Z Lebensm Unters Forsch (1984) 178:86-89

Zeitschrift fur

Lebensmittel- Untersuchung

und-Forschung © Springer-Verlag 1984

Nachweis von Blutplasma in erhitzten Fleischwaren mittels Ultradiinnschicht-isoelektrischer Focussierung*

Friedrich Bauer 1 und Herbert Stachelberger 2 1 Institut ffir Fleischhygiene, Fleischtechnologie und Lebensmittelkunde der Veterinfirmedizinischen Universit/it,

Linke Bahngasse 1 l, A-1030 Wien, Osterreich 2 Institut ftir Angewandte Botanik, Technische Mikroskopie und Organische Rohstofflehre der Technischen Universit/it,

Getreidemarkt 9, A-1060 Wien, Osterreich

Detection of Blood Plasma in Heat-Treated Meat Products by Means of Uitrathinlayer Isoelectric Focusing

Summary. The de tec t ion o f b l o o d p l a sma in hea t - t rea t - ed mea t p roduc t s was pe r fo rmed by means o f u l t ra th in- layer isoelectr ic focusing. Because o f the p o o r solubi l i ty o f dena tu red b l o o d p l a s m a in wate r or d i lu ted salt so- lu t ions the extracts were concen t ra t ed by adso rp t i on o f the p ro te in on hydroxy l apa t i t e and subsequent elu- tion. Desa l t ing o f the samples was done by gel ch roma- tography . Gels wi th a thickness o f 150 g m were used for isoelectr ic focusing because o f their exellent resolu- t ion as well as low expendi ture o f t ime and cost. 0 .2% of d ry b l o o d p l a s m a in sausages were still de tec table by the m e t h o d described.

Zusammenfassung. Der Nachweis von Blu tp lasma in erhi tz ten F le i schwaren wurde mi t Hilfe der U l t r ad i inn - schicht- isoelektr ischen Focuss ie rung durchgef i ihr t . Wegen der ger ingen L6sl ichkei t von dena tu r i e r t em Blu tp lasma in Wasse r bzw. verdf innten Salz l6sungen wurde der Ex t r ak t durch A d s o r p t i o n des Prote ins an H y d r o x y l a p a t i t und nachfo lgende E lu t ion konzen- triert . Die f/Jr die isoelektr ische Focuss ie rung ben6t ig te salzfreie P robe wurde durch A b t r e n n u n g der nieder- mo leku la ren Subs tanzen mit tels G e l c h r o m a t o g r a p h i e durchgef i ihr t . Wegen der hohen Trennschfirfe sowie aus Zei t - und Kos tengr f inden wurde die isoelektr ische Focuss ie rung in Gelen mi t 150 gm Dicke durchgef / ihr t . Mi t dieser M e t h o d e k6nnen noch 0 ,2% Trockenb lu t - p l a sma in Bri ihwiirs ten nachgewiesen werden.

Einleitung

In Osterreich ist der Zusatz von Fremdeiweil3 in Fleischerzeugnissen mit Ausnahme yon Milcheiweig in Aufstrichkonserven und somit auch der Zusatz yon Blutplasma verboten. In der BRD hingegen darf

* Als Poster prS.sentiert anl/iBlich des Etektrophoreseforums '83, TU Miinchen, 24.-26. Oktober 1983

Offprint requests." F. Bauer

gewissen Fleischprodukten Blutplasma zugesetzt werden. Blutplas- ma wird neben dem gel6sten MuskeleiweiB in erhitzten Briihwfirsten koaguliert und ist an der Strukturbildung beteiligt.

Fiir den Nachweis von Fremdeiweil3 in Fleischerzeugnissen, aber auch fiir die Identifizierung yon Fleisch- und Fischarten kommen hauptsfichlich serologische und elektrophoretische Methoden in Be- tracht. Unter den eindimensionalen Elektrophorese-Techniken be- sitzt die isoelektrische Focussierung das h6chste Aufl6sungsverm6- gen und scheint damit fiir ihre Anwendung bei derart schwierigen Problemstellungen gewisse Vorteile zu besitzen. Es gibt bereits Hin- weise zur Identifizierung yon Fleisch- und Fischsorten mittels IEF in Polyacrylamidgelen oder Agarose [1-3]. Auch bei binfiren Fleischmi- schungen ist der Nachweis der Tierart m6glich [4]. Ein weiteres An- wendungsgebiet der IEF stelit die Differenzierung der Tierart in er- hitzten Fleischerzeugnissen [7] sowie in erhitzten und konservierten Fischerzeugnissen dar [8, 9]. Au6erdem k6nnen Fremdproteine wie Sojaeiweil3 und andere pflanzliche Eiwei6arten in Fleischerzeugnis- sen nachgewiesen werden [10]. Die Anwendung der IEF in ultradfin- hen Polyacrylamidgelen 1/igt dabei eine wesentliche Zeit- und Ko- stenersparnis erwarten [5, 6].

Ober die Nachweism6glichkeiten yon Blutplasma gibt es bisher nur wenige Mitteilungen. Erw/ihnenswert sind bier Versuche, Blut- plasma auf der Grundlage des Citratgehaltes nachzuweisen [I 1] so- wie papierelektrophoretische [11] und serologische Methoden [12- 16]. Mittels Disc-Elektrophorese ist Blutplasma nur in Mischungen mit rohem Fleisch nachweisbar [17]. In letzter Zeit wurde eine Be- stimmungsmethode von Blutplasma auf der Grundlage der Immun- turbidimetrie vorgestellt [15, 16].

Es war daher das Ziel der in der vor l iegenden Ar - bei t beschr iebenen Untersuchungen , ffir den Nachweis von Blu tp lasma in Brfihwiirsten eine m6gl ichs t emp- findliche U n t e r s u c h u n g s m e t h o d i k a u f der Grund lage der Ul t rad i innschich t - i soe lek t r i schen Focuss ie rung ( U D I E F ) zu erarbei ten.

Material und Methoden

Ger6te. Homogenisator (ULTRA-TURRAX), Zentrifuge, Chroma- tographiesfiule 0,9× 15 cm (PHARMACIA), UV-Photometer mit DurchfluBkiivette und angeschlossenem Schreiber (PYE-UNI- CAM), Fraktionssammler mit Tropfenz/ihler (BIO-RAD), Elektro- phoresekammer (UGI-Kammer, DESAGA), Netzger~it f/Jr Hoch- spannungselektrophorese (CAMAG).

Untersuchungsmaterial. Trockenblutplasma, Rinderserumalbumin, Brfihwurst ohne und mit Zusatz von Trockenblutplasma.

Reagentien. Pufferl6sungen: 0,01 und 0,5 m-Phosphatpuffer pH 7,0. - Hydroxylapatit: BioGel HTP (BIO-RAD). - Entsalzungsgel: Bio-

F. Bauer u. H. Stachelberger: Nachweis yon Blutplasma in erhitzten Fleischwaren 87

Gel P4 oder BioGel P6-DG (BIO-RAD). Stamml6sungen zur Gel- bereitung: 29,2% Acrylamid+0,8% N,N'-Methylenbisacrylamid (w/v) = L6sung A. 2% N,N,N',N'-Tetramethylfithylendiamin (v/ v) = L6sung B. - 1,5% Ammoniumpersulfat (w/v) = L6sung C. - Ampholyt (Servalyt T 4/9 bzw. Biolyte tech. 4/9). 8,3 m-Harnstoff (gereinigt mit Mischbett-Ionenaustauscber AG 501-X8 (d); BIO- RAD).

Elektrodenl6sungen. Anode: 0,83 g Asparaginsfiure und 0,92 g Glut- amins~iure auf 250 ml dest. Wasser. - Kathode: 30 ml .Kthylendia- rain, 1,09 g Arginin (freie Base) und 0,91 g Lysin (freie Base) auf 250 ml dest. Wasser.

Silanisierungsmittel. 0,2% Silane A 174 PHARMACIA) in )kthanol/ Wasser (1 + 1, v/v).

Fixiermedium. 20% TrichloressigsSmre mdest. Wasser (w/v).

Universallgsungsmittel. Methanol/Wasser/Eisessig (25 + 65 + 10, v/ v), t/iglich frisch bereitet aus Methanol/Wasser (50 + 50, v/v) und Eis- essig/Wasser (20 + 80, v/v).

Fdrbel6sung. 0,05% Serva Blau G in Universall6sungsmittel (t~iglich frisch bereitet).

Extraktion. 10 g homogenisierte Probe mit 25 ml 0,01 m-Phosphat- puffer pH 7,0 extrahieren (30 s, ULTRA-TURRAX) bei ca. 20 000 g zentrifugieren und den Uberstand filtrieren. 10 ml Filtrat und 1 g Hydroxylapatit in ein Zentrifugenglas geben, 15-30 rain rfihren, da- nach zentrifugieren und 1)berstand verwerfen. An Hydroxylapatatit adsorbiertes Protein mit 1 ml 0,5 m-Phosphatpuffer pH 7,0 desorbie- ren (15 rain Riihren) und zentrifugieren. Lrberstand gelchromatogra- phisch entsalzen (H6he des Gelbettes ca. 10 cm), mit Durchflugpho- tometer Elutionsverlauf bei 280 nm registrieren und das Eluat in 15- Tropfen-Fraktionen auffangen. Von der entsprechenden Fraktion (Absorptionsmaximum) 10 gl zur Elektrophorese einsetzen.

Elektrophorese. Gelbereitung: 1,7 ml L6sung A+0,25 ml L6sung B + 7,3 ml 8,3 m-Harnstoff bzw. dest. Wasser + 0,5 ml Ampholyt mi- schen, ca. 30 s entgasen. Danach Zugabe yon 0,3ml L6sung C. Gie- Ben der Gele nach der Klappmethode [18] auf silanisierten Glasplat- ten (9 x 12 cm, in Silanisierungsmittel tauchen und anschliel3end luft- trocknen). Abstandshalter aus 150 gm dickem kommerziellem Iso- lierband (TESAFLEX). Polymerisationszeit ca. 15 min.

Elektrophoretische Auftrennung: Die mit Gel beschichtete Glas- platte auf dem mit Paraffin61 behandelten Kiihlblock der Trennkam- mer legen (Kiihlung mit Leitungswasser). An den R/indern der Lfingsseiten die mit den entsprechenden Elektrodenfliissigkeiten be- feuchteten Elektrodendochte und darauf die Platinelektroden legen. Ca. 1,5 cm vonder Kathode entfernt (= ca. 20% der Elektrodendi- stanz) einen mit Paraffin61 befilmten Applikatorstreifen luftblasen- frei auflegen. Die Elektroden mit ca. 1,2 kg beschweren. Vorelektro- phorese 15 min bei 500 V, danach Probenauftrag (10 gl) und 90 min Elektrophorese bei 1000 V (= 1500 V. h).

Fixierung, F/irbung und Dokumentation: 10 min in 20% Tri- chloressigsfiurel6sung fixieren, 1 min in Universall6sungsmittel ba- den, 10 rain ffirben und danach bis zur Farblosigkeit des Untergrun- des mit Universall6sungsmittel entf/irben. Dokumentation der Gele durch Fotografie im Durchlicht nach Lufttrocknung.

Ergebnisse und Diskussion

Die Schwierigkeit des elektrophoretischen Nachweises von Blutplasma in erhitzten Fleischwaren ist in der Tatsache zu suchen, dab denaturiertes Blutplasma in

Wasser bzw. verdiinnten Salzl6sungen nur sehr schwer 16slich ist. Bei der Verwendung von Harnstoff-Mercap- to/ithanol-L6sungen ist zwar das ExtraktionsausmaB um ein Vielfaches gesteigert, jedoch werden bei der Elektrophorese die Banden des Blutplasma von den Banden des mitextrahierten FleischeiweiBes/iberdeckt. Auf diesem Weg lfil3t sich der Nachweis von Blutplas- ma in Fleischwaren daher nicht durchfiihren. Durch die Verwendung von Hydroxylapatit zur Adsorption der Proteine und nachfolgende Desorption mit gerin- gen Volumina von 0,5 m-Phosphatpuffer wird die Ex- traktion mit Wasser erm6glicht. Gleichzeitig werden damit st6rende Substanzen, wie niedermolekulare an- organische und organische Stoffe, Polysaccharide und Fette abgetrennt. Zur Vermeidung verzerrter Banden bei der UDIEF ist eine Entsalzung der Probel6sung notwendig, welche zweckm/il3igerweise auf gelchroma- tographischem Wege durchgefiihrt wird. Der Verlauf der Entsalzung wird bei 280 nm photometrisch regi- striert und das Eluat in Schritten zu je 15 Tropfen (= ca. 0,5 ml) aufgefangen. Die das Extinktionsmaximum enthaltene Fraktion wurde zur Elektrophorese einge- setzt. Im allgemeinen geniigt eine einmalige Vermes- sung des Elutionsverlaufes.

Zum Nachweis von Blutplasma mittels IEF mug die Elektrophorese in Gegenwart von Harnstoff durch- geffihrt werden. Bei Abwesenheit von Harnstoff ver- schieben sich die fiir den Nachweis von Blutplasma wichtigen Banden im Gel in Richtung der Anode (Abb. 1). Bis zu einem Zusatz von 0,2% kann Trocken- blutplasma auf Grund des Auftretens der Banden A2 und der Intensitfitsverstfirkung der Bande B nachge- wiesen werden. Die Doppelbande M i s t dem Myo- globin zuzuordnen.

Die Zuordnung der Bande B war nicht m6glich. Sie wird sowohl bei Blutplasma als auch in Briihwurstex- trakten ohne Plasmazusatz gefunden. M6glicherweise ist fiir ihr Auftreten eine Plasmafraktion verantwort- lich, welche aus dem Restblut des zur Verarbeitung ge- langenden Fleisches stammt und auf Grund ihrer ho- hen Affinit/it zu Hydroxylapatit noch nachgewiesen werden kann. Die Zone A 1/iBt sich in zwei Gruppen einteilen. Bei der Bandengruppe A2 handelt es sich mit grol3er Wahrscheinlichkeit um Rinderserumalbumin; sie tritt nur bei Blutplasma bzw. Briihwiirsten mit Plas- mazusatz auf. Bei Verwendung Harnstoff-freier Gele wird bei Rinderserumalbumin die gleiche Verschie- bung des isoelektrischen Punktes wie bei hitzedena- turiertem Blutplasma beobachtet (Abb. 2).

Die Bandengruppe A1 wird in Briihwurstextrakten mit und ohne Zusatz von Plasma gefunden. Diese Pro- teinfraktion ist in L6sung jedoch instabil und kann nach Aufbewahrung der L6sung fiber einige Tage (bei 4 °C) in den Pherogrammen nicht mehr sichtbar ge- macht werden (Abb. 2). Zwischen nativem und auf

88 F. Bauer u. H. Stachelberger: Nachweis yon Blutplasma in erhitzten Fleischwaren

Abb. 1. Nachweis yon Trockenblutplasma (TBP) in Briihwiirsten. UDIEF in Gegenwart (1-4) und bei Abwesenheit von Harnstoff (5- 8); Briihwurst ohne Zusatz yon TBP (1,5); Briihwurst mit 0,4% (2,6), 0,6% (3,7) und 0,2% TBP (4,8)

Abb.2. UDIEF von Rinderserumalbumin (1,5), Blutplasma auf 80 °C erhitzt (2,6), Brfihwurst mit 0,6% TBP (3,7) und Briihwurst ohne Zusatz von TBP (4,8) in Gegenwart (1-4) und bei Abwesenheit yon Harstoff im Gel (5-8)

Abb. 3. UDIEF yon erhitztem (80 °C) (1) und nativem (2) Rinderse- rumalbumin in Gegenwart von Harnstoff im Gel

Abb.4. UDIEF in Gegenwart von Harnstoff; Extraktmischungen von Brfihwiirsten ohne Zusatz von TBP (a) und Brfihwiirsten mit 1,7% TBP (b); Mischungsverhfilmisse (a+b) von oben nach unten: 10+0; 9+1; 8+2; 6+4; 4+6; 2+8; 0+10

80 °C erh i tz tem R i n d e r s e r u m a l b u m i n wird kein Un- terschied im IP-Bereich der auf t re tenden Banden ge- funden; es folgt lediglich eine Verr ingerung im Ab- s tand der IPs der einzelnen Banden (Abb. 3).

Bei Verwendung eines App l ika to r s t r e i f ens mi t run- den Offnungen (D = 3 mm) k6nnen bis zu 20 P roben p ro 10 cm Gelbre i te aufge t ragen werden (Abb. 4). Die Unte r sch iede im Bandenmus te r zwischen Abb . 1 und Abb . 4 ergeben sich aus der Verwendung von A m p h o - lyten verschiedener Herstel ler . Zur Ident i f iz ierung yon Blu tp lasma in Br/ihwfirsten ist es notwendig , Brfih- wurs tex t rak te mi t und ohne P lasmazusa tz gleichzeitig

mi t den u n b e k a n n t e n P roben zu focussieren. Zur Ver- me idung unterschiedl icher Bandenmus te r au f G r u n d verschieden langer Lagerung der Ext rak te sollte die Ex- t r ak t ion der Vergle ichsproben m6gl ichs t gleichzeitig mi t jener der zu un te r suchenden P roben durchgef i ihr t werden.

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Eingegangen am 22. August 1983. Angenommen am 20. September 1983

Aus der Industrie

VA-Analogstand 663

f/Jr die polarographische und voltammetrische Praxis

Hersteller: Deutsche Metrohm GmbH & Co, Elektronische MeBger/ite, In den Birken 3, 7024 Filderstadt 4. Nicht mehr die Gravitationskraft bewirkt den Quecksilberaustritt aus der Capillare, sondern ein Stickstoffiiberdruck. Verwendet wird wie bisher nachgereinigter Stickstoff (Nz-Bombe mit Reduzierventil). - Das zen- trale Element des neuen Standes ist die Multi Mode Electrode (MME), die als DME, SMDE oder HMDE eingesetzt werden kann. Bei der tropfenden Hg-Elektrode (DME) bleibt das Mikroventil ge6ffnet, das Abschla- gen der Tropfen erfolgt pneumatisch. Bei der station&en Hg-Tropfelektrode (SMDE) er- folgt die Tropfenbildung durch kurzzeitiges Offnen des pneumatisch gesteuerten Mikro- ventils. Die Tropfenoberfl/iche ist im Gegen- satz zur DME wfihrend der Messung kon- stant und oscillationsfrei. Dies resultiert in ei-

nem niedrigeren und noise/irmeren Grund- stromverlauf, der verbesserte Nachweisgren- zen bringt. Bei der hiingenden Tropfenelektro- de (HMDE) wird ein einzelner Tropfen gebil- det, an dem die gesamte Bestimmung ablfiuft. Der von der Atmosph/ire hermetisch abge- schlossene Hg-Vorrat in der Elektrode be- tr/igt 6 ml, was ffir 200 000 Tropfen reicht. Die kompakte Konstruktion dieser einzig- artigen MME gewiihrleistet ein komforta-

bles und sicheres Arbeiten. Sie 1/igt sich pro- blemlos ffillen und der Capillarenwechsel geht einfach und schnell. Durch die neue Bauart der MME lassen sich billige Glascapillaren verwenden. Da eine neue Capillare stets die beste ist, wurde der Preis mit ca. DM 10 (bei 5 min Arbeitszeit) sehr niedrig gehalten. Wird nicht mit der Elektrode gearbeitet, ist das Mi- kroventil stets verschlossen, d.h. ein unbeab- sichtigtes Austreten von Hg ist nicht mehr m6glich. - Alternativ kann man auch mit der integrierten rotierenden Scheibenelektrode arbeiten. Dazu wird der Teflonrotor, der als Rfihrer agiert, durch einen Glassy-Carbon-, Gold-, Platin- oder Silber-Tip ersetzt.

Der VA-Analogstand 663 ist steckerkom- patibel zu den bewiihrten Polarographen 506 und 626. In der Inversvoltammetrie emp- fiehlt sich zur Automation des gesamten MeB- ablaufs der VA-Timer 621 oder der universel- lere VA-Controller 608, der zus/itzlich Entliif- tung, Tropfenbildung, Wiederholungsmes- sungen und Standardaddition automatisch steuert.