Necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) · que agente, infeccioso o tóxico, era responsable. Ahora se sabe que la etiología es infecciosa. Definición patológica: Degeneración

The University of Arizona 1

1

Necrosis hepatopancreática aguda (AHPND)

The University of ArizonaAquaculture Pathology Laboratory

Tucson, Arizona

2

2009

2010

2011 2011

2012

Dispersión de la enfermedad AHPND en el Este y Sureste Asiático

Síndrome de la mortandad temprana (EMS o AHPND)

EMS presenta dos fases distintivas: Fase aguda/temprana

Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND). Pérdida aguda de la función de las células de los

túbulos del HP (células “R”, “B”, “F” y “E”). Desprendimiento agudo severo de las células de los

túbulos del HP. Ausencia de infección bacteriana (de cualquier tipo), de

acuerdo a pruebas de hibridación in situ (ISH) con sonda genética universal para la detección de bacterias (basada en 16S RNA).

3


Síndrome de la mortandad temprana (EMS o AHPND)

Fase terminal. Destrucción del HP por especiesoportunistas de Vibrio spp.

4

EMS (China) – Fotos cortesia de Mr. Luyi5

EMS en China – Fotos cortesia de Mr. Luyi6


Signos clínicos de EMS/AHPND

Marcada atrofia del hepatopáncreas (HP). Tejido conectivo de la cápsula del HP

presenta frecuentemente coloración pálida, amarillenta o blanquecina. En ocasiones se observan puntos o vetas de

coloración negruzca (melanización). Poca consistencia del HP lo hace difícil de

aplastar entre el pulgar y el índice.

Juveniles de Penaeus vannamei (Vietnam). EMS (lado izquierdo); Normal (lado derecho).

Histopatología: Fase aguda con pérdida de la función

del órgano (HP)

9

Origen de las muestras:Sur de China: Agosto/Septiembre 2010

Vietnam: Julio 2011 & 2012 & Deciembre 2011 & 2012


Case 11-041. Hepatopáncreas normal 10PROXIMAL

DISTAL

Case 11-214. P. monodon. Vietnam; 10x Desprendimiento severo de células e inflamación moderada 11

DISTAL

PROXIMAL

Case 11-214. P. monodon. Vietnam; Nótese el avance de las lesiones en sentido proximal a distal. 20x

PROXIMAL

DISTAL


13Case 11-214. P. monodon. Vietnam; Nótese el avance de las lesiones en sentido proximal a distal. 20x

PROXIMAL

DISTAL

14PROXIMAL

DISTAL

Histopatología: Fase terminal con destrucción del órgano causada por vibriosis

15

Origen de las muestras:Sur de China: Agosto/Septiembre 2010

Vietnam: Julio 2011 & 2012 & Deciembre 2011 & 2012


16

Case 11-214. P. monodon . Vietnam; Fase terminal de EMS. Destrucción de la mayoría de los túbulos. Infección bacteriana masiva (probablemente Vibrio spp). 4x.

17Sur de China 2010: 10-361B/2; P. vannamei; Fase terminal de EMS; 20x

AHPNDHEPATOPANCREATITIS SÉPTICA

(SHPN-VIBRIOSIS)

HISTOPATOLOGÍAAHPND vs. SHPND


VIBRIOSIS NHP

HISTOPATOLOGÍA

AHPND vs. SHPND

VIBRIOSIS NHP

HISTOPATOLOGÍA

AHPND vs. NHP

EMS/ AHPND

Hasta marzo del 2013 se desconocía específicamente que agente, infeccioso o tóxico, era responsable. Ahora se sabe que la etiología es infecciosa.

Definición patológica:Degeneración progresiva, aguda, del HP en dirección

proximal a distal, con pérdida de la función del órgano, necrosis y desprendimiento de las células de los túbulos.

Fase terminal con marcada inflamación inter- e intra-tubular, desarrollo de infección bacteriana secundaria masiva acompañada de necrosis y desprendimiento de las células de los túbulos.


Estudios de infectividad en UAZ-APL usando cepas bacterianas de Vietnam

Un cultivo mixto de cepas bacterianas del estómago que indujo EMS durante estudios llevados a cabo en Vietnam fue sujeto a investigación en UAZ-APL.

Se utilizó el método de inmersión para determinar la patogenicidad de cada una de las cepas de bacteria en el cultivo mixto.

22

Experimento #1: Estudio de inmersión con cultivo bacteriano mixto aislado a partir de camarones con EMS (preparado en Vietnam).

Experimento #2: Prueba de desafío (inmersión) con aislados individuales de bacteria cultivada en TSB+ y cultivo mixto (control positivo).

Experimento #3: Prueba de desafío (inmersión) con aislados individuales de bacteria cultivada a partir de los tratamientos del Experimento #2 que lograron inducir EMS.“Gavage reverso” usando filtrado libre de bacteria a partir de caldo TSB+.

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Estudios de infectividad en UAZ-APL usando cepas bacterianas de Vietnam

Prueba de inmersión con bacteria mantenida en caldo de cultivo

24

Camarón SPF sumergido en 2.108

cells/ml por 15 min. Camarones

transferidos a contenedores en donde se agregó2.106 cells/ml durante el experimento.


Resultados Exp#1: Inmersión con cultivo bacteriano mixto

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0

2

4

6

8

10

12

14

16

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4

Nu

mb

er o

f su

rviv

ing

shri

mp

Day post challenge

ControlImmersion 1Immersion IIImmersion III

Resultados Exp#1: Inmersión. Cultivo bacteriano mixto

26

Signos clínicos Exp#1. A&B: inmersión con cultivo mixto; se muestra un camarón con estómago e intestino vacío, palidez y atrofia severa del HP; C&D: se muestra un camarón normal del control negativo; estómago e intestino llenos, coloración obscura normal del HP.

27

Exp #1: Resultados del análisis histopatológico.

A&B: Control negativo.

C,D,E & F: camarón infectado con el cultivo mixto mostrando patología típica de EMS.


Resultados Exp#2: Inmersión. Cultivos puros individuales.

28

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3

Nu

mb

er o

f su

rviv

ing

shri

mp

Days post challenge

Control

Mixed culture A

Pure culture A/1

Pure culture A/2

Pure culture A/3

29

Exp. #2:Resultados del análisis histopatológico

A&D: Cultivo mixto y cultivo puro A/3. Se muestra patología típica de EMS.

B&C: Cultivo puro A/1 y A/2. Se muestra la apariencia histológica normal.

Exp.#3: Inmersión & gavage reverso con cultivos puros

recobrados del Exp#2

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3

Nu

mb

er o

f su

rviv

ing

shri

mp

Days post challenge

Negative control

Mixed culture A

Pure culture A/3

Pure culture B/1

Reverse gavage


31

Exp#3: Resultados del análisis histopatológico

A) Cultivo mixto “A”

B) Cultivo puro “A/3”

C) Cultivo puro “B/1”

D) Gavage reverso con filtrado (0.2 µm) de cultivo “A/3”

Resúmen

El agente se localiza en el estómago del camarón.

La causa de EMS es un agente bacterianotransmitido por la via oral; el agente colonizael tracto digestivo del camarón produciendouna toxina(s) que afecta severamente el hepatopáncreas.

32

33

El agente que induce la patología típica de EMS/AHPND fue identificado como una cepa de Vibrio parahaemolyticus.


Análisis metagenómico de dos cepas de VP

Cepas analizadas: VP A/2 & VP A/3. VP A/2 NO causa AHPND/EMS. VP A/3 SI causa AHPND/EMS. Se diseñaron primers de PCR a partir de la

secuencia metagenómica y del material extracromosómico encontrado.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

34

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

NO‐INFECCIOSO

133513‐028 A/3

13‐306 D/4 13‐028 A/2

1 2 3 4 5 6

12‐297 B

INFECCIOSO

Muestras:1. 1 Kb marker2. Phage (contig 9)3. Contig 324. Contig 525. Contig 736. Contig 89

Perfil de PCR de cada cepa

35

Se detectó la presencia de un bacteriófago en VP A/3 (contig 9) no relacionado con la virulencia

100 nm100 nm

36


Contigs Contigs 52 & 89 fueron los únicos

amplicones que se generaron de manera consistente entre las cepas causantes AHPND.

Se diseñó un método de PCR basado en Contig 89 para la detección del VP causante de AHPND.

37

1 2 3 4 5 6

Detección de cepas de VP causantes de AHPND usando Contig 89

Muestras:1. 1 kb marker2. Vietnam3. China4. Malaysia5. Thailand6. Mexico

38

PRESENCIA DE EMS/AHPNDEN MEXICO

39


40

Marzo, 2013

Marzo, 2013

Mayo, 2013

Dispersión de “mortalidades atípicas” en el Pacífico mexicano

41

EMS/AHPND en Sonora, México – Foto: Dra. Silvia Gomez 42


Comparación de signos clínicos de EMS entre Asia y México

EMS/AHPND en VietnamEMS/AHPND cerca de Mazatlán,

México

43

Signos clínicos de EMS/AHPND en México

HP normalHP atrofiado44

Análisis histológico de muestras tomadas en México

Mayo 2013

EMS/AHPND, fase aguda.

EMS/AHPND, fase terminal.

45


Mexico – AHPND fase aguda (Caso UAZ-APL 13-218; 4x)

46

Mexico – AHPND fase aguda (Caso UAZ-APL 13-220;10x)

47

Análisis histológico de muestras tomadas en México

Mayo 2013

EMS/AHPND, fase aguda.

EMS/AHPND, fase terminal.

48


Mexico – AHPND, fase terminal (Caso UAZ-APL 13-220A-3; 4x)

49

Mexico – AHPND, fase terminal (Caso UAZ-APL 13-220A-3; 20x)

50

Comparación de características bioquímicas entre cepas de VP del sureste asiático y de México causantes de AHPND

API 20 NE Test Result VP A/3SE Asia

VP from Mexico

NO3=> NO2 + +

NO2 => N2 - -

Indole + +

Glucose fermentation - (usually +) - (usually +)

Arginine dihydrolase - -

Urease - -

Esculin hydrolysis - -

Gelatin liquefaction + +

B-Galactodiase + +

Assimilation of:D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-glucosameine, maltose, L-malate

+ +

D-gluconate, caprate, citrate, phenyl acetate - -

Oxidase + + 51


Confirmación de la patogenicidad de la cepa de VP mexicana y la capacidad de

inducir AHPND

Se llevó a cabo una serie de experimetos por immersion y per os con cepas de VP mexicana.

Se confirmó la capacidad de inducir EMS/AHPND.

52

Cepas de Vibrio parahaemolyticus utilizadas en el estudio

Clave de identificación

Tipo de muestra

13-306D/4 (Mexico) Hepatopancreas

13-511A/1 (Mexico) Sedimento

13-028A/3 (Vietnam) Control positivo

13-028A/2 (Vietnam) Control negativo

53

54

Resultados de los experimentospor inmersión y per os

Insert picture of survival graphs from paper


55


56


Primer Secuencia Tamaño del fragmento

89F 5’ GTC-GCT-ACT-GTC-TAG-CTG-AA-3’470bp89R 5” ACG-GCA-AGA-CTT-AGT-GTA-CC-3’

Muestra ID# Tipo de muestra

1 13-306D/4 HP

2 13-511A/1 Sedimento

3 13-028A/3 Control positivo

4 13-028A/2 Control negativo

Conclusiones del estudio

La presencia de EMS-AHPND en México fue confirmada por medio de histopatología, bioensayo y PCR.

Se cuenta con un método de PCR que puede detectar la presencia de la cepa de V. parahaemolyticus causante de AHPND en México.

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Manejo de la enfermedad (Managing “The Perfect Killer”)

Tomado de: Seminario del Dr. G. Chamberlain en la ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam

Deciembre 10, 2013

El manejo de EMS/AHPND requiere de una estrategia diferente

Los virus necesitan un hospedero para replicarse. Se requiere entonces controlar al hospedero. La partícula viral se destruye una vez libre en el agua.

Las bacterias (tales como la causante de EMS/AHPND) se pueden multiplicar sin problema al estar libres en el agua, fuera del hospedero.

Algunas prácticas de manejo que parecen estar funcionando…

Sembrar animales de mayor talla. Los camarones de mayor talla tienden a mostrar mejor sobrevivencia. Uso de “raceways” o maternidades. Use jaulas flotantes en los estanques para

sembrar las postlarvas, liberándolas despues de 2-3 semanas, cuando han alcanzado una talla mayor.


Uso de especies alternativas. Penaeus monodon parece ser menos afectado que Penaeus vannamei en los estanques.

Policultivo con tilapia. La presencia de tilapia parece estimular la proliferación de cierto tipo de microalgas y cierta flora microbiana que confiere protección a los camarones en los estanques.


Uso de “bioflocs”. Aun bajo investigación. Falta información sobre el nivel de protección que se pueda alcanzar. El principio que se persigue aplicar: la gran variedad de especies de bacteria compitiendo entre sí, podrían desplazar la causante de EMS/AHPND.


Uso de sistemas intensivos con bioseguridad. Es posible tener un mejor control sobre la exclusión del patógeno. Tanques circulares (50m en

diámetro) de baja precipitación, baja salinidad (4ppt) y altas densidades (~450 PL/m2).

Sistemas de recirculación. Altamente bioseguros, completamente aislados y con exclusión total del patógeno. Uso de camarones SPF de rápido crecimiento.



Programas de selección genética para el desarrollo de resistencia a EMS/AHPND. Parece que existe algún componente genético en el camarón que confiere cierta tolerancia a EMS. Estudios llevados a cabo por el grupo CP a mostrado 75% de sobrevivencia en 10% de familias expuestas a una prueba de enfrentamiento de 15 días. El desempeño en estanques aun esta siendo evaluado.


OIE (World Organization for Animal Health) Department of Animal Health, MARD, Vietnam for local

arrangements in Vietnam. Uni-President feed company in Vietnam for funding toxicity

& infectivity studies. CP Food, Thailand for funding recent work on EMS. World Bank & Global Aquaculture Alliance for travel. FAO project for the airfare. Minh Phu Seafood for diagnostic services. Grobest for molecular biology work.

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Agradecimientos

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Necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) · que agente, infeccioso o tóxico, era responsable. Ahora se sabe que la etiología es infecciosa. Definición patológica: Degeneración