ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Lê Thị Ngọc Quỳnh

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA

PROTEIN GIÀU METHIONINE

TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng

PGS. TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội 2015

1

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1. Methionine và protein giàu Methionine

1.1.1. Tổng quan chung về Methionine

Met, axit amin chứa sulfur (methionine và cysteine) và các axit amin khác như

lysine, threonine và isoleucine đều được tổng hợp từ họ aspartate. Aspartate kinase là

enzyme đầu tiên trong con đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine,

threonine, Met và isoleucine. Enzyme này xúc tác quá trình phosphoryl hóa aspartate

bằng cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate. Thông thường, có ít nhất hai

dạng aspartate kinase được tìm thấy trong thực vật. β-aspartyl phosphate sẽ được

chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde và sau đó là homoserine, bởi sự xúc tác

tương ứng của aspartic semialdehyde dehydrogenase và homoserine kinase. Tuy nhiên,

trong thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine và sinh tổng hợp Met là O-

phosphohomoserine (OPH), cơ chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS) và

cystathionine gamma-synthase (CgS). OPH có thể chuyển hóa trực tiếp thành threonine

bởi sự tham gia của TS hoặc là tham gia vào cơ chế ba bước để tạo thành Met: phản

ứng trùng ngưng cysteine và OPH tạo thành cystathionine, sau đó thành homocysteine

và cuối cùng là thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β-lyase và

homocysteine methyltransferase. Cuối cùng, chỉ có khoảng 20% Met được sử dụng làm

thành phần tạo nên protein, trong khi có đến 80% Met sẽ được biến đổi để tạo thành

SAM, cũng là sản phẩm cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp Met.

1.1.2. Các protein giàu Methionine

Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín

hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA. Do

đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N (N-

terminal) trong chuỗi peptide. Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được

nghiên cứu từ rất sớm trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của

2

Brazil, hạt hướng dương, ngô, và lúa. Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm

lượng Met trong khoảng 11-22%.

Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá kỹ

do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt là cho

các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các axit amin

chứa sulfur như Met. 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18% methionine,

2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine. Tuy nhiên, việc cải thiện hàm

lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met cần thiết

trong thức ăn chăn nuôi. Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ

nước, tạo nên sự cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein. Met

được tìm thấy nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong

khi ở các protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép. Tuy nhiên, đối với các

protein có chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met

sulfoxide (MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng. Do đó, MRP được xem như

protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài

sinh vật khác nhau.

1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine

1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng

Các dạng oxy phản ứng (ROS) là những phân tử hóa học trong cấu trúc chứa oxy,

có khả năng phản ứng mạnh. Khi nồng độ ROS càng tăng cao thì càng đem lại nhiều

hậu quả nghiêm trọng. Nghiên cứu cũng chỉ ra ROS có thể đóng các vai trò phá

hủy, bảo vệ hoặc truyền tín hiệu, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng giữa sự sản

sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian. Khi điều kiện môi

trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao gồm: tăng tỷ lệ ion đi

qua màng tế bào, tăng cường Ca2+

có mặt trong bào tương, kích hoạt protein

MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị kích thích bởi các tác

nhân sinh học và phi sinh học. ROS được sinh ra ở các bào quan khác nhau và dẫn

3

đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy thông tin phải được

chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào. Các tín hiệu thông qua ROS cần phải được

tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay phosphatase. Hydrogen

peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu huỳnh là Cys và Met.

Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều nghiên cứu khác nhau, tình

trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi khác nhau đối với protein.

Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan tâm hơn. Trong thực vật, chức năng

của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met đã từng được công bố.

1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng

Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử

protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone (MetO2)

khi gắn thêm các nguyên tử oxy. MetO tồn tại với hai dạng đồng phân quang học là

methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và methionine-R-sulfoxide (Met-R-O). Ngược lại

với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy trong các hệ thống sinh học), cần một

lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và

MetO lại có tính thuận nghịch .

Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do so

với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa trong tế

bào. Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ protein cũng

như các đại phân tử khác. Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong protein có thể

cùng bị oxy hóa đồng thời. Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met trong protein có

cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc vào việc các tác

nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong cấu trúc protein như

nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein. Shechter đã phát hiện chỉ các gốc Met trong

chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn toàn, trong khi đối với các

protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có thể bị oxy hóa.

4

1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine

Oxy hóa Met xảy ra trong điều kiện hiếu khí là điều không thể tránh khỏi, chính

vì vậy các tế bào trong sinh vật sống đã phát triển nhiều cơ chế phức tạp cũng như các

enzyme để chống lại quá trình oxy hóa Met. Ngược lại với MetO2, MetO có thể được

chuyển hóa một cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác của enzyme Msr. MsrA có

thể tham gia khử dạng Met-S-O tự do và Met-S-O trên protein trong khi MsrB khử

Met-R-O tự do thành Met kém hiệu quả hơn so với dạng liên kết trong protein do ái lực

thấp hơn với cơ chất này ở dạng tự do. Cả MsrA và MsrB đều là những enzyme có tính

bảo thủ cao trong vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực bao gồm cả tế bào người và hầu

hết các sinh vật có chứa cả 2 dạng enzyme MsrA và MsrB. MsrA là một dạng enzyme

phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật từ vi khuẩn đến cây trồng đến động

vật có vú, trong đó có cả người. Gần đây, một họ enzyme Msr mới được tìm thấy ở

E.coli, chỉ có tính đặc hiệu trong hoạt tính khử Met-R-O dạng tự do và không có khả

năng khử MetO liên kết trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O). Đặc biệt,

fRMsr chỉ được tìm thấy trong một vài sinh vật đơn bào. Tuy nhiên trong điều kiện

môi trường sống có nhiều bất lợi như hiện nay, đảm bảo cân bằng giữa việc sản sinh

và loại bỏ ROS bị phá vỡ bởi nhiều tác nhân bất lợi như ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt

độ thấp hoặc cao và những tổn thương cơ học. Chính điều đó đã gây ra ảnh hưởng rất

lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản

lượng.

1..3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy

phản ứng

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng

được ghi nhận. Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên protein

Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức năng ổn

định ROS trên đối tượng thực vật. Mối liên quan giữa quá trình oxy hóa Met với sự

5

mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin và sự mất chức năng của protein này cũng

được ghi nhận.

Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải

protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung tính

(neutrophil). Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với đầu

dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ. Peptide được phát hiện tăng 16 Da. Tuy

nhiên, đáng tiếc rằng nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hoàn chỉnh các

protein và vị trí các gốc Met bị mẫn cảm với quá trình oxy hóa.

Le và cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có

thể đem lại tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật. Bên

cạnh đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn

MRP mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu quá trình oxy hóa

Met và quá trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr. Thông qua đó, natri hypochlorite

(NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP.

Năm 2015, Jacques và cs đã sử dụng một phương pháp mới được gọi là

COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị trí MetO trên hệ protein của cây mô hình

trong điều kiện bất lợi oxy hóa. Sử dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme

catalase 2, nhóm tác giả đã tìm thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein,

đồng thời cũng định lượng protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây

kiểu dại. Tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng viên tiềm năng để tiếp cận

bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ. Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm

với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn

là điều chưa được biết đến.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy

phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu về

biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản

ứng bảo vệ của cây đậu (Pisum

6

sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn

trùng chích hút nhựa cây có mức độ phá hoại được đánh giá là nguy hiểm đối với

nhiều

cây trồng họ Fabaceae. Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố ảnh hưởng

lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý được trồng

phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam.

Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng

của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện nay,

vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các

tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của

Msr trên thực vật.

Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc can

thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với oxy

hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr. Chính vì vậy, chúng tôi

đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây Arabidopsis

thaliana”. Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới về protein chứa

Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam.

Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi,

các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu

của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản). Hạt

Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong thư viện dòng

FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên

Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản. Trong thư viện dòng FOX, cDNA hoàn chỉnh

của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn vào plasmid mang

7

gen chống chịu kháng sinh hygromycin. Plasmid được chuyển vào cây Arabidopsis

bằng phương pháp nhúng hoa.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1.

2.2.1. Phƣơng pháp tiếp cận bằng tin sinh học

2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP

Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc

Viện Di truyền Nông nghiệp.

Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào

phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) và phần mềm Blast2goBasic phiên

bản 3.0 (https://www.blast2go.com) để tiến hành phân loại chức năng gen.

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

8

Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta

chứa toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào

để tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP

(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/), pSORT (http://www.psort.org/), và

CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/).

2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều

kiện bình thường và điều kiện bất lợi

Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức độ

biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn. Các thử nghiệm này

được tiến hành theo quy trình như sau:

Xử lý hạn: kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập

là GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04

năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM

1037236-GSM 1037247.

Xử lý mặn: dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series

GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514. Tất cả các dữ

liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu.

Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng

với điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết. Trình tự 1-kb ngược

dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm yếu tố cis nhờ

phần mềm MEGA 4.

2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm

2.2.2.1. Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240

Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên đĩa

petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong điều

kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ phòng

9

nuôi 24±2oC. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn khác nhau.

Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS

chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi

khác nhau.

2.2.2.2. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi

Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên

môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi

sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM. Cây sống sót trên môi

trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.

Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen và

cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển

cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng độ 750

µM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến

ngày thứ 8.

Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành

dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) có cải biến. Gieo hạt cây chuyển

gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh Hygromycin.

Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS

chuyển sang giá thể đất. Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong dung dịch

paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM, được giữ

trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều kiện ánh

sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu xanh của lá sau 24 giờ.

10

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP

3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis

Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit amin

và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP. Danh sách 121 gen AtMRP được

cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp. MAPMAN là một

công cụ cho phép chú giải chức năng gen. Kết quả phân tích cho thấy khoảng 50 % gen

AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong tế bào. Số còn lại đóng vai

trò quan trọng trong tế bào (Bảng 3.1). Trong đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20

AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con

đường tín hiệu Ca2+

(tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính

được quan tâm khi phân tích MRP. Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều

cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham gia vào trong tế bào

thực vật. MRP

Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo Mapman

Nhóm chức năng gen AtMRP

Kiểm soát ion kim loại 2

Phản ứng điều kiện bất lợi 1

Xử lý RNA 4

Điều hòa phiên mã RNA 20

Biến đổi protein 12

Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+

) 6

Chu trình tế bào 3

Sự phát triển 1

Vận chuyển (kim loại) 6

Chưa biết chức năng 56

(Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

11

Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm

BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: quá trình sinh học

(Hình 3.1), thành phần của tế bào (Hình 3.2) và chức năng phân tử (Hình 3.3). Kết

quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm quan

trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học của thực

vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan trọng của tế

bào.

Hình 3.1. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học.

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

12

Hình 3.3. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Để nhận biết đích đến của MRP trong tế bào, chúng tôi đã sử dụng 3 công cụ

bao gồm ChloroP, pSORT và CELLO để dự đoán dựa trên trình tự polypeptide của

121 MRP ở định dạng fasta. Kết quả là 21 MRP được dự đoán có đích đến ở lục lạp

bởi ChloroP và/hoặc pSORT, trong khi chỉ có 9 MRP được dự đoán là cư trú trong ty

thể của tế bào thực vật bởi pSORT và/hoặc CELLO (Hình 3.4). Trong đó, chỉ có 2

protein cùng được dự đoán là nằm trên lục lạp bởi ChloroP và pSORT và chỉ có 1

protein cũng được dự đoán ở ty thể bởi pSORT và CELLO (Hình 3.4).

Hình 3.4. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần

mềm ChloroP, pSORT và CELLO

Như vậy, để làm rõ hơn đích tác động quá trình oxi hóa và khử Met trong thực

vật, nghiên cứu đã chỉ ra một số lượng lớn MRP tham gia vào các quá trình quan trọng

trong tế bào như kiểm soát quá trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+

. Sản phẩm của các

gen được dự đoán nằm ở các bào quan giàu ROS là lục lạp và ty thể, góp phần làm

sáng tỏ hơn chức năng của MRP trong tế bào.

10 92

ChloroP pSORT

A. Lục lạp

21

2 61

CELLO pSORT

B. Ty thể

9

13

3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều

kiện thường và điều kiện bất lợi

Trong điều kiện chịu mặn, 11 và 17 gen có mức độ biểu hiện phiên mã tăng và

giảm ít nhất 2 lần. Trong khi, 23 và 16 gen được lần lượt có mức độ biểu hiện tương

ứng là cao hơn và thấp hơn trong điều kiện chịu hạn. Trong đó, 6 gen cùng có đáp ứng

tăng gấp hơn 2 lần và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn 2 lần trong cả hai điều kiện cực

đoan trong thí nghiệm. Gen At3G59900 có biểu hiện tăng 10,7 lần trong điều kiện chịu

hạn nhưng lại giảm biểu hiện -2,6 lần trong điều kiện chịu mặn. Tổng số 10 gen mã

hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được chỉ ra

ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao

TT Tên gen Met

(%)

Chiều

dài (a.a)

Số lần thay đổi ở

mức độ biểu hiện Mô tả gen

Xử lý

hạn

Xử lý

mặn

1 At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 Protein chứa vùng LEA

nhóm I

2 At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết

3 At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9

Biểu hiện quá mức dẫn

đến sự “giả vàng úa dưới

ánh sáng”

4 At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết

5 At3G62090 6,38 346 64,6 2,3 Nhân tố phiên mã bHLH

liên quan đến yếu tố MYC

6 At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0

Gen giả mã hóa cho

protein trong họ chuỗi

truyền điện tử P450

7 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết

8 At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11

9 At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã liên

quan đến sự kéo dài

10 At5G67390 7,43 176 -4,2 -4,1 Protein chưa biết

Ichikawa và cs (2006) đã báo cáo về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra

hiện tượng “giả vàng úa trong điều kiện ánh sáng”. At3G55240 mã hóa cho protein

nhỏ có chiều dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp).

14

Các trình tự tương đồng với gen này cũng được tìm thấy trong các cây họ đậu và họ

lúa nhưng không được tìm thấy trong động vật có vú. Điều này cho thấy đây là gen

mã hóa cho protein đặc trưng chỉ được biểu hiện trong thực vật. Tuy nhiên, chưa có

bất kỳ một công bố nào cho đến nay báo cáo về sự liên hệ của gen At3G55240 với

sự chống chịu điều kiện bất lợi. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn At3G55240 là gen

ứng viên cho các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn vai trò của gen đối với cây

trồng trong các điều kiện cực đoan.

3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp

ứng điều kiện bất lợi

Cả 5 yếu tố cis đều được tìm thấy trong các gen AtMRP. Trong đó, MYBR được

tìm thấy trong 21 gen AtMRP, ABRE có mặt trong 19 gen AtMRP, 16 gen AtMRP có

chứa MYC, 5 gen AtMRP có chứa ICEr2 và RSRE có mặt trong 4 gen AtMRP. Khi

phân tích sự có mặt của một số yếu tố cis nằm vùng promoter của AtMRP, ABRE được

tìm thấy lặp lại 3 lần trên gen At1G32560, mã hóa cho LEA nhóm I. Kết quả này phù

hợp với nghiên cứu của Hundertmark và cs, trong đó chỉ ra rằng 82% gen LEA có chứa

trình tự lõi nhận biết của yếu tố ABRE trong vùng promoter.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được có trung bình 0,61 yếu tố cis

đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của mỗi gen AtMRP. Ở Arabidopsis, 6 gen

mã hóa MRP đáp ứng phiên mã tăng với hạn hán và độ mặn cao có trung bình 0,83 yếu

tố cis này trên promoter của mỗi gen. Điều này cho thấy sự tăng nhẹ về tần số xuất

hiện của các yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của các MRP có

mức độ phiên mã tăng lên trong điều kiện hạn hán và chịu mặn.

15

3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cƣờng biểu hiện gen

At3G55240 (dòng RBC1)

3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen

Hạt giống dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện của gen At3G55420 (gọi tắt là

dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) được tiến hành xác định tỷ lệ đồng hợp tử/dị

hợp tử. Kết quả nảy mầm hạt cây RBC1 trên môi trường chứa và không chứa kháng

sinh hygromycin được thể hiện qua Hình 3.5. Như vậy, với tỷ lệ nảy mầm 100% trên

cả 2 môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm, hạt RBC1 là

đồng hợp tử, đủ điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, sức

nảy mầm và sự phát triển của mỗi hạt có sự khác biệt nhất định, nguyên nhân là do độ

mẩy và lép của hạt thí nghiệm.

Hình 3.5. Dòng cây RBC1 đƣợc nảy mầm, A. môi trƣờng ½ MS đặc chứa kháng

sinh hygromycin 15mg/l, B. môi trƣờng ½ MS đặc

3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen

a. Hình thái cây trên đĩa thạch

Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ở các giai đoạn 7, 10 và 14 ngày tuổi. Kết

quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch được

trình bày trên Hình 3.6.

16

Hình 3.6. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch

b. Hình thái cây trên giá thể đất

Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường

½MS chuyển sang giá thể đất. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận

ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và cây đối

chứng kiểu dại trên môi trường giá thể đất được minh họa trong Hình 3.7.

Hình 3.7. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất

A. Cây 3 tuần tuổi, B. Cây 4 tuần tuổi, C. Cây 5 tuần tuổi

17

Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai

đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây

nhạt khác biệt so với dòng cây đối chứng. Kiểu hình này tương tự như cây vàng úa

trong điều kiện ánh sáng yếu hay còn gọi là “sự giả vàng úa dưới ánh sáng” gọi tắt là

PEL (Pseudo-Etiolation in Light). Tuy nhiên, kiểu hình PEL lại không ảnh hưởng đến

khả năng quang hợp của dòng RBC1. Lục lạp có cấu trúc tương đối bình thường

ngoại trừ khả năng tổng hợp tinh bột thấp hơn so với dòng đối chứng. Các dòng tăng

cường biểu hiện gen At3G55240 trong ngân hàng các dòng FOX của RIKEN đều có

mức độ phiên mã của gen được tăng lên 1x103 cho đến hơn 1x10

8 lần so với cây kiểu

dại. Khi mức độ biểu hiện của At3G55240 càng tăng thì số lượng lục lạp càng giảm.

Như vậy, mức độ biểu hiện của At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp của

cây.

3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi

Để kiểm tra việc giảm biểu hiện của At3G55240 có liên quan đến tín hiệu phòng

vệ, gen At3G55240 được biểu hiện quá mức trong cây mô hình A. thaliana và thử

nghiệm phản ứng của cây trong một số điều kiện bất lợi thường gặp. Gieo dòng hạt

chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng kiểu dại trên môi trường ½ MS tương ứng có và

không có kháng sinh hygromycin 15mg/l . Chọn các cây có kích thước tương đương

nhau ở giai đoạn 12 ngày tuổi chuyển sang 3 loại môi trường: (i) Môi trường ½ MS, có

bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Môi trường

½ MS, có bổ sung CdCl2 ở nồng độ 750 µM: đĩa thử nghiệm CdCl2, lặp lại 3 lần. (iii)

Môi trường ½ MS: đĩa đối chứng. Đếm các cây sống sót trên môi trường NaCl và

CdCl2 bắt đầu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Kết quả thử nghiệm kháng mặn ở nồng độ

NaCl 175 mM được biểu hiện trên Hình 3.8 và Hình 3.9.

18

Hình 3.8. Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trƣờng ½ MS

Hình 3.9. Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. Cây 12 ngày

tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 175 mM NaCl .

Hình 3.10. Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. Cây 12 ngày

tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 750 µM CdCl2

Kết quả này cho thấy cả dòng cây đối chứng (kiểu dại) và dòng cây chuyển gen

RBC-1 đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất

hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Như vậy, việc biểu hiện quá mức

At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy

cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao.

Sau 5 ngày kể từ ngày chuyển sang môi trường ½ MS có chứa CdCl2 750µM, lá

của dòng cây RBC-1 bắt đầu có hiện tượng vàng úa dần dần. Như vậy, RBC-1 xuất

hiện triệu chứng bị gây độc bởi Cd sớm hơn so với giống cây kiểu dại (Hình 3.8 và

Hình 3.10). Do vậy, dễ dàng nhận thấy rằng việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên

cây mô hình A. thaliana cũng làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với CdCl2 ở

nồng độ cao.

20

Cuối cùng, dòng cây RBC1 được so sánh với dòng cây đối chứng trong thí

nghiệm nhạy cảm với thuốc diệt cỏ paraquat. Paraquat là hợp chất có hoạt tính khử,

nguyên nhân sinh ra anion superoxide trong tế bào được ghi nhận ở Arabidopsis và

Nicotiana benthamian. Do đó, paraquat gây nên sự phá hủy và giết chết tế bào.

Hình 3.11. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1

Kết quả của thí nghiệm cho thấy tăng cường mức độ phiên mã của gen

At3G55240 trong dòng RBC1 cũng làm tăng tính nhạy cảm của tế bào với paraquat

(Hình 3.11). Lá của dòng RBC1 xử lý với paraquat bị mất diệp lục và trở nên trắng

hoàn toàn chỉ sau 24 giờ xử lý. Điều này được nhận thấy ở tất cả các nồng độ sử dụng

trong thí nghiệm 0,5, 1 và 2 µM. Ngược lại, dòng cây đối chứng bị mất diệp lục ở mức

độ chậm hơn so với RBC1.

Tóm lại, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana cho

thấy sự gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào trong điều kiện chịu mặn, bị gây độc bởi

21

CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat. Điều này gợi ý rằng gen At3G55240 có thể đóng vai

trò trong quá trình loại bỏ ROS. Ở thực vật, ROS đóng vai trò tín hiệu quan trọng như

chất truyền tin thứ hai trong việc kích hoạt cơ chế phòng thủ chống lại điều kiện bất

lợi. Khi nhận được tín hiệu từ ROS dưới điều kiện căng thẳng oxy hóa, thực vật thường

phản ứng lại bằng cách kích hoạt một loạt cơ chế phản ứng phức tạp để khử ROS, nhờ

hoạt động của các chất loại bỏ ROS có và không có bản chất enzyme. Do đó, biểu hiện

mạnh mẽ của protein có vai trò dọn dẹp ROS ở giai đoạn đầu của điều kiện bất lợi sẽ

làm giảm tín hiệu kích hoạt cơ chế phòng thủ, giảm khả năng kháng lại của thực vật.

Bên cạnh đó, ảnh hưởng của MRP đến phản ứng của cây trước một số điều kiện

bất lợi cũng được nghiên cứu. Calmodulin là protein được tập trung nghiên cứu về

ảnh hưởng của oxy hóa Met đến việc rối loạn và làm mất chức năng của protein. Đột

biến cây Arabidopsis bằng cách chèn thêm đoạn T-DNA vào 7 gen mã hóa cho

calmodulin đã góp phần khẳng định vai trò đặc biệt của các gen này đến quá trình

chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi gây ra bởi paraquat và H2O2; cụ thể, các

đột biến gen mã hóa calmodulin 5 và calmodulin 6 cho thấy sự tăng tính nhạy cảm

đối với paraquat và H2O2 trong quá trình nảy mầm và sinh trưởng của hạt.

Protein sốc nhiệt Hsp21 cũng là protein đích được nghiên cứu nhiều quá trình oxy

hóa Met và ảnh hưởng của nó đối với cây trồng. Dòng cây biểu hiện mạnh Hsp21 ít bị

ảnh hưởng và trọng lượng tươi vẫn lớn hơn dòng cây đối chứng. Do vậy, protein này

giúp tăng cường sự sống sót cho tế bào thực vật trong những điều kiện bất lợi oxy hóa.

Chính vì vậy, thông qua nghiên cứu này, gen At3G55240 được dự đoán là mã

hóa cho protein đóng vai trò trong việc khử ROS. Kết quả này bước đầu sẽ cung cấp

những dẫn liệu cho nghiên cứu thực nghiệm nhằm phân tích vai trò của gen mã hóa

MRP liên quan đến tính chống chịu ở thực vật, về đích tác động của Msr bên cạnh

một số MRP được công bố trước đây như calmodulin và hsp21.

22

KẾT LUẬN

Từ kết quả phân tích thu được chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

1. Hệ gen của cây Arabidopsis thaliana có chứa 121 gen mã hóa MRP,

trong đó khoảng 50% đã biết chức năng là đóng các vai trò quan trọng trong quá

trình của tế bào như tham gia vào tín hiệu Ca2+

, kiểm soát quá trình phiên mã

RNA. Trong số này có 21 MRP có đích đến ở lục lạp và 9 MRP cư trú ở ty thể.

2. Trong tổng số gen mã hóa MRP ở Arabidopsis có 39 gen đáp ứng phiên mã

trong điều kiện hạn hán, 28 gen đáp ứng phiên mã trong điều kiện mặn. Trong

đó, gen At3G55240 có biểu hiện giảm rất mạnh ở cả 2 điều kiện là hạn hán và

mặn.

3. Dòng cây Arabidopsis chuyển gen RBC1 biểu hiện quá mức gen

At3G55240 sinh trưởng và phát triển tốt, tuy nhiên lại có đặc điểm hình thái đặc

trưng của sự giả vàng úa dưới ánh sáng. Dòng cây chuyển gen RBC1 mẫn cảm

hơn (nhạy cảm hơn) với điều kiện mặn, CdCl2 và thuốc diệt cỏ paraquat.

KIẾN NGHỊ Để tiếp tục phát triển kết quả nghiên cứu trong phạm vi của đề tài, chúng tôi có

một số kiến nghị như sau:

1. Sử dụng các phương pháp thực nghiệm, ví dụ phương pháp phân tích

hình thái và phương pháp thử nghiệm trên một số điều kiện bất lợi, để làm rõ

hơn vai trò của một số gen mã hóa MRP chưa biết chức năng mà có đáp ứng

phiên mã mạnh với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra trong nghiên cứu này, ví dụ

gen At4G34590 được tăng cường biểu hiện lên đến 337,5 lần trong điều kiện

hạn hán.

2. Mở rộng nghiên cứu, trước mắt trong phạm vi lĩnh vực tin sinh học, đối

với MRP trên các cây nông nghiệp quan trọng khác như lúa gạo, ngô và sắn.