TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

29

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG NỒNG ĐỘ ADN BK

POLYOMAVIRUS BẰNG KỸ THUẬT TAQMAN PROBE

REAL-TIME PCR

Hoàng Xuân Sử*; Trịnh Thị Mỹ Anh**; Nguyễn Sỹ Lánh***

Phan Quốc Toản****; Nguyễn Giang Hòa****; Đinh Thị Thu Hằng*

TÓM TẮT

Mục tiêu: thiết lập được kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK

polyomavirus ADN. Vật liệu và phương pháp: kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng

nồng độ BK polyomavirus ADN trong công trình này được nghiên cứu thiết lập với cặp mồi,

probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus, Bioedit và đánh giá

bước đầu trên bộ mẫu chuẩn ADN cùng mẫu huyết tương, nước tiểu của 10 bệnh nhân sau

ghép thận có BK polyomavirus (+) và 10 mẫu máu ngoại vi của người hiến máu tình nguyện BK

polyomavirus (-). Kết quả và kết luận: phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X

QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 0,05

μ probe, 5 μl ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion đủ thể tích 20 μl, chu trình nhiệt: (50oC/2

phút) (95oC/15 phút) (94

oC/15 giây, 58

oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7

oC. Kỹ thuật Taqman

probe real-time PCR đạt ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel mẫu với độ tin cậy 95%, bước

đầu đánh giá cho kết quả tương đương khi so sánh với kit RealStar® BKV PCR 1.0 trên

20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, góp phần chủ động trong việc theo dõi và giám sát BK

polyomavirus ở bệnh nhân sau ghép thận ở Việt Nam.

* Từ khóa: BK polyomavirus; Bệnh thận do B polyomavirus; Định lượng; Ghép thận;

Taqman probe real-time PCR.

Quantification of BK Polyomavirus Load in Vietnamese Renal

Transplant Recipients by an In-house Taqman Probe Real-time

PCR Assay

Summary

Objectives: To establish an in-house real-time PCR assay using Taqman probe for detection

and quantification of BKV DNA load in renal transplant recipients. Materials and methods: An in-

house quantitative real-time PCR assay was established with specific primer pairs and Taqman

probe targeting VP1 gene of BKV using Primer3plus and Bioedit. We also initially evaluated

performance of the developed assay on 10 fold serial dilutions of plasmid DNA inserted VP1

gene sequence of BKV as well as clinical specimens collected from 10 recipients infected with

* Học viện Quân y

** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

*** Bệnh viện Việt Đức

**** Bệnh viện Quân y 103

Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)

Ngày nhận bài: 27/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/05/2018

Ngày bài báo được đăng: 30/05/2018

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

30

BKV after renal transplantation and peripheral blood samples from 10 healthy blood donors

negative for BKV DNA. Results and conclusion: The optimization of real-time PCR assay had

the following components: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Germany); 0 05 μM

probe, 5 μl DNA template, and deionized H2O equals to 20 μl, was performed using the Rotor-

GeneQ instrument with the cycling conditions as follows: 50oC for 2 mins, denaturation at 95

oC

for 15 mins, followed by 45 cycles of amplification at 94oC for 15s, 58

oC for 60s. In the

developed assay, the limit of detection is 1 copy/µl on DNA panel at 95% confidence. In

conclusion, this Taqman probe real-time PCR assay achieved a concordant result with the

RealStar BKV PCR 1.0 kit on 20 clinical specimens contributes to monitoring and surveilance

of BKV of kidney transplant recipients in Vietnam.

* Keywords: BK polyomavirus; BK polyomavirus-associated nephropathy; Quantification;

Renal transplantation; Taqman probe real-time PCR.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hơn 40 năm đã qua kể từ khi B

polyomavirus (BKV) lần đầu tiên được

phân lập từ nước tiểu của một bệnh nhân

(BN) ghép thận (viết tắt là BK) bị hẹp niệu

quản [2], nhưng loài virut cơ hội này vẫn

cần được nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ

chế bệnh học của nhiều bệnh liên quan.

BKV là thành viên của nhóm nhỏ

Polyoma của Papovaviruses, bao gồm

BKV, JC virut và Simian 40 virut (SV-40),

là một loại virut khá phổ biến với tỷ lệ

huyết thanh dương tính ở trẻ em trung

bình 80% [4].

Nhiễm B V thường không có triệu

chứng lâm sàng, tuy nhiên một số triệu

chứng cũng được ghi nhận là sốt và viêm

đường hô hấp trên thể nhẹ [5]. Sau khi

nhiễm nguyên phát, B V vẫn còn tiềm ẩn

ở nhiều cơ quan trong cơ thể, đặc biệt

trong các tế bào biểu mô niệu đạo và biểu

mô thận. hi cơ thể trong tình trạng bị ức

chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch qua

trung gian tế bào có liên quan đến tái hoạt

động và sao chép của virut, dẫn đến kích

hoạt một chuỗi phản ứng và phân giải tế

bào [6]. Ở BN ghép thận, sau khi BKV

nhân lên, đi vào các mao mạch, xuất hiện

trong nước tiểu (viruria) và tấn công bộ

phận ghép, dẫn đến tổn thương khác

nhau. hoảng 1/3 số BN có viruria sẽ

phát triển B V trong máu (viremia), nếu

không được can thiệp kịp thời sẽ phát

triển thành bệnh thận do B V (B V-

associated nephropathy, B VN) với tỷ lệ

dao động 1 - 10%, dẫn đến thải ghép, mất

chức năng thận ghép [5]. Việc tái hoạt

động của BKV ở người nhận ghép thận

với dấu hiệu thường gặp là virut phát tán

trong nước tiểu với tỷ lệ 20 - 60% BN [6].

Trong khi đó, ở những người khỏe mạnh

hay BN có khả năng miễn dịch, hiện

tượng tái hoạt động của B V và xuất hiện

B V viruria rất hiếm. Ngoài liên quan đến

thận ghép, B V thường gặp ở người

nhận ghép tủy xương [7], hay một số báo

cáo cũng cho thấy B V và B V viruria ở

BN ghép tạng không phải thận như ghép

tim, phổi và gan. Nhìn chung, BKV có mặt

trong máu hoặc nước tiểu không liên

quan đến suy giảm chức năng thận ở

những BN này [4, 5, 8, 9].

Như vậy, đến nay BKV được khẳng

định là nguyên nhân quan trọng hàng đầu

dẫn đến B VN ở BN sau ghép thận 4].

Hiện tượng mất mô thận ghép thấy ở

45% BN BKVN [10]. Chính vì vậy, việc

chẩn đoán sớm và ức chế hoàn toàn BKV

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

31

nhân lên sau ghép thận là đích điều trị

cuối cùng nhằm hồi phục cả chức năng

và hình thái của thận ghép. Định lượng

nồng độ BKV ADN bằng real-time PCR có

giá trị trực tiếp trong phát hiện tái hoạt

động của virut cũng như giám sát điều trị

[1]. BKV với hệ gen là ADN dạng vòng,

kích thước 5,13 kb, trong đó gen VP1 mã

hóa cho viral protein 1 thường sử dụng

trong chẩn đoán. Cho đến nay, chưa có

nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về

B V được công bố ở Việt Nam. Một số

cơ sở y tế đã sử dụng kít thương mại như

Realstar BKV PCR (Altona Diagnostics,

Đức), Artus® BK Virus RG PCR Kit

(Qiagen, Đức)… xác định tải lượng BKV

ADN, tuy nhiên giá thành các kít này rất

cao, đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ

và chưa đề cập đến khía cạnh các kít này

có thể không phù hợp với một số chủng

BKV ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi

thực hiện công trình này nhằm: Thiết lập

được kỹ thuật Taqman probe real-time

PCR định lượng nồng độ BKV ADN, góp

phần chủ động trong việc theo dõi và

giám sát BKV ở BN sau ghép thận.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1. Mẫu bệnh phẩm.

Lựa chọn mẫu máu ngoại vi (06 mẫu,

ký hiệu PB 1, 2, 5, 7, 8, 10), nước tiểu

(04 mẫu, ký hiệu PBK3, 4, 6, 9) của

10 BN sau ghép thận có BKV (+), trong

đó 1 BN B VN (PB 10) được khẳng định

bằng mô bệnh học kết hợp với phân tích

trình tự gen VP1 của BKV, 9 BN còn lại

khẳng định bằng semi-nested PCR theo

Arthur và CS [11] (nhóm bệnh) và 10 mẫu

máu ngoại vi của người hiến máu tình

nguyện BKV (-) (nhóm chứng). Các mẫu

bệnh phẩm được cung cấp nhờ hợp tác

nghiên cứu giữa Viện Nghiên cứu Y

Dược học Quân sự, Học viện Quân y và

Khoa Thận, Lọc máu - Bệnh viện Quân y

103, Học viện Quân y, Bệnh viện Hữu

nghị Việt Đức và Bệnh viện Trung ương

Huế.

2. Thiết lập kỹ thuật Taqman probe

real-time PCR.

200 µl mẫu huyết tương, cặn nước

tiểu được sử dụng để tách chiết BKV

ADN theo quy trình bộ kit GeneJET

Whole Blood Genomic DNA Purification

Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ), thu

100 µl mẫu ADN. Cặp mồi, Taqman

probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1

sử dụng phần mềm Primer3plus và

Bioedit dựa trên trình tự tham chiếu của

gen VP1 BKV đã công bố trên Genbank

có tên qBK-F/R, qBK-Pr và đặt Hãng IDT,

Mỹ tổng hợp, có trình tự qBK-F: 5’-

TAGGCGCCAACCATTAGAC-3’; qB -R:

5’- ACGTAATGGCACTTGCTCG-3’; qB -Pr:

5’-FAM- GAGCAGCCGCAGCCCATATAGGC-

BHQ1-3’. Quá trình tối ưu kỹ thuật real-

time PCR bao gồm khảo sát trên chu trình

nhiệt, trong đó lần lượt đánh giá nhiệt độ

gắn mồi khác nhau; tối ưu các thành

phần tham gia trên cơ sở phản ứng real-

time PCR tiêu chuẩn. Phản ứng real-time

PCR có thành phần như sau: 1X

QuantiTect Probe PCR Master Mix

(Qiagen, Đức); 0,2 - 0,5 μ mồi xuôi, mồi

ngược mỗi loại, 0,05 - 0,3 μ probe, 5 μl

ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion

DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl.

Quá trình khuếch đại thực hiện trên máy

real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen,

Đức) với chu trình: (50oC/2 phút)

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

32

(95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 56 -

60oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.

Kết quả real-time PCR tối ưu được lựa

chọn tại giá trị khảo sát cho chu kỳ

ngưỡng thấp nhất.

3. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR

định ƣợng nồng độ BKV ADN.

* Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định

lượng nồng độ BKV ADN trên bộ mẫu

chuẩn ADN:

Bộ mẫu chuẩn ADN được thiết lập từ

mẫu plasmid tinh khiết pGEMT-VP1 pha

loãng trong nước khử ion tạo dải nồng độ

100 - 108 (copy/µl). Plasmid pGEMT-VP1

này thiết lập qua con đường tái tổ hợp,

chứa trình tự gen VP1 của BKV phân lập

từ BN BKVN và khẳng định bằng giải

trình tự [2]. Bộ mẫu chuẩn ADN là cơ sở

để đánh giá kỹ thuật real-time PCR thiết

lập cũng như xác định nồng độ BKV ADN.

* Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định

lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm

sàng:

Kỹ thuật real-time PCR được khảo sát

trên 10 mẫu BKV ADN của BN sau ghép

thận có BKV (+) và 10 mẫu BKV (-) là

huyết tương người khỏe mạnh hiến máu

tình nguyện đã xác định BKV (-) bằng

semi-nested PCR theo Arthur và CS [11].

Đồng thời, chúng tôi định lượng BKV

ADN đối chứng với bộ kít thương mại

RealStar® BKV PCR 1.0 (Altona

Diagnostics, Đức) có chứng chỉ CE-IVD

[12].

Tất cả các thử nghiệm tối ưu và định

lượng đều tiến hành lặp lại ít nhất 2 lần,

xác định giá trị trung bình, mỗi lần chạy

đều có chứng âm là nước khử ion và

chứng dương.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

1. Thiết lập và tối ưu kỹ thuật real-time

PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN.

Kỹ thuật real-time PCR được thiết lập

và tối ưu trên mẫu chứng dương là huyết

tương BN sau ghép thận bị BKVN. Sử

dụng phần mềm chuyên dụng để thiết kế

một bộ mồi, probe hoàn toàn mới cho kỹ

thuật Taqman probe real-time PCR có

khả năng xác định BKV ADN phù hợp với

các chủng của Việt Nam và quốc tế. Để

hiệu suất phản ứng real-time PCR lý

tưởng, chúng tôi lần lượt tối ưu các điều

kiện cũng như thành phần phản ứng.

a.

b

Hình 1: Biểu đồ khuếch đại tối ưu kỹ thuật

real-time PCR phát hiện BKV AND.

(A: Tối ưu nồng độ mồi. 1 - 4: Nồng độ

mồi tương ứng là 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 µM;

dc: Đối chứng âm là nước kh ion; B: Tối

ưu nồng độ probe từ 0,05 - 0,3 µM)

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

33

Từ kết quả hình 1A cho thấy: nồng độ

mồi cho giá trị Ct sớm nhất 0,2 µ . Như

vậy, đây là nồng độ mồi tối ưu cho phản

ứng real-time PCR BKV. Trên cơ sở nồng

độ mồi tối ưu, nồng độ probe được khảo

sát ở các mức 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 µM. ết

quả cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM là

nồng độ thấp nhất mà vẫn cho kết quả

đáng tin cậy. Do đó, nồng độ probe tối ưu

được lựa chọn cho phản ứng real-time

PCR BKV ADN là 0,05 µM (hình 1B). Chu

trình nhiệt tối ưu được xác định như sau:

(50oC/2 phút) (95oC/15 phút) (94oC/15 giây,

58oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.

Bảng 1: Thành phần tối ưu của kỹ thuật real-time PCR.

STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µ )

1 QuantiTect Probe PCR master mix 1X 10

2 qBK-F/R 5 µM 0,2 µM 0,8

3 Probe qBK-Pr 5 µM 0,05 µM 0,2

4 Nước khử ion DNA/RNAase free - 4

5 BKV ADN 5

Tổng 20

2. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR

định ƣợng nồng độ BKV ADN.

Trong công trình này, trên cơ sở có

sẵn mẫu chuẩn dương plasmid tái tổ hợp

chứa gen đích VP1, lựa chọn mẫu

plasmid có nồng độ, độ tinh sạch cao

(nồng độ 1010 copies/µl, A260/280: 2,01

được xác định bằng máy đo quang phổ

Nanodrop ND-1000) làm mẫu chuẩn.

Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ

đồng bộ cao nhất và có thể pha loãng

thành các nồng độ chính xác, cũng là

hướng thiết lập được WHO và NIBSC

(National Institute for Biological

Standards and Control, Viện Quốc gia về

Kiểm chuẩn Sinh học) khuyến cáo. Các

mẫu plasmid có dải nồng độ 100 - 108

(copies/µl) được chia nhỏ thành nhiều

ống, mỗi ống chứa ADN plasmid đủ

dùng cho 1 phản ứng, bảo quản ở điều

kiện -20oC. Kỹ thuật real-time PCR sau

khi tối ưu đánh giá trên bộ mẫu chuẩn

BKV ADN này cho hiệu suất phản ứng

PCR đạt 103,7%, sai số 0,005 - các giá

trị gần như lý tưởng, cho thấy quy trình

tối ưu real-time PCR cũng như thao tác

kỹ thuật tốt, bộ mẫu chuẩn đạt nồng độ

có độ chính xác cao. Theo tính toán,

ngưỡng phát hiện của kỹ thuật real-time

PCR trên mẫu chuẩn ADN thiết lập này

có thể đạt 1 copy/µl với độ tin cậy 95% -

ngưỡng đạt được ở một số kít thương

mại hiện nay (dữ liệu không trình bày).

Đây là cơ sở để đánh giá kỹ thuật real-

time PCR định lượng nồng độ BKV ADN

trên các mẫu lâm sàng (hình 2).

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

34

Hình 2: Biểu đồ khuếch đại định lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm sàng và

đường chuẩn standard curve bằng kỹ thuật real-time PCR phát triển.

(SK2-SK4: 3 mẫu chuẩn với nồng độ lần lượt là 103; 102; 101 (copies/µl); PBK1-PBK3:

Các mẫu bệnh phẩm BK (+); NC: Đối chứng âm là nước kh ion)

Bước đầu, chúng tôi đã đánh giá đồng thời kỹ thuật real-time PCR phát triển (đặt

tên là kít LDA_BK) và bộ kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0 (Hãng Altona) trên

các mẫu lâm sàng gồm 10 mẫu bệnh phẩm dương tính với BKV và 10 mẫu âm tính.

Kết quả giá trị trung bình các lần thử nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm B V dương tính

được thống kê theo bảng 2, còn 10 mẫu âm tính đều không xuất hiện tín hiệu huỳnh

quang với cả 2 bộ kít.

Bảng 2: Nồng độ các mẫu bệnh phẩm B V dương tính.

STT

Mã

Nồng độ copy/ m Log copy/ ml

Sự khác biệt ( og)

Hệ số biến thiên

CV% (log) Kít

LDA_BK Kít Altona Kít

LDA_BK Kít Altona

1 PBK1 1.88E+04 1.36E+04 4.27 4.13 0.14 2.37

2 PBK2 2.90E+04 1.69E+04 4.46 4.23 0.24 3.84

3 PBK3* 9.98E+08 5.1E+08 9.00 8.71 0.29 2.33

4 PBK4* 1.10E+07 1.01E+07 7.04 7.00 0.04 0.39

5 PBK5 5.16E+03 5.13E+02 3.71 2.71 1.00 22.1

6 PBK6* 9.45E+08 2.08E+08 9.98 9.32 0.66 4.82

7 PBK7 1.70E+03 1.35E+03 3.23 3.13 0.10 2.23

8 PBK8 1.13E+06 3.67E+05 6.05 5.56 0.49 5.95

9 PBK9* 2.48E+05 1.21E+05 5.39 5.08 0.31 4.2

10 PBK10 3.24E+04 1.70E+04 4.51 4.23 0.28 4.53

(*: Mẫu nước tiểu)

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

35

Từ kết quả đánh giá cho thấy, kỹ thuật

real-time PCR định lượng nồng độ BKV

ADN được phát triển đã xác định trên 10

mẫu bệnh phẩm BKV (+), kết quả tương

đương so với kít thương mại RealStar®

BKV PCR 1.0, thể hiện qua khác biệt về

số log giữa 2 giá trị nồng độ (sử dụng

2 kít khác nhau) và hệ số biến thiên

(CV%) cùng một mẫu. Giá trị nồng độ được

xác định bằng kít LDA_BK từ 103 - 108

copies/ml. Chỉ có một mẫu PBK5 nồng độ

khác biệt là 1 log, CV 22,1%, điều này có

thể được lý giải do 2 bộ kít khác nhau về

chiến lược thiết kế mồi, các bộ mẫu

chuẩn, cũng như sai khác giữa những lần

thao tác. Đồng thời, do số lượng mẫu

đánh giá trong công trình này còn hạn

chế nên chưa thể khẳng định sự khác

biệt của một mẫu là PB 5 có ý nghĩa

thống kê hay không.

Phát hiện B V viremia bằng kỹ thuật

real-time PCR được khẳng định có giá trị

chẩn đoán dương tính và giá trị chẩn

đoán âm tính cao hơn cho B VN so với

phát hiện viruria bằng xét nghiệm tế bào

decoy hay PCR. Tuy nhiên, tương tự như

xét nghiệm real-time PCR trong theo dõi

tải lượng virut khác, hiện có sự khác biệt

đáng kể trong cách phát triển kỹ thuật dẫn

đến khó khăn khi so sánh kết quả giữa

phòng thí nghiệm khác nhau cũng như

xác định một giá trị ngưỡng trong chẩn

đoán và điều trị B VN. Tuy nhiên, Hirsch

và CS đã xác định mức nồng độ B V

ADN > 104 copies/ml huyết tương trong

hơn 4 tuần ở BN sau ghép thận có liên

quan đến B VN với độ đặc hiệu 93% 9],

giá trị này được nêu trong các hướng dẫn

gần đây 6 . huyến nghị này cũng được

các trung tâm trên thế giới sử dụng và

khảo nghiệm, sai khác về nồng độ được

chấp nhận ít nhất 1 log.

Ghép thận là phương pháp điều trị

thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho BN

bệnh thận mạn giai đoạn cuối. Ở nước ta

ước tính có khoảng 80.000 BN bị bệnh

thận mạn giai đoạn cuối và mỗi năm

khoảng 4.000 BN có nhu cầu ghép thận.

Việc theo dõi điều trị BN sau ghép thận

đóng vai trò quan trọng trong duy trì chức

năng thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy

cơ mất mô ghép hay suy chức năng thận

ghép. Nguyên nhân dẫn đến suy chức

năng của thận ghép đồng loại chủ yếu do

BKV nhân lên trong tế bào biểu mô ống

thận, làm tổn thương, hoại tử ống thận

trực tiếp. Ống thận hoại tử tỷ lệ với BKV

nhân lên, tuy nhiên khi BKV nhân lên bị

giới hạn trong vùng tủy thận sẽ không làm

ảnh hưởng đến chức năng thận ghép. Do

đó, ở giai đoạn sớm này của bệnh rất khó

xác định biểu hiện của BKVN. Chỉ khi

BKV bắt đầu nhân lên xảy ra ở vùng vỏ

thận, có mối liên quan rõ với hoại tử tế

bào biểu mô ống thận và nồng độ

creatinin huyết thanh tăng. Cơ chế dẫn

đến rối loạn chức năng mô ghép thận

đồng loại được xác định là do rò rỉ và

nước tiểu chảy ngược từ ống thận bị tổn

thương vào khoang kẽ và mao mạch

quanh ống thận. Do đó, tổn thương và

hoại tử ống thận cấp là dấu hiệu quan

trọng của BKVN.

BKV hoạt động và BKVN phát triển

phụ thuộc vào hiệu quả điều trị giảm liều

thuốc ức chế miễn dịch và đáp ứng miễn

dịch kháng virut của cơ thể chủ. Diễn biến

của tái hoạt động BKV phát hiện trực tiếp

bằng xác định tải lượng BKV ADN hỗ trợ

phát hiện gián tiếp qua theo dõi đáp ứng

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

36

miễn dịch đặc hiệu với B V. Do đó, sử

dụng kỹ thuật real-time PCR tối ưu xác

định tải lượng BKV ADN giúp theo dõi,

giám sát chỉ số này trong máu và nước

tiểu, là công cụ rất có giá trị trong tiên

lượng BKVN, cần được nghiên cứu phát

triển ở Việt Nam.

KẾT LUẬN

Đã thiết lập thành công kỹ thuật

Taqman probe real-time PCR định lượng

nồng độ BKV ADN trong huyết tương,

nước tiểu ở BN sau ghép thận với

ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel

mẫu, độ tin cậy 95%. Phản ứng real-time

PCR tối ưu có thành phần: 1X QuantiTect

Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức);

0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại,

0,05 μ probe, 5 μl ADN khuôn, nước

khử ion DNAase/RNAse free đủ thể tích

20 μl, với chu trình nhiệt được thực hiện

trên máy real-time PCR Rotor-Gene Q

(Qiagen, Đức). Kỹ thuật real-time PCR

này bước đầu được đánh giá cho kết quả

tương đương so với kít RealStar® BKV

PCR 1.0 trên 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đinh Thị Thu Hằng, Hoàng Xuân S .

Đặc điểm kiểu gen của BK polyomavirus trên

bệnh nhân sau ghép thận ở miền Bắc Việt

Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN. Khoa học

Y Dược. 2018, tập 34, số 1 tr.1-6.

2. Gardner S.D et al. New human

papovavirus (B.K.) isolated from urine after

renal transplantation. Lancet. 1971, 1 (7712),

pp.1253-1257.

3. Reploeg M.D, G.A Storch, D.B Clifford.

BK virus: a clinical review. Clin Infect Dis.

2001, 33 (2), pp.191-202.

4. Sawinski D. S. Goral. BK virus infection:

an update on diagnosis and treatment. Nephrol

Dial Transplant. 2015, 30 (2), pp.209-217.

5. Sharma R et al. BK virus in kidney

transplant: Current concepts, recent advances,

and future directions. Exp Clin Transplant.

2016, 14 (4), pp. 377-384.

6. Pavlakis M. A, Haririan, D.K. Klassen.

BK virus infection after non-renal transplantation.

Adv Exp Med Biol. 2006, 577, pp.185-189.

7. Loeches B et al. BK virus in liver

transplant recipients: a prospective study.

Transplant Proc. 2009, 41 (3), pp.1033-1037.

8. Remund K.F, M Best, J.J. Egan.

Infections relevant to lung transplantation.

Proc Am Thorac Soc. 2009, 6 (1), pp.94-100.

9. Hirsch H.H et al. Polyomavirus-

associated nephropathy in renal

transplantation: critical issues of screening

and management. Adv Exp Med Biol. 2006,

577, pp.160-173.

10. Bohl D.L, D.C. Brennan. BK virus

nephropathy and kidney transplantation. Clin J

Am Soc Nephrol. 2007, 2 Suppl 1, pp.S36-46.

11. Arthur R.R, S. Dagostin, K.V. Shah.

Detection of BK virus and JC virus in urine

and brain tissue by the polymerase chain

reaction. J Clin Microbiol. 1989, 27(6): pp.

1174-9.

12. RealStar® BKV PCR Kit

1.0_https://www.altona-diagnostics.com. 2016.