Mutacijų paieška paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) genome

Vadovas: dr. Gintaras Brazauskas, LAMMC Žemdirbystės institutasKonsultantas: dr. Rita Armonienė, LAMMC Žemdirbystės institutasStudentas: Edita Sajonaitė, Vytauto Didžiojo universitetas

TikslasRasti mutacijas paprastojo kviečio genuose, kurie aktyvinasi kviečio grūdinimosi metu.

Uždaviniai Atrinkti genus, kurie aktyvinasi paprastojo

kviečio grūdinimosi metu; HRM metodu nustatyti, kuriuose genuose yra

mutaciniai pakitimai.

Tyrimų objektas Tirtos dvi paprastojo kviečio selekcinės

linijos „5450-1“ ir „5899-16“. Kviečio sėklos paveiktos mutagenu

etilmetano sulfonatu (EMS). DNR išskyrė dr. R. Armonienė doktorantūros

studijų metu. Iš viso yra 946 individai.

Genas IRI-1 (Ice recrystallization inhibition protein gene 1)

WRKY71 (Transcription factor)

VRN2 (Vernalisation gene 2)

WCOR518 (Wheat cold responsive gene)

Funkcija Slopina ledo kristalų susidarymą ląstelėje.

Aktyvina transkripcijos faktorius.

Svarbu vernalizacijos procese.

Saugo ląsteles nuo osmosinio slėgio šalčio metu.

Fragmento ilgis, bp

244 249 243 298

Pradžios (Forward) pradmuo ir jo seka

TaIRI-1_F1:CGGCTCAAGGGTCTTGTCAT

WRKY71_F1: GGCGGCAATAACCACTACAAC

VRN2_F1: GCAGGTGAGCCATGTTTTGG

WCOR518_F1: CATCGATACGCTGAAACTGTTGG

Pabaigos (Reverse) pradmuo ir jo seka

TaIRI-1_R1:CGGTATTGTCGTTCCCGGTT

WRKY71_R1: GTGGACGTAACGCTTGGAGA

VRN2_R1:CGGCTCAAGGGTCTTGTCAT

WCOR518_R1: GCAGATACGGGTGGTACTGATAG

Geno sekos nr. genų banke

AY968588.1 ABN43177.1 AY485980.1 U73214.1

Metodika

HRM reakcijos

Analizė su programa HRM Software v3.01

Galimų mutantų atrinkimas ir jų

DNR pagausinimas PGR metodu

Elektroforezė. Fragmento

išpjovimas iš agarozės gelio

DNR fragmentų išvalymas iš

forezės reagentų.

DNR pagausinimas PGR metodu

DNR išvalymas iš

PGR reagentų

Duomenų analizė su programa Mega 5.10

HRM reakcijos

Melt Doctor TM HRM Master Mix* 5 µPradžios pradmuo (Forward primer) 0,3 µM

0,3 µl

Pabaigos pradmuo (Reverse primer) 0,3 µM

0,3 µl

dH2O 3,4 µlDNR (DNA) 20 ng 1 µl10 µl*Life technologies, JAV

HRM reakcijos atliekamos naudojantis 7500 Fast Real-Time PCR System (Life technologies, JAV) aparatu ir 7500 Software v.2.0.5 (Life technologies, JAV) programa.

1 lentelė. HRM mišinys 1 reakcijai pagal gamintojo protokolą.

1 pav. 7500 Software v.2.0.5 (Life technologies, JAV) programa (aut. nuotr.).

3 pav. 7500 Fast Real-Time PCR System (Life technologies, JAV) aparatas (aut. nuotr.).

2 pav. HRM plokštelė su mėginiais (aut. nuotr.).

Analizė su programa HRM Software v3.01Stebimi DNR lydymosi temperatūros (Tm) pokyčiai.

4 pav. Analizės bendras vaizdas.

5 pav. Analizės bendras vaizdas.

6 pav. Analizės bendras vaizdas.

7 pav. Darbas su programa HRMSoftware v3.01 ir duomenų analizė (R. Armonienės nuotr.).

Galimų mutantų atranka ir pagausinimas PGR metodu

Atrenkami tie individai, kurių lydymosi temperatūra (Tm) nuo laukinio genotipo skiriasi >0,2 ◦C. Pasirinkti mutantai pagausinami naudojant Thermo Scientific Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix* rinkinį.Phusion Flash PCR Master Mix* 25 µPradžios pradmuo (Forward primer) 0,3 µM

3 µl

Pabaigos pradmuo (Reverse primer) 0,3 µM

3 µl

dH2O 9 µlDNR (DNA) 20 ng 10 µl50 µl

2 lentelė. PGR mišinio gaminimas 1 reakcijai pagal gamintojo protokolą.

* Thermo Scietific,Lietuva

8 pav. Mastercycler gradient termocikleris (Eppendorf, Voketija) (aut. nuotr.).

Elektroforezė. Fragmento išpjovimas iš agarozės gelio, išvalymas.Elektroforezei atlikti buvo naudojamas prietaisas Electrophoresis Power Supply-EPS 301 (Amersham Pharmacia Biotech, JAV).

Pasirinktieji fragmentai iš agarozės gelio buvo išpjaunami steriliu skalpeliu.

Išvalomi rinkiniu GeneJETTM Gel Extraction Kit (Thermo Scietific, Lietuva) pagal gamintojo nurodytą protokolą.

9 pav. Agarozės gelio ruošimas elektroforezei (aut. nuotr.).

Fragmentų pagausinimas PGR metodu ir išvalymas iš PGR reagentų.Pagausinami naudojant Thermo Scientific Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scietific, Lietuva) rinkinį.

Fragmentai švalyti iš PGR reagentų su GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scietific, Lietuva) rinkiniu pagal gamintojo protokolą.

Sekoskaita ir duomenų analizė su programa Mega 5.10

Fragmentai paruošiami vadovaujantis GATC Biotech protokolu. DNR sekoskaita atlikta GATC Biotech centre, Vokietijoje.

Analizei naudojama Mega 5.10 programa, Fasta formatas.

Rezultatai

Atranka su HRM Software v3.01 (1)IRI-1 geno wt16, M632 individai.

10 pav. IRI-1 geno M632 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

11 pav. IRI-1 geno M632 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Derivative Melt Curves kreive.

12 pav. IRI-1 geno M632 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Difference Plot kreive.

Atranka su HRM Software v3.01 (2)

VRN2 geno wt16, M787, M812, M716, M822, M761, M775;

13 pav. VRN-2 geno M822 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

14 pav. VRN-2 geno M761ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

15 pav. VRN-2 geno M812ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

Atranka su HRM Software v3.01 (3)

WCOR518 geno wt16, wt1, M42, M545, M810;

16 pav. WCOR518 geno M545 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

17 pav. WCOR518 geno M810 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

Atranka su HRM Software v3.01(4)

WRKY71 geno wt1, wt16, M481, M490, M558, M632, M775, M711, M866.

18 pav. WRKY71 geno M490 ir wt1 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

19 pav. WRKY71 geno M775 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Aligned Melt Curves kreive.

20 pav. WRKY71 geno M775 ir wt16 individų lydymosi temperatūrų palyginimas Derivative Melt Curves kreive.

WRKY71 geno mutacijos nukleotidų sekose

Nukleotidų pakitimai:M481 C į T; M558 G į A;

M775 C į T;M711 G į A;

M866 G į A;M490 G į A;

M632 C į T.

21 pav. Sekoskaitos rezultatai WRKY71 gene (nukleotidų sekos). Analizuota su Mega 5.10 programa.

WRKY71 geno mutacijos amino rūgščių sekose

M775 keičia Histidiną į Tiroziną;M490 keičia Gliciną į Asparto rūgštį.

22 pav. Sekoskaitos rezultatai WRKY71 gene (amino rūgščių sekos). Analizuota su Mega 5.10 programa.

VRN2 geno mutacijos nukleotidų sekose

23 pav. Sekoskaitos rezultatai VRN2 gene (nukleotidų sekos). Analizuota su Mega 5.10 programa.

Nukleotidų pakitimai:M761 G į A;M787 G į A;M775 G į A;

M812 C į C/T; M716 C į T;M822 G į A.

VRN2 geno mutacijos amino rūgščių sekose

24 pav. Sekoskaitos rezultatai VRN2 gene (amino rūgščių sekos). Analizuota su Mega 5.10 programa.

M787 keičia Gliciną į Asparto rūgštį;M775 Alaniną į Treoniną;M822 Gliciną į Glutamo rūgštį;M761 Gliciną į Asparto rūgštį.

Mutacijų dažnis(Botticella ir kt., 2011)

Mutacijų dažnis VRN2 gene Mutacijų dažnis WRKY71 gene kb

Literatūroje minima, kad mutacijų dažnis paprastuosiuose kviečiuose dažniausiai būna 1 mutacija per 38-40 kb (Botticella ir kt., 2011; Slade ir kt., 2005).

Išvados Temperatūrų skirtumas tarp galimų mutantų ir laukinio

genotipo ne visada rodo mutaciją. Rasta tokių atvejų, kai temperatūrų skirtumas atsiranda dėl heterozigotos buvimo.

Rastos tyliosios (silence) ir klaidingos (missence) mutacijos.

Daugiausia mutacijų rasta WRKY71 ir VRN2 genuose. Kituose IRI-1 ir WCOR518 genuose rastos tik heterozigotos.

Pagal mutacijų dažnį galima įvertinti, kad tirtuose genuose rastos mutacijos atitinka minimas literatūroje.

Literatūra Botticella E., Sestili F., Hernandez-Lopez A., Phillips A., Lafiandra

D. 2011. High Resolution Melting analysis for the detection of EMS induced mutations in wheat Sbella genes. BMC Plant Biology, 11: 156;

Slade A.J., Fuerstenberg S.I., Loeffler D., Steine M.N., Facciotti D. 2005. A reverse genetic,nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING. Nature Biotechnology, 23: 75–81;

Armonienė R. 2014. Daktaro disertacija: Žieminių kviečių tolerantiškumas žemoms temperatūroms: genų paieška ir analizė. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centras, Akademija.

Sikora P., Chawade A., Larsson M., J Olsson J., Olsson O. 2011. Mutagenesis as a tool inplant genetics, functional genomics, and breeding. International Journal of Plant Genomics, 2011: 13.

Praktikos privalumai Darbas su nauja tema; Nauja įranga, programos; Didelės, naujos, erdvios laboratorijos; Naujos žinios, nesusijusios su praktikos

tema; Draugiškas kolektyvas; Arbatos pertraukėlės.

Praktikos trūkumai

Per didelis atstumas nuo namų iki instituto.

Padėka Dėkoju dr. Gintarui Brazauskui už suteiktą galimybę. Ačiū dr. Ritai Armonienei už supratingumą, kantrybę,

pamokymus, kritiką ir rūpestį. Dėkoju „Augalų genetikos ir fiziologijos skyriaus“ kolektyvui

už nuoširdų bendravimą ir palaikymą. Dėkoju Lietuvos mokslo tarybai už projekto „Studentų

mokslinės veiklos skatinimas“ (VP1-3.1-ŠMM-01-V-02-003) paramą.

Mutacijų paieška paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) genome

Vadovas: dr. Gintaras Brazauskas, LAMMC Žemdirbystės institutasKonsultantas: dr. Rita Armonienė, LAMMC Žemdirbystės institutasStudentas: Edita Sajonaitė, Vytauto Didžiojo universitetas