Nanobiophotonics for biomolecular diagnostics .Nanobiophotonics for biomolecular diagnostics

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Joo Pedro Maurcio Rosa Licenciado

Nanobiophotonics for biomolecular diagnostics

Dissertao para obteno do Grau de Doutor em Biotecnologia

Orientador: Doutor Pedro Viana Baptista, Professor Associado com Agregao, FCT/UNL

Co-orientador: Doutor Joo Carlos Lima, Professor Associado, FCT/UNL

June 2013

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Copyright em nome de Joo Pedro Maurcio Rosa, e da FCT/UNL.

A Faculdade de Cincias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tm o direito,

perptuo e sem limites geogrficos, de arquivar e publicar esta dissertao atravs de

exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro

meio conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar atravs de repositrios

cientficos e de admitir a sua cpia e distribuio com objectivos educacionais ou de

investigao, no comerciais, desde que seja dado crdito ao autor e editor.

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A meus pais

To my parents

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ACKNOWLEDGMENTS

The work here presented would not be possible without the support of so many people and institutions

that I fear I will forget someone. All the expression of gratitude may not be enough to show the full

extent of my thankfulness for all the support throughout the good and bad moments of this journey.

However, my most special thanks must be addressed to:

- My PhD advisors, Professors Pedro Baptista and Joo Carlos Lima, for supporting and putting

up with me, for their guidance, advisory and the academic and scientific growth they promoted in me

during these years. Thank you for the opportunity of joining the great adventure that was this crazy

project. I thank you both for the support, discussions, criticism and dedication to the cause. Most of

all, Thank you for believing in me.

I would like to thank Pedro for the constant support and insightful discussions that far exceeded

science. Without your pragmatism and vision none of this would have been possible. It is commonly

said that you are who you spend more time with and I must thank you for who I am now. You have

been an example and a beacon in many things. You pushed me and demanded the best of me. Youve

placed your trust in me and I can only hope not to have let you down. Thank you.

I would like to thank Joo Carlos for the enthusiastic discussions in science and the lessons in life. For

allowing me to grow on my terms and for fuelling the dreams that were essential for this project. I will

not forget the opportunities you provided me with and the belief in my competences that you dared to

show when I would not. Thank you.

- Fundao para a Cincia e Tecnologia, for the financial support (SFRH/BD/43320/2008)

provided to conduct this thesis and to attend national and international scientific meetings.

- The Departament of Chemistry for hosting the doctoral program and the Department of Life

Sciences for housing me during these 4 four years. My thanks to all their members as well, for all the

support given throughout these years and for providing the conditions to achieve my research goals.

- To Joo Conde for all the invaluable help with the work in the biosensors. For all the

cooperation and endless discussions that lead to numerous breakthroughs and results. I cannot thank

you enough for believing it was worth it.

- To Ana, Claudia Fernandes, Claudia Correia, Mara and Sheetal for the work (hands on) that

allowed me to explore several avenues simultaneously without losing focus. I can only hope that you

enjoyed working with me as I have enjoyed working with you.

Life is partly what we make it, and partly what it is made by the friends we choose.

Chinese proverb

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- Ana, Carina, Carlota, Carolina, Conde, Crossfire, Fbio, Letcia, Maria, Milton, Revolt e

Veigas por terem sido os pilares da minha sanidade e os amigos que eu precisei e tenho a sorte de ter;

e ao Artur, Ana Filipa, Ana Marta, Ana Sofia, Carla, Csar, Equipa, Prof. Folgosa, Ins Gomes, Ins

Osrio, Isabel, Joo Av, Lia, Mrcia, Marco, Mrio, Marta, Madalena, Margarida, Pedrosa,

Quaresma, Renato, Rita e Z por todos os momentos passados juntos e que fizeram da FCT a minha

segunda casa ao longo destes anos.

Ao AVP, Gonalo, Large, Red e Santo pelas noitadas no laboratrio, pelas idas ao frum e montra,

pela pardia, pelas ideias, pela loucura, pela alegria, pelas futeboladas, pronto! Pelo infinito

companheirismo e amizade.

In the fear and alarm

You did not desert me

My brothers in arms

Brothers in Arms, Dire Straits

- Ao Large, porque s tu que sabes.

- A todos os meus amigos. BCMicos: Brunol, Nico, Cati, Sol, Lara, Rols, Hlio, Pips, Lusa,

Ropio, Mimi, Andreia. Torrejanos: Carreira, Andr, Dani, CD, Careca, Ritinha, Lili, Bruno,

Ch, Pilas, Sofia, Pedro, Cuba. E aos mais antigos: Filipe, Mafalda, Pedro, Rui Jos e Rui

Pedro. Pela amizade que nem o tempo nem a distncia conseguem abalar. Eu no esqueo. Obrigado.

- Rita pelos anos que me aturou e me apoiou. Pelo que passmos juntos de bom e de mau que

nunca vou esquecer. Pelo Thor. Por toda a capacidade de animar e de me suportar quando eu mais

precisei. Por toda a dedicao que incondicionalmente mostrou e que eu nem sempre soube retribuir

ou reconhecer. Muito Obrigado. Mesmo.

- s pessoas que me moldaram e marcaram como pessoa profissional, aos meus Professores

Margarida e Carlos, Maria Amlia Maia, Fernanda Franco, Felisbela Falco, Teresa Sirgado, Carlos

Silva, Carlos Lopes, Teresa Moura, Nuno Neves e Wanda Viegas.

- minha famlia, em particular aos meus avs, os faris da minha vida e as luzes dos meus

olhos. Ao Pedro, meu primo, meu irmo, meu exemplo! Nen pela mulher de fogo, as cartadas

incompletas e a Ana Joo. Ao Tot e Bela por serem mais que tios. Aos meus padrinhos pelo carinho

incondicional. E quero deixar um agradecimento muito especial aos meus pais que sempre estiveram

nos bastidores a torcer por mim, a apoiar incondicionalmente, a guiar-me. Por tudo o que passaram

comigo e por mim. Um muito obrigado. Sem vocs, eu no seria nada.

- To anyone I may have missed in the list above. You may be away from my head at the

moment but are surely in my heart! Thank you!

Joo Bixo Rosa

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RESUMO

O principal objectivo desta tese foi estudar a modulao de fluorescncia induzida por nanopartculas

de ouro (AuNPs) em fluorforos prximos e/ou ligados sua superfcie atravs de molculas de

cidos nucleicos. A compreenso do efeito da distncia nas propriedades espectrais dos fluorforos

permitiria desenvolver um biossensor para caracterizao de sequncias de DNA e/ou RNA.

Para estudar os efeitos fotofsicos envolvidos na modulao de fluorescncia por AuNPs foi necessrio

desenvolver uma abordagem experimental que removesse o efeito da interferncia ptica causada pela

presena de AuNPs. Ao comparar as amostras com solues referncia controladas foi possvel

determinar o rendimento quntico de fluorescncia e o tempo de decaimento de fluorescncia de

fluorforos na vizinhana de AuNPs. Durante esta caracterizao foram desvendados vrios

fenmenos no-fotofsicos relacionados com AuNPs, como o efeito do pH local superfcie da AuNP,

o acoplamento do oscilador da plasmnica com o momento de transio do fluorforo ou a agregao

de fluorforos induzido por AuNPs.

O mtodo experimental desenvolvido foi aplicado ao estudo do efeito da distncia na modulao de

fluorescncia induzida por AuNPs. Usando molculas de DNA como espaadores, as propriedades

fotofsicas de fluorforos a diferentes distncias da superfcie de AuNPs mostrou uma dependncia

com a distncia correspondente a 1/r6.

O conhecimento adquirido sobre sistemas AuNP-DNA-fluorforo permitiu o desenvolvimento de

biossensores optimizados para a deteco semi-quantitativa de RNA. Partindo desse potencial

quantitativo, foi possvel desenvolver um sistema de controlo e quantificao simultnea de sntese de

RNA in vitro. A deteco e silenciamento gnico in situ foi demonstrada em mRNA de EGFP como

prova de conceito. Uma estratgia semelhante foi utilizada com sucesso na deteco de siRNA e

miRNA endgeno. A aplicao deste sistema anlise de microdeleces e isoformas de RNA foi

demonstrada em alvos sintticos.

PALAVRAS-CHAVE: Fluorescncia, Nanodiagnstico, Nanopartculas, Ouro

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ABSTRACT

The main objective of this thesis was to study the fluorescence modulation induced by gold

nanoparticles (AuNPs) on fluorophores nearby and/or bonded to the AuNPs surface through nuclei

acid molecules. The understanding of the effect of distance in the spectral properties of fluorophores

would allow the development of a biosensor for the characterisation of DNA and/or RNA sequences.

To study the photophysics involved in the fluorescence modulation by AuNPs it was necessary to

develop an experimental approach that removed the effect of the optical interference caused by the

presence of AuNPs. By comparing the samples with controlled reference solutions it was possible

determine the fluorescence quantum yield and fluorescence decay time of the fluorophores in the