MYCOPLASMA DUO 6273962740

IDENTIFIZIERUNG UND DIFFERENZIALTITIERUNGGENITALER MYKOPLASMEN

1- KLINISCHE BEDEUTUNGMykoplasmen sind kommensale Organismen, die die Schleimhaut desUrogenitaltraktes kolonisieren und sich unter bestimmten Bedingungenübermäßig vermehren und dadurch veschiedene Krankheiten verursachen:• Ureaplasma urealyticum (Uu), verursacht bei Männern hauptsächlich

Harnröhrenentzündung (zweite Ursache einer nicht-gonorrhoischenHarnröhrenentzündung), gelegentlich auch Prostataentzündung undNebenhodenentzündung [12]. Bei Frauen kann U. urealyticum zurChorioamnionitis [13] und einem frühen Bruch der Membranen führen, wasein Risiko für neonatale Infektionen darstellt. Dies ist beiReproduktionsstörungen aufgetreten [3,4,5].

• Mycoplasma hominis (MH) wurde als eine Ursache für die Entzündungder Gebärmutterschleimhaut und der Eileiter [12] und in Verbindung mitnicht spezifischer Entzündung der Vagina beobachtet [8].Beide Spezies können folgende Erkrankungen verursachen:• neonatale Infektionen (Meningitis, Infektionen der Atemwege, Sepsis)

[9,10,12,13]

• Sepsis nach der Geburt [6,12]

• Athritis.Da sie als kommensale oder pathogene Organismen vorliegen können,sollten quantitative Kriterien zur Interpretation von Kulturen vonUrogenitalproben von Erwachsenen [1, 2, 11] verwendet werden. DieEntscheidung über die Behandlung hängt von der Mykoplasma-Konzentration und dem klinischen Erscheinungsbild ab.

MYCOPLASMA DUO ermöglicht dem Labor::• Urogenitale Mykoplasmen zu züchten, zu identifizieren und differenzial

zu titrieren (UU und MH)• Ein standardisiertes Inokulum für den Antibiotika-Verträglichkeitstest

herzustellen.

2- PRINZIPDie Selektivität der Mikrovertiefung X ist durch ein Antimykotikum und eineAntibiotikamischung sichergestellt.Identifizierung / Titrierung urogenitaler Mykoplasmen basiert auf denspezifischen Stoffwechseleigenschaften jedes Organismus:Hydrolyse von :- Harnstoff nach Ureaplasma urealyticum (UU)- Arginin nach Mycoplasma hominis (MH)

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unter Freisetzung von Ammoniak und Alkalisierung des Mediums (ohneTrübung des Mediums).Die Reaktion wird durch Farbänderung des pH-Indikators von gelb in rot(Phenolrot) sichtbar gemacht:• Gelbe Mikrovertiefung: keine Mykoplasmen• Rote Vertiefung: Vorliegen von Mykoplasmen

Die Titrierung basiert auf dem Prinzip der Verdünnungen in flüssigemMedium: durch Serienverdünnung des Suspensionsmediums in Vertiefung D (10-1-Verdünnung) und in den Vertiefungen U ≥ 104 und H ≥ 104 (10-2-Verdünnung) kann der Titer des Stammes bestimmt werden. Dieser Titer entspricht der Anzahl an Vertiefungen, deren Farbe sichinnerhalb von 24 bis 48 Stunden ins Rote verändert; jede rote Vertiefungenthält mindestens eine CCU (Colour Changing Unit - Farbänderun -gseinheit) – siehe Diagramm zum Ablesen der Ergebnisse.

Vorbereitung des Antibiotika-VerträglichkeitstestsDie Mikrovertiefung X durch selektive Anreicherung der Probe ermöglicht dieVorbereitung eines standardisierten Inokulums (103 bis 105 CCU/ml) (ColourChanging Units - Farbänderungseinheit) für den Antibiotika-Verträglichkeitstestnach Inkubation über 24 Stunden.

3- DARREICHUNGSFORM – LAGERUNG – HALTBARKEIT• Darreichungsform :

Mycoplasma Duo, Kat.-Nr. 62740• Microplate (20 Mikrotiterplatten), : jede

Mikrotiterplatte enthält 6 Mikrovertiefungenmit:

• dehydrierten Substraten für die Identifizierung• Mykoplasma-Wachstumsfaktoren.• Mittel zur Hemmung des Wachstums der

begleitenden polymorphen Flora.U und U ≥ 104: Identif izierung undTitrierung von UU (enthält Harn)H und H ≥ 104: Identif izierung undTitrierung von MH (enthält Arginin)D : VerdünnungsvertiefungX : selektive Mykoplasmen-Anreicherung:Vorbereitung des standardisierten Inokulumsfür den Antibiotika-Verträglichkeitstests

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MYCOPLASMA DUO

Patient :Date :

U

U ≥104 D H ≥104

X H

• 20 Gefäße, jeweils mit 2 ml Suspension medium (Suspension/Transportmedium)

• 1 Tropffläschchen mit 15 ml diluent (Verdünnungsmittel).• 40 Kunststoffmikropipetten (für jede Probe werden 2 benötigt).• 20 Klebestreifen.

Mycoplasma Duo supension medium (code 62739)• 40 Gefäße, jeweils mit 2 ml Suspensionsmedium (Suspension/

Transportmedium)

• Lagerung : bei +2-8°C.

• Haltbarkeit : bis zu dem auf der Packung angegebenen Verfallsdatum.

4- PROBEN 1) Genitalproben : Harnröhre, Endocervix, Vagina (und wenigergebräuchlich Hals- und Nasen- sowie Augenabstriche bei Kleinkindern):Da Mykoplasmen an Zellen haften, müssen die Zellen durch Abschabender Schleimhaut gewonnen werden. Der Tupfer (Zytobürste oderBactopick®) sollte dann in 2 ml Medium eingetaucht werden.

2) Biologische Proben :• Urin* : - erster Teil der Blasenentleerung: die Probe homogenisieren.

- Urin bei Blasenentleerung: das Zentrifugationspellet in 0,2 mlKochsalzlösung resuspendieren.

• Sperma- und weniger häufig Blutkulturüberstand, Liquor, Gelenkflüssigkeitoder Bronchialaspirat bei Neugeborenen.0,2 ml der Probe in 2 ml Suspensionsmedium beimpfen.

* Da Mykoplasmen an Zellen haften, sind die für den Nachweis genitalerMykoplasmen geeignetesten Urogenitalproben die, die Epithelzellenenthalten: Abstriche der Harnröhre, Endocervix, Vagina durch Entnahmevon Zellen von der Schleimhaut.Die Lagerbedingungen für biologische Proben entnehmen Siebitte den aktuellen Empfehlungen [14].

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3) Transport : Die Probe kann in Suspensionsmedium transportiert werden: nachBeimpfumg dieses Mediums kann die Probe wie folgt gelagert werden:• 48 Stunden bei Raumtemperatur • 72 Stunden bei +2-8°C• 6 Monate tiefgefroren bei -20°C

5- TESTABLAUF

A. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL• Inkubator bei 37°C• Behälter für kontaminierten Abfall

B. TESTABLAUF

Beimpfung der Mikrotiterplatte1) Verdünnungsmittel

Mit dem Tropffläschchen 4 Tropfen (200 µl) Verdünnungsmittel in jededer drei Vertiefungen der unteren Reihe der Mikrotiterplatte geben: U ≥ 104, D und H ≥104.

2) Proben Mit einer Mikropipette das mit der Probe beimpfte Suspensionsmediumverteilen:- 4 Tropfen (100 µl) in jede der drei Vertiefungen der oberen Reihe der

Mikrotiterplatte geben: U, X, H;- 1 Tropfen (25 µl) in Vertiefung D geben.

3) Verdünnung Mit einer anderen Pipette (für die Verdünnungen muss unbedingt eineandere Pipette verwendet werden, da Mykoplasmen am Kunststoff haftenbleiben) den Inhalt der Vertiefung D gründlich homogenisieren (durchdreifaches Ansaugen des Inhalts der Vertiefung), anschließend dieSuspension ansaugen und einen Tropfen (25 µl) in die Vertiefung U ≥ 104

und eine Tropfen (25 µl) in die Vertiefung H ≥ 104 geben.

Inkubation• Die Mikrotiterplatte mit Klebefolie abdecken.• 24 Stunden in einem Inkubator bei 37°C inkubieren, anschließend, falls

erforderlich, diese Inkubation um weitere 24 Stunden verlängern (sieheAbschnitt 7).

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4 Tropfen(200 µl)

1 Tropfen(25 µl)

BEBRUTEN

24-48 Stunden bei 37°Cim Brutschrank bebrüten

beimpftesSuspensionsmedium

Die Probe in dasSuspensionsmediu

m gebenSuspensionsmedium

Verdünnungspuffer

BEIMPFEN

PROBENENTNAHME

4 Tropfen(100 µl)

1 Tropfen(25 µl)

2 ml

D D D

UX H

U ≥ 104

H ≥ 104

U ≥ 104

H ≥ 104

6- ABLESEN – INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

1) Ablesen der ergebnisse• Die Ergebnisse werden zunächst nach der 24stündigen Inkubation

abgelesen: Dadurch wird das endgültige Ergebnis in Proben mit hohenKonzentrationen (≥ 104 CCU/ml) ermittelt;

• Ein zweites Ablesen nach 48stündiger Inkubation wird benötigt:- um negative Ergebnisse zu bestätigen,- um Stämme in geringerer Konzentration (≤ 103 CCU/ml) nachzuweisen,- um Stämme nachzuweisen, die in höherer Konzentration (≥ 104

CCU/ml) vorliegen, jedoch eine niedrige Stoffwechselrate aufweisen.

2) Interpretation

Ein Farbwechsel der Harn- bzw. Arginin-Mikrovertiefungen von gelb in rotohne Trübung des Mediums weist auf das Vorliegen von Mykoplasmen hin.

Das Diagramm zum Ablesen und zur Interpretation der Ergebnisse istfür beide Mykoplasmen-Spezies identisch: die DUO MikrovertiefungenU und U ≥ 104 für UU, H und H ≥ 104 für MH ablesen.

MYCOPLASMA DUO ermöglicht eine differenzierte Titrierung der beidenMykoplasmen-Spezies, die beide in derselben Probe vorliegen können.

Die Proben werden klassifiziert als:• negativ : keine Farbänderung (gelbes Medium)• positiv für UU : die Farbänderung tritt nur in der/n Vertiefung(en) U auf• positiv für MH : die Farbänderung tritt nur in der/n Vertiefung(en) H auf• positiv für UU und MH : eine Farbänderung in den Vertiefungen U und

H weist darauf hin, dass beide Spezies in der Probe vorliegen; den Titerfür jede Spezie ablesen.

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U

U ≥ 104

H

H ≥ 104

ABLESEN NACH 24 STUNDEN

Vertiefungen U und U ≥ 104 rot Vertiefungen H und H ≥ 104 rot

SOFORTIGEAUSWERTUNGPOSITIVE Probe

MH mit vorhanden

CCU/ml Probe

AUSWERTUNG : bis auf 48 hverschoben

AUSWERTUNG : bis auf 48 hverschoben

HOHEM Titer

≥ 10 4

Vertiefung H rot,Vertiefung H ≥ 104 gelb

Vertiefungen H und H ≥ 104 gelb

WEITERE 24 STUNDEN BEBRÜTENNACH 48 STUNDEN ABLESEN UND AUSWERTEN

DUO UU DUO MH

SOFORTIGEAUSWERTUNGPOSITIVE Probe

UU mit

vorhanden

CCU/ml Probe

AUSWERTUNG : bis auf 48 hverschoben

AUSWERTUNG : bis auf 48 hverschoben

HOHEM Titer

≥ 10 4

Vertiefung U rot,Vertiefung U ≥ 104 gelb

Vertiefungen U und U ≥ 104 gelb

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ABLESEN NACH 48 STUNDEN

Vertiefungen U und U ≥ 104 rot Vertiefungen H und H ≥ 104 rot

SOFORTIGE AUSWERTUNGPOSITIVE Probe

UU mit vorhanden

CCU/ml Probe

AUSWERTUNG : POSITIVE Probe

UU mit

vorhanden

CCU/ml Probe

Auswertung je nach klinischen Befund

AUSWERTUNG:NEGATIVE Probe

UU vorhanden

NIEDRIGEM Titer

≤ 10 3

HOHEM Titer

≥ 10 4

Vertiefung U rot,Vertiefung U ≥ 104 gelb

SOFORTIGE AUSWERTUNGPOSITIVE Probe

MH mit vorhanden

CCU/ml Probe

AUSWERTUNG : POSITIVE Probe

MH mit

vorhanden

CCU/ml Probe

Auswertung je nach klinischen Befund

AUSWERTUNG:NEGATIVE Probe

MH vorhanden

HOHEM Titer

NIEDRIGEM Titer

≤ 10 3

≥ 10 4

Vertiefung H rot,Vertiefung H ≥ 104 gelb

Vertiefungen U und U ≥ 104 gelb Vertiefungen H und H ≥ 104 gelb

Anmerkung• Verzögertes Ablesen der Ergebnisse (z. B. nach einem Wochenende):

Alle Ergebnisse bleiben 48 Stunden unverändert. Dadurch können dieErgebnisse auch später abgelesen werden.

• Diese Identifizierung kann durch Beobachtung der auf Agar fürMykoplasmen isolierten Kolonien bestätigt werden.

• Im Fall einer Trübung des Mediums, die auf ein Wachstum von anderenBakterien als Mykoplasmen hinweist (ein seltenes Phänomen, da dieSelektivität durch Additive verbessert wurde), eine Subkultur auf Agaraus Suspensionsmedium oder der Vertiefung D anlegen (1 bis 3 Tropfenauf die Oberfläche des Mediums geben und anschließend 48 Stundenbei 37°C in 10% CO2 inkubieren).

• Durch diese Methode können Titer in der Größenordnung von 103 und104/ml bestimmt werden, die akzeptierte Pathogenitätsgrenzwertedarstellen [7].

7- VERWENDUNG DER VERTIEFUNG XDie Vertiefung X sollte nicht interpretiert werden. Sie wird verwendet, umsicherzustellen, dass selektive Mykoplasmen angereichert wurden, um einstandardisiertes Inokulum für Antibiotika-Verträglichkeitstests (SIRMYCOPLASMA Kat.-Nr. 62781) herzustellen:Den Inhalt der Vertiefung X 1:100 verdünnen:• mit U9-Bouillon (U9, Kat.-Nr. 62762) für UU,• mit Arginin-Bouillon (Arginine, Kat.-Nr. 62763) für MH.20 µl von Vertiefung X entnehmen und 2 ml Harn oder Arginin-Bouillonüberführen (gemäß der Spezies). Jede SIR MYCOPLASMA –Vertiefung mit100 µl dieser 1:100-Verdünnung beimpfen.

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8- LEISTUNG / QUALITÄTSKONTROLLE DES TESTS• Die Leistung von Mycoplasma Duo wird durch Verwendung folgender

Stämme kontrolliert:

9- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERSAlle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einemQualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung derFertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolleunterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterienentspricht. Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle dereinzelnen Chargen werden bei Bio-Rad aufbewahrt.

10- GRENZEN DES TESTSUrinproben können aufgrund der geringen Menge an enthaltenen Zellen zufalsch negativen Ergebnissen oder bei alkalischem pH-Wert zu falschpositiven Ergebnissen führen.

11- LITERATURSiehe Französische Version.

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STAMME AKTIVITATSKONTROLLE

Ureaplasma urealyticum ref UU 80Mycoplasma hominis ref MH 31

Zufriedenstellende Identifizierung,Titrierung und Anreicherung

MIKROTITERPLATTEN-INHIBITIONSKONTROLLE

Enterococcus faecalis CIP 76117Proteus mirabilis ATCC 25933

InhibitionInhibition

MEDIUM-INHIBITIONSKONTROLLE

Staphylococcus aureus CIP 52148 Inhibition

8. MARDH P.A. and coll., Mycoplasma hominis in women with bacterialvaginosis and their consorts, (abstract) June 1988: 7th CongressInternational Organization for Mycoplasmology - Vienna

9. WAITES K.B. and coll., Chronic Ureaplasma urealyticum andMycoplasma hominis infections of central nervous system in preterminfants. Lancet, 1988, 2/9, 17-21

10. MADOFF S. & HOOPER D.C., Non genitourinary infections caused byMycoplasma hominis in Adults. Rev. Infect. Dis., 1988, 3, 602-612

11. BONISSOL CH., Isolement et identification des mycoplasmesurogénitaux, Méd. Mal. infect., 1980, 10, 640-646

12. COPIN E. and LEBRUN L., Infections à mycoplasmes urogénitaux, Feuil.Biol, 1991, 32, (181), 9-15

13. CASSELL G.H., WAITES K.B., WATSON H.L., CROUSE D.T. andHARASAWA R., Ureaplasma urealyticum intra-uterine infection: role inprematurity and disease in newborns, Clin. Microbiol, Rew., 1993, 6 (1),69-87

14. Basic Laboratory Procedures Clinical Bacteriology. WorldHealth Organization. Geneva. 1991. 1st edition.

11- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. EB F. and ORFILA J., Les Mycoplasmes génitaux: rôle pathogène et

diagnostic, Méd. Mal. infect, 1985, 9bis, 491-494

2. SCHIEFFER H.G., Urethral syndrome in women: etiologic, cytologic andclinical studies, (abstract) June 1988: 7th Congress InternationalOrganization for Mycoplasmology - Vienna

3. QUINN P.A. and coll. Incidence of late loss and U. urealyticum in womenwith recurrent pregnancy loss, Abstract of the 1987 ICAAC

4. LAMONT R.F. TAYLOR ROBINSON D. and coll. The role of mycoplasmas,ureaplasmas and chlamydia in the genital tract of women presentingspontaneous early preterm labor., J. Med. Microbiol., 1987,- 24, 253-257

5. WAITES K.B. and coll. Ureaplasma pneumonia and sepsis associatedwith persistent pulmonary hypertension in the newborn, (abstract) June1988: 7th Congress International Organization for Mycoplasmology -Vienna

6. PHILLIPS L.E. and coll., Post cesarean wound infection by Mycoplasmahominis in a patient with persistent post partum fever, Diagn. Microbiol.Infect. Dis. 1987, 7, 193-197

7. BEBEAR C. and RENAUDIN H., Les mycoplasmes génitaux : principed’isolement et d’identification, Feuil. Biol., 1986, 27,19-23

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(GB) • This product contains human or animal components. Handle with care.(FR) • Ce produit contient des composants d'origine biologique humaine ou animale. Manipuler avec précaution.(ES) • Este producto contiene componentes humanos o animales. Manejar con cuidado.(IT) • Questo prodotto contiene componenti umane o animali. Maneggiare con cura.(DE) • Dieses Produkt enthält Bestandteile menschlichen oder tierischen Ursprungs. Vorsichtig handhaben.(PT) • Este medicamento contém componentes de origem humana ou animal. Manuseie com cuidado.(SE) • Denna produkt innehåller beståndsdelar från människa eller djur. Hantera produkten varsamt.(DK) • Dette produkt indeholder humane og animalske komponenter. Skal behandles med forsigtighed.(GR) • Αυτό το προϊόν περιέχει ανθρώπινα ή ζωικά στοιχεία. Χειριστείτε το µε προσοχή.(PL) • Niniejszy produkt zawiera składniki pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Nale y obchodzić się z nim ostro nie.(LT) • Šiame produkte yra žmogiškosios arba gyvūninės kilmės sudėtinių dalių. Elgtis atsargiai.(HU) • A készítmény emberi vagy állati eredetű összetevőket tartalmaz. Óvatosan kezelendő.(EE) • Käesolev toode sisaldab inim-või loomseid komponente. Käsitseda ettevaatlikult.(SK) • Tento výrobok obsahuje ľudské alebo zvieracie zložky. Narábajte s ním opatrne.(CZ) • Tento výrobek obsahuje lidské nebo zvířecí komponenty. Zacházejte s ním opatrně.(RO) • Acest produs conţine materiale de origine umană sau animală. Manevraţi-l cu grijă.(BG) • Този продукт съдържа човешки или животински компоненти. Бъдете внимателни при работа с него.(LV) • Šis produkts satur cilvēkiem vai dzīvniekiem paredzētas sastāvda as. Apieties uzmanīgi.(MT) • Dan il-prodott fih komponenti umani jew tal-annimali. U a b’attenzjoni.(NL) • Dit product bevat menselijke of dierlijke bestanddelen. Breekbaar.(SI) • Izdelek vsebuje človeške ali živalske sestavine. Rokujte previdno.(FI) • Tässä tuotteessa on ihmisestä tai eläimistä peräisin olevia osia. Käsittele varovasti.

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