M+H ]+

Temperatura de la fuente (°C) 150

Voltaje del Capilar (kV): 3.50

Voltaje de Cono (V) 30

Source offset 50

Temperatura de solvatación (°C) 500

Flujo del gas de solvatación (L/Hr) 600



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 17 de 21


Flujo de gas de cono ((L/Hr): 150

Nebulizador 7

Resolución LM1 3.06

Resolución HM1 14.4

Ion energy 1 0.5

Resolución LM2 3.0

Resolución HM2 14.45

Ion energy 2 0.5

Flujo de gas de colisión (mL/min) 0.16

collision 4

Condiciones MRM:

Para la ocratoxina A se utiliza dos transiciones MRM, uno para cuantificación y

otro para confirmación:

Tabla 3. Condiciones MRM

Compuesto

Transición MS/MS

Dwell

Time

(s)

Voltaje

de cono

(V)

Energía de

colisión

(eV)

Modo de

Ionización

Ocratoxina A 404.05 > 239.05 (1)

404.05 > 358.2 (2)

0.247

0.247

26

26

20

12

ESI+

ESI+

5.7 Cálculo y expresión de resultados



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 18 de 21


5.7.1. Cuantificación del resultado

La cuantificación de los resultados se realiza interpolando las áreas de las muestras

analizadas en la curva de calibración utilizando el método del estándar externo. El

método cuantitativo MS/MS es el MRM (Monitoreo de Reacción Múltiple). El

procesamiento de datos de las muestras, blancos, y estándares se realiza con el

software MassLynx 4.1 con la aplicación TargetLynx 4.1.

La concentración de Ocratoxina A en la muestra se calcula de la siguiente ecuación:

Donde:

Ci = concentración derivada de la curva de calibración en ug/ml.

Vd1 = volumen de la solución de extracción (ml)

Vd2 = volumen de la solución de extracción tomado para la limpieza por la columna

(ml)

Vf = volumen final de extracto(ml).

Wm = Peso de muestra (g)

R = % de recuperación/100 de la muestra adicionada o control fortificado

Nota: a todas las muestras se realiza corrección por recuperación obtenida del control.

5.7.2. Cálculo de confirmación:

El cálculo confirmatorio será realizado a las muestras que presenten resultados

mayores a contenidos máximos permitidas en la matriz

a) Los límites de tolerancia son establecidos según las siguientes ecuaciones:

Limites Tr = (1± % Tolerancia Tr/100)*Trp

Limites Ratio = ((100± %T ratio)/100)*Rp

Donde:

Trp: Tiempo de retención relativa promedio de los 6 estándares de calibración.

Rp: Ratio promedio de iones precursores para los 6 estándares de calibración.

%Tolerancia Tr: 2.5 para HPLC-Ms/Ms ( ver tabla 3)

% T ratio: 20, debido a que el ratio de los precursores es mayor 50% (ver tabla 3)

Vd2xWmxR

Vd1xVfng/mlCiug/KgC



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 19 de 21


Las tolerancias máximas permitidas de intensidad relativa de iones se muestran en

el siguiente cuadro (establecido en la Directiva 2002/657/CE):

Tabla 3: Tolerancias Máximas

LC-MS/MS

% Tolerancia Tr 2.5

% Tolerancia Ratio <= 10 50

% Tolerancia Ratio [10-20] 30

% Tolerancia Ratio [20-50] 25

% Tolerancia Ratio > 50 20

Puntos Id. por ion/transition N° 1 2.5

Puntos Id. por ion/transition N° 2-4 (a) 1.5

Puntos Id. por ion/transition N° 2-4 (b) 2.5

(a) mismo precursor, (b) diferente precursor

b) La asignación de puntos confirmatorios para la identificación de Ocratoxina A:

Si la muestra cumple con los límites de tolerancia establecida en a) Se procede

con la asignación de puntos confirmatorios.

La técnica LC-MS-MS se realizará con un 1 precursor y dos productos, por tanto

de acuerdo a la tabla 3, el total de puntos IPs es 4.0 según lo establecido en las

Directiva 2002/657/CE y 96/23/CE.

c) Los resultados se expresan en µg de Ocratoxina A /Kg de muestra. Los cuales

son registrados en la hoja de trabajo correspondiente. (REG-UCCIR/Lab-61)

disponible en PRO-UCCIRT/Lab-06 Control de Datos.



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 20 de 21


5.8 Control de Calidad

parámetro de

calidad Interno Frecuencia

Criterio de

aceptación

Acción

inmediata

Acciones en casos

reiterativos

Blanco reactivo

En cada lote

de muestras

analizadas

< LoD

Corroborar la

lectura,

inyectando

nuevamente, y

verificar blanco

matriz

Verificar solventes

usados. Repetir lote

analizado, tres o más

casos consecutivos,

generan un SACP.

Blanco matriz

En cada lote

de muestras

analizadas

< LOQ

Cuando no se

encuentre

disponible,

utilizar como

adición

estándar,

---

Calibración mínimo

3 puntos

En cada lote

de muestras

analizadas

r2 > 0.99 Calibrar

nuevamente

Verificar mantenimiento

del equipo. Repetir la

curva de calibración y

las inyecciones de las

muestras

Duplicados

Cada 10

muestra

analizadas o

en cada lote.

RSD <20%

Repetir la

muestra

analizada

Verificar la

homogeneidad de la

muestra y repetir el

análisis de los

duplicados.

Muestra o blancos

fortificados

En cada lote

de muestras

analizadas o

después de 30

muestras

Recuperación

según cartas

control

(aprox.60-

120)

Repetir la

muestra

analizada

Verificar la

homogeneidad de la

muestra y repetir

análisis de la muestra

fortificada..

Estándar de

verificación de

Cada 10

muestras

RSD < 20%

respecto a la

Calibrar

nuevamente

Verificar estándares y

fechas de vencimiento,



Residuos Tóxicos



(LC-MS/MS).

Revisión: 04

Página 21 de 21


calibración calibración

inicial

calibrar nuevamente y

repetir las inyecciones

del lote analizado

* tres o más casos consecutivos generan una SACP

LoD = Límite de detección del método

LoQ = límite de cuantificación del método

6. ANTECEDENTES

No aplica

7. ANEXO

No aplica

Documents

MÉTODO DE ENSAYO: DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN