Narzędzia Narzędzia diagnostyki molekularnej diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznymw typowaniu genetycznymw typowaniu genetycznymw typowaniu genetycznym

((genotypowaniugenotypowaniu) ) 

Dr hab. Beata Krawczyk

Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska 

Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 1

Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój diagnostyki molekularnejdiagnostyki molekularnej

Data Odkrycia

1953 poznanie struktury heliakalnej dwuniciowego DNA 

1958 izolacja polimerazy DNA I E. coli

1960 pierwsza technika hybrydyzacji

1969 hybrydyzacja in situ

1970odkrycie enzymów restrykcyjnych

1970y y y yj y

i odwrotnej transkryptazy

1975 Southern blotting

1977 sekwencjonowanie DNA

1983 pierwsza synteza oligonukleotydów

1985analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

1985 wynalezienie PCR

1986zastosowanie fluorescencji w hybrydyzacji in situ(FISH)

1988odkrycie termostabilnej polimerazy DNA ‐optymalizacja PCR

1992 koncepcja real‐time PCR

1996 pierwsze aplikacje mikromacierzy DNA

2001 pierwsza wersja sekwencji ludzkiego genomu2

Wybór metody diagnostycznej zależy od blporuszanego problemu:

‐ wykrywanie‐ identyfikacja ‐ typowanie (różnicowanie)typowanie (ró nicowanie)‐ badania taksonomiczne; filogeneza

3

środowisko

Genotyp

genom

Ekspresja genu Fenotyp

genomMetody genotypowe

☺Metody wykorzystujące  właściwości kwasów nukleinowych

Metody fenotypowe

Klasyczne Molekularnewłaściwości kwasów nukleinowych np. hybrydyzacja  DNA‐DNA, mikromacierze oligonukleotydowe tzw. chip DNA

Klasyczne

Biotypowanie

Typowanie bakteriofagowe

Molekularne

Analiza białek‐PAGE, MLEE

Immunodiagnostyka☺Metody oparte na analizie kwasów nukleinowych

‐analizie genu

bakteriofagowe

Typowanie bakteriocynowe

Antybiogramy

Immunodiagnostyka

‐analizie fragmentu genu

‐analizie genomu

Antybiogramy

4

Wybór metody badawczej uzależniony jest od celu jaki chcemy Wybór metody badawczej uzależniony jest od celu jaki chcemy osiągnąć osiągnąć 

Rodzina Rodzaj Gatunek Podgatunek Szczep

Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie 16S rDNA

Rybotypowanie w systemie ARDRARybotypowanie w systemie ARDRA

Hybrydyzacja DNA‐DNA

ITS PCR

RFLP PFGERFLP, PFGE

Multilocus Enzyme Electrophoresis‐MLEE

Analiza Profili Białkowych z całych komórek

AFLP

RAPD, AP‐PCR 

Rep‐PCR

5

Typowanie mikroorganizmówTypowanie mikroorganizmówTypowanie mikroorganizmówTypowanie mikroorganizmów

Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa

li ik i óanaliza mikroorganizmów, 

poniżej poziomu gatunku lub podgatunkuponiżej poziomu gatunku lub podgatunku

6

Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa analiza analiza izolatówizolatów bakteryjnych, poniżej poziomu bakteryjnych, poniżej poziomu 

gatunku lub podgatunku. gatunku lub podgatunku. 

stwierdzenie czy wśródbadanego zbioru  izolatów istnieją grupy 

wykazujące podobieństwo, świadczące o pochodzeniu  klonalnym

identyfikacja obecności i opisu dynamikirozprzestrzeniania się poszczególnychszczepów bakteryjnych danego gatunku

stwierdzenie czy wśródbadanego zbioru  izolatów istnieją grupy 

wykazujące podobieństwo, świadczące o pochodzeniu  klonalnym

identyfikacja obecności i opisu dynamikirozprzestrzeniania się poszczególnychszczepów bakteryjnych danego gatunku

identyfikacja ogniska epidemicznego i

badanie śladówbiologicznych w kryminalistyce

identyfikacja ogniska epidemicznego i

badanie śladówbiologicznych

Typowanie drobnoustrojów

epidemicznego i dostarczenia przesłanek, 

co do sposobu jegowygaszenia

filogeneza

biologicznych w kryminalistyce Typowanie Typowanie 

drobnoustrojówdrobnoustrojów

epidemicznego i dostarczenia przesłanek, 

co do sposobu jegowygaszenia

filogeneza

biologicznych 

wykrywanie i charakterystykaelementów genetycznych  szukanie związków pomiędzy

filogeneza (genetyka ewolucji) 

wykrywanie i charakterystykaelementów genetycznych  szukanie związków pomiędzy

filogeneza (genetyka ewolucji) 

Metody typowania najczęściej wykorzystywane są do badań organizmów

g y yodpowiedzialnych za

rozprzestrzenianie się, zjadliwość i  lekooporność bakterii

szukanie związków pomiędzy mechanizmami wirulencji 

wśród badanych szczepów; 

g y yodpowiedzialnych za

rozprzestrzenianie się, zjadliwość i  lekooporność bakterii

szukanie związków pomiędzy mechanizmami wirulencji 

wśród badanych szczepów; 

Metody typowania najczęściej wykorzystywane są do badań organizmów haploidalnych, jednak coraz częściej znajdują zastosowanie również w 

badaniach organizmów diploidalnych takich jak: drożdże, grzyby parazyty. 7

W trakcie wyboru markera powinniśmy W trakcie wyboru markera powinniśmy kierować się:kierować się:

•• Poziomem zmienności organizmuPoziomem zmienności organizmu•• niektóre fragmenty genomu mutują szybciej niż inne, a pożądany stopień niektóre fragmenty genomu mutują szybciej niż inne, a pożądany stopień 

polimorfizmu zależy od postawionego pytaniapolimorfizmu zależy od postawionego pytania

Markery molekularne Markery molekularne są narzędziami do są narzędziami do

uzyskiwania danychuzyskiwania danych

Organizmy blisko spokrewnione wymagają k ó b d i h

Do badania odległych genetycznie taksonów wykorzystujemy mniej 

markerów bardzo zmiennych y y j y j

polimorficzne fragmenty

Markery kodominująceIdentyfikują wszystkie allele 

w danym locus: RFLP, sekwencje SNP

Markery dominujące –ujawniają tylko dominującą formę alleliczną: RAPD AFLPsekwencje, SNP, 

mikrosatelity np.STRformę alleliczną: RAPD, AFLP

8

Metody Metody genotypowaniagenotypowaniaMetody Metody genotypowaniagenotypowania

Metoda genotypowaniaUdział w typowaniu 

szczepówPowtarzalność 

wynikówPotencjał różnicujący

Typowanie plazmidowe Większość Wystarczająca Wystarczający

Hybrydyzacja (rybotypowanieoparte o Southern blot,  mikromacierze)

Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobrymikromacierze)

REA‐PFGE Wszystkie Dobra Bardzo dobry

Rybotypowanie oparte o PCR Wszystkie Bardzo dobra Dobry

PCR/RFLP Wszystkie Bardzo dobra Dobry

PCR‐fingerprinting np. RAPD Wszystkie Dobra Bardzo dobry

AFLP Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry

ADSRRS‐fingerprinting ? Bardzo dobra Bardzo dobry

PCR‐MP ? Bardzo dobra Bardzo dobry

Real‐time PCR Wszystkie Bardzo dobra ?

Sekwencjonowanie (MLST) Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry

9

Identyfikacja szczepów bakteryjnych

Antybiogramy, klasyczne serotypowaniefagotypowanie

Pi ób d iPierwsze próby wprowadzania molekularnych 

testów do typowania

H br d acja1970 PPA RFLP Hybrydyzacja Southern

Druga seria testów molekularnych  Rozwój baz 

1970

do typowania 

PFGE Metody PCR: RAPD, AFLP, itp.

jdanych 

1985

Powszechne stosowanie testów molekularnych 

MLVA MLST dLST

Między ‐narodowa wymiana danych

2000‐2007R PCRMLVA MLST dLST

Innowacyjne technologie 

danych

???

Rep PCR

sekwencjonowanie genomów, technologie oparte na genomice, 

spektroskopia 

???

10

Analiza profili plazmidowych Analiza profili plazmidowych ((angang. PPA . PPA -- PlasmidPlasmid Profile Profile AnalysisAnalysis))

•Po raz pierwszy została zastosowana w badaniach epidemiologicznych w roku 1988

•Uważa się, że szczepy izogeniczne (należące do tej samej grupy) mają identyczny zestaw plazmidów

T h ik l i d ó i d j h l id•Technika prosta, ale ograniczona do szczepów posiadających plazmidy, szczepy bezplazmidowe są nietypowalne

•Komórki niektórych gatunków bakterii, nawet szczepów, nabywają i tracą plazmidy spontanicznieplazmidy spontanicznie

Profile plazmidowe dla E.coli

11

angang. REAP . REAP –– RRestrictionestriction EEnzymenzyme AAnalysisnalysis of of PPlazmidlazmid

Liczba i wielkość uzyskanych fragmentów DNA determinowana jest przez 

długość sekwencji rozpoznania dla określonego enzymu restrykcyjnego 

oraz charakter trawionego DNA (% składu par zasad GC).

Statystycznie w przypadku DNA z zawartością par GC około 50%Statystycznie, w przypadku DNA z zawartością par GC około 50%,

4‐nukleotydowa sekwencja rozpoznania powinna występować co 256 pz,

6‐nukleotydowa co 4 kpz, a sekwencja 8‐nukleotydowa co 65 kpz.

12

RybotypowanieRybotypowanieRybotypowanieRybotypowanie

• Wybrane fragmenty operonu rrn stanowią cel molekularny nowoczesnych technik rybotypowania:

polimorficznego regionu pomiędzy genami rrs i rrl (ang. ITS PCR – Internal Transcribed Spacer PCR)

zmiennego regionu wewnątrz genu rrs

regionu zawierającego geny rrs i rrl oraz rozdzielający je fragment polimorficzny

regionu kodującego tRNA

Promotory

Polimorficzny region DNA

Terminatory

3’5’

rrs rrl rrf

Produkty genowe 16S RNA 23S RNA 5S RNAtRNA tRNA

13

Schemat eukariotycznego operonu Schemat eukariotycznego operonu rrnrrn

IGS 18S rDNA ITS‐1      5,8S rDNA ITS‐2         25S – 28S rDNA IGS

IGS – Intergenic Spacer, nietranskrybowany region dd i l j t j i k joddzielający powtarzające się sekwencje

ITS – Internal Transcribed Spacer

14

Komórka bakterii

METODY HYBRYDYZACYJNE METODY OPARTE NA TECHNICE PCR

Izolacja genomowego DNA

Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.

Elektroforeza i transfer 

PCR regionu zmiennegomiędzy rrs‐rrl rDNA.

RFLP produktów amplifikacji regionów 

operonu rrnPCR regionu 

zawierającego gen k d j 16S RNArozdzielonych fragmentów

DNA na filtr.Hybrydyzacja z sondą 

komplementarną do rDNA.

kodujący 16S rRNA

p ą

RFLP zhybrydyzowanego

Polimorfizm długości produktów PCR

ITS ITS PCRPCR

ARDRA Sekwencjonowanieotrzymanych produktów 

PCR.y y y g

z sondą rDNA (rrn loci)rrn RFLP

15

Sekwencje repetytywnej p y yw genotypowaniu

16

Wykorzystanie sekwencji Wykorzystanie sekwencji repetytywnychrepetytywnychww genotypowaniugenotypowaniu bakteriibakteriiw w genotypowaniugenotypowaniu bakteriibakterii

Różnice w wielkości oraz liczbie kopii repetytywnych fragmentów DNA są podstawą różnicowania metodą rep‐PCR. 

Regiony takie najwcześniej zostały odkryte i opisane u Enterobacteriacae

• Rep PCR• Rep‐PCR

• SSR – ang. Short Sequence Repeat

• DR ang Direct Repeat• DR ang. Direct Repeat

• VNTR ang. Variable Number Tandem Repeat

17

RepRep PCRPCRRepRep‐‐PCRPCR

• Przykładem tego typu sekwencji są REP (ang. RepetitiveChromosomal Elements) o długości 38 pz i ERIC (ang.

Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długościEnterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długości 124‐127 pz, obecne u bakterii Gram ujemnych. 

VNTRVNTR((angang VVariableariable NNumberumber TTandemandem RRepeatepeat))((angang. . VVariableariable NNumberumber TTandem andem RRepeatepeat))

K ótki k j kl t d t j i i l• Krótkie sekwencje nukleotydowe, powtarzające się wiele razy w danym locus, o różnej liczbie kopii w zależności od szczepu, tworząc tym samym polimorfizm długości.

18

MLVA (MLVA (angang. . MultipleMultiple‐‐LocusLocus VariableVariable NumberNumber Tandem Tandem RepeatsRepeats AnalysisAnalysis))

J d lifik j i l l i óż i j li bi• Jednoczesna amplifikacja wielu loci o zróżnicowanej liczbie tandemowych powtórzeń ‐MLVA (ang. Multiple‐LocusVariable Number Tandem Repeats Analysis) odpowiada ł ż j k ji PCR ( lti l k PCR)złożonej reakcji PCR (ang. multipleks PCR). 

• Powstały obraz prążków w elektroforezie żelowej możnaPowstały obraz prążków w elektroforezie żelowej można traktować jako genetyczny „fingerprinting”, stąd metoda znana jest też pod nazwą MLVF‐ang.Multiple‐Locus VariableNumber Tandem Repeats FingerprintingNumber Tandem Repeats Fingerprinting. 

19

MLVA (MLVA (angang. . MultipleMultiple‐‐LocusLocus VariableVariable NumberNumberTandemTandem RepeatsRepeats AnalysisAnalysis))Tandem Tandem RepeatsRepeats AnalysisAnalysis) ) dla dla StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus

20

TypowanieTypowanie spaspa StaphylococcusStaphylococcus aureusaureusTypowanie Typowanie spaspa StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus

U ki k j t d h tó ń i dd li i ó j• Uzyskiwane sekwencje tandemowych powtórzeń są numerowane i poddawane analizie porównawczej z

wykorzystaniem oprogramowania Ridom StaphType (dostępny na stronie http://spacerver.ridom.de).

• Powstały kod numeryczny oznacza typ spa oraz zawiera informacje na temat wykrytych zmian w regionachPowstały kod numeryc ny o nac a typ spa ora awiera informacje na temat wykrytych mian w regionach

powtarzalnych.

21

Techniki Techniki genotypowaniagenotypowania oparte na analizie całego oparte na analizie całego genomu, wykorzystujące reakcje PCRgenomu, wykorzystujące reakcje PCR

Metoda nie wymaga znajomości sekwencji genomowego DNA badanego drobnoustrojubadanego drobnoustroju

• PCR-fingerprinting (RAPD, AP-PCR, DAF)• LM PCR techniki oparte na ligacji adaptorów• LM-PCR – techniki oparte na ligacji adaptorów

22

T h ikiT h iki PCRPCR fi i tifi i tiTechnikiTechniki PCRPCR‐‐fingerprintingfingerprinting

• Technika PCR‐fingerprinting jest uniwersalną metodą wykrywania 

polimorfizmu DNA – polega na przypadkowym amplifikowaniu 

polimorficznego DNA poprzez dobór odpowiednich starterów 

ó l kt f t d i k l ”wzór elektroforetyczny    =     „odcisk palca”  

23

RAPD RAPD ang. ang. Random Random AmplifiedAmplified PolymorphicPolymorphic DNADNA

1 2 3

Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA

Genom A

Genom B

1 2 3 4

A B

3

1

3

12

3

24

Rozkład produktów reakcji RAPD w rozdziale elektroforetycznym

24

TechnikiTechniki PCRPCR‐‐fingerprintingfingerprintingRAPD APRAPD AP PCR DAFPCR DAFRAPD, APRAPD, AP‐‐PCR, DAFPCR, DAF

Wymienione metody różnią się od siebie tylko długością stosowanych starterów

RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA) ‐ 9‐10 nt, temp. dołączania 30‐35°C, detekcja z BrEt;ą , j ;

AP‐PCR (ang. Arbitrarily Primed PCR) ‐18‐32 nt, temp. dołączania poniżej 45°C 5 i 40 kli d t k j t di fi45°C,5 min; 40 cykli, detekcja przez autoradiografię;

DAF ( ang. DNA Amplification Fingerprinting) ‐ 5‐8 nt, temp. dołączania ( g p g p g) , p ą30 °C, 30 sekund; BrEt lub Ag. 

25

Czynniki wpływające na wyniki reakcji Czynniki wpływające na wyniki reakcji RAPDRAPDRAPDRAPD

Startery DNA Matrycowe DNA. Stężenie chlorku magnezu Stężenie deoksyrybonukletydówPolimeraza DNA i bufor reakcyjny Parametry amplifikacji. 

26

Dokumentacja KM PG

Różnicowanie metodą RAPD szczepów K. pneumoniae, w reakcji PCR użyto polimerazy PwoM2 - marker wielkości DNA M2 (1008, 883, 615, 517, 466, 396 pz)K kontrola negat na reakcji PCR

Różnicowanie metodą RAPD szczepówK. pneumoniae, w reakcji PCR użyto polimerazy Taq rekombinantowejM2 - marker wielkości DNA M2 (1008, 883, 615, 517 466 396 pz);K- - kontrola negatywna reakcji PCR

1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 – produkty reakcji RAPD dla kolejnych izolatów.Rozdział prowadzono w 6% żelu poliakryloamidowym.

517, 466, 396 pz);K- kontrola negatywna reakcji PCR1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 – produkty reakcji RAPD dla kolejnych izolatów.Rozdział prowadzono w 6% żelu poliakryloamidowym.

27

Parametry amplifikacjiParametry amplifikacji

Temperatura denaturacji może mieć wpływ na wzór 

produktu, inne parametry są niezmienialne, wzór 

produkowany w temperaturze denaturacji w 90 °C jest 

podobny, ale nie identyczny co w 94 °C. 

28

Parametry amplifikacjiParametry amplifikacjiNiska temperatura przyłączania startera DNA

• Przeważnie zakres stosowanych temperatur przyłączania wynosiPrzeważnie zakres stosowanych temperatur przyłączania wynosi 

od 25 °C do 40°C ; 

• Wraz ze wzrostem temperatury przyłączania w zakresie  25 ‐ 40 °C 

następuje redukcja sygnału tła.

• Optymalna temperatura przyłączania starterów zależy od długości 

zastosowanego startera np.g p

10 nt – 36 °C; 18 nt i > 35‐50 °C, przeważnie 40 °C; 

k d dł l b d• rekomenduje się dłuższe startery, jeżeli będzie wytwarzana 

wystarczająca ilość produktów.

29

W niektórych reakcjach stosuje się dwie fazy:I stosuje się 3 ‐ 5 początkowych cykli o relatywnie niskiejI. stosuje się 3  5 początkowych cykli, o relatywnie niskiej temperaturze przyłączania i często wydłużonym jego czasie, nawet 20 ‐ 25 °C przez 5 minut;II. następnie stosuje się 30 cykli o wyższej temperaturze przyłączania, np. 36 ‐ 40°C, trwającej 1 ‐ 2 minuty

Jednak tego typu reakcja nie zawsze jest konieczna, wystarczy zastosować niską temperaturę przyłączania,wystarczy zastosować niską temperaturę przyłączania, zwiększając tylko ilość cykli.

30

Z czego wynika polimorfizm RAPDZ czego wynika polimorfizm RAPDZ czego wynika polimorfizm RAPDZ czego wynika polimorfizm RAPD

• Jest wynikiem mutacji w obrębie sekwencji 

komplementarnych do końca 3’ startera oraz delecji lubkomplementarnych do końca 3  startera oraz delecji  lub 

insercji w pewnej odległości od miejsca wiązania startera

• Sekwencje repetytywne

31

Zastosowanie RAPDZastosowanie RAPD

1. Do analizy porównawczej izolatów

RAPD dla szczepów        Różnicowanie klinicznych szczepów k h

Candida albicanswankomycyno‐opornych 

Enterococcus faeciummetodą RAPD

Dokumentacja KM PG 32

Analiza wzorów Analiza wzorów fingerprintingfingerprinting ‐‐ Interpretacja wzorów Interpretacja wzorów APAP‐‐PCRPCR, RAPD, RAPD

• Jeżeli wzór AP‐PCR( RAPD) jest identyczny, bądź różnica 

dotyczy 3 i > prążków to interpretacja jest prosta natomiastdotyczy 3 i > prążków to interpretacja jest prosta, natomiast 

gdy różnica dotyczy 1 prążka, lub intensywność kilku prążków 

spada, konieczne staje się zmienienie warunków reakcji bądź 

sekwencji starterów. sekwencji starterów.

• Tyler KD, Wang G, Tyler SD, Johnson WM. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification‐

b d DNA fi i ti f t ti b t i l th J Cli Mi bi l 1997 35 339 346based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. J Clin Microbiol 1997;35:339‐346. 

33

Kolekcja izolatów

Izolacja DNA

Amplifikacja PCR fragmentów genówl k

Amplifikacja PCR fragmentów genów

Sekwencjonowanie (dideoxy)

Kolekcja danych

Określenie sekwencji nukleotydowej

Zgromadzenie danych sekwencji nukleotydowych

Profile alleliczne i identyfikacja typu sekwencji (ST)

P d i ł ST d k l k kl l

Nowe sekwencjealleli 

i fik j ST

Analiza danych

Przydział ST do kompleksu klonalnegoi weryfikacja ST

Badanie populacji Badania epidemiologiczne

Analiza Sekwencji 

ML

Diagram badawczy MLSTPorównuje się profile alleliczne izolatów z centralną bazą danych 

www.mlst.net 34

MLSTMLSTMLSTMLSTMaiden M C J, Bygraves J A, Feil E, Morelli G, Russell J E, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant D A, Feavers I M, Achtman M and Spratt B G (1998) Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. S i USA 95 3140 3145Sci. USA, 95: 3140‐3145 

Urwin R, Maiden MC. (2003) Multi‐locus sequence typing: a tool for global epidemiology Trends Microbiol Oct;11(10):479 87epidemiology. Trends Microbiol. Oct;11(10):479‐87.

David M. Aanensen* and Brian G. Spratt (2005) The multilocus sequence typing network: mlst net Nucleic Acids Research Vol 33typing network: mlst.net Nucleic Acids Research, Vol. 33,

Maiden MC. Multilocus sequence typing of bacteria.Annu Rev Microbiol. 2006;60:561‐882006;60:561 88

35

Gatunki Metody referencyjne* Metody alternatywne

Staphylococcus aureus typowanie fagowe, REA-PFGE AP-PCR, VNTR-PCR, PCR/RFLP PPA ADSRRS PCRPCR/RFLP, PPA, ADSRRS, PCR-MP

Streptococcus pneumoniae REA-PFGE Serotypowanie

Enterokoki REA-PFGE rybotypowanie, RAPD, y yp , ,ADSRRS, PCR-MP

Escherichia coli # Citrobacter, Proteus, Providencia

REA-PFGE AP-PCR, REP-PCR, ADSRRS,PCR-MP

Klebsiella Serratia REA PFGE PPA† ADSRRS PCR MPKlebsiella, Serratia REA-PFGE PPA†, ADSRRS, PCR-MP

Enterobacter REA-PFGE, rybotypowanie

Pseudomonas aeruginosa REA-PFGE Rybotypowanie, ARDRA

Acinetobacter REA-PFGE PCR/RFLP, REP-PCR, ADSRRS, PCR-MP

Clostridium difficile AP-PCR REA, PFGE‡, PCR-MP

Mycobacterium tuberculosis IS16110 RFLP, spoligotyping REP-PCR, VNTR-PCR,y p g yp gSouthern Blot

Mycobacterium avium REA-PFGE rybotypowanie

Borrelia burgdorferi sensu lato immunodiagnostyka, PFGE PPA, PCR/ RFLP, RAPD, VNTR-PCR, real-time PCR

Objaśnienia:REA‐PFGE, ang. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową; AP‐PCR, ang. Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction; PPA, ang. Plasmid Profile Analysis – analiza profili plazmidowych (z lub bez analizy restrykcyjnej); REA, Restriction Endonuclease Analysis – analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA z użyciem konwencjonalnej elektroforezy; RFLP – ang. Restriction Fragment Length Polimorphism ; RAPD, ang. Random Amplified Polymorphic DNA, VNTR, ang. Variable Number Tandem Repeat, AFLP, ang. Amplified Fragment Length Polymorphism; ADSRRS ang. Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites; PCR MP, ang. PCR Melting Profiles; real‐time PCR – amplifikacja w czasie rzeczywistym; REP‐PCR, ang. Repetitive Element Polymerase Chain Reaction*Rekomendowane na podstawie danych publikowanych i stałych opini ekspertów# E.coli O157:H7 musi być identyfikowane przez serotypowanie†Dla bakterii gram ujemnych, analiza profili całych plazmidów, bez trawienia restrykcyjnego‡Wiele szczepów Clostridium difficile jest nietypowalna metodą PFGE z powodu problemów z degradacją DNA

36

KonkluzjaKonkluzjaKonkluzjaKonkluzja• Należy pamiętać, że w miarę upływu czasu i y p ę , ę p yrozprzestrzeniania się drobnoustrojów, różnice fenotypowe i genotypowe pomiędzy szczepami yp g yp p ę y pwzrastają. 

• Powinniśmy uwzględnić pewną elastyczność wPowinniśmy uwzględnić pewną elastyczność w interpretacji danych eksperymentalnych: małe różnice nie zawsze oznaczają nowy typ genetyczny.różnice nie zawsze oznaczają nowy typ genetyczny. 

• Powinniśmy również uwzględnić błąd eksperymentalny (niedokładność) nawet weksperymentalny (niedokładność), nawet w przypadku pracy z wysoce różnicującą techniką. 

37