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Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät
Neue Methoden der Pflanzenzüchtung
zur Selektion und gezielten
Veränderung von Nutzpflanzen
Christian Jung
6. Agrarwissenschaftliches Symposium, 24. September 2015 , Innovative Biomasse-Erzeugung , Herausforderungen und Perspektiven,
Weihenstephan
Institut für
Pflanzenbau und
Pflanzenzüchtung
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Die Anwendung biotechnologischer Methoden in der Pflanzenzüchtung
Verkürzung der
ZüchtungsphaseDH-Produktion,
in vitro Vermehrung
Genetisch veränderte
Pflanzen
Erhöhung des Selek-
tionserfolges
Gentechnisch
veränderte Pflanzen
• de facto
• de jure
Erweiterung der gene-
tischen Variabilität
Art-
bastardierungSomatische Fusion
embryo rescueMutationsauslösung,
genome editingallele
mining
Zell- und Gewebekultur Gentechnik, Genetik, Molekularbiologie
Biostatistik, Bioinformatik,
Genomforschung
Pflanzengenetische
Ressourcen
Marker-gestützte Selektion,
genomic selection
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Alle diploiden Pflanzen besitzen eine ähnliche Anzahl von Genen (25.000 – 35.000),
unterscheiden sich aber im Anteil der repetitiven DNA des Genoms (bis 95%).
10µmPhoto: Thomas Schmidt
Größenvariation pflanzlicher Chromosomen
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Stadien der strukturellen Genomanalyse
109 108 107 106 105 104 103 Bp
Chromosom
......AGCAGATTT
AGACGTAGAT
TGCAGATGAC
AGTAGACGGA
TAGACGGATG
CGGTGATGAC
GTGTGGGGTG
ACGGTGAGTG
TTTATGTGAGG
GTCGTGAGTG
GCGAGGGTGC
AGTTGGGTCG
TGGTGAAAAC
GTGTGACTGA
TGCTGATGCT
GACGTTGACG
TAAGTTTGA.....
DNA-SequenzPhysische Karte aus large-
insert Klonen (BAC-contigs)
genetische KarteKerngenom
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Marker-gestützte Selektion vs. Genomische Selektion
Marker
Gene, QTL
Marker-gestützte Selektion:
• wenige Marker
• Einzelne Gene
Genomische Selektion:
• sehr viele Marker
• Viele (alle) Gene, die an der Ausprägung eines Merkmals
beteiligt sind (quantitative trait loci, QTL)
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Hochdurchsatz-Genotypisierungen als
Voraussetzung für die genomische Selektion
Microarray Technologie: Hundertausende oder Millionen
Sequenzen auf einem Chip (Whole genome DNA chip
array)
Next generation sequencing Technologie: bis zu 300
Milliarden Nukleotide/Lauf (1 Woche)
• SNP Detektion
• Mapping by sequencing: Kartierung von crossover in
spaltenden Populationen
Affymetrix.com
http://www.liv.
ac.uk/lmf/
Illumina hiseq
DNA SNP array
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Zwei Schritte führten zur Steigerung des Fruchtgewichtes bei
Tomaten
Lin T, et al. (2014) Genomic analyses provide insights into the history of tomato
breeding. Nature Genetics 46 (11):1220-1226.
PIM: S. pimpinellifolium (wild ancestor)
CER: S. lycopersicum var. cerasiforme (cherry tomato)
BIG: S. lycopersicum (big-fruited tomato)
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Die Möglichkeiten zur gentechnischen Veränderung von
Nutzpflanzen sind in den letzten Jahren stark erweitert worden
Spendergen
Transformation
Die traditionelle Sichtweise gentechnisch veränderter Pflanzen:
Erweiterungen und Abwandlungen:
• Cisgene Pflanzen
• Ektopische Regulation endogener Gene
• Genome editing
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Methoden zur Mutagenese pflanzlicher Gene
• Zufällige Mutagenese durch
– Bestrahlung
– Chemische Substanzen
• Insertionsmutagenese
• Genome editing
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Zahlreich, ungerichtet,
spontan
Ortsspezifisch, gezielt auf
eine Sequenz hin gerichtet
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Genome editing, targeted genome
modification
• Einzelnukleotid-Mutation:
– Betrifft ein Gen, welches Bestandteil des Genoms ist oder
– gleichzeitig mehrere Gene, wenn diese über ein hohes Maß an
Sequenzhomologie verfügen (Genfamilien)
– Punktmutation (ein bis wenige Nukleotide), frame shift Mutation
• Einfügen von Insertionen in einem bestimmten Sequenzabschnitt durch
homologe Rekombination (gene replacement)
• Deletion größerer Chromosomen-Fragmente
– Gleichzeitiger Einsatz von zwei sgRNAs
• Veränderte Genexpression
• Routine für Reis, Mais, Soja
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Präzises genome editing und ortsspezifische
Mutageneseortsspezifische Rekombinase (künstliche Restriktionsenzyme) zur Erzeugung von Doppelstrangbrüchen
(DSB)
Führt zur Stimulation des zellulären DNA Reparatursystems: DSBs werden beseitigt durch
• homologe Rekombination (Resultat ist eine de jure gentechnisch veränderte Pflanze) oder durch die
• fehleranfällige Verknüpfung nicht-homologer Enden (non-homologous end joining NHEJ)
Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)
• Fusion einer Zinkfinger DNA-Bindedomäne mit der FokI Endonuklease
• Zinkfinger DNA-Bindedomäne kann gentechnisch so verändert werden, dass eine bestimmte
Zielseqauenz im Genom angesteuert wird (je 3 Bp, die miteinander verknüpft werden können, so dass
bis zu 18 Bp lange Sequenzen gebunden werden)
• Zwei Gene müssen in die Zelle eingebracht werden (mit oder ohne Insertions-DNA)
Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs)
• Künstliche Restriktionsenzyme nach Fusion der TAL Effektor DNA-Bindedomäne mit der FokI
Endonuklease
homing endonucleases (oder meganucleases)
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs)
Methoden, um die ortsspezifische Rekombinase in die Pflanzenzelle einzubringen:
• Agroinfiltration
• virale Vektoren
• Agrobacterium vermittelter Transfer, üblicherweise in einem Expressionsplasmid, mit oder ohne
template Sequenz oder zu inserierender DNA
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Gezielte Modifikationen mit Designer Endonukleasen
Endonuklease
Erkennungssequenzen
1. Deletion
Results of Zinc Finger Nuclease treatment of a specific gene sequence
2. Insertion
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Ortsspezifische Mutagenese mit dem CRISPR-Cas
System
CRISPR-Cas System: Immunabwehr von Bakterien gegen
fremde DNA (Viren, Plasmide)
• CRISPRs: Clustered regularly interspaced short
palindromic repeats
• Cas: CRISPR associated RNA-guided DNA
endonuclease (üblicherweise Endonuklease Cas9)
• sgRNA: single guide RNA (Fusion aus crRNA und
tracrRNA), gentechnisch modifiziert, bindet spezifisch
an eine Zielsequenz
Protospacer: transcribed sequences from the invading DNA
PAM: protospacer adjacent motif (2-5 bp)
crRNA: CRISPR RNAs
tracrRNA: transactivating CRISPR RNA
Jinek et al (2012): Science 337:816-821
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Genome editing with cropsSpecies technique Target gene Purpose/phenotype
Rice TALENs OsBADH2 encoding betaine
aldehyde dehydrogenase
knockout
Rice TALENs CAO1 branching pattern
Rice TALENs Disease resistance gene
OsSWEET14
bacterial blight resistance
Maize TALENs IPK1, herbicide resistance Reduced phytate content, herbicide resistance, homologous
recombination to simultaneously deliver the herbicide
resistance gene and knock out the phytate synthase gene
Maize meganuclease MS26 Male sterility
Soybean TALENs Fatty acid desaturase 2
(FAD2)
High oleic acid, low linoleic acid
Cotton Gene insertion Herbicide resistance
Rapeseed Zinc finger nucleases b-ketoacyl-ACP synthase II
(KASII)
Altered gene regulation
Wheat CRISPR/Cas9 Inositol oxygenase and
phytoene desaturase genes
Wheat CRISPR/Cas9 TaMLO Broad spectrum resistance to powdery mildew, Simultaneous
targeting different homoeoalleles
Sorghum CRISPR/Cas9 Proof of concept
Barley TALENs Proof of concept, haploid barley cells manipulated to
produce DH barley
Tomato TALENs PROCERA gibberellic acid metabolism
Tomato CRISPR/Cas9 ARGONAUTE7 Leaf shape
Potato, apple Zinc finger nucleases Proof of concept
Orange CRISPR/Cas9 phytoene desaturase
14(September 2015)
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Züchtung von nachwachsenden
Rohstoffen für die Biomasseerzeugung
Biomasse:
• Festbrennstoffe aus Lignocellulose (perennierende Pflanzen und schnell wachsende
Baumarten wie Miscanthus sinensis, Chinaschilf, Pappeln, Weiden)
• zucker-, stärke- oder ölhaltige Pflanzen (z. B. Zuckerrüben, Kartoffeln, Raps) zur
Erzeugung pflanzlicher Kraftstoffe (z. B. Ethanol, Pflanzenöl,
Pflanzenölmethylester)
• Überführung von Lignozellulose-Biomasse in Ethanol
• gasförmige Energieträger (z. B. Biogas aus Gülle) zur Wärme- und Stromerzeugung
Traditionelle Nutzung der zur Biomasseerzeugung genutzten Kulturpflanzen
• Erzeugung von Nahrungs- und Futtermitteln → erfordert duale Ausrichtung der
Zuchtziele
• nur als Rohstoffe für die Biomasseerzeugung
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Züchterische Aktivitäten von nachwachsenden
Rohstoffen für die Biomasseerzeugung
Quelle Nutzung Traditionelle
Zuchtziele
Zuchtziel für Biomasseerzeugung
Raps Samenöl Ölertrag Ölertrag
Getreide Bioethanol,
Ganzpflanzensilage,
Biogas
Samenertrag,
Backqualität
Gesamte Biomasse, hohe alpha Amylase Aktivität
Zuckerrüben Bioethanol/Biogas Bereinigter
Zuckerertrag
Zuckerertrag
Mais Biogas (Bioethanol) Kornertrag,
Biomasse,
Futterqualität
Methanertrag, Nutzung von Kurztagsgenen zur
Züchtung spätreifender Sorten, geringer
Ligningehalt
Miscanthus-Hybriden,
incl.
Miscanthus × giganteus
Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag
Weiden, Pappeln, Pinien Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag
Luzerne Futterqualität Biomasseertrag
Sorghum (Sorghum
bicolor), Sudangras (S.
sudanense)
Bioethanol/Biogas Kornertrag Biomasseertrag, Veränderung des Gehaltes an
Komponenten der Zellwand (Zellulose,
Hemicellulose, Lignin)
Deutsches Weidelgras
(Lolium perenne)
Biogas Futterqualität Methanertrag
Energieversorgung – Bioenergie – Ernährung – technische Lösungen
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Energiemaiszüchtung• Reife verzögern: Kurztaggene aus exotischen Populationen integrieren
• Kältetoleranz in spätes Zuchtmaterial einlagern
GGP Bonn, W. Schmidt (KWS SAAT AG)
Silomais Energiemais
Methanbildung Minimal im Pansen Maximal im Fermenter
Verweildauer ½ Tag 30 – 40 Tage
Stärkegehalt Hoch > 32 % ausgereiftes
Korn notwendig
Nicht entscheidend
TS-Gehalt 30- 35 % zur max.
Futteraufnahme
25 – 30 % zur Vermeidung
von Sickersaft
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Die pflanzliche Zellwand: Ein Forschungsobjekt
für die Bioenergieerzeugung
Pflanzliche Biomasse (exklusive Ernteorgane) besteht größtenteils aus Zellwandbestandteilen
Ziel: Züchtung von Pflanzen mit höherem Celluloseanteil und geringerem Protein- und Ligninanteil (N-Gehalt)
Ektopische Expression von Cellulose-Synthasegenen
Ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. NAC- and Myb-domain-containing proteins), die die Bildung sekundärer Zellwändbestandteile initiieren
Transgene Pappeln mit verringertem Ligninanteil (Energieersparnis bei Holzverarbeitung)
Steigerung der Effizienz des Celluloseabbaus(Clostridium thermocellum, Trichoderma-Pilze)
18http://www.daviddarling.info/images/plant_cell_wall.gif
Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel
Winterrüben, eine neuartige Kultur für die europäische Landwirtschaft
AUTUMN WINTER
SPRINGSUMMER
Winterrübenanbau mit schossresistenten
ZuckerrübenWinterrübenanbau mit herkömmlichen
Zuckerrüben
AUTUMN WINTER
SPRINGSUMMER
Zuckerrübe: höchstes CO2 Einsparungspotential aller Pflanzen in Europa, ideal für Biogas
Lagerung: Rüben für Biogas-Produktion müssen geschnitztelt werden, Lagerung als Silage, hoher Milchsäureanteil, kein
Energieverlust bei Lagerung über Jahre
hoher Wasseranteil (80%): großer Lagerflächenbedarf
Hoher Schmutzanteil verringert Gärvolumen, höherer Maschinenverschleiß
Ziel: weitere Steigerung des Zuckerertrages
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Zwei Gene kontrollieren das Schossen bei
Zuckerrüben
20
BBX19 BTC1d
BvFT1 BvFT2
REC
Interaction
Activation
Repression
A B
A: Kontrollpflanze nach Vernalisation
B: BTC1-RNAi transgene Pflanze nach Vernalisation
Winterrüben Prototyp: BTC1-reprimierte transgene Pflanzen
schossen nicht nach Vernalisation
Dally et al., 2014
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Methoden zur Veränderung von Genen einer Nutzpflanze und
deren rechtliche Bewertung
• Artbastardierung
• Induzierte zufällige
Mutagenese
Genetisch veränderte Pflanze
Ohne gesetzliche Regelungen
Sehr viele Veränderungen
Gentechnik-Gesetzgebung
• Einschleusen fremder Gene in
das Genom
• Gezielte Veränderung
endogener Gene durch
Gentransfer
Gentechnisch veränderte Pflanze
Eine Veränderung
Induzierte gezielte
Mutagenese (genome
editing)
Gentechnisch veränderte Pflanze
Eine Veränderung