Upload
jan-abbink
View
215
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Confocal Laser Scanning Microscopy
dept. of Pathology, Ghent University
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
basic confocal fluorescent microscopy
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Conventional widefield fluorescent microscope:•Fluorophores throughout the entire depth of the specimen are illuminated•Fluorescence signals are collected not only from the plane of focus but also from areas above and below
Thick specimens: blurry, lack of contrast
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Confocal fluorescent microscope:
•Point light source: intense irradiation at the focal spot•Point detection: elimination of out-of-focus fluorescence Optical sectioning of thick specimens: sharp images
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
widefield versus point illumination
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Benefits of CLSM:
•Elimination of out-of-focus fluorescence•Areas above and below the focal spot: less intense irradiation•Series of optical sections at different depths: 3D reconstruction of the specimen
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Benefits of CLSM:
•Permits the direct study of living cells without damage•Improves lateral and axial resolution•Simultaneous detection•Electronic data acquisition
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Elements of the confocal microscope:
•Point light source (laser)•Scanning system (usually a laser-scanner)•Lens (condensor and objective)•Filters•Detector (PMT or CCD)
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Applications:
•Fluorescent-stained cells in tissue slices/small intact organisms•Localizing fluorescence-tagged molecules in dissociated cells•Monitoring fluorescence in living specimens (GFP)•Photobleach experiments (FRAP, FLIP)
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Radiance 2100
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
System: Nikon Diaphot 300
•Inverted microscope•Lenses: 10x fluor, 40x fluor (oil), 60x plan apo (oil)•Hg lamp•Filter sets: DAPI, FITC, TRITC
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
System: 3 lasers
•4 line argon laser: 457, 476, 488, 514nm•Green HeNe laser: 543nm•Blue laser diode: 405nm
2 channel confocal
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
System: dichroic mirrors
•100% det1
•500DCLPXR
•560DCLPXR
•100% det2
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
System: PMT1 emission filter set
HQ442/45 HQ500LP
HQ485/30 HQ515/30
HQ488/10 HQ530/60
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
System: PMT2 emission filter set
HQ515/30 HQ590/70
HQ530/60 HQ600/50
HQ545/40 E600LP
E570LP
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
System: implications for the choice of fluorophore•Lasers absorption spectrum•Emission filters emission spectrum
Fluorophore wall chartBioRad interactive database athttp://fluorescence.bio-rad.com/frames6.htm
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Software: Lasersharp 2000
Instrument control panel•Objective •Box size •Speed •Channel
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Software: Lasersharp 2000
Control of the optical system set up•Laser •Dichroic mirror •Emission filter
Method design (simultaneous/sequential)
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Lasersharp 2000: image acquisition
•Live scan/sequential live scan•Z-series collection•Vertical section•Line scan•Scan rotation and panning
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Lasersharp 2000: analysis and processing functions•Arithmetic operations•Histogram •Line profile•Projection •Orthogonal view
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Lasersharp 2000: region of interest scanning (ROI)•Fotobleaching experiments (FRAP, FRET, …)•Different shapes of ROIs•Different illumination levels•Multi-phase time course
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Images
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
mon
olay
er c
ultu
re o
f ce
rvic
al c
ance
r ce
lls
Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
mon
olay
er o
f ce
rvic
al
canc
er c
ells
in
cocu
lture
with
PB
MC
s
Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie
mon
olay
er o
f ce
rvic
al
canc
er c
ells
infe
cted
w
ith f
luor
esce
nt b
eads
Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Raedt et al 2008
Survival and dispersion of transplanted BrdU/GFP positive aNPCs.
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Raedt et al 2008
in v
ivo
diff
eren
tiatio
n to
war
ds G
FA
P p
ositi
ve
astr
ocyt
es
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Raedt et al 2008
In vivo differentiation towards NeuN positive neuronal cells
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Waeytens et al, IBD 2008
thick sections from ileum (A-C) and colon (D-F) from IL-10-/- mice that received L. lactis intragastrically
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Waeytens et al, IBD 2008
Transmission electron micrographs of intact mucosa from loops in control mice (A, B)
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Waeytens et al, IBD 2008
Tra
nsm
issi
on e
lect
ron
mic
rogr
aphs
of
infla
med
muc
osa
orig
inat
ing
from
ile
al lo
ops
in D
SS
-Bal
b/c
mic
e (C
-E
) an
d IL
-10-/
- mic
e (F
).
Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)
Practical information
Assistance: Anouk Waeytens, Isabelle RottiersDemo + CAS softwareReservation onlineImage storage: CD, DVD, USB, … Handbooks
CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie