Multiples Sequenz Alignment

3. Vorlesung WS 2005/2006 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 1

Multiples Sequenz AlignmentLiteratur: Kapitel 4 in Buch von David Mount

Thioredoxin-Beispiel heute aus Buch von Arthur Lesk


Einfach

Schwierig wegen Insertionen und

Deletionen(indels)

Alignments können einfach oder schwer sein

GCGGCCCA TCAGGTACTT GGTGGGCGGCCCA TCAGGTAGTT GGTGGGCGTTCCA TCAGCTGGTT GGTGGGCGTCCCA TCAGCTAGTT GGTGGGCGGCGCA TTAGCTAGTT GGTGA******** ********** *****

TTGACATG CCGGGG---A AACCGTTGACATG CCGGTG--GT AAGCCTTGACATG -CTAGG---A ACGCGTTGACATG -CTAGGGAAC ACGCGTTGACATC -CTCTG---A ACGCG******** ?????????? *****


Homo sapiens DjlA protein

Escherichia coli DjlA protein

Protein-Alignment kann durch tertiäre Strukturinformationen geführt werden

nur so kann man letztlich auch bewerten, ob ein Sequenzalignmentkorrekt ist.


• Homologie: Ähnlichkeit, die durch

Abstammung von einem gemeinsamen

Ursprungsgen herrührt –

die Identifizierung und Analyse von

Homologien ist eine zentrale Aufgabe

der Phylogenie.

• Ein Alignment ist eine Hypothese

für die positionelle Homologie

zwischen Basenpaaren bzw.

Aminosäuren.

Definition von “Homologie”

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MSA für Thioredoxin-FamilieFarbe Aminosäuretyp Aminosäurengelb klein, wenig polar Gly, Ala, Ser, Thrgrün hydrophob Cys, Val, Ile, Leu

Pro, Phe, Tyr, Met, Trpviolett polar Asn, Gln, Hisrot negativ geladen Asp, Glublau positiv geladen Lys, Arg


Infos aus MSA von Thioredoxin-FamilieThioredoxin: aus 5 beta-Strängen bestehendes beta-Faltblatt, das auf beiden Seiten von alpha-Helices flankiert ist.

gemeinsamer Mechanismus: Reduktion von Disulfidbrücken in Proteinen


Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie

1) Die am stärksten konservierten Abschnitte entsprechen wahrscheinlich dem aktiven Zentrum.Disulfidbrücke zwischen Cys32 und Cys35 gehört zu dem konservierten WCGPC[K oder R] Motiv.Andere konservierte Sequenzabschnitte, z.B. Pro76Thr77 und Gly92Gly93 sind an der Substratbindung beteiligt.



2) Abschnitte mit vielen Insertionen und Deletionen entsprechen vermutlich Schleifen an der Oberfläche. Eine Position mit einem konservierten Gly oder Pro läßt auf eine Wendung der Kette (‚turn‘) schließen.



3) Ein konserviertes Muster hydrophober Bausteine mit dem Abstand 2 (d.h., an jeder zweiten Position), bei dem die dazwischenliegenden Bausteine vielfältiger sind und auch hydrophil sein können, läßt auf ein -Faltblatt an der Moleküloberfläche schließen.



4) Ein konserviertes Muster hydrophober Aminosäurereste mit dem Abstand von ungefähr 4 läßt auf eine -Helix schließen.



Die Thioredoxine sind Teil einer Superfamilie, zu der auch viele weiter entfernte homologe Protein gehören, z.B. Glutaredoxin (Wasserstoffdonor für die Reduktion von Ribonukleotiden bei der DNA-Synthese)Protein-Disulfidisomerase (katalysiert bei der Proteinfaltung den Austausch falsch gefalteter Disulfidbrücken)Phosducin (Regulator in G-Protein-abhängigen Signalübertragungswegen)Glutathion-S-Transferasen (Proteine der chemischen Abwehr).

Die Tabelle des MSAs für Thioredoxinsequenzen enthält implizit auch Muster, die man zur Identifizierung dieser entfernteren Verwandten nutzen kann.


Es gibt im wesentlichen 3 unterschiedliche Vorgehensweisen:

(1) Manuell

(2) Automatisch

(3) Kombiniert

Multiples Sequenz-Alignment - Methoden


manuelles Alignment bietet sich an falls

– Alignment einfach ist.

– es zusätzliche (strukturelle) Information gibt.

– automatische Alignment –Methoden in lokalen Minima feststecken.

– ein automatisch erzeugtes Alignment manuell “verbessert” werden kann.

Gründe für manuelles Alignment


2 Methoden:

• Dynamische Programmierung– betrache 2 Proteinsequenzen von 100 Aminosäuren Länge.

- wenn es 1002 Sekunden dauert, diese beiden Sequenzen erschöpfend zu alignieren, dann wird es

1003 Sekunden dauern um 3 Sequenzen zu alignieren,

1004 Sekunden für 4 sequences und

1.90258x1034 Jahre für 20 Sequenzen.

• Progressives Alignment

multiples Sequenzalignment


berechne zunächst paarweise Alignments

für 3 Sequenzen wird Würfel aufgespannt:

D.h. dynamische Programmierung hat nun Komplexität n1 * n2 * n3mit den Sequenzlängen n1, n2, n3.

Sehr aufwändig! Versuche, Suchraum einzuschränken.

dynamische Programmierung mit MSA Programm



Links: Baum für 5 Sequenzen ohne Paarung von Sequenzen.

Neighbour-joining Methode: berechne Summe aller Kantenlängen

S = a + b + c + d + e (Kantenlängen sind bekannt)

In diesem Fall seien sich A und B am nächsten. Konstruiere daher den Baum rechts.

Generell: Verbinde die Sequenzpaare mit den kürzesten Abständen …

Man erhält den Baum mit der kleinsten Summe der Kantenlängen.

Konstruiere anhand phylogenetischem Baum ein versuchsweises Multiples Sequenz Alignment.


Dieses Alignment dient dazu, den möglichen Raum inmitten des Würfels einzugrenzen, in dem das beste MSA zu finden sein sollte.

Grosse Rechenersparnis!



• wurde von Feng & Doolittle 1987 vorgestellt

• ist eigentlich eine heuristische Methode. Daher ist nicht garantiert, das “optimale” Alignment zu finden.

• benötigt (n-1) + (n-2) + (n-3) ... (n-n+1) paarweise Sequenzalignments als Ausgangspunkt.

• weitverbreitete Implementation in Clustal(Des Higgins)

ClustalW ist eine neuere Version, in der den Parameter für Sequenzen und Programm Gewichte (weights) zugeteilt werden.

Progressives Alignment


Schnelle paarweise Alignments:berechne Matrix der Abstände

1 PEEKSAVTALWGKVN--VDEVGG2 GEEKAAVLALWDKVN--EEEVGG3 PADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGA4 AADKTNVKAAWSKVGGHAGEYGA5 EHEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQ

Hbb_Human 1 -Hbb_Horse 2 .17 -Hba_Human 3 .59 .60 -Hba_Horse 4 .59 .59 .13 -Myg_Whale 5 .77 .77 .75 .75 -

Hbb_Human

Hbb_Horse

Hba_Horse

Hba_Human

Myg_Whale

2

1

3 4

2

1

3 4

alpha-helices

Nachbar-Verbindungs-Baumdiagramm

progressive Alignments entsprechend dem Baumdiagramm

CLUSTAL W

Überblick der ClustalW Prozedur


• Berechne alle möglichen paarweisen Alignments von Sequenzpaaren.

Es gibt (n-1)+(n-2)...(n-n+1) Möglichkeiten.

• Berechne aus diesen isolierten paarweisen Alignments den “Abstand” zwischen jedem Sequenzpaar.

• Erstelle eine Abstandsmatrix.

ClustalW- Paarweise Alignments


Clustal W - Nachbarschaftsbaum

• aus den paarweisen Distanzen wird ein Nachbarschafts-Baum erstellt

• Dieser Baum gibt die Reihenfolge an, in der das progressive Alignment ausgeführt werden wird.


• aligniere die beiden ähnlichsten Sequenzen zuerst.

• dieses Alignment ist dann “fest” und wird nicht mehr angetastet. Falls später ein GAP eingeführt werden muss, wird er in beiden Sequenzen an der gleichen Stelle eingeführt.

• Deren relatives Alignment bleibt unverändert.

Multiples Alignment - Erstes Paar


Ziehe den Baum heran um festzulegen, welches Alignment als nächstes durchgeführt werden soll:

– aligniere eine dritte Sequenz zu den ersten beiden

oder

– aligniere zwei total verschiedene Sequenzen miteinander.

Option 1Option 1 Option 2Option 2

Clustal W – Zeit der Entscheidung


Wenn beim Alignment einer dritten Sequenz mit den ersten beiden eine Lücke eingefügt werden muss um das Alignment zu verbessern, werden beide als Einzelsequenzen betrachtet.

+

ClustalW- Alternative 1


Falls, andererseits, zwei getrennte Sequenzen aligniert werden müssen, werden diese zunächst miteinander aligniert.

+

ClustalW- Alternative 2


gctcgatacgatacgatgactagctagctcgatacaagacgatgacagctagctcgatacacgatgactagctagctcgatacacgatgacgagcgactcgaacgatacgatgactagct

gctcgatacgatacgatgactagctagctcgatacaagacgatgac-agcta

Progressives Alignment – 1. Schritt


gctcgatacgatacgatgactagctagctcgatacaagacgatgacagctagctcgatacacgatgactagctagctcgatacacgatgacgagcgactcgaacgatacgatgactagct

gctcgatacacgatgactagctagctcgatacacgatgacgagcga



gctcgatacgatacgatgactagctagctcgatacaagacgatgac-agcta+gctcgatacacgatgactagctagctcgatacacgatgacgagcga

gctcgatacgatacgatgactagctagctcgatacaagacgatgac-agctaGctcgatacacga---tgactagctaGctcgatacacga---tgacgagcga



gctcgatacgatacgatgactagctagctcgatacaagacgatgac-agctagctcgatacacga---tgactagctagctcgatacacga---tgacgagcga+ctcgaacgatacgatgactagct

gctcgatacgatacgatgactagctaGctcgatacaagacgatgac-agctagctcgatacacga---tgactagctagctcgatacacga---tgacgagcga-ctcga-acgatacgatgactagct-

Progressives Alignment – letzter Schritt


Vorteil:– Geschwindigkeit.

Nachteile:– keine objektive Funktion.

– Keine Möglichkeit zu quantifizieren ob Alignment gut oder schlecht ist.

– Keine Möglichkeit festzustellen, ob das Alignment “korrekt” ist.

ClustalW- Vor- und Nachteile


Mögliche Probleme:

– in ein lokales Minimum zu geraten.

Falls zu einem frühen Zeitpunkt ein Fehler im Alignment eingebaut wird, kann dieser später nicht mehr korrigiert werden.

– Zufälliges Alignment.

ClustalW - Lokales Minimum


• Sollen all Sequenzen gleich behandelt werden?

Obwohl manche Sequenzen eng verwandt und andere entfernt verwandt sind?

• Sollen alle Positionen der Sequenzen gleich behandelt werden?

Obwohl sie unterschiedliche Funktionen und Positionen in der dreidimensionalen Strukturen haben können?

Genauigkeit des Alignments verbessern


• Sequenzgewichtung

• Variable Substitutionsmatrizen

• Residuen-spezifische Gap-Penalties und verringerte Penalties in hydrophilen Regionen (externe Regionen von Proteinsequenzen), bevorzugt Gaps in Loops anstatt im Proteinkern.

• Positionen in frühen Alignments, an denen Gaps geöffnet wurden, erhalten lokal reduzierte Gap Penalties um in späteren Alignments Gaps an den gleichen Stellen zu bevorzugen

ClustalW- Besonderheiten


• Zwei Parameter sind festzulegen (es gibt Default-Werte, aber man sollte sich bewusst sein, dass diese abgeändert werden können):

• Die GOP- Gap Opening Penalty ist aufzubringen um eine Lücke in einem Alignment zu erzeugen

• Die GEP- Gap Extension Penalty ist aufzubringen um diese Lücke um eine Position zu verlängern.

ClustalW- vom Benutzer festzulegende Parameter


• Bevor irgendein Sequenzpaar aligniert wird, wird eine Tabelle von GOPs erstellt für jede Position der beiden Sequenzen.

• Die GOP werden positions-spezifisch behandelt und können über die Sequenzlänge variieren.

• Falls ein GAP an einer Position existiert, werden die GOP und GEP penalties herabgesetzt – und alle anderen Regeln treffen nicht zu.

• Daher wird die Bildung von Gaps an Positionen wahrscheinlicher, an denen bereits Gaps existieren.

Positions-spezifische Gap penalties


• Solange kein GAP offen ist, wird GOP hochgesetzt falls die Position innerhalb von 8 Residuen von einem bestehenden Gap liegt.

• Dadurch werden Gaps vermieden, die zu eng beieinander liegen.

• An jeder Position innerhalb einer Reihe von hydrophilen Residuen wird GOP herabgesetzt, da diese gewöhnlich in Loop-Regionen von Proteinstrukturen liegen.

• Eine Reihe von 5 hydrophilen Residuen gilt als

hydrophiler stretch.

• Die üblichen hydrophilen Residuen sind:

D Asp K Lys P Pro

E Glu N Asn R Arg

G Gly Q Gln S Ser

Dies kann durch den Benutzer geändert werden.

Vermeide zu viele Gaps


• Die am meisten divergenten Sequenzen (also am stärksten von allen anderen Sequenzen verschiedenen) sind gewönlich am schwierigsten zu alignieren

• Es ist manchmal besser, ihr Alignment auf einen späteren Zeitpunkt zu verschieben (nachdem die einfacheren Sequenzen aligniert wurden)

• Man kann dazu einen Cutoff wählen (der Default liegt bei 40% Identität).

Divergente Sequenzen


• Progressives Alignment ist ein mathematischer Vorgang, der völlig unabhängig von der biologischen Realität abläuft.

• Es kann eine sehr gute Abschätzung sein.

• Es kann eine unglaublich schlechte Abschätzung sein.

• Erfordert Input und Erfahrung des Benutzers.

• Sollte mit Vorsicht verwendet werden.

• Kann (gewöhnlich) manuell verbessert werden.

• Es hilft oft, farbliche Darstellungen zu wählen.

• Je nach Einsatzgebiet sollte der Benutzer in der Lage sein, die zuverlässigen Regionen des Alignments zu beurteilen.

• Für phylogenetische Rekonstruktionen sollte man nur die Positionen verwenden, für die eine zweifelsfreie Hypothese über positionelle Homologie vorliegt.

Tips für progressives Alignment


• Es macht wenig Sinn, proteinkodierende DNS-Abschnitte zu alignieren!

ATGCTGTTAGGGATGCTCGTAGGG

ATGCT-GTTAGGGATGCTCGT-AGGG

Das Ergebnis kann sehr unplausibel sein und entspricht eventuell nicht dem biologischen Prozess.Es ist viel sinnvoller, die Sequenzen in die entsprechenden Proteinsequenzen zu übersetzen, diese zu alignieren und dann in den DNS-Sequenzen an den Stellen Gaps einzufügen, an denen sie im Aminosäure-Alignment zu finden sind.

Alignment von Protein-kodierenden DNS-Sequenzen


GDE- The Genetic Data Environment (UNIX)

CINEMA- Java applet available from:

– http://www.biochem.ucl.ac.uk

Seqapp/Seqpup- Mac/PC/UNIX available from:

– http://iubio.bio.indiana.edu

SeAl for Macintosh, available from:

– http://evolve.zoo.ox.ac.uk/Se-Al/Se-Al.html

BioEdit for PC, available from:

– http://www.mbio.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/BIOEDIT/bioedit.html

Software für manuelle Alignments


Sequenz: MGGRSSCEDP GCPRDEERAP RMGCMKSKFL QVGGNTFSKT ETSASPHCPVYVPDPTSTIK PGPNSHNSNT PGIREAGSED IIVVALYDYE AIHHEDLSFQKGDQMVVLEE SGEWWKARSL ATRKEGYIPS NYVARVDSLE TEEWFFKGISRKDAERQLLA PGNMLGSFMI RDSETTKGSY SLSVRDYDPR QGDTVKHYKIRTLDNGGFYI SPRSTFSTLQ ELVDHYKKGN DGLCQKLSVP CMSSKPQKPWEKDAWEIPRE SLKLEKKLGA GQFGEVWMAT YNKHTKVAVK TMKPGSMSVEAFLAEANVMK TLQHDKLVKL HAVVTKEPIY IITEFMAKGS LLDFLKSDEGSKQPLPKLID FSAQIAEGMA FIEQRNYIHR DLRAANILVS ASLVCKIADFGLARVIEDNE YTAREGAKFP IKWTAPEAIN FGSFTIKSDV WSFGILLMEIVTYGRIPYPG MSNPEVIRAL ERGYRMPRPE NCPEELYNIM MRCWKNRPEERPTFEYIQSV LDDFYTATES QYQQQP

SMART ergibt:

Beispiel: Src-Kinase HcK


Kinase-Einheit


Protein Data Bankhttp://www.rcsb.org1ATP


SH3 Domäne

Src homology 3 (SH3) Domänen binden an Zielproteine mit Sequenzen, die Proline und hydrophobe Aminosäuren enthalten. Pro-enthaltende Polypeptide können an SH3 in zwei verschiedenen Orientierungen binden. SH3 Domänen sind kleine Proteinmodule von ungefähr 50 Residuen Länge. Man findet sie in vielen intrazellulären oder Membran-assoziierten Proteinen …


CATH: 1abo


SH2 Domäne

Die Src homology 2 (SH2) Domäne ist eine Proteindomäne mit etwa 100 Aminosäuren. SH2 Domänen funktionieren als Regelmodule von intrazellulären Signalkaskaden indem sie mit grosser Affinität an Phospho-Tyrosin enthaltende Peptide binden. SH2 Domänen findet man oft zusammen mit SH3 Domänen … Ihre Struktur ist alpha+beta …


CATH: 1g83 1fbz 1aot

3. Vorlesung WS 2005/2006 Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 45http://jkweb.berkeley.edu/



http://www.cellsignal.com

Was kann man mit modularem Denken erreichen?


Progressive Alignments sind die am weitesten verbreitete Methode für multiple Sequenzalignments.

Sehr sensitive Methode ebenfalls: Hidden Markov Modelle (HMMer)

Multiples Sequenzalignment ist nicht trivial. Manuelle Nacharbeit kann in Einzelfällen das Alignment verbessern.

Multiples Sequenzalignment erlaubt Denken in Proteinfamilien und –funktionen.

Zusammenfasusng

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