ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH AN GIANG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG

ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN

TRÊN LÚA PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

TẠI HUYỆN THOẠI SƠN, TỈNH AN GIANG

KHƢU PHƢƠNG YẾN ANH

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH AN GIANG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG

ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN

TRÊN LÚA PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

TẠI HUYỆN THOẠI SƠN, TỈNH AN GIANG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Khƣu Phƣơng Yến Anh

CƠ QUAN CHỦ QUẢN

iii

Đề tài nghiên cứu khoa học “Nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng

nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa phân lập từ đất tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An

Giang” do tác giả Khưu Phương Yến Anh, công tác tại Khoa Sư phạm thực hiện.

Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo

trường Đại học An Giang thông qua ngày 18/08/2015.

Nguyễn Thị Thanh Xuân Nguyễn Sĩ Lâm

Thƣ ký

Phản biện 1 Phản biện 2

Chủ tịch Hội đồng

iv

TÓM TẮT

Bệnh đạo ôn (rice blast disease) là bệnh gây hại quan trọng nhất trên cây lúa,

tác nhân gây bệnh là nấm Pyricularia oryzae Cav.. Đề tài được thực hiện nhằm phân

lập và tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng nấm Pyricularia

oryzae gây bệnh đạo ôn hại lúa. Kết quả đã phân lập được 80 chủng xạ khuẩn khác

nhau từ đất ở các ruộng lúa thuộc 6 xã huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang. Trong đó,

có 21 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm đạo ôn, chiếm tỉ lệ 26,25%. Đánh

giá khả năng đối kháng bằng phương pháp khoan lỗ thạch với 4 lần lặp lại cho thấy

2 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm P.oryzae mạnh nhất là ĐMB-40 (17,88

mm) và VKB-09 (14,69 mm). Chủng xạ khuẩn ĐMB-40 được phân loại là loài

Streptomyces recifensis, VKB-09 thuộc loài Streptomyces laurentii. Hai chủng xạ

khuẩn đều sinh enzym cellulase và chitinase. Kết quả thử nghiệm trên lúa trong nhà

lưới, cả 2 chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 đều có khả năng đối kháng bệnh đạo

ôn lá và đạo ôn cổ bông qua 2 lần phun vào 25 NSS và 65 NSS.

v

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu

trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng. Những kết luận mới về khoa học

của công trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Long Xuyên, ngày 03 tháng 09 năm 2015

Ngƣời thực hiện

Khưu Phương Yến Anh

vi

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Chấp nhận của hội đồng .......................................................................................... i

Tóm tắt .................................................................................................................... ii

Cam kết kết quả ...................................................................................................... iii

Mục lục .................................................................................................................... iv

Dang sách bảng ....................................................................................................... vi

Danh sách hình ........................................................................................................ vii

Danh mục các từ viết tắt ......................................................................................... viii

CHƢƠNG 1 – GIỚI THIỆU ................................................................................ 1

1.1. Tính cần thiết của đề tài ................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

1.3. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 2

1.4. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

1.5. Những đóng góp của đề tài ............................................................................. 2

CHƢƠNG 2 – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................... 4

2.1. Sơ lược về xạ khuẩn ......................................................................................... 4

2.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn .................................................................. 4

2.1.2. Đặc điểm sinh lý- sinh hóa của xạ khuẩn .................................................... 6

2.1.3. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn ....................................................................... 7

2.1.4. Vai trò của xạ khuẩn ..................................................................................... 7

2.2. Bệnh đạo ôn trên lúa ...................................................................................... 8

2.2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa ................................................................. 8

2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa ......................................................... 10

2.2.3. Cơ chế phát sinh và phát triển bệnh đạo ôn lúa ............................................ 10

2.2.4. Biện pháp phòng trị bệnh đạo ôn lúa ............................................................ 12

2.3. Khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa của xạ khuẩn ................... 13

2.3.1. Sự hình thành khả năng đối kháng của xạ khuẩn .......................................... 13

2.3.2. Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cây trồng .............. 13

2.3.3. Tình hình nghiên cứu chất đối kháng từ xạ khuẩn ....................................... 15

CHƢƠNG 3 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 18

3.1. Vật liệu ............................................................................................................. 18

vii

3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 20

3.2.1. Phương pháp thu mẫu đất ............................................................................. 20

3.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski ...................................... 21

3.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng

nấm Pyricularia oryzae của xạ khuẩn ......................................................... 22

3.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym

của xạ khuẩn bằng cách đo đường kính vòng thuỷ phân ........................... 23

3.2.5. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái và định danh xạ khuẩn ............... 24

3.2.6. Thử nghiệm khả năng đối kháng nấm P. oryzae

gây bệnh đạo ôn trên lúa từ dịch nuôi xạ khuẩn ......................................... 24

3.2.7. Xử lý thống kê ............................................................................................ 27

CHƢƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28

4.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng có khả năng

đối kháng nấm Pyricularia oryzae ............................................................ 28

4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái

và phân loại 2 chủng xạ khuẩn ................................................................. 29

4.3. Khả năng sinh enzym của 2 chủng xạ khuẩn ................................................. 35

4.4. Kết quả khả năng đối kháng nấm P. oryzae trên lúa từ dịch nuôi xạ khuẩn 37

4.4.1. Kết quả hoạt tính đối kháng của dịch nuôi xạ khuẩn

ở các nồng độ khác nhau ........................................................................... 37

4.4.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn

trên lúa của dịch nuôi xạ khuẩn trong nhà lưới ......................................... 38

CHƢƠNG 5 – KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................. 43

5.1. Kết luận ............................................................................................................ 43

5.2. Hạn chế ......................................................................................................... 43

5.3. Khuyến nghị .................................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 44

PHỤ LỤC ............................................................................................................... 46

8

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Kết quả vòng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của 21 chủng xạ khuẩn 29

Bảng 2: Đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng xạ khuẩn .................................. 30

Bảng 3: Kết quả Search Blast trình tự gen 16s rRNA của chủng ĐMB-40

trên GenBank .............................................................................................. 33

Bảng 4: Kết quả Search Blast trình tự gen 16s rRNA của chủng VKB-09

trên GenBank .............................................................................................. 34

Bảng 5: Hoạt tính enzym cellulase và chitinase của 2 chủng XK (D-d; mm) 35

Bảng 6: Vòng đối kháng nấm P.oryzae của dịch nuôi XK ở các

nồng độ khác nhau (D-d; mm) .................................................................... 38

Bảng 7: Tỉ lệ diện tích bệnh trên lá 30, 40, 50 và 60 NSS (%) .............................. 39

Bảng 8: Tỉ lệ giảm bệnh trên lá vào 30, 40, 50 và 60 NSS (%) ............................. 40

Bảng 9: Tỉ lệ bệnh thối cổ bông và tỉ lệ giảm bệnh thối cổ bông vào 85 NSS (%) 41

9

DANH SÁCH HÌNH Trang

Hình 1: Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn .................................................................... 5

Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn ................................................................................... 5

Hình 3: Các dạng chuỗi sinh bào tử của xạ khuẩn ................................................. 6

Hình 4: Bào tử của xạ khuẩn .................................................................................. 6

Hình 5: Dấu hiệu bệnh đạo ôn ở lúa ....................................................................... 9

Hình 6: Vùng bị thiệt hại năng suất lúa do nhiễm đạo ôn ..................................... 9

Hình 7: Cành sinh bào tử và bào tử nấm Pyricularia oryzae ................................. 10

Hình 8: Chu kỳ phát triển của nấm đạo ôn ............................................................. 11

Hình 9: Cơ chế đối kháng nấm (A) và cấu trúc (B) của Kasugamycin ................. 14

Hình 10: Cơ chế tác động (A) và cấu trúc (B) của

Validamycin lên Rhizoctonia solani ...................................................................... 15

Hình 11: Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang ............. 21

Hình 12: Vòng đối kháng P.oryzae của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 .............. 28

Hình 13: Mặt trước và sau khuẩn lạc của xạ khuẩn ĐMB-40 ................................ 31

Hình 14: Cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn ĐMB-40 (40X) ......................... 31

Hình 15: Mặt trước và sau khuẩn lạc của xạ khuẩn VKB-09 ................................. 31

Hình 16: Cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn VKB-09 (40X) ........................... 31

Hình 17: Vòng hoạt tính enzym cellulase của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 ...... 37

Hình 18: Vòng hoạt tính enzym chitinase của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 ..... 37

Hình 19: Dịch nuôi xạ khuẩn 7 ngày ...................................................................... 67

Hình 20: Xuất hiện bệnh sau 20NSS ...................................................................... 67

Hình 21: Nghiệm thức NT1 50NSS ....................................................................... 68

Hình 22: Nghiệm thức NT2 50NSS ....................................................................... 68

Hình 23: NT3 50NSS ............................................................................................. 68

Hình 24: NT4 50NSS ............................................................................................. 68

Hình 25: NT5 50NSS ............................................................................................. 68

Hình 26: Vết bệnh cấp 5 ở NT1 ............................................................................. 69

Hình 27: Đạo ôn cổ lá (trái) và cổ bông (phải) ở nghiệm thức NT1 ...................... 69

Hình 28: Đạo ôn cổ gié và cổ bông ở nghiệm thức NT1 (ĐC-) ............................. 69

Hình 29: Bào tử và khuẩn lạc nấm đạo ôn P.oryzae .............................................. 69

Hình 30: Khuẩn lạc một số chủng xạ khuẩn ........................................................... 71

Hình 31: Thu mẫu tại ruộng xã Định Mỹ ............................................................... 71

10

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chất kháng sinh : CKS

Đồng bằng sông Cửu Long : ĐBSCL

Kính hiển vi : KHV

Ngày sau khi sạ : NSS

Nghiệm thức : NT

Tỉ lệ diện tích bệnh : TLDTB

Tỉ lệ giảm bệnh : TLGB

Tỉ lệ giảm bệnh trên bông : TLGBTB

Vi sinh vật : VSV

Xạ khuẩn : XK

Xạ khuẩn đối kháng : XKĐK

1

CHƢƠNG 1

GIỚI THIỆU

1.1. TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây lúa là một trong các cây lương thực chính ở Việt Nam cũng như trên thế

giới. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vựa lúa lớn nhất, trong đó An Giang

có diện tích nông nghiệp chủ yếu là trồng lúa. Bệnh đạo ôn (rice blast disease) là

bệnh gây hại quan trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là bệnh cháy lá lúa. Khi dịch

đạo ôn xảy ra thiệt hại đến năng suất và sản lượng làm ảnh hưởng đến kinh tế. Tác

nhân gây bệnh là nấm Pyricularia oryzae Cav. Bệnh có thể tấn công mọi giai đoạn

của cây lúa, bắt đầu từ giai đoạn sau khi gieo sạ cho đến trước trổ gọi là bệnh cháy

lá, gây hại trên cổ lá gọi là thối cổ lá, gây hại trên cổ bông gọi là thối cổ bông làm

lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa. Bệnh nặng sẽ làm mất trắng năng

suất nếu không phát hiện sớm và phòng trị kịp thời.

(http://www.haiduongdost.gov.vn/index.php?option=com_content&view=art

icle&catid=303:khoa-hc-va-cong-ngh&id=2049)

Hằng năm thường có 2 thời điểm xuất hiện bệnh nhiều nhất là vào tháng 11 –

12 và tháng 5 – 6 dương lịch, dịch bệnh đạo ôn gây thiệt hại về năng suất ảnh hưởng

rất lớn đến nền kinh tế của tỉnh nhà và đời sống của nông dân. Bệnh bộc phát mạnh

trên lúa từ 20 – 30 ngày tuổi. Các vùng lúa có diện tích bị nhiễm bệnh cao là huyện

Thoại Sơn và Châu Thành. Bệnh phát sinh nhiều trên các ruộng trồng giống lúa

OM4218 và IR50404. (http://www.ciheam.org/)

Ở Việt Nam, thời tiết khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho bệnh đạo ôn trên lúa

phát triển. Vụ lúa hè thu 2012, ĐBSCL đã có hơn 70.000 hecta lúa bị bệnh đạo ôn.

Tại nhiều nơi, nông dân phải phá bỏ, gieo sạ lại hàng trăm hecta lúa do bị nhiễm

bệnh trên 25%. Trong vụ đông xuân 2012 – 2013, theo nhận định của Cục Bảo vệ

Thực Vật, bệnh đạo ôn lá và bệnh đạo ôn cổ bông tiếp tục phát sinh phát triển, có

một số diện tích bị nhiễm bệnh đạo ôn lá với tỷ lệ cao trên 20% trên những chân

ruộng sạ dày, bón thừa phân đạm, gieo trồng giống nhiễm. Theo Trung tâm Bảo vệ

Thực vật phía Nam, vào thời điểm cuối tháng 1 năm 2013 toàn khu vực phía Nam có

56.818 hecta lúa bị nhiễm bệnh bệnh đạo ôn lá và 4.675 hecta nhiễm bệnh đạo ôn cổ

bông với tỷ lệ bệnh 5% – 15%.

(http://www.hoptri.com/vi/quy-trinh-giai-phap/item/178-bien-phap-phong-tru-benh

dao-on-hai-lua)

Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh đạo ôn phổ biến là dùng thuốc hóa học.

Tuy nhiên, thuốc hóa học là tác nhân gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng sức

khoẻ con người. Do đó, việc hạn chế khả năng phát tán và gây bệnh của nấm

Pyricularia oryzae dựa vào khả năng đối kháng của các vi sinh vật (VSV) như vi

khuẩn, nấm, xạ khuẩn (XK) nhằm đưa ra phương pháp tối ưu phòng trừ bệnh đạo ôn

lúa bằng chế phẩm VSV là công việc cấp bách của các nhà khoa học.

2

Sử dụng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng nấm, vi khuẩn gây bệnh trong bảo

vệ thực vật là quan điểm chiến lược trong bảo vệ cây trồng. Xạ khuẩn là VSV sống

hoại sinh, hầu hết các loài không gây bệnh cho người, động vật và cây trồng. Vì vậy,

việc tìm kiếm các chủng XK có hoạt tính đối kháng cao và tạo chế phẩm kháng sinh

kháng nấm áp dụng vào công tác bảo vệ thực vật có tầm quan trọng đặc biệt. Các

chất kháng sinh (CKS) được dùng để tiêu diệt nấm, vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng

như bệnh đạo ôn, bệnh khô vằn, vàng lụi ở lá lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có tác

dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu

bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến các loài có ích khác và đặc biệt còn có khả

năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học, làm chất kích thích tăng trưởng

ở một số nồng độ nhất định như kích thích khả năng nảy mầm của hạt. CKS thường

ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung các chất độn để làm tăng độ bền, có thể trộn

lẫn vào đất, phun trực tiếp lên thực vật, dùng xử lý hạt giống để tiêu diệt mầm bệnh

bên trong và ngoài hạt. (Lương Đức Phẩm, 2011)

Do đó, đề tài “Nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây

bệnh đạo ôn trên lúa phân lập từ đất tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang” được

thực hiện nhằm góp phần vào xu hướng tiến tới một nền nông nghiệp sạch và bền

vững hiện nay.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Phân lập và tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm

Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa, nhằm ứng dụng trong phòng trừ

bệnh đạo ôn lúa.

1.3. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa được phân lập từ các

mẫu đất ruộng tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang.

1.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Phân lập xạ khuẩn từ các mẫu đất ruộng tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang.

Tuyển chọn 2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Pyricularia

oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa.

Xác định đặc điểm hình thái, khả năng sinh enzym và định danh đến loài 2 chủng

xạ khuẩn đã được lựa chọn.

Bước đầu thử nghiệm khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa từ dịch

nuôi xạ khuẩn đã tuyển chọn trong nhà lưới.

1.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

Đối với lĩnh vực khoa học và công nghệ có liên quan

Bồi dưỡng, đào tạo cán bộ khoa học, tăng cường kiến thức về kỹ thuật, công nghệ.

Thông qua đề tài nghiên cứu góp phần tạo điều kiện cho sinh viên ngành Sư phạm

Sinh, Công nghệ Sinh học tham gia nghiên cứu, thực hiện chuyên môn yêu thích.

Đối với tổ chức chủ trì và các cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu

- Bổ sung vào bảo tàng giống VSV các chủng xạ khuẩn có khả năng ứng dụng cao

trong thực tiễn của tỉnh An Giang.

- Các chủng xạ khuẩn phân lập được làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu và giảng

dạy trong trường đại học.

3

Đối với kinh tế - xã hội và môi trường

- Các chủng xạ khuẩn phân lập được ứng dụng sản xuất chế phẩm đối kháng có

nguồn gốc từ vi sinh vật có khả năng chống nấm gây bệnh đạo ôn lúa giúp nông dân

có thể giảm bớt chi phí sản xuất, tăng năng suất cây trồng, làm giàu dinh dưỡng cho

đất.

- Có thể giảm bớt lượng chi phí nhập khẩu các loại kháng sinh có giá thành rất cao.

Góp phần phát triển kinh tế cho nông dân, giảm bớt lượng thuốc hóa học ảnh hưởng

sức khỏe con người, làm đất chai sạn và môi trường bị ô nhiễm.

4

CHƢƠNG 2

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1. SƠ LƢỢC VỀ XẠ KHUẨN

2.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố rất

rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại

sinh, có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty). (Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Xạ khuẩn có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ

chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ

thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Trong mỗi g

đất thường có trên 1 triệu xạ khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường

thạch). (Bùi Thị Hà, 2008)

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể

chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,

nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.

Thành tế bào của XK có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có tác dụng duy

trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào và chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide

bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N – axetyl muramic bởi các liên

kết 1,4 – β glucozit, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 – 120 Å, lớp giữa rắn

chắc dày khoảng 50 Å, lớp trong dày khoảng 50 Å. Thành tế bào XK không chứa

cellulose và chitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và

quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào.

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ

yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng

trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK. Tế bào chất của

XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat và

polisacarit. Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc

thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình

thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.

(Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Đa số XK có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có

nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám ... Màu sắc của XK là một đặc

điểm phân loại quan trọng. Đường kính sợi của XK khoảng từ 0,1 – 0,5 μm. Có thể

phân biệt được hai loại sợi khác nhau. Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi

trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc XK, từ đây phát sinh ra bào tử. Sợi cơ chất là

sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh

ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí

sinh. Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng. Một số XK không có sợi khí

sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra

5

khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc

khỏi môi trường (hình 1). (http://voer.edu.vn/m/xa-khuan-actinomycetes)

Hình 1. Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn ( Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Khuẩn lạc XK thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt,

lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc XK thường rắn

chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích

thước bào tử. Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích

thước khuẩn lạc thay đổi tùy loài XK và tùy điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc thường

có dạng phóng xạ, một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng

nhất định. Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn đồng tâm là do XK sinh ra chất ức

chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng

có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra

chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo

thành khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm (hình 2).

Hình 2. Khuẩn lạc xạ khuẩn ( Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh

gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho XK, có nhiều dạng

khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng … (hình 3). Trên mỗi cuống

sinh bào tử mang từ 30 – 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng

cũng có khi chỉ mang 1 – 2 bào tử. Sự hình thành bào tử ở XK có thể xảy ra do sự

kết đoạn hoặc do sự cắt khúc của cuống sinh bào tử. Bào tử XK có nhiều hình dạng

khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với kích thước trung bình

khoảng (0,7 – 0,9 × 0,7 – 1,9) µm. Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy

6

loài, tùy cá thể trong loài thậm chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử. Bề mặt bào tử

XK có thể nhẵn, có gai, khối u, nếp nhăn hay dạng tóc (hình 4). Bào tử XK được

bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400 Å,

gồm có 3 lớp, giúp cho bào tử tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh

như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc

màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau.

(Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Hình 3. Các dạng chuỗi sinh bào tử của xạ khuẩn

(Chuỗi bào tử xạ khuẩn chi Streptomyces: A, B, C, D; chi Nocadiopis: E)

Nguồn: http://voer.edu.vn/m/xa-khuan-actinomycetes

Hình 4. Bào tử của xạ khuẩn

(Dạng nhẵn: A; xù xì: B; gai: C)

Nguồn: http://voer.edu.vn/m/xa-khuan-actinomycetes

2.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit

hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối

nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên, khả năng

hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau. Phần

lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự

sinh trưởng là 25 – 30 0C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường

chỉ nằm trong khoảng 18 – 28 0C. Độ ẩm thích hợp đối với XK dao động trong

khoảng 40 – 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5. XK không có giới tính. (Bùi

Thị Hà, 2008)

C B A

7

XK có khả năng hình thành enzym, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và

các CKS nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các sản phẩm

trong quá trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzym… có thể được tích lũy trong

sinh khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men. Hệ sợi cơ chất có thể tiết

vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố

chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. (Nguyễn Hoàng Minh

Huy, 2006)

2.1.3. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Phân loại theo phương pháp truyền thống: Cũng như đối với vi khuẩn, việc

phân loại XK hiện nay chủ yếu dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S

rRNA. Bên cạnh đó, các đặc điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý,

sinh hóa thường được kết hợp để định danh XK một cách chính xác đến tên

loài.Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào được

coi là đặc điểm quan trọng nhất. Các đặc điểm khác như thành phần đường,

menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GC trong ADN genom cũng

mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân loại XK. Các đặc

điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong phân loại xạ khuẩn là khả

năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng,

khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Bên cạnh đó, các chỉ

tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác

của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau,

tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm

trao đổi chất đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời.

(Nguyễn Lân Dũng, 2012).

Phân loại theo phương pháp hiện đại: Các nhà khoa học trên thế giới đều

cho rằng mức độ tương đồng về trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa

các cá thể VSV. Tất cả các loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách

tổng hợp protein nhờ các riboxom. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự

nucleotit của gen mã hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa

chúng. rRNA là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì: Phân

tử này có mặt trong mọi tế bào VSV. Thực hiện cùng một chức năng là cấu thành

nên riboxom, bộ máy tổng hợp protein của tế bào. Có kích thước vừa phải (1500 bp)

để tiến hành các nghiên cứu phả hệ. Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm

nhất trong lịch sử tiến hóa. Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay

nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến

hoá. Mặc dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hóa cho rRNA cũng chứa những

vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác

nhau. Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà khoa học

đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, bao

gồm cả các vùng biến đổi. So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể

chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi. (Nguyễn Lân Dũng, 2012)

8

2.1.4. Vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm VSV phân bố rộng rãi trong đất, chúng tham gia vào các

quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như cellulose, tinh bột v.v... góp

phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính này còn được ứng

dụng trong quá trình chế biến phân hủy rác v.v... Nhiều XK có khả năng sinh chất

kháng sinh. Đặc điểm này được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất các CKS dùng

trong y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm. (http://voer.edu.vn/m/xa-khuan

actinomycetes)

Xạ khuẩn có vai trò chống nấm gây hại cây trồng: Từ lâu các nhà khoa học

đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng XK có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật.

Theo Kamada (1974), khi điều tra VSV đối kháng trong đất ở Nhật Bản cho thấy nơi

nào có nhiều XK thì ở đó các loài Fusarium biến mất nhanh. Thông thường một loài

xạ khuẩn đối kháng (XKĐK) có thể ức chế nhiều loài nấm gây bệnh và được sử

dụng như tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng

các chủng có hoạt phổ rộng phải chú ý tránh XK ức chế luôn cả khu hệ sinh vật có

lợi trong vùng rễ. Không phải tất cả XK có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện

trong đất (khoảng 4% – 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế

nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là quy luật cân bằng

sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi

trong đất có mầm gây bệnh.

Xạ khuẩn ngoài việc chống nấm bằng cách tiết chất đối kháng còn sinh

enzym tác động lên hệ VSV như enzym chitinase tác động lên thành tế bào nấm

mốc, các enzym phân giải hợp chất hữu cơ khó tan như cellulase giúp phân giải

cellulose tạo thành phân bón hữu cơ cho cây trồng. Dùng để sản xuất nhiều enzym

như protease, amylase, cellulase, chitinase… một số axit amin và axit hữu cơ.

Ngoài ra, nhiều loài XK còn sinh ra các chất kích thích sinh trưởng đối với thực vật

cũng như các loài VSV có lợi cho đất.

Một số chủng XK vừa kháng được các nấm gây bệnh vừa giết được tuyến

trùng hại cây trồng. XK còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều

hợp chất trong đất, nước. Một số XK có thể gây bệnh cho người, động vật.

(Lương Đức Phẩm, 2011)

2.2. BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA

2.2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa

Bệnh đạo ôn (cháy lá) có thể phát sinh ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng

của lúa và có thể gây hại ở cổ lá, lá, lóng thân, cổ bông, gié và hạt.

- Trên lá: Bệnh gây hại chủ yếu giai đoạn mạ – đẻ nhánh. Lúc đầu vết bệnh chỉ là

những chấm nhỏ, màu xanh xám, sau lớn lên có dạng hình thoi (mắt én) đặc trưng,

viền nâu, tâm màu xám trắng. Trên các giống nhiễm đốm bệnh rất to, ngược lại

giống kháng thì vết bệnh chỉ cở bằng đầu kim. Bệnh nặng, các vết bệnh liên kết lại

làm lá bị cháy khô.

9

- Trên cổ lá, thân và cổ bông: triệu chứng ban đầu cũng có màu xám xanh sau

chuyển sang nâu, do nấm tấn công vào mạch dẫn gây cản trở việc vận chuyển các

chất dinh dưởng nuôi lá, thân và hạt làm cho lá, thân dễ gãy, hạt bị lép, lửng.

- Trên hạt: bệnh xảy ra vào giai đoạn trổ, vết bệnh trên hạt cũng có dạng mắt én,

viền nâu, tâm xám trắng. Nếu bệnh tấn công sớm sẽ làm hạt bị lép, lửng. Nếu ẩm độ

không khí cao, chỗ vết bệnh sẽ mọc một lớp nấm mốc màu xám xanh, dễ bị gãy, làm

ruộng lúa trở nên xơ xác (hình 5). Lúa sẽ bị cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh

sớm ở giai đoạn đẻ nhánh, nhất là khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi cho bệnh và

bón phân không hợp lý. (Nguyễn Phú Dũng, 2005)

Vết bệnh mới và sau trên lá; Bệnh hại trên đốt thân, cổ bông; Ruộng lúa bệnh nặng

Hình 5. Dấu hiệu bệnh đạo ôn ở lúa

Nguồn: http://www.thaibinhseed.com.vn/cach-phong-tri-benh-dao-on-hai-lua

Ở Nhật Bản, từ năm 1953 – 1960, thất thu sản lượng lúa do bệnh cháy lá

hằng năm trung bình là 2,98%. Riêng trong năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá

chiếm 24,8% trong tổng thiệt hại. Đối với bệnh thối cổ gié, nếu vượt 10% gié bị

nhiễm bệnh sẽ thất thu năng suất 6% và 5% hạt sẽ có phẩm chất kém.. Theo ước

tính của FAO thiệt hại do bệnh này gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ

0,7% – 17,5%, những nơi thiệt hại nặng có thể làm giảm đến 80% (hình 6).

Hình 6. Vùng bị thiệt hại năng suất lúa do nhiễm đạo ôn (Chấm đỏ cho thấy

các quốc gia hoặc khu vực nơi bệnh đạo ôn đã được báo cáo)

Nguồn: internet

10

Ở Việt Nam, theo thống kê của viện Bảo vệ thực vật trên toàn quốc thiệt hại

do nấm bệnh đạo ôn gây ra đối với cây lúa hàng năm mất khoảng 10% – 25%. Ở các

tính phía Nam, diện tích nhiễm đạo ôn trên lá là 16.773 hecta, trong đó diện tích

nhiễm nặng là 10 hecta. Bệnh đạo ôn hại cổ bông nhiễm 5.847 hecta (Bộ NN và

PTNT, 2014).

2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa

Tác nhân gây hại là nấm Pyricularia oryzae thuộc họ Moniliales, lớp nấm

Bất Toàn. Abe (1911) và Kinishi (1933) cho rằng nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp

ở nhiệt độ 25 – 28 0C và ẩm độ không khí là 93% trở lên. Bào tử của nấm rất nhỏ, có

thể phát tán và bay cao đến 24 m, thậm chí đến 10.000 m dễ lây lan cho các ruộng

lân cận trong khu vực. Nấm phát triển tốt trong điều kiện mát từ 24 – 28 0C, ẩm độ

cao >80%, biên độ nhiệt giữa ngày và đêm cao sẽ dễ phát sinh thành dịch. Bào tử

nấm nảy mầm khi gặp lớp nước tự do trên lá hay không khí bão hòa nước, ở 24 0C

bào tử cần 6 giờ, vượt quá 28 0C bào tử phát triển kém. Bào tử xâm nhập vào tế bào

lá bằng cách mọc thành đĩa áp, chọc thủng vách tế bào lá lúa. Ngoài ra, bào tử còn

tiết ra độc tố pyricularin gây độc cho cây. Cây lúa là ký chủ chính, bệnh có thể lưu

tồn trên các cây ký chủ phụ mọc quanh ruộng như các loài cỏ lồng vực, đuôi phụng,

cỏ chỉ, lúa ma, lúa chét. (Lương Đức Phẩm, 2011)

Quan sát trên kính hiển vi cho thấy cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào,

đầu cành thon và hơi gấp khúc. Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc.

Bào tử có hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 ngăn ngang, bào tử

không màu (hình 7).

2.2.3. Cơ chế phát sinh và phát triển bệnh đạo ôn trên lúa

2.2.3.1. Cơ chế xâm nhiễm của nấm Pyricularia oryzae

Trên bề mặt vết bệnh, bào tử được tạo ra ở ẩm độ không khí từ 93% trở lên.

Ẩm độ càng cao tốc độ sinh trưởng càng nhanh. Bào tử nảy mầm khi có lớp nước tự

do hay ẩm độ không khí bão hòa. Trên bề mặt nước, 80% lượng bào tử có thể nảy

mầm được và sau 24 giờ có khả năng sinh sản. Theo kết quả nhóm giải mã gen nấm

gây bệnh đạo ôn do Ralph Dean thuộc Đại học Bắc Carolina (Mỹ) đứng đầu xác

Hình 7. Cành sinh bào tử và bào tử nấm Pyricularia oryzae

Nguồn: http://www.hoptri.com/vi/quy-trinh-giai-phap/item/

11

định Pyricularia oryzae có hơn 11.000 gen và tiết ra gần 800 protein để xâm nhập

và lây nhiễm sang lúa. Nấm sử dụng một loại thụ thể mới để phân biệt lúa với các

thực vật khác. Những thụ thể này nằm trên bào tử của nấm.

Trên bề mặt lá, bào tử nảy mầm xâm nhiễm trực tiếp qua lớp cutin và biểu bì

qua sự tạo trực tiếp đĩa bám và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm có thể xâm nhiễm trực

tiếp qua khí khổng. Vòi xâm nhiễm phát triển từ đĩa bám sau khi xâm nhập vào tế

bào sẽ tạo thành một túi và từ đó khuẩn ty lan vào các tế bào cây (hình 8).

Trong cây bệnh hay trong môi trường nuôi cấy, người ta trích được hai loại

độc tố: α – picolinic axit (C6H5NO2) và một chất khác được gọi tên là piricularin

(C18H14N2O3). Nếu bôi piricularin lên một vết thương cơ học trên lá lúa, sẽ tạo một

đốm cháy giống như vết bệnh cháy lá. Piricularin còn làm cây bệnh và tập trung

coumarin làm cây lúa không phát triển. Piricularin bị chlorogenic axit và ferulic axit

làm mất độc tính. Ngoài ra, nấm còn tạo ra hai loại độc tố khác là pyriculol và

tenuazonic axit. (Nguyễn Phú Dũng, 2005)

2.2.3.2. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh

Sự phát sinh và phát triển của bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố ngoại cảnh và

mức độ nhiễm bệnh của giống.

Ảnh hưởng của thời tiết, khí hậu: Bệnh này thường phát triển mạnh trong

điều kiện khí hậu mát mẻ, ẩm độ cao, mưa nhỏ kéo dài, đêm sương mù nhiều. Đặc

biệt trong vụ lúa Đông Xuân tại vùng ĐBSCL vào tháng giêng – tháng hai dương

lịch, bệnh này sẽ gây hại trên diện rộng trùng vào lúc lúa đứng cái đến trổ. Các vùng

Hình 8. Chu kỳ phát triển của nấm đạo ôn

Nguồn: Nấm Pyricularia oryzae truy cập từ http://blog.zing.vn/

12

thường xuyên bị bệnh cháy lá hằng năm như Tiền Giang, An Giang, Đồng Tháp và

Sóc Trăng. Tuy nhiên, điều kiện khô hạn làm cây lúa thiếu nước, quá trình trao đổi

chất kém, khả năng hấp thu dinh dưỡng yếu, cây lúa không chống chọi được bệnh. Ở

những vùng cao nguyên, điều kiện khô hạn thiếu nước kết hợp với đêm sương mù

nhiều, biên độ nhiệt lớn sẽ làm cho bệnh này càng dễ phát sinh mạnh.

Ảnh hưởng của đất: những ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nước,

những vùng đất kém màu mỡ, đất nhẹ, giữ nước kém và những ruộng lúa có lớp đất

sét nông rất phù hợp cho bệnh đạo ôn phát triển và gây hại.

Ảnh hưởng của phân bón: Ba loại phân N-P-K đều có ảnh hưởng rất lớn đến

việc phát sinh bệnh nếu bón không cân đối. Thông thường, bón dư thừa phân đạm sẽ

làm tăng bệnh, dư phân lân không thấy rõ ảnh hưởng lên bệnh. Tuy nhiên, nếu bón

thêm phân lân trên vùng đất phèn sẽ hạn chế bệnh cháy lá rất rõ ràng. Phân kali có

ảnh hưởng rất phức tạp trên sự phát triển của bệnh cháy lá; bón dư thừa đạm và kali

đều làm tăng bệnh; bón đạm vừa phải kết hợp đủ lượng kali thì sẽ giảm bệnh rất rõ.

Do đó, trong giai đoạn sau trổ nếu ruộng bị nhiễm bệnh cháy lá họặc thối cổ bông

thì không được bón thêm phân bón lá có nitrat kali.

Mật độ gieo sạ cũng có liên quan đến khả năng phát triển của bệnh cháy lá.

Gieo sạ càng dày, tán lá lúa càng nhiều, khả năng che khuất càng lớn, ẩm độ dưới

tán lá càng cao, điều kiện khí hậu càng thuận lợi cho nấm cháy lá phát triển.

Ảnh hưởng của giống lúa: ngoài các yếu tố nêu trên thì đặc tính của giống

cũng có ảnh hưởng tới mức độ phát triển của bệnh. Những giống nhiễm bệnh nặng

(giống mẫn cảm) sẽ tạo điều kiện cho bệnh gây hại và lây lan trên diện rộng.

(Hà Huy Niên, 2007)

2.2.4. Biện pháp phòng trị bệnh đạo ôn trên lúa

Hiện nay, biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến trong việc phòng trừ bệnh

đạo ôn vì cho hiệu quả nhanh, dễ sử dụng. Tuy nhiên, nếu sử dụng không đúng,

không hợp lý, sử dụng lâu dài sẽ gây ảnh hưởng xấu tới môi trường, tăng khả năng

hình thành tính kháng thuốc của sâu bệnh, tiêu diệt thiên địch, phá vỡ cân bằng sinh

thái, gây nhiều dịch hại mới. Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp IPM (Integrated

Pest Management) được xem là biện pháp chính trong kiểm soát dịch hại. Chọn

giống tốt, kháng bệnh khử lẫn tạp hạt cỏ trước khi gieo. Dùng biện pháp sạ

hàng, bón phân cân đối N-P-K, không bón thừa phân đạm, nên bón phân đạm theo

theo nhu cầu cây lúa. Sau mùa thu hoạch, cày vùi rơm rạ để trả lại nguồn hữu cơ cho

đất đồng thời diệt được mầm bệnh, hạn chế đốt rơm vì biện pháp này chỉ trả lại một

số chất khoáng có trong tro, đất dần dần kém màu mỡ, mau suy kiệt. Vệ sinh đồng

ruộng bằng cách thu gom, tiêu diệt lúa rày, cỏ dại mọc ven bờ là nơi lưu tồn và lây

lan mầm bệnh sau này. Giữ mực nước đầy đủ thường xuyên trên mặt ruộng tùy theo

nhu cầu nước theo từng giai đoạn của cây lúa, tránh để ruộng khô nước khi bệnh

cháy lá xảy ra. Cần thăm đồng thường xuyên, phát hiện kịp thời khi bệnh mới xuất

hiện. (Nguyễn Văn Đĩnh, 2004)

13

2.3. KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA CỦA

XẠ KHUẨN

2.3.1. Sự hình thành khả năng đối kháng của xạ khuẩn

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng

chống bệnh cây. Các nghiên cứu cho thấy cơ chế cơ bản và quan trọng nhất của sự

đối kháng bởi VSV đối với mầm bệnh là do sản sinh ra các chất kháng sinh (CKS)

(Gnanamanickam và Mew, 1989). Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm

giảm rõ rệt tỉ lệ bị bệnh của cây. Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ

khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh. Trong số 8000 CKS hiện nay thì trên

thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ XK, chủ yếu là từ các chủng thuộc chi

Streptomyces. Đa số chất kháng sinh từ XK đều có phổ kháng sinh rộng, kềm hãm

hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài VSV khác nhau. Một loại

XKĐK có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động

rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất. (Lê Gia Hy, 2010)

Ngoài việc sinh các CKS dùng trong y học thì XK còn sinh ra các chất đối

kháng VSV gây bệnh hại cây trồng (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm đạo ôn,

nấm thối cổ rễ…). Đã có nhiều tác giả nghiên cứu ứng dụng XK vào việc phòng trừ

bệnh trên cây trồng như: Nguyễn Đình Hải, 2012; Trịnh Thới An, 2014; Kiều Hữu

Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 2005…

Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất có tính chống lại các VSV hại,

chúng có hoạt tính sinh lý cao có tác động chọn lọc và được các VSV tiết ra đưa vào

môi trường sống trong mối quan hệ đối kháng với các sinh vật khác, trong đó vi

khuẩn, nấm, xạ khuẩn là những VSV sinh ra nhiều chất kháng sinh nhất (Lương Đức

Phẩm, 2011). CKS có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số VSV khác

một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp, có thể can thiệp vào hoạt động sinh

lý của một chất khác bằng cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kềm hãm hoặc ức chế

sự phát triển của VSV khác. (http://dictionary.reference.com/browse/antagonist).

Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: CKS được

tổng hợp từ một, hai, ba chất trao đổi bậc một khác nhau, hay bằng cách polyme hóa

các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

để tạo thành các dạng kháng sinh khác nhau. CKS còn là chất tham gia cạnh tranh

của XK trong môi trường sống tự nhiên. Nhiều chủng XK có khả năng tổng hợp

đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá

trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu

trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền

chất, enzym và cofactor. (Bùi Thị Việt Hà, 2006)

2.3.2. Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối kháng nấm gây bệnh gây trồng

Kasumin (Kasugamycin) C14H28ClN3O10: là một kháng sinh aminoglycoside

được phân lập lần đầu vào năm 1965, từ Streptomyces kasugaensis, một chủng

Streptomyces tìm thấy gần ngôi đền Kasuga ở Nara, Nhật Bản. Kasugamycin được

phát hiện bởi Hamao Umezawa. Kasugamycin được biết đến như một loại thuốc có

14

thể ngăn chặn sự phát triển của nấm đạo ôn. Nó ngăn chặn những sự tổng hợp

protein và kết khối lại của aminoacyl – RNA hòa tan tới riboxom trong sợi nấm

(hình 9). Giống như rất nhiều các loại thuốc kháng sinh tự nhiên được biết,

Kasugamycin ức chế sự tăng sinh của nấm bằng cách ức chế tổng hợp protein ở

bước khởi đầu của dịch mã, quá trình ức chế được cho là xảy ra bởi sự cạnh tranh

trực tiếp với sự chuyển khởi RNA. (http://en.wikipedia.org/wiki/Kasugamycin)

Theo Vũ Triệu Mân năm 1998, thuốc ở dạng tinh chế, tan trong nước.

Thuốc được sản xuất thành dạng dung dịch 2%, dạng bột thấm nước 2% và 5%,

dạng hạt 2% và dạng hỗn hợp có tên là Kasuran 50WP (5% Kasumin + 75,6%

CuOCl = 45% Cu) pha nước ở nồng độ 0,1% để phòng trừ bệnh phấn trắng, bệnh

thối dưa chuột, dưa hấu, một số bệnh vi khuẩn và nấm hại chè, cam, chanh, cà chua,

khoai tây; Kasurabcide (1,2% kasumin + 20% Fthalide) dạng bột thấm nước dùng

1,5 kg/ha trừ đạo ôn, đốm sọc, vi khuẩn hại lúa. (Nguyễn Hoàng Minh Huy, 2006)

Streptomyces griseoviridis chủng 61 được sử dụng phòng trừ những bệnh

gây ra bởi Pythium, Fusarium, nấm mạng nhện Botrytis. Khi phun, những bào tử đã

sấy và thể sợi Streptomyces nảy mầm và bắt đầu để bám chắc vào và vòng quanh rễ

cây, chúng cạnh tranh với nấm hại cây trồng về không gian sống và thức ăn bằng

việc tranh lấy vùng sống quanh rễ cây nhưng chúng không gây hại cho cây.

(www.sodohydro.com/)

Validamycin (C20H35NO13): đã được mô tả vào năm 1970 bởi tác giả Nhật

Bản (Iwasa et al., 1970) là một chất chuyển hóa thứ cấp của Streptomyces sp chủng

số T-7545, được tìm thấy trong một mẫu đất thu thập được từ các thành phố của

Nhật Bản Akashi, Hyogo Prefecture. Xạ khuẩn này đã được xác định là

Streptomyces hygroscopicus var. Limoneus.Validamycin được dùng để trừ nấm

Rhizoctonia solani (hình 10) gây bệnh khô vằn hại lúa. (http://www.toxicology.cz/)

B A

Hình 9. Cơ chế đối kháng nấm (A) và cấu trúc (B) của Kasugamycin

Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Kasugamycin

15

2.3.3. Tình hình nghiên cứu chất đối kháng từ xạ khuẩn

Người đầu tiên đặt nền móng cho hoạt tính đối kháng của VSV là Alexander

Fleming - nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penicilin vào tháng 10 năm

1928. Năm 1945, A. Fleming, E. Chain và H. W. Florey đã được nhận giải thưởng

Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicilin mở ra kỉ nguyên mới trong y học

- kỉ nguyên kháng sinh. Cho đến ngày nay, trên thế giới và Việt Nam đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng của VSV trong đó xạ khuẩn là đối

tượng được nghiên cứu rất nhiều và đã đạt được một số thành tựu nhất định.

Năm 1999, kháng sinh lospomal HA – 92 ra đời, được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces CDRLL-312 tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối với

các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây

bệnh mạnh.

Ở Trung Quốc, ngay từ những năm 1930, đã sử dụng xạ khuẩn và các chất

trao đổi của chúng để nghiên cứu hạn chế các bệnh thực vật. Từ năm 1950, đã chọn

được chủng 5406 trong 400 chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất vùng rễ cây bông

và cỏ linh lăng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillicum alboatrum gây bệnh thối

rễ cây bông non và ứng dụng trong phòng bệnh cho 6 triệu ha bông. Cho đến năm

B A

Hình 10. Cơ chế tác động (A) và cấu trúc (B) của Validamycin lên

Rhizoctonia solani

Nguồn: http://www.vipesco.com.vn/kythuatchitiet.php?Id=72

16

1991, chất kháng sinh “120” từ chủng Streptomyces hygroscopycus var.

bejinggernsis phòng, chống cho 330 triệu ha cây trồng và chỉ số bệnh giảm 50% –

98,9% tùy theo từng loại bệnh.

Ở Nhật Bản, việc sử dụng xạ khuẩn sinh kháng sinh trong bảo vệ thực vật đã

được biết đến từ lâu như Blastisidin S sản xuất từ S. griserochromogenes,

Kausugamixin từ S. kasuganensis, Validamycin từ S. hygrocopycus chống bệnh khô

vằn rất có hiệu quả. Năm 2003, yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. Kháng sinh này có khả

năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất này

còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml.

Ở Liên Xô, Levorin và Trichotexin trừ nấm Vertillum dehliae gây bệnh héo

rũ bông có hiệu quả cao. Ở Bungari, những chủng xạ khuẩn chống nấm thường

thuộc nhóm màu xám và các loài S. griseus, S. albus, S. candidus…

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. 201

có khả năng sinh kháng sinh mới là z-methylheptyl iso-nicotinate có khả năng kháng

được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F. solani.

Tại Hàn Quốc (2007) phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp. C684

sinh kháng sinh laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng

methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin.

Ở Việt Nam, Đỗ Thu Hà (2004), nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống

nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẳng đã phân lập được 2 chủng xạ khuẩn là

Streptomyces nashvillensis QN-23 và Streptomyces globosus QN-24 có khả năng

kháng các loại nấm kiểm định là A. niger, P. oryzae, F. oxysporum.

Bùi Thị Việt Hà (2006) nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm gây

bệnh thực vật ở Việt Nam, đã ứng dụng phân loại xạ khuẩn đến mức phân tử để xác

định được các chủng xạ khuẩn là Streptomyces antimycoticus chống nấm Sclerotium

rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua, Streptomyces diastatochromogenes có hiệu

quả tốt trong phòng chống bệnh lở cổ rễ và thối bắp do Rhizoctonia solani gây ra

trên bắp cải, Streptomyces hygroscopicus có hiệu quả tốt đối với việc phòng chống

bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani) ở lúa với hiệu lực gần xấp xỉ validacin.

Bùi Thị Hà (2008). Từ các mẫu đất khác nhau đã phân lập và thuần khiết

được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt

tính kháng nấm gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. Đã

tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có

hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT – 2E và

CT – 5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định.

Lê Thu Hiền và cs (2012), phân lập và tuyển chọn được 10 dòng vi khuẩn và

xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo

vàng cà chua, dưa chuột. Hiệu quả ức chế nấm trong phòng thí nghiệm đạt 85% –

86%, hiệu quả ức chế bệnh héo vàng cà chua, dưa chuột trong nhà lưới đạt 65% –

67%.

17

Nguyễn Đình Hải (2012), nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12-

Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân

thiện với môi trường. Kết quả nghiên cứu cho thấy tác động của chủng xạ khuẩn

nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp

quan trọng (cây đậu xanh) cho thấy chủng xạ khuẩn không gây hại cho các sinh vật

trong môi trường sống.

Trịnh Thới An (2014), đã phân lập được 30 chủng xạ khuẩn từ đất trồng rau

màu tại xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An, trong đó có 1 chủng sinh

chất kháng nấm Pythium sp. gây hại trên rau màu mạnh.

Lê Minh Tường và Ngô Thị Kim Ngân (2014), đã tiến hành phân lập và đánh

giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Rhizoctonia solani gây

bệnh đốm vằn trên lúa. Kết quả nghiên cứu này đã phân lập được 216 chủng xạ

khuẩn, trong đó có hai chủng xạ khuẩn là có khả năng ức chế mạnh và ổn định đối

với sự phát triển của khuẩn ty nấm R.solani gây bệnh đốm vằn trong điều kiện

phòng thí nghiệm.

Lê Minh Tường và Trần Thị Thu Em (2014), đã phân lập được 26 chủng xạ

khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa ở ĐBSCL, trong đó có 3

chủng có khả năng đối kháng mạnh với nấm bệnh khi nghiên cứu trong phòng thí

nghiệm.

Cho đến thời điểm hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào lĩnh vực

xạ khuẩn đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa trong nhà lưới và ngoài đồng

ruộng.

18

CHƢƠNG 3

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. VẬT LIỆU

3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa được phân lập từ các

mẫu đất ruộng tại xã Vĩnh Khánh, xã Vĩnh Trạch, xã Định Thành, xã Định Mỹ, xã

Vĩnh Phú, xã Vĩnh Chánh thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang.

Hoá chất

Hóa chất dùng trong các thí nghiệm: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3,

NaCl, FeSO4.7H2O, MnCl2, Na2CO3, ZnSO4, agar, tinh bột tan, CMC (Carboxyl

Methyl Cellulose), chitin, glucose, …

Thiết bị và dụng cụ

- Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan), tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ

sấy Memmert (Đức), tủ ấm Binder (Đức), kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản),

tủ lạnh Hitachi (Tokyo, Nhật Bản), máy đo pH Hana (Nhật), máy li tâm Heraeus

(Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus

(Trung Quốc), máy nghiền mẫu (Đức).

- Các dụng cụ thí nghiệm: thước đo khuẩn lạc, lò điện, bình tam giác, ống nghiệm,

đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy báo cũ,

lame, lammel, bông mỡ, bông thấm nước, …

3.1.2. Nguyên liệu

Các mẫu đất được lấy ở các độ sâu 5 - 10 cm tại các ruộng lúa.

Chủng nấm kiểm định Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa nhận từ phòng thí

nghiệm Vi sinh - Trường Đại học An Giang.

Lúa giống Jasmine 85 (cấp giống nguyên chủng) do công ty Bảo Vệ Thực Vật An

Giang sản xuất.

Thuốc trừ đạo ôn lúa: Kasumin 2L.

Phân bón: Ure 46%, Super lân 16%, Kali 60%.

Chậu trồng, đất trồng và các vật liệu khác.

Sử dụng môi trường ISP 4 (International Streptomyces Project 4) để phân lập xạ

khuẩn, môi trường Gause 1 nuôi cấy xạ khuẩn xác định hoạt tính đối kháng, môi

trường Gause 2 (dịch thể) nuôi cấy xạ khuẩn xác định hoạt tính enzym, môi trường

PDA (Potato Dextrose Agar) dùng để nuôi cấy nấm Pyricularia oryzae, môi trường

thân lúa để thu bào tử nấm Pyricularia oryzae, và các môi trường thử hoạt tính

enzym của xạ khuẩn.

- Môi trường ISP 4 có thành phần (g/L)

- Tinh bột tan : 10 g

- KH2PO4 : 1,0 g

19

- MgSO4.7H2O : 1,0 g

- NaCl : 1,0 g

- (NH4)2SO4 : 1,0 g

- CaCO3 : 1,0 g

- Agar : 15 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH 7,0 – 7,2. Khử trùng 1atm trong 30 phút.

- Môi trường Gause 1 nuôi cấy xạ khuẩn có thành phần (g/L)

- Tinh bột tan : 20 g

- NaCl : 0,5 g

- KH2PO4 : 0,5 g

- MgSO4.7H2O : 0,5 g

- FeSO4 : 0,01 g

- KNO3 : 1,0 g

- Agar : 20 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH 7,0 - 7,2. Khử trùng 1atm trong 30 phút.

- Môi trường Gause 2 (dịch thể) có thành phần (g/L)

- Cao thịt bò : 5g

- Pepton : 5 g

- NaCl : 5 g

- Glucose : 10 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH 7 - 7,2. Khử trùng 1atm trong 30 phút.

- Môi trường khoai tây PDA nuôi cấy nấm Pyricularia oryzae có thành phần

- Khoai tây : 200 g

- Dextrose : 20 g

- Agar : 20 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH 6,7-6,8. Khử trùng 1atm trong 30 phút.

Cách làm: khoai tây cắt hạt lựu nấu với nước cất sau đó lọc lấy dịch trong; bổ sung

nước cho đủ 1000 mL.

20

- Môi trường thân lúa (Nguyễn Thị Thanh Xuân, 2003)

- Thân lúa : 300 g

- Glucose : 5 g

- Agar : 20 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH 6,5. Khử trùng 1atm trong 30 phút.

Thân lúa được cách thành từng khúc dài khoảng 4 cm, thêm nước vào vừa

ngập thân lúa, nấu trong nồi áp suất ở nhiệt độ 105 0C trong 20 phút, lược lấy nước.

- Môi trƣờng thử hoạt tính enzym bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch

- Môi trường thử hoạt tính chitinase (Lê Duy Linh, 1997)

- NaNO3 : 3,5 g

- K2HPO4 : 1,5 g

- MgSO4.7H2O : 0,5 g

- KCl : 0,5 g

- FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết)

- Bột chitin : 10 g

- Agar : 20 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm trong 30 phút.

* Cách chiết chitin từ vỏ, đầu tôm

Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô.

Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70 0C – 75

0C/ 4 giờ, sau đó rửa

sạch bằng nước cất.

Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26 0C – 30

0C/ 16 giờ, rửa sạch.

Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.

- Môi trường thử hoạt tính cellulase (Trần Thanh Thủy, 1999)

- NaNO3 : 3,5 g

- K2HPO4 : 1,5 g

- MgSO4.7H2O : 0,5 g

- KCl : 0,5 g

- FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết)

- CMC : 10 g

21

- Agar : 20 g

- Nước cất : 1000 mL

- pH = 6,5. Khử trùng 1 atm trong 30 phút.

3.1.3. Thời gian và địa điểm

- Thời gian: Từ tháng 06/2014 đến tháng 06/2015.

- Địa điểm: Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh và khu

nhà lưới – trại thực nghiệm - Khu thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học An Giang.

3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu đất

- Chọn điểm thu mẫu đất: tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang chọn 06 xã: Vĩnh

Khánh, Vĩnh Trạch, Định Thành, Định Mỹ, Vĩnh Phú, Vĩnh Chánh (hình 11). Mỗi

xã chọn 03 ruộng lúa, mỗi ruộng thu 03 mẫu đất ở ba vị trí khác nhau để đại diện

cho toàn mẫu ruộng. Vị trí thứ nhất là đất dưới ruộng, vị trí thứ hai là đất ẩm nơi tiếp

giáp giữa mặt ruộng và bờ đê, vị trí thứ ba là đất khô trên bờ đê.

- Cách lấy mẫu: Dùng dao lấy khoảng 10 – 50 g đất cách bề mặt từ 5 – 10 cm ở ba

vị trí trên, để vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín lại. Ngoài túi dán nhãn ghi rõ

ngày, nơi lấy mẫu.

- Mẫu đất được mang về phòng thí nghiệm, tiến hành phơi khô mẫu trong điều kiện

tự nhiên. Sau đó, nhặt bỏ rác, đá, các xác hữu cơ và đem mẫu nghiền trong cối thủy

tinh rồi tiến hành sàng qua rây có đường kính 2 mm. Mẫu đất nghiền xong được

đựng trong các túi nilon kín và bảo quản trong tủ lạnh 4 0C.

Hình 11. Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

Nguồn: internet

22

3.2.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

- Cân 10 g đất cho vào bình tam giác 250 mL chứa 90 mL nước cất vô trùng, lắc

trên máy lắc 30 phút.

- Dùng pipet vô trùng hút 1 mL dịch đất sang ống nghiệm có chứa 9 mL nước vô

trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2

, 10-3

...10-6

.

- Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3

đến 10-6

, nhỏ 0,1 mL sang đĩa

petri chứa môi trường ISP 4. Dùng que trang chang đều, đậy đĩa petri, gói lại rồi lật

sấp và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30 0C trong 7 ngày. Tiến hành quan sát và phân

biệt khuẩn lạc xạ khuẩn với các loại vi sinh vật khác.

- Từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường

thạch nghiêng ISP 4, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 7 ngày. Bảo quản trong tủ

lạnh 4 0C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm Pyricularia oryzae của xạ

khuẩn

Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng của XK thể hiện thông qua kích thước vòng đối

kháng (vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc). Chất đối kháng do XK tiết ra sẽ

ức chế sự phát triển của nấm đạo ôn, làm đạo ôn không phát triển được tạo thành

vòng đối kháng.

Phương pháp thỏi thạch

Mục đích: Tuyển chọn sơ bộ các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm

Pyricularia oryzae mạnh nhất từ các chủng phân lập được.

Cách tiến hành

- Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 trong đĩa petri 7 ngày.

- Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch chứa xạ khuẩn đặt vào đĩa petri chứa

môi trường PDA. Sau đó cấy chấm điểm nấm P. oryzae vào 2 phía đối diện thỏi

thạch.

- Để vào tủ lạnh 4 – 5 giờ cho hoạt chất đối kháng từ thỏi thạch khuếch tán vào môi

trường. Để vào tủ ấm, nuôi ở 28 – 30 0C, đọc kết quả sau 3 ngày.

Tính kết quả

- Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn được xác định dựa vào kích thước vòng đối

kháng (D - d, mm). D là đường kính vòng đối kháng và d là đường kính thỏi thạch.

- Kết quả là giá trị trung bình của 4 lần lặp lại và thí nghiêm lặp lại 2 lần.

Phương pháp khoan lỗ thạch

Mục đích: Xác định hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn trong môi trường dịch thể.

Cách tiến hành

- Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể Gause 1 không bổ sung agar để thu

dịch nuôi xạ khuẩn.

23

- Từ ống thạch nghiêng, giống được cấy truyền sang các bình tam giác dung tích 250

mL chứa 100 mL môi trường Gause 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong 48

giờ ở nhiệt độ phòng.

- Giống phát triển được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang bình tam giác dung tích 250

mL chứa 80 mL môi trường Gause 1 dịch thể. Quá trình lên men kéo dài 7 ngày ở

nhiệt độ phòng trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau đó xác định hoạt tính đối kháng

nấm của dịch nuôi xạ khuẩn.

- Sử dụng khoan nút chai vô trùng, khoan lỗ trên đĩa môi trường PDA. Dùng que cấy

vô trùng, cấy chấm điểm nấm Pyricularia oryzae được nuôi 3 ngày trên môi trường

PDA (đặc) vào 2 phía đối diện của lỗ thạch. Sau đó hút 0,1 mL dịch nuôi cấy xạ

khuẩn nhỏ vào lỗ thạch mới khoan. Để ở nhiệt độ phòng, sau 3 ngày tiến hành kiểm

tra kết quả dựa vào kích thước vòng đối kháng (D – d, mm), D là đường kính vòng

đối kháng và d là đường kính lỗ thạch. Kết quả là giá trị trung bình của 4 lần lặp lại

và thí nghiệm bố trí lặp lại 2 lần.

3.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzym của xạ khuẩn bằng cách đo đường

kính vòng thủy phân

Nguyên tắc

Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục

môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của phần môi trường trong

suốt phản ánh hoạt động của enzym.

Cách tiến hành

- Thu dịch enzym thô từ môi trường lỏng: Xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi

trường Gause 2 dịch thể, ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong

thu được enzym thô.

- Chuẩn bị môi trường thử hoạt tính hai loại enzym cellulase và chitinase. Dùng

khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên các đĩa petri.

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 mL dịch enzym vào các lỗ khoan. Nhỏ 0,1 mL nước

cất làm đối chứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 4 0C trong 1 – 2 giờ, sau đó chuyển

sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ. Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt

thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc.

Kiểm tra kết quả

- Sau khi nhuộm màu lugol, nếu xạ khuẩn có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong

suốt quanh lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải, vùng cellulose chưa

bị phân giải có màu tím hồng nhạt. Nếu xạ khuẩn có hoạt tính chitinase, vùng chitin

bị phân giải trở nên trong suốt, vùng chưa phân giải có màu nâu đỏ đậm.

- Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D – d (mm). D là đường kính vòng

phân giải, d là đường kính lỗ thạch.

- Kết quả là giá trị trung bình của 4 lần lặp lại và thí nghiệm bố trí lặp lại 2 lần.

24

3.2.5. Phƣơng pháp quan sát đặc điểm hình thái và định danh xạ khuẩn

Tiến hành nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn được tuyển chọn trên môi trường

Gause 1, quan sát các đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. Sau đó, gởi 2 chủng xạ

khuẩn định danh đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử tại phòng thí nghiệm

sinh học phân tử - Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại

học Cần Thơ.

- Quan sát đại thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 ở nhiệt

độ phòng, sau 7 ngày lấy ra quan sát các đặc điểm: Kích thước khuẩn lạc để biết tốc

độ phát triển, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, mép khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc

mặt phải, mặt trái, màu sắc của môi trường do sắc tố xạ khuẩn tạo ra.

- Quan sát vi thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 có đặt

lamel nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy

lamel ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử, bào tử dưới kính hiển vi.

3.2.6. Thử nghiệm khả năng đối kháng nấm P. oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa

từ dịch nuôi xạ khuẩn

Thí nghiệm 1 : Xác định hoạt tính đối kháng của dịch nuôi xạ khuẩn ở các nồng

độ khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Xác định được nồng độ dịch nuôi xạ khuẩn có hoạt tính đối

kháng nấm mạnh nhất để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

Chuẩn bị thí nghiệm: Nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn đã được tuyển chọn trong môi

trường Gause 1 dịch thể theo phương pháp như mục 3.2.3. Thu dịch nuôi cấy xạ

khuẩn, pha loãng đến các nồng độ 30%, 50%, 80%, 100%. Đối chứng (ĐC) sử dụng

nước cất.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4

lần lập lại và thí nghiệm được bố trí 2 lần:

(1) Nghiệm thức 1: cấy nấm P. oryzae, nước cất. (ĐC)

(2) Nghiệm thức 2: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 30%.

(3) Nghiệm thức 3: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 50%.

(4) Nghiệm thức 4: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 80%.

(5) Nghiệm thức 5: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 100%.

(6) Nghiệm thức 6: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 30%.

(7) Nghiệm thức 7: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 50%.

(8) Nghiệm thức 8: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 80%.

(9) Nghiệm thức 9: cấy nấm P. oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 100%.

Kết quả: xác định hoạt tính đối kháng nấm P. oryzae của dịch nuôi cấy 2 chủng xạ

khuẩn ở các nghiệm thức trên theo phương pháp khoan lỗ thạch.

Số liệu được thống kê và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0, phân tích

ANOVA ở mức ý nghĩa 0,05.

25

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn trên lúa của dịch nuôi xạ

khuẩn

Chuẩn bị thí nghiệm

- Các chậu đất trồng được làm sạch cỏ, bơm nước và làm bằng mặt trước khi trồng.

- Ngâm giống, ủ giống: Lúa giống Jasmine 85, thời gian sinh trưởng 93 – 98 ngày.

Giống lúa được khử trùng bề mặt bằng biện pháp 3 sôi 2 lạnh trong 15 phút, sau đó

hạt lúa được phơi khô, ủ 60 giờ. Hạt nảy mầm tốt đem gieo thành hàng trong chậu

(cao 30 cm, rộng 35 cm, dài 50 cm), mỗi chậu gieo 12 hạt.

- Nhân mật số nấm đạo ôn: các đĩa nấm được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường

thân lúa đặt trong tủ tối, nhiệt độ 29 – 30 0C trong 5 ngày để nấm phát triển hệ sợi và

tạo bào tử. Rửa đĩa petri nuôi nấm để lấy bào tử bằng nước cất vô trùng, thêm vài

giọt Tween 80 để tăng khả năng bám dính các bào tử lên lá mạ, sau đó lấy 1 giọt

dung dịch bào tử đưa lên lame quan sát dưới kính hiển vi (pha loãng mẫu nếu cần

thiết) để sao cho có khoảng 50 bào tử trên một quang trường kính hiển vi, tương

đương 105 bào tử trên 1 mL dung dịch. Sử dụng bình phun 3 atm/cm

2 để phun cho

lúa.

- Thu dịch nuôi hai chủng xạ khuẩn thô: từ ống thạch nghiêng, xạ khuẩn được cấy

truyền sang các bình tam giác dung tích 500 mL chứa 250 mL môi trường Gause 1

dịch thể, nuôi lắc 220 vòng/phút trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng để thu dịch nuôi xạ

khuẩn thô, ly tâm, pha theo nồng độ được xác định ở thí nghiệm 1, mỗi chậu phun

100 mL dịch nuôi XK. Sử dụng thuốc trừ đạo ôn Kasumin 2L làm đối chứng dương

(ĐC (+)).

- Cách nhiễm nấm bệnh: Sử dụng phương pháp phun dịch bào tử nấm đạo ôn vào 16

ngày sau khi sạ (NSS), tương ứng với giai đoạn lúa đã có 3 – 4 lá thật phát triển,

phun mỗi chậu 3 mL dung dịch bào tử. Sau khi chủng nấm các chậu lúa được phủ

bao tải ẩm, phun giữ ẩm thường xuyên và giữ nhiệt độ 24 – 26 0C trong 24 giờ. Sau

đó phun sương tạo độ ẩm cao cho đến cuối thí nghiệm.

- Thời điểm phun dịch nuôi xạ khuẩn: Lần 1: 25 ngày sau khi sạ (NSS), lần 2: 65

NSS.

- Cây lúa trong thời gian thí nghiệm được chăm sóc, tưới tiêu theo chế độ chăm sóc

cây lúa bình thường. chia ra 3 lần bón: 10, 20, 45 NSS.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ở khu nhà lưới – trại thực nghiệm

Trường Đại học An Giang. Trồng lúa trong chậu theo thể thức hoàn toàn ngẫu

nhiên, bố trí thành 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp (mỗi lần lặp lại là 1

chậu), bao gồm:

(1) phu XK (ĐC –).

(2) Nghi

(3) 1.

(4) 2.

26

(5) XK 1 +

50% XK 2).

Chỉ tiêu theo dõi

a. Chỉ tiêu về bệnh trên lá: được ghi nhận vào lúc 30, 40, 50, 60 ngày sau khi sạ

(NSS). Chọn ngẫu nhiên 3 cây/ chậu, mỗi cây lấy ra 1 chồi, lấy tất cả các lá từ trên

xuống để đo kích thước vết bệnh, phân cấp các vết bệnh trên lá và tính diện tích vết

bệnh trên các lá riêng biệt, quan sát theo tiêu chuẩn đánh giá và công thức của

Pinnschmidt và cs (1993).

Đánh giá theo bảng phân cấp sau

Cấp 1 Chiều dài vết bệnh <0,3 cm với diện tích là 0,02 cm2

Cấp 2 Chiều dài vết bệnh 0,3 – 0,5 cm với diện tích là 0,04 cm2

Cấp 3 Chiều dài vết bệnh 0,7 – 0,9 cm với diện tích là 0,09 cm

2

Cấp 4 Chiều dài vết bệnh 1,3 – 1,7 cm với diện tích là 0,21 cm

2

Cấp 5 Chiều dài vết bệnh >1,7 cm với diện tích là 0,45 cm

2

Đánh giá bệnh theo công thức sau

- Tỉ lệ diện tích bị bệnh trên lá (TLDTB): đánh giá bệnh theo công thức sau

Trong đó:

Y: % diện tích bệnh

a1,… , an: diện tích bệnh ở cấp 1,… n

X1,… Xn: số vết bệnh ở cấp 1,…n

L: tổng diện tích lá quan sát (diện tích lá = dài x rộng x 0,75).

- Tỉ lệ diện tích bệnh trên lô (TLDTB) (%): đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá

hiệu quả đối kháng của các hóa chất gây đối kháng. Tỉ lệ diện tích bệnh được tính

theo công thức sau

- Tỉ lệ giảm bệnh so với đối chứng (TLGB) (%): biểu hiện hiệu quả đối kháng so

với đối chứng và được tính theo công thức sau

27

b. Chỉ tiêu về bệnh trên cổ bông: lấy chỉ tiêu bệnh trên bông lúc 85 NSS. Chọn

ngẫu nhiên mỗi chậu 3 cây lúa, quan sát và đếm tất cả các bông, ghi nhận và tính

theo công thức Tsai (1988):

Trong đó:

X: trung bình mức độ bệnh trên bông.

n1: số bông bị bệnh 100% (có vết bệnh trên cổ bông).

n2: số bông bị bệnh 66,7 ≤ 100%.

n3: số bông bị bệnh 50 – 66,7%.

n4: số bông bị bệnh 33,3 ≤ 50%.

n5: số bông bị bệnh nhưng không gây hại trên hạt.

n6: số bông không bệnh.

N: tổng số bông quan sát.

- Tỉ lệ giảm bệnh trên bông (TLGBTB) (%): biểu hiện hiệu quả đối kháng

P.oryzae trên bông được tính theo công thức sau

Trong đó:

TLGBTB: tỉ lệ giảm bệnh trên bông.

XĐC: tỉ lệ bệnh thối cổ bông trên nghiệm thức đối chứng.

XNT: tỉ lệ bệnh thối cổ bông trên nghiệm thức có xử lí đối kháng.

3.2.7. Xử lý thống kê

Các số liệu trong thí nghiệm được xử lý thống kê bằng chương trình SPSS

(Statistical Program Scienetific System) dùng cho Window phiên bản 16.0. Sự khác

biệt có ý nghĩa ở mức xác xuất 0,05 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự

kèm theo qua phép kiểm định Duncan.

28

CHƢƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG

ĐỐI KHÁNG NẤM Pyricularia oryzae

Tiến hành lấy mẫu đất ruộng tại các xã thuộc huyện Thoại Sơn, đã phân lập

được 80 chủng xạ khuẩn khác nhau, được kí hiệu theo quy ước: 3 chữ cái đầu là viết

tắt tên xã (ĐT: Định Thành, VK: Vĩnh Khánh, VT: Vĩnh Trạch, ĐM: Định Mỹ, VC:

Vĩnh Chánh, VP: Vĩnh Phú) và vị trí lấu mẫu (A: vị trí dưới mặt ruộng, B: vị trí bờ

đê, C: vị trí tiếp giáp giữa mặt ruộng và bờ đê), các số từ 0 đế 80 là thứ tự chủng

phân lập được.

Sau khi thử khả năng đối kháng của 80 chủng xạ khuẩn đối với nấm P.

oryzae gây bệnh đạo ôn theo phương pháp khuếch tán trên thạch, đã tuyển chọn sơ

bộ được 21 chủng có hoạt tính kháng nấm P. oryzae ở các mức độ khác nhau, chiếm

tỷ lệ 26,25%. So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công

bố trước đây của Lê Minh Tường (2014) là 10% khi khảo sát các chủng xạ khuẩn

trên đất trồng lúa ở một số tỉnh ĐBSCL, tỷ lệ chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng

nấm đạo ôn của đề tài có phần cao hơn. Hiệu quả đối kháng của 21 chủng XK đối

với nấm P. oryzae trong điều kiện phòng thí nghiệm được trình bày ở bảng 1, phụ

lục 1.

Kết quả phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn cho thấy đất ruộng trồng lúa là đất

giàu dinh dưỡng, có độ ẩm, pH thích hợp nên XK phát triển mạnh. Xạ khuẩn có khả

năng đối kháng nấm đạo ôn đều phân bố ở các ruộng cả 6 xã của huyện Thoại Sơn,

và vị trí mặt ruộng có số lượng xạ khuẩn nhiều hơn 2 vị trí còn lại. Điều này có thể

giải thích do xạ khuẩn là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và

nguồn thức ăn là xác bã rơm, rạ, động vật, vỏ xác tôm cua, cá…đang bị phân hủy.

Đồng thời, với điều kiện đất ruộng có lượng nước ra vào thường xuyên, lớp đất mặt

luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng xạ khuẩn sinh trưởng phát triển. 21

chủng XK thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm P. oryzae với nhiều

mức độ khác nhau.Trong đó, 2 chủng VKB-09 và ĐMB-40 thể hiện khả năng ức chế

nấm gây bệnh đạo ôn mạnh với đường kính vòng đối kháng lần lượt là 14,62 mm và

16,17 mm, kết quả này cao hơn khảo sát của Lê Minh Tường năm 2014 là 9,8 mm.

Hình 12. Vòng đối kháng P. oryzae của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09

29

Bảng 1. Kết quả vòng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của 21 chủng xạ khuẩn

Xạ khuẩn Vòng đối kháng

(mm)

ĐMB-30 13,00l

ĐMB-40 16,17p

ĐMC-25 5,32c

ĐMC-56 10,40i

ĐMC-58 4,87b

ĐTA-24 5,62cd

ĐTC-15 9,50k

ĐTC-33 7,90g

ĐTC-62 6,65e

ĐTC-71 12,80nl

VCA-72

4,77b

VCB-20 8,67h

VCB-79 12,70nl

VCC-01 3,75a

VKB-04 8,30h

VKB-09 14,62o

VKC-06 5,80d

VPA-45 11,40m

VPA-66 12,42n

VTA-27 7,32f

VTC-41 8,55h

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở

mức 0,05

Để kiểm tra kết quả chính xác hơn, hai chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09

tiếp tục được nuôi lắc trong môi trường dịch thể Gause 1 trong 7 ngày để thu dịch

nuôi cấy. Kết quả kiểm tra hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp khoan lỗ

thạch với chủng nấm P.oryzae là: ĐMB-40 (17,88 mm) và VKB-09 (14,69 mm),

được thể hiện ở hình 12.

Như vậy, môi trường sống ở ruộng lúa có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho xạ

khuẩn sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, ức

30

chế nấm gây bệnh đạo ôn góp phần bảo vệ mùa màng, đồng thời tham gia phân hủy

các chất thải nông nghiệp, giúp làm sạch đồng ruộng.

Từ đó, 2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh đạo

ôn P.oryzae ĐMB-40 (17,88 mm) và VKB-09 (14,69 mm) được tuyển chọn để

nghiên cứu tiếp tục.

4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI HAI

CHỦNG XẠ KHUẨN

Tiến hành cấy 2 chủng XK trên MT Gause 1 trong 7 ngày. Khuẩn lạc được

ghi nhận mô tả. Cấu trúc vi thể của xạ khuẩn được quan sát dưới KHV, chụp hình

bào tử, cuống sinh bào tử. Sau đó định danh đến loài các chủng xạ khuẩn bằng

phương pháp sinh học phân tử tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử - Viện nghiên

cứu và phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ. Kết quả trình bày

ở bảng 2, bảng 3, bảng 4, phụ lục 2 .

Bảng 2. Đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng xạ khuẩn

Chủng Đặc điểm hình thái Phân loại

ĐMB-40

Khuẩn lạc: Bề mặt xạ khuẩn ĐMB-40 lúc đầu có

màu trắng đục, sau hơn 7 ngày nuôi cấy thì có màu

xám đen, khuẩn lạc có những nếp tỏa ra tạo thành

những vòng đồng tâm, mép khuẩn lạc màu nâu, trên

bề mặt khuẩn lạc có lớp chất hữu cơ kết tinh, dùng

que cấy lấy khuẩn lạc lên thì thấy khuẩn lạc mềm,

sợi cơ chất không dính chặt vào mặt thạch, không

tiết sắc tố (hình 13).

Hình thái vi thể: Hệ sợi của xạ khuẩn ĐMB-40 phân

nhánh nhiều, cuống sinh bào tử xoắn cuộn tròn, bào

tử có dạng hình cầu, nhỏ (hình 14).

Streptomyces

recifensis

.

VKB-09

Khuẩn lạc: khi mới cấy 2 – 3 ngày thì khuẩn lạc có

màu trắng sáng nhưng sau đó màu sẩm dần, đến

ngày thứ 7 thì bề mặt khuẩn lạc có màu tím hơi xám,

khô, có vòng đồng tâm, khi dùng que cấy lấy khuẩn

lạc lên thì thấy khuẩn lạc mềm, các sợi cơ chất

không ăn sâu vào mặt thạch, tiết ra sắc tố màu vàng

và thấm vào môi trường thạch (hình 15).

Hình thái vi thể: Hê sợi của xạ khuẩn VKB-09 phân

nhánh nhiều, cuống sinh bào tử dạng xoắn lò xo

nhưng không chặt bằng sợi sinh bào tử của xạ khuẩn

ĐMB-40, bào tử nhỏ, hình cầu (hình 16).

Streptomyces

laurentii

31

Hình 13. Mặt trƣớc và sau khuẩn lạc của xạ khuẩn ĐMB-40

Hình 15. Mặt trƣớc và sau khuẩn lạc của xạ khuẩn VKB-09

Hình 16. Cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn VKB-09 (40X)

Hình 14. Cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn ĐMB-40 (40X)

32

Kết quả giải trình tự của gen 16S RNA đối với chủng ĐMB-40 đã giải được một

đoạn gen dài 1703 Nu, có trình tự như sau:

>141029-40_B01_F11_F.ab1 1703

AAAGAGGGCATGCGCGTGCTTACACATGCAGTCGAACGATGAACACTTG

GTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTC

ACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTG

CAGGCATCTGCGAGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCG

CCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTG

CCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG

CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCT

ATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCT

TTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCG

GCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTC

CGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGATTGT

GAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCTAGCTAG

AGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAG

ATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTG

ACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGG

TAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGT

CGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGC

CGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCG

GAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTG

ACATACACCGGAAACGTCCAGAGATGGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTA

CAGGTGGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA

GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCG

GGGGTGATGGGGACTCACAAGAAGACCGCCGGGGTCAACTCCGAAGGA

AGGTGGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTAATGTCTTGGGGCTG

CAACCTGGCTACAATGGGCCGGTACAATGGACTTGCGATACCCGGGAGG

GTGGAGCGAATTCTCAAAAAAGCCGGGTCTCATTTTTCGAATTGGGGGG

CTTGCCACTCCAACCCCATAGAAAACCGGGATTCCCTTAAAAATTCCCAA

AACACAATTTTGTCGGGGGGGAAAAAATTTTCCCGGGCCTTTGTACCCAC

CCCCGGCTCCCCTCCCAAAAAAATGGGAAACCCCAAAACCGGGGGGCCA

CCCTCCTTTGGGGAAGAGAGTCCCAAAAGGGACGTTGAGGGGATGAAGT

GAACCCAAAAAGGGGGCCCGCAAGAGTAAAAGAAAGGAAAAAAAGAA

AAAAAAAAAAGGAAGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG

GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAAACCCCGGGGGGGGGGGGGGCCGG

GGGAACCCCGGGGGAAAAGGGGGGGGGGGGGG

Trình tự này được sử dụng để Search Blast trên GenBank để xác định các trình tự

tương đồng, kết quả được thể hiện ở bảng 3.

33

Bảng 3. Kết quả Search Blast trình tự gen 16s rRNA của chủng ĐMB-40 trên

GenBank

Kết quả giải trình tự của gen 16S RNA đối với chủng VKB-09 đã giải được một

đoạn gen dài 1540 Nu, có trình tự như sau:

>141029-09_D01_F12_F.ab1 1540

AAAAGGGCATGCGGCGTGCTTACACATGCATGTCGACGATGAAGCCTTC

GGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACATGTGGGCAATCTGCCCT

TCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACTG

CGGGAGGCATCTCCTGCGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCC

GCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACG

GGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG

CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGATATTGCACAATGGGCGAA

AGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAA

ACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAA

GCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGC

GTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTC

GGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATCCGATACGGGCA

GGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAAT

GCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCC

ATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGAT

ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACAT

TCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGA

GTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA

AGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCA

AGGCTTGACATATACCGGAAACACCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGT

34

CGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG

GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCC

CTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGG

AAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCC

ACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAAGCTTCGATGCCTGGAGGGGAACGA

ATTCAAAAACCGGTCCATTTCGGATTGGGGGTGCACTCCCCCCCTGAAG

GCGGGTGTTTTAAAACCAAAAACATTTTTGGGGGGAAAATTTCCCCGGC

TGTTAACCCCCCGTCCCTCCAAAATTGTAACCCAACCGGGGCCACCCCCT

CTGGGGGGTGTTGGAATGGGCAGTGGGGATAATTTTAAAAAGGGACCCA

TATCAAGGGAAAGGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCCGG

GGGCCCCCCGGGGGGGGGGGG

Trình tự này được sử dụng để Search Blast trên GenBank để xác định các

trình tự tương đồng, kết quả được thể hiện ở bảng 4.

Kết quả Blast search trên GenBank cho thấy chủng ĐMB-40 có trình tự 16S

rRNA tương đồng với loài Streptomyces recifensis với tỉ lệ 97%. Chủng VKB-09 có

trình tự tương đồng với loài Streptomyces laurentii với tỉ lệ 98%. Xạ khuẩn

Streptomyces recifensis và Streptomyces laurentii là loài mới được phát hiện và

chưa có nhiều nghiên cứu mô tả về nó. Do đó, đề tài đã đóng góp vào bảo tàng giống

VSV của Việt Nam 2 chủng xạ khuẩn mới và có nhiều tiềm năng cần tiếp tục nghiên

cứu và khai thác các đặc tính quý.

Bảng 4. Kết quả Search Blast trình tự gen 16s rRNA của chủng VKB-09 trên

GenBank

35

Như vậy, cả 2 chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 đều thuộc chi

Streptomyces. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30 0C,

pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn

(xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng

lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và

động vật nguyên sinh. Hơn 50 loại thuốc kháng sinh khác nhau đã được phân lập từ

các loài thuộc chi Streptomyces, bao gồm: streptomycin, chloramphenicol, neomycin

và tetracycline.

(Streptomyces. http://www.microbiologybytes.com/video/Streptomyces.html)

4.3. KHẢ NĂNG SINH ENZYM CỦA HAI CHỦNG XẠ KHUẨN

Tiến hành nuôi cấy hai chủng xạ khuẩn trong môi trường Gause 2 dịch thể,

ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, chiết dịch trong thu dịch enzym thô. Kiểm tra

hoạt tính enzym cellulase và chitinase theo phương pháp 3.2.4. Kết quả được trình

bày trong bảng 5, hình 17, 18, phụ lục 3.

Bảng 5. Hoạt tính enzym cellulase và chitinase của 2 chủng XK (D-d; mm)

Xạ khuẩn Enzym (mm)

Cellulase Chitinase

ĐMB-40 22,42 0,14a 28,38 0,71

a

VKB-09 28,50 0,45b 33,04 1,05

b

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở

mức 0,05

Xạ khuẩn chống nấm, ngoài sự tiết chất kháng sinh, chúng còn tác động lên

khu hệ vi sinh vật thông qua enzym phân giải các hợp chất hữu cơ, đây là phức hệ

gồm nhiều enzym có vai trò quan trọng trong việc làm sạch đất khỏi nấm bệnh, ngăn

ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây, tăng hiệu quả kháng bệnh cho cây.

Hai chủng xạ khuẩn này có hoạt tính enzym chitinase khá cao ĐMB-40

(28,38 mm), VKB-09 (33,04 mm). Nhờ đó chúng sẽ phân hủy xác động vật như các

loài giáp xác, vỏ tôm, cua… hạn chế mùi hôi thối làm ô nhiễm môi trường. Mặt

khác, thành phần quan trọng trong thành tế bào nấm chính là chitin, mà ĐMB-40 và

VKB-09 đều có thể sinh chitinase nên khi sử dụng chúng để phòng trị đạo ôn thì

enzym chitinase sẽ phát huy tác dụng và làm tăng hiệu quả đối kháng. Đây là đặc

tính quan trọng trong cơ chế đấu tranh sinh học phòng trừ nấm bệnh của xạ khuẩn

góp phần tăng hiệu quả đối kháng nấm bệnh.

Tuy nhiên, do hoạt tính enzym chitinase khá cao, nó có thể có những tác

động tiêu cực đến đời sống của các loài giáp xác sống trong môi trường đồng ruộng,

nên nếu sử dụng chủng xạ khuẩn này để sản xuất chế phẩm cần lưu ý đối với những

ruộng lúa có kết hợp nuôi tôm, cua vào thời điểm phun thuốc sao cho không ảnh

36

hưởng đến quá trình hình thành vỏ tôm, cua làm ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng,

phát triển của chúng.

Bên cạnh đó, cả hai chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính enzym cellulase cao

ĐMB-40 (22,42 mm), VKB-09 (28,50 mm). Do trên mặt ruộng có rất nhiều rơm rạ

của những vụ trước chưa được xử lí triệt để, mà thành phần chính trong rơm lại là

cellulose, là một hợp chất khó phân hủy, quá trình phân giải diễn ra chậm, trong thời

gian tương đối dài, nếu ĐMB-40 và VKB-09 được phun trên ruộng một thời gian

trước khi gieo sạ lúa thì rơm sẽ được phân hủy, đây sẽ là nguồn phân bón hữu cơ tốt

cho cây lúa, đồng thời cũng giảm lượng phân hóa học, hạn chế ô nhiễm môi trường

đồng ruộng, tiết kiệm chi phí cho người trồng lúa. Ngoài ra, rơm rạ của vụ lúa trước

là một trong số những nguồn bệnh cho vụ sau, nếu phun ĐMB-40 và VKB-09 lên

rơm của vụ lúa trước thì chất đối kháng của chúng sẽ giúp tiêu diệt một phần mầm

bệnh đạo ôn, giúp giảm chi phí phun thuốc phòng ngừa bệnh cho vụ sau.

Ngày nay, xu hướng ủ rơm rạ tại ruộng sau khi thu hoạch, có bổ sung thêm

các chế phẩm vi sinh được nông dân rất ưa chuộng và triển khai thực hiện ngày càng

nhiều, điều này thể hiện sự tiến bộ của công nghệ sinh học được ứng dụng vào thực

tiễn ngày càng rộng rãi. Do đó, nguồn rơm rạ sau thu hoạch với thành phần cellulose

trên 40% rất khó phân hủy với điều kiện bình thường, nếu được sử dụng làm nguồn

cơ chất cho xạ khuẩn có mặt trong rơm, rạ và trong đất thì sẽ được phân hủy rất

nhanh và trở thành nguồn phân bón rất tốt cho cây trồng đồng thời trả lại cho đất

chất dinh dưỡng bị mất đi, hạn chế được tình trạng đất bạc màu, cằn cỗi.

Từ kết quả cho thấy cả hai chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh enzym

chitinase và cellulase.Vòng hoạt tính enzym cellulase (28,5 mm) và chitinase (33,04

mm) của xạ khuẩn VKB-09 cao hơn và có sự khác biệt có ý nghĩa với xạ khuẩn

ĐMB-40. Kết quả này so với kết quả của Lê Minh Tường (2014) là tương đương. Sự

kết hợp hoạt động của các enzym trên giúp phân giải mạnh các biopolymer, nguồn

cơ chất phổ biến trong các ruộng lúa.

Qua phân tích có thể kết luận cả hai chủng xạ khuẩn đều có khả năng đối

kháng nấm P.oryzae vừa có khả năng sinh enzym chitinase và cellulase. Như vậy,

nếu sử dụng hai chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 để đối kháng nấm đạo ôn trên

thì một mặt sẽ ngăn chặn bệnh phát triển, đồng thời enzym cellulase do chúng tiết ra

cũng sẽ phân hủy rơm rạ, tạo thành nguồn phân bón hữu cơ hữu ích cho lúa, góp

phần giảm lượng phân hóa học phải bón cho lúa, giảm ô nhiễm môi trường.

37

4.4. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM P.oryzae

TRÊN LÚA TỪ DỊCH NUÔI XẠ KHUẨN

4.4.1. Kết quả hoạt tính đối kháng của dịch nuôi XK ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm này nhằm mục đích chọn ra nồng độ dịch nuôi xạ khuẩn sinh

chất đối kháng mạnh nhất, từ đó sử dụng phun trong thí nghiệm đối kháng trên lúa

tiếp theo.

Tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường Gause 1 dịch thể trên máy

lắc 220 vòng/phút trong 7 ngày để thu nhận dịch nuôi xạ khuẩn thô. Sau đó tiến

hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau theo phương pháp 3.2.6 (thí nghiệm 1), xác

định khả năng đối kháng với nấm đạo ôn bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Kết quả

thí nghiệm được trình bày trong bảng 6, phụ lục 4.

Kết quả bảng 6 cho thấy dịch nuôi xạ khuẩn ở các nồng độ khác nhau đều có

khả năng đối kháng đạo ôn với mức độ khác nhau. Đối với chủng ĐMB-40, nghiệm

thức 5 (ĐMB-40, 100%) có hiệu quả đối kháng đạo ôn cao nhất (17,88 mm) và khác

Hình 17. Vòng hoạt tính enzym cellulase của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09

Hình 18. Vòng hoạt tính enzym chitinase của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09

38

biệt có ý nghĩa với nghiệm thức đối chứng. Đối với xạ khuẩn VKB-09 thì nghiệm

thức NT8 (VKB-09, 80%) kháng nấm đạo ôn tốt nhất (15,38 mm) và khác biệt có ý

nghĩa với nghiệm thức đối chứng. So với kết quả của Lê Như Kiểu (2008) khi

nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng nấm đạo ôn lúa vòng đối kháng cao nhất là 4,5

mm thì kết quả của đề tài có phần cao hơn. Như vậy, ngoài việc sử dụng vi khuẩn

đối kháng thì xạ khuẩn đối kháng cũng cho kết quả tốt và cao hơn, bên cạnh đó xạ

khuẩn là nhóm VSV ít gây độc cho sinh vật khác nên độ an toàn khi sử dụng sẽ cao

hơn, hiệu quả tốt hơn.

Bảng 6. Vòng đối kháng nấm P.oryzae của dịch nuôi XK ở các

nồng độ khác nhau (D – d; mm)

Nghiệm thức Vòng đối kháng (mm)

NT1 (ĐC -) 0,00 0,00a

NT2 (ĐMB-40, 30%) 13,75 0,48cd

NT3 (ĐMB-40, 50%) 14,44 0,49de

NT4 (ĐMB-40, 80%) 15,50 0,59e

NT5 (ĐMB-40, 100%) 17,88 0,45f

NT6 (VKB-09, 30%) 9,81 0,69b

NT7 (VKB-09, 50%) 12,75 0,47c

NT8 (VKB-09, 80%) 15,38 0,63de

NT9 (VKB-09, 100%) 14,69 0,67de

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở

mức 0,05

Cả hai chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 đều sinh chất đối kháng nấm

P.oryzae, khả năng đối kháng của hai chủng có sự khác biệt và cao hơn nghiệm thức

đối chứng. Như vậy, nồng độ dịch nuôi xạ khuẩn ở nghiệm thức NT5 (ĐMB-40,

100%) và NT8 (VKB-09, 80%) cho hiệu quả kháng đạo ôn mạnh nhất sẽ được chọn

cho thí nghiệm trên lúa trong nhà lưới.

4.4.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn trên lúa của dịch nuôi XK

Không phải tất cả xạ khuẩn kháng nấm in vitro đều có hoạt tính trong môi

trường đất, vì khi phun ra môi trường đất còn rất nhiều yếu tố tác động đến chúng.

Xạ khuẩn được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ,

ẩm độ sống được tối ưu hóa sao cho chúng sinh trưởng tốt nhất. Ngoài môi trường

đất ruộng, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thường xuyên thay đổi tùy vào điều kiện thời

tiết, mùa vụ, nhiệt độ ngày và đêm, trong đất ruộng có rất nhiều VSV khác, chúng

39

có thể cạnh tranh với xạ khuẩn về môi trường sống, dinh dưỡng, làm mất hoạt tính

của xạ khuẩn…

Để đánh giá được khả năng kháng đạo ôn trên lúa ngoài môi trường đất, thí

nghiệm đã được bố trí tại nhà lưới số 1, khu thực nghiệm trường Đại học An Giang

trong thời gian 95 ngày theo phương pháp 3.2.6 (thí nghiệm 2). Tiến hành lấy chỉ

tiêu bệnh trên lá 4 lần và 1 lần trên bông. Kết quả chỉ tiêu bệnh trên lá được trình

bày trong bảng 7 và 8, phụ lục 5, phụ lục 8. Kết quả chỉ tiêu bệnh trên bông trong

bảng 9, phụ lục 6.

Kết quả bảng 7 cho thấy cả 4 nghiệm thức 2, 3, 4, 5 qua các ngày 30, 40, 50,

60 NSS đều thể hiện khả năng ức chế bệnh đạo ôn trên lúa trong điều kiện nhà lưới

và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (-) khi không phun

dịch nuôi xạ khuẩn. Điều này chứng tỏ hiệu quả giảm bệnh của lần phun 25 NSS

kéo dài đến 60 NSS.

Ở các ngày 30, 40, 50, 60 NSS trung bình tỉ lệ diện tích bệnh trên lá của các

nghiệm thức NT2 (ĐC+), NT3, NT4 và NT5 không có sự khác biệt có ý nghĩa về

thống kê.

Bảng 7. Tỉ lệ diện tích bệnh trên lá 30, 40, 50 và 60 NSS (%)

Nghiệm thức Tỉ lệ diện tích bệnh trên lá (%)

30 NSS 40 NSS 50 NSS 60 NSS

NT1 (ĐC -) 0,29 0,02b

0,70 0,04c

1,37 0,08b

1,63 0,09b

NT2 (ĐC +) 0,16 0,01a

0,18 0,02a

0,21 0,02a

0,27 0,01a

NT3 (ĐMB-40) 0,17 0,01a

0,19 0,02a

0,23 0,02a

0,28 0,01a

NT4 (VKB-09) 0,18 0,01a

0,25 0,01ab

0,33 0,01a

0,37 0,02a

NT5 (50%

ĐMB-40 +50%

VKB-09)

0,19 0,03a

0,27 0,01b

0,30 0,02a

0,36 0,03a

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở

mức 0,05

Qua kết quả cho thấy, khi bệnh đạo ôn xuất hiện thì tỉ lệ diện tích bệnh trên

lá của các nghiệm thức đều tăng qua các ngày khảo sát, tuy nhiên tốc độ phát triển

của bệnh ở nghiệm thức NT2 (ĐC +), NT3, NT4, NT5 tăng nhưng chậm hơn rất

nhiều so với NT1 (ĐC -), do xạ khuẩn đã sinh chất đối kháng với nấm đạo ôn kềm

hãm tốc độ phát triển bệnh, làm cho tốc độ phát triển của bệnh giảm. Lý do khiến

diện tích bệnh không giảm là vì khi nấm đạo ôn đã tấn công thì độc tố do nấm tiết ra

sẽ làm tổn thương vùng tế bào tại vị trí đó, vùng tế bào bị nhiễm độc tố sẽ chết và

không thể phục hồi lại được. Theo quy luật phát sinh phát triển tự nhiên của VSV

trong môi trường, nhận thấy không thể tiêu diệt triệt để dịch bệnh mà thuốc chỉ kềm

hãm dịch bệnh bùng phát nghiêm trọng, điều này đúng với quy luật trong đấu tranh

40

sinh học của sinh vật trong tự nhiên, đảm bảo mức cân bằng sinh học trong đồng

ruộng, đó cũng là mục tiêu trong xu hướng bảo vệ thực vật hiện nay.

Như vậy, ứng dụng đấu tranh sinh học trong bảo vệ cây trồng là biện pháp

sinh học an toàn, đạt hiệu quả cao, không ảnh hưởng đến sức khỏe người và động

vật, không gây ô nhiễm môi trường và đảm bảo mức cân bằng sinh thái đồng ruộng,

đáp ứng được mục tiêu ứng dụng khoa học công nghệ trong nông nghiệp. Tìm ra

chủng xạ khuẩn có khả năng kềm hãm sự phát triển của nấm gây bệnh đạo ôn P.

oryzae có ý nghĩa rất lớn trong công tác tìm kiếm nguồn VSV ứng dụng sản xuất chế

phẩm sinh học của các nhà khoa học.

Kết quả tỉ lệ diện tích bệnh của NT3 và NT2 không khác biệt về mặt thống

kê chứng tỏ hiệu quả kháng bệnh đạo ôn của chủng ĐMB-40 rất tốt, so với sản phẩm

có mặt trên thị trường là tương đương nên chủng xạ khuẩn này có thể sử dụng tiếp

tục nghiên cứu tạo ra chế phẩm phòng trị bệnh đạo ôn có nguồn gốc vi sinh giảm

được lượng thuốc hóa học đang được nông dân sử dụng diệt đạo ôn lúa hiện nay.

Điều này đáp ứng được xu hướng đẩy mạnh áp dụng công nghệ sinh học vào lĩnh

vực nông nghiệp hiện nay, mở ra một hướng mới đưa nền nông nghiệp Việt Nam

phát triển bền vững, sạch và hiện đại.

Tỉ lệ diện tích bệnh của NT4 cao hơn và có sự khác biệt không có ý nghĩa

với nghiệm thức NT2, NT3, có nghĩa là hiệu quả kháng đạo ôn của nghiệm thức này

thấp hơn. Nghiệm thức NT4 và NT5 ở ngày 30, 40, 50, 60 NSS không có sự khác

biệt có ý nghĩa, có thể kết luận khả năng kháng đạo ôn của hai nghiệm thức này

tương đương nhau. Khi kết hợp giữa xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 các chất đối

kháng sẽ phản ứng với nhau tạo ra một cơ chế phản ứng mới tác động lên nấm mạnh

hơn khi chỉ có một chủng VKB-09 nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê.

Bảng 8. Tỉ lệ giảm bệnh trên lá vào 30, 40, 50 và 60 NSS (%)

Nghiệm thức Tỉ lệ giảm bệnh trên lá (%)

30 NSS 40 NSS 50 NSS 60 NSS

NT1 (ĐC -) 0,00 0,00a

0,00 0,00a

0,00 0,00a

0,00 0,00a

NT2 (ĐC +) 60,78 7,77b

76,07 4,76b

82,28 1,24b

82,53 1,15b

NT3 (ĐMB-40) 59,84 8,73b

74,51 5,35b

82,02 2,01b

82,04 1,20b

NT4 (VKB-09) 53,32 7,28b

66,67 4,98b

76,76 2,46b

76,08 2,77b

NT5 (50% ĐMB-

40 +50% VKB-09) 49,50 7,74

b 68,58 5,960

b 77,78 2,93

b 78,87 3,31

b

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở

mức 0,05

Kết quả bảng 8 cho thấy nghiệm thức NT2 có tỉ lệ giảm diện tích bệnh cao

nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức đối chứng (-) qua tất cả các ngày

41

theo dõi. Ở ngày 30, 40, 50 và 60 NSS, nghiệm thức NT3 có tỉ lệ giảm bệnh có khác

biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (-). Các nghiệm thức có sự khác biệt

không ý nghĩa nhưng đều thấp hơn đối chứng (-) có ý nghĩa thống kê.

Hiệu quả giảm bệnh của nghiệm thức NT2 và NT3 không có sự khác biệt có

ý nghĩa, có thể thấy hiệu quả giảm bệnh của xạ khuẩn ĐMB-40 tương đương với sản

phẩm trên thị trường (82,04%).

Nhƣ vậy, có thể sử dụng cả 2 chủng ĐMB-40 và VKB-09 để sản xuất chế

phẩm sinh học trong quản lý và phòng trừ bệnh đạo ôn cho lúa. Trong đó, chủng

ĐMB-40 cho hiệu quả giảm bệnh cao nhất, đồng thời sinh enzym cellulase và

chitinase rất cao nên đây là chủng có tiềm năng rất quý cần tiếp tục khai thác trong

lĩnh vực sản xuất chế phẩm vi sinh phòng và trị bệnh đạo ôn lúa.

Bảng 9. Tỉ lệ bệnh thối cổ bông và tỉ lệ giảm bệnh thối cổ bông vào 85 NSS (%)

Nghiệm thức Tỉ lệ thối cổ bông

(%) Tỉ lệ giảm bệnh TCB (%)

NT1 (ĐC -) 2,38 0,020d

0,00 0,00a

NT2 (ĐC +) 0,30 0,006a

87,34 0,26d

NT3 (ĐMB-40) 0,47 0,007b

80,30 0,31c

NT4 (VKB-09) 0,61 0,010c

74,31 0,31b

NT5 (ĐMB-40

+ VKB-09) 0,62 0,012

c 74,14 0,56

b

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở

mức 0,05

Kết quả từ bảng 9 cho thấy các nghiệm thức NT2, NT3, NT4 và NT5 đều có

khả năng kháng đạo ôn cổ bông và có sự khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (-).

Nghiệm thức 3 có kết quả 80,30%, tương đương với nghiệm thức 2 (87,34%) chứng

tỏ chủng ĐMB-40 có hiệu quả kháng đạo ôn cao nhất. Như vậy, lần phun dịch nuôi

xạ khuẩn vào 65 NSS có tác dụng kháng đạo ôn cổ bông lúa rất tốt, giúp lúa đạt

năng suất cao khi thu hoạch.

Hiệu quả kháng đạo ôn cổ bông của nghiệm thức NT4 và NT5 sự khác biệt

không có ý nghĩa, trong khi đó nghiệm thức NT3 cho hiệu quả kháng cao hơn và có

sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức NT4 và NT5. Như vậy, xạ khuẩn ĐMB-

40 có hiệu quả kháng đạo ôn trên lúa tốt hơn VKB-09, việc phối hợp ĐMB-40 và

VKB-09 không làm tăng hiệu quả kháng đạo ôn cổ bông.

Nghiệm thức NT3 có tỉ lệ giảm bệnh đạo ôn cổ bông cao hơn NT4 và NT5

nhưng thấp hơn NT2 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Như vậy, hiệu quả giảm

bệnh đạo ôn cổ bông của xạ khuẩn ĐMB-40 cao hơn VKB-09 và cao hơn khi phối

hợp hai xạ khuẩn nhưng, tỉ lệ giảm bệnh đạo ôn cổ bông của xạ khuẩn ĐMB-40

42

không cao bằng sản phẩm Kasumin 2L được sử dụng phòng trừ bệnh đạo ôn lúa trên

thị trường.

Qua kết quả thí nghiệm nhận thấy cả 2 chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09

đều có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn lá và đạo ôn cổ bông trên lúa. Phun

2 lần trong một vụ lúa vào 25 NSS và 65 NSS sẽ cho hiệu quả phòng và trị bệnh

đạo ôn rất tốt đến thu hoạch. Có thể sử dụng 2 chủng xạ khuẩn này sản xuất chế

phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường sẽ giúp nông dân bảo vệ lúa khỏi dịch đạo ôn,

vừa an toàn cho môi trường, không độc đối với sức khỏe người và các động vật

khác, vừa đảm bảo cân bằng sinh học đồng ruộng so với sử dụng các loại thuốc

phòng trừ đạo ôn có nguồn gốc hóa học hiện nay.

Tóm lại: cả hai chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 đều có khả năng

kháng đạo ôn lá, đạo ôn cổ bông trên lúa với hiệu quả tương đối gần bằng với sản

phẩm trên thị trường. Đồng thời, chúng còn có khả năng sinh enzym ngoại bào

chitinase có tác dụng tăng hiệu quả tác động lên thành sợi nấm gây bệnh đạo ôn, và

enzym cellulase phân hủy rơm, rạ, xác bã thực vật tạo nguồn phân bón hữu cơ tự

nhiên cho đồng ruộng. Như vậy, trong tương lai có thể sử dụng 2 chủng này để

nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ đạo ôn, hướng tới một nền nông

nghiệp sạch, bền vững, giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học gây ô nhiễm môi

trường.

43

CHƢƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

Phân lập được 80 chủng xạ khuẩn khác nhau từ đất ở các ruộng lúa thuộc 6 xã

huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang. Tìm được 21 chủng xạ khuẩn có khả năng đối

kháng nấm đạo ôn Pyricularia oryzae, chiếm tỉ lệ 26,25%. Từ đó đã chọn được 2

chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm P.oryzae mạnh nhất là ĐMB-40 (17,88

mm) và VKB-09 (14,69 mm).

Qua quan sát đại thể và vi thể hai chủng xạ khuẩn cho thấy chúng có điểm chung

như: khuẩn lạc mềm, chuỗi sinh bào tử dạng xoắn. Sau khi giải trình tự Nu đã định

danh chủng xạ khuẩn ĐMB-40 thuộc loài Streptomyces recifensis và chủng VKB-09

thuộc loài Streptomyces laurentii.

Kết quả thí nghiệm xác định khả năng sinh enzym ngoại bào cho thấy cả hai xạ

khuẩn đều sinh enzym cellulase và chitinase khá cao.

Xác định khả năng đối kháng nấm đạo ôn của hai chủng xạ khuẩn ở các nồng độ

khác nhau, kết quả cho thấy ở các nồng độ khác nhau của hai chủng xạ khuẩn đều có

khả năng đối kháng với nấm đạo ôn Pyricularia oryzae. Trên cơ sở đó đã lựa chọn

chủng ĐMB-40 (nồng độ 100%) và VKB-09 (nồng độ 80%), là nồng độ kháng tối

ưu nhất để phun trên lúa.

Kết quả thử nghiệm trên lúa trong nhà lưới cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn ĐMB-

40 và VKB-09 đều có khả năng đối kháng bệnh đạo ôn lá và đạo ôn cổ bông qua 2

lần phun vào 25 NSS và 65 NSS. Chủng ĐMB-40 có khả năng kháng đạo ôn cao

hơn VKB-09, hiệu quả đối kháng tương đương sản phẩm Kasumin 2L trên thị

trường.

5.2. HẠN CHẾ

Chưa tách chiết và xác định thành phần chất đối kháng của hai chủng xạ

khuẩn ĐMB-40 và VKB-09.

5.3. KHUYẾN NGHỊ

Cần có nghiên cứu tiếp theo về môi trường và điều kiện tối ưu cho 2 chủng xạ

khuẩn sinh chất đối kháng nấm Pyricularia oryzae mạnh nhất và không ảnh hưởng

sự phát triển của các loài động vật nuôi thủy sản.

Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh đạo ôn lúa từ

các chủng xạ khuẩn Streptomyces recifensis và Streptomyces laurentii phân lập được

và thử nghiệm ở điều kiện ngoài đồng.

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bùi Thị Hà. (2008). Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng

sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. (Luận văn thạc sĩ

không xuất bản). Trường đại học Thái Nguyên, Việt Nam.

Biện pháp phòng trừ bệnh đạo ôn hại lúa. (k.n.). Truy cập từ

http://www.hoptri.com/vi/quy-trinh- giai-phap/item/178-bien-phap-phong-

tru-benh-dao-on-hai-lua.

Biological and chemical control of rice blast disease (Pyricularia oryzae) in

Northern Greece. (k.n.). Retrived from http://www.ciheam.org/

Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn. (2014). Tình hình dịch hại chủ yếu 7 ngày

trên một số cây trồng (từ ngày 06/12 đến ngày 11/12/2014). Hà Nội: Cục bảo vệ

thực vật.

Crawford DL, Lynch JM, Whipps JM, Ousley MA. (1993). Isolation and

characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen.

Applied and Environmental Microbiology, 59, 899-905.

Cách phòng trị bệnh đạo ôn hại lúa. Truy cập từ

http://www.thaibinhseed.com.vn/tu-van/ho-tro-ky-thuat/cach-phong-tri-

benh-dao-on-hai-lua-10266.html.

Hà Văn Nhân. (k.n.). Phòng trừ bệnh đạo ôn cho lúa- Viện cây lương thực- cây thực

phẩm. Truy cập từ http://www.haiduongdost.gov.vn/index.

Hà Huy Niên. & Lê Lương Tề. (2007). Bảo vệ thực vật. Hà Nội: NXB Đại học Sư

phạm.

Kasugamycin. (k.n.).Truy cập từ http://en.wikipedia.org/wiki/Kasugamycin.

Lương Đức Phẩm. (2011). Sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học trong nông

nghiệp. Hà Nội: Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

Lê Gia Hy (chủ biên). (2010). Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng. Hà Nội:

Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

Lê Minh Tường. & Trần Thị Thu Em. (2014). Khảo sát khả năng đối kháng của các

chủng xạ khuẩn đối với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn hại lúa. Tạp

chí chuyên đề Nông nghiệp, 4, 120-126.

Lê Minh Tường. & Ngô Thị Kim Ngân. (2014). Phân lập và đánh giá khả năng đối

kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Rhizoctonia solani kunh gây bệnh

đốm vằn trên lúa. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 4, 113-119.

Nấm Pyricularia oryzae. Truy cập từ http://blog.zing.vn.

Nguyễn Đình Hải. (2012). Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces

toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với

môi trường. (Luận văn thạc sĩ không xuất bản). Trường Đại học Công nghệ,

Việt Nam.

45

Nguyễn Lân Dũng (chủ biên). (2012). Vi sinh vật học (Phần 1). Hà Nội: Nhà xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật.

Nguyễn Lân Dũng. (1983). Thực tập Vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng, Biên dịch). Hà

Nội: NXB ĐH&THCN. (Quyển sách gốc được xuất bản năm 1976).

Nguyễn Hoàng Minh Huy. (2006). Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn

Streptomyces dicklowii. (Luận văn thạc sĩ không xuất bản). Trường đại học

Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

Nguyễn Thị Thanh Xuân., Trần Vũ Phến., & Phạm Văn Kim. (tháng 7, 2003). Ảnh

hưởng của nòi của nấm Pyricularia grisea lên biểu hiện tính kháng lưu dẫn

khi xử lý với clorua đồng và acibenzolar-S-methyl. Bài viết được trình bày

tại Hội thảo quốc gia Bệnh Cây và Sinh Học Phân Tử, Việt Nam.

Nguyễn Phú Dũng. (2005). Ứng dụng chất kích kháng CuCl2 và oxalic acid để quản

lý bệnh đạo ôn (Pyricularia grisea) trên giống lúa OM 1490 trong điều kiện

ngoài đồng tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang. (Đề tài NCKH cấp trường).

Trường Đại học An Giang, Việt Nam.

Nguyễn Đức Lượng. (2003). Thí nghiệm công nghệ sinh học (Tập 2). TP Hồ Chí

Minh: Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.

Nguyễn Văn Đĩnh (chủ biên). (2004). Giáo trình biện pháp sinh học trong bảo vệ

thực vật. Hà Nội: Trường Đại học nông nghiệp.

Streptomyces. Truy cập từ

http://www.microbiologybytes.com/video/Streptomyces.html.

Streptomyces griseoviridis chủng 61. (k.n.). Truy cập từ http://www.sodohydro.com.

Trịnh Thới An. (2014). Phân lập và tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh

chất kháng nấm Pythium sp. Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM, 61, 113

Validamycin. (k.n.). Truy cập từ http://www.vipesco.com.vn/kythuatchitiet.php.

Vi Thị Đoan Chính. (2000). Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh

của chủng

Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật

dung hợp tế bào trần, (Luận án tiến sĩ không xuất bản). Viện công nghệ sinh

học Hà Nội, Việt Nam.

Vũ Triệu Mân. (2007). Giáo trình bệnh cây chuyên khoa. Trường Đại học nông

nghiệp 1, Hà Nội, Việt Nam.

Waksman, S. A. (1961). The Actinomycetes. Classification, identification and

descriptions of

genera and species, vol 2. USA : TheWilliams & Wilkins Co., Baltimore.

William B.Whitman. (2012). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume

5: The

Actinobacteria. USA: University of Georgia Athen

46

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: KẾT QUẢ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM P.ORYZAE CỦA 21 CHỦNG XK

Descriptives Vòng đối kháng

Xạ khuẩn N Mean Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum

Lower Bound Upper Bound

VKB-04 4 8.3000 .14142 .07071 8.0750 8.5250 8.20 8.50

VKB-09 4 14.6250 .32016 .16008 14.1156 15.1344 14.40 15.10

VKC-06 4 5.8000 .16330 .08165 5.5402 6.0598 5.60 6.00

VTA-27 4 7.3250 .23629 .11815 6.9490 7.7010 7.00 7.50

VTC-41 4 8.5500 .40415 .20207 7.9069 9.1931 8.00 8.90

VPA-45 4 11.4000 .27080 .13540 10.9691 11.8309 11.00 11.60

VPA-66 4 12.4250 .33040 .16520 11.8993 12.9507 12.00 12.80

ĐMB-40 4 16.1750 .33040 .16520 15.6493 16.7007 15.80 16.50

ĐMC-58 4 4.8750 .09574 .04787 4.7227 5.0273 4.80 5.00

ĐMC-25 4 5.3250 .22174 .11087 4.9722 5.6778 5.00 5.50

ĐMC-56 4 10.4000 .42426 .21213 9.7249 11.0751 10.00 11.00

ĐMB-30 4 13.0000 .40825 .20412 12.3504 13.6496 12.50 13.50

ĐTC-33 4 7.9000 .08165 .04082 7.7701 8.0299 7.80 8.00

ĐTC-15 4 9.5000 .16330 .08165 9.2402 9.7598 9.30 9.70

ĐTC-71 4 12.8000 .18257 .09129 12.5095 13.0905 12.60 13.00

ĐTC-62 4 6.6500 .10000 .05000 6.4909 6.8091 6.60 6.80

ĐTA-24 4 5.6250 .20616 .10308 5.2970 5.9530 5.40 5.80

VCB-79 4 12.7000 .24495 .12247 12.3102 13.0898 12.50 13.00

VCA-72 4 4.7750 .20616 .10308 4.4470 5.1030 4.60 5.00

VCC-01 4 3.7500 .17321 .08660 3.4744 4.0256 3.50 3.90

47

VCB-20 4 8.6750 .15000 .07500 8.4363 8.9137 8.50 8.80

Total 84 9.0750 3.51067 .38305 8.3131 9.8369 3.50 16.50

ANOVA

Vòng đối

kháng

Sum of

Squares

df Mean

Square

F Sig.

Between

Groups

1018.94

0

20 50.947 798.9

20

.000

Within

Groups

4.018 63 .064

Total 1022.95

8

83

Duncana Vòng đối kháng

Xạ khuẩn N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

VCC-01 4 3.7500

VCA-72 4 4.7750

ĐMC-58 4 4.8750

ĐMC-25 4 5.3250

ĐTA-24 4 5.6250 5.6250

48

VKC-06 4 5.8000

ĐTC-62 4 6.6500

VTA-27 4 7.3250

ĐTC-33 4 7.9000

VKB-04 4 8.3000

VTC-41 4 8.5500

VCB-20 4 8.6750

ĐTC-15 4 9.5000

ĐMC-56 4 10.4000

VPA-45 4 11.4000

VPA-66 4 12.4250

VCB-79 4 12.7000 12.7000

ĐTC-71 4 12.8000 12.8000

ĐMB-30 4 13.0000

VKB-09 4 14.6250

ĐMB-40 4 16.1750

Sig. 1.000 .577 .098 .331 1.000 1.000 1.000 .050 1.000 1.000 1.000 .050 .117 1.000 1.000

49

Phụ lục 2: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐMB-40 VÀ VKB-09

ĐMB-40 File: F11_F.ab1 Run Ended: 2014/10/30 1:37:0 Signal G:2047 A:2334 C:2436 T:1747

Sample: F11_F Lane: 15 Base spacing: 14.159746 1703 bases in 20896 scans Page 2 of 2

50

VKB-09-File: F12_F.ab1 Run Ended: 2014/10/30 1:37:0 Signal G:1923 A:1958 C:2218 T:1389

Sample: F12_F Lane: 13 Base spacing: 14.0976515 1540 bases in 18723 scans Page 1 of 2

51

Phụ lục 3: KẾT QUẢ HOẠT TÍNH ENZYM CELLULASE VÀ CHITINASE CỦA

2 CHỦNG XẠ KHUẨN

Xạ khuẩn Cellulase Chitinase

VKB-09

27.0 34.0

26.0 32.0

29.0 33.5

30.0 34.0

30.0 32.0

30.0 32.0

29.0 33.0

29.0 33.0

27.0 31.0

26.0 34.5

29.5 28.0

29.5 27.0

ĐMB-40

22.0 31.0

22.0 26.0

22.5 26.5

23.0 31.0

22.0 26.0

22.0 26.5

23.0 29.5

22.0 29.5

23.0 27.5

23.0 26.0

22.0 28.0

22.5 27.0

Descriptives

N Mean

Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence

Interval for Mean

Minimum Maximum

Lower

Bound

Upper

Bound

cellulase VKB-09 12 28.5000 1.55212 .44806 27.5138 29.4862 26.00 30.00

ĐMB-40 12 22.4167 .46872 .13531 22.1189 22.7145 22.00 23.00

Total 24 25.4583 3.30322 .67427 24.0635 26.8532 22.00 30.00

chitinase VKB-09 12 33.0417 3.64603 1.05252 30.7251 35.3582 30.00 44.00

ĐMD-40 12 28.3750 2.45991 .71011 26.8121 29.9379 26.00 34.50

Total 24 30.7083 3.86432 .78880 29.0766 32.3401 26.00 44.00

52

ANOVA

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

cellulase Between Groups 222.042 1 222.042 168.931 .000

Within Groups 28.917 22 1.314

Total 250.958 23

chitinase Between Groups 130.667 1 130.667 13.509 .001

Within Groups 212.792 22 9.672

Total 343.458 23

Phụ lục 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM P.ORYZAE

CỦA 2 CHỦNG XẠ KHUẨN Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU

Nghiệm thức D-d (mm) Nghiệm thức D-d (mm)

NT1 (ĐC -) 0.0 0.0 0.0 0.0

NT6 (VKB-09. 30%) 10.5 11.0 8.5 12.0

0.0 0.0 0.0 0.0 9.0 11.5 6.0 10.0

NT2 (ĐMB-40.

30%)

11.5 13.5 15.0 14.5 NT7 (VKB-09. 50%)

13.5 13.0 14.0 11.5

13.0 14.5 15.5 12.5 14.5 13.0 12.0 10.5

NT3 (ĐMB-40.

50%)

13.0 12.5 14.0 13.5 NT8 (VKB-09. 80%)

13.5 12.5 15.0 16.0

15.0 16.0 16.0 15.5 15.0 16.0 17.0 18.0

NT4 (ĐMB-40.

80%)

13.5 15.0 13.0 16.0 NT9 (VKB-09.

100%)

13.5 14.0 13.0 12.5

15.0 17.5 17.0 17.0 16.0 17.5 17.0 14.0

NT5 (ĐMB-40.

100%)

18.0 17.5 18.0 16.5

19.0 18.0 16.0 20.0

Descriptives

Nghiệ

m thức

N Mean

Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence

Interval for Mean

Minimum Maximum

Lower

Bound

Upper

Bound

NT1 8 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00

NT2 8 13.7500 1.36277 .48181 12.6107 14.8893 11.50 15.50

NT3 8 14.4375 1.37419 .48585 13.2887 15.5863 12.50 16.00

NT4 8 15.5000 1.66905 .59010 14.1046 16.8954 13.00 17.50

NT5 8 17.8750 1.27475 .45069 16.8093 18.9407 16.00 20.00

NT6 8 9.8125 1.94454 .68750 8.1868 11.4382 6.00 12.00

53

NT7 8 12.7500 1.33631 .47246 11.6328 13.8672 10.50 14.50

NT8 8 15.3750 1.78786 .63210 13.8803 16.8697 12.50 18.00

NT9 8 14.6875 1.88864 .66774 13.1086 16.2664 12.50 17.50

Total 72 12.6875 5.17200 .60953 11.4721 13.9029 .00 20.00

ANOVA

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 1755.812 8 219.477 96.419 .000

Within Groups 143.406 63 2.276

Total 1899.219 71

Duncan

Nghiệ

m thức N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4 5 6

NT1 8 .0000

NT6 8 9.8125

NT7 8 12.7500

NT2 8 13.7500 13.7500

NT3 8 14.4375 14.4375

NT9 8 14.6875 14.6875

NT8 8 15.3750 15.3750

NT4 8 15.5000

NT5 8 17.8750

Sig. 1.000 1.000 .190 .052 .206 1.000

Phụ lục 5: TỈ LỆ DIỆN TÍCH BỆNH TRÊN LÁ VÀO 30. 40. 50 VÀ 60 NSS (%)

Descriptives

54

ANOVA

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

N Mean

Std.

Deviatio

n Std. Error

95% Confidence

Interval for Mean

Minimum Maximum

Lower

Bound

Upper

Bound

benhla1 NT1 8 .2856 .07268 .02570 .2248 .3463 .21 .40

NT2 8 .1611 .04521 .01599 .1233 .1989 .11 .22

NT3 8 .1729 .04654 .01645 .1340 .2118 .11 .24

NT4 8 .1897 .03829 .01354 .1577 .2217 .13 .25

NT5 8 .1917 .04910 .01736 .1507 .2328 .13 .26

Total 40 .2002 .06631 .01049 .1790 .2214 .11 .40

benhla2 NT1 8 .6951 .10131 .03582 .6104 .7798 .59 .84

NT2 8 .1888 .05386 .01904 .1437 .2338 .13 .26

NT3 8 .1934 .06504 .02300 .1390 .2478 .12 .27

NT4 8 .2537 .04790 .01694 .2137 .2938 .18 .31

NT5 8 .2706 .04182 .01479 .2357 .3056 .20 .31

Total 40 .3203 .20232 .03199 .2556 .3850 .12 .84

benhla3 NT1 8 1.3742 .23591 .08341 1.1770 1.5715 1.14 1.83

NT2 8 .2116 .04800 .01697 .1715 .2517 .15 .29

NT3 8 .2306 .06129 .02167 .1794 .2819 .16 .31

NT4 8 .3332 .03169 .01121 .3067 .3597 .29 .37

NT5 8 .3008 .06972 .02465 .2426 .3591 .22 .39

Total 40 .4901 .46324 .07325 .3419 .6382 .15 1.83

benhla4 NT1 8 1.6336 .27369 .09676 1.4048 1.8624 1.34 2.07

NT2 8 .2792 .02728 .00965 .2564 .3020 .25 .32

NT3 8 .2813 .05327 .01883 .2368 .3259 .22 .36

NT4 8 .3733 .06812 .02408 .3164 .4303 .27 .46

NT5 8 .3589 .09862 .03487 .2764 .4413 .20 .48

Total 40 .5853 .54772 .08660 .4101 .7604 .20 2.07

55

benhla1 Between

Groups .078 4 .019 7.286 .000

Within Groups .094 35 .003

Total .172 39

benhla2 Between

Groups 1.446 4 .362 84.321 .000

Within Groups .150 35 .004

Total 1.596 39

benhla3 Between

Groups 7.896 4 1.974 146.056 .000

Within Groups .473 35 .014

Total 8.369 39

benhla4 Between

Groups 11.050 4 2.762 148.758 .000

Within Groups .650 35 .019

Total 11.700 39

Duncan

benhla1

nt N

Subset for alpha =

0.05

1 2

Duncana NT2 8 .1611

NT3 8 .1729

NT4 8 .1897

NT5 8 .1917

NT1 8 .2856

Sig. .290 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are

displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size =

8.000.

56

benhla2

Nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3

Duncana NT2 8 .1888

NT3 8 .1934

NT4 8 .2537 .2537

NT5 8 .2706

NT1 8 .6951

Sig. .068 .609 1.000

benhla3

Nt N

Subset for alpha =

0.05

1 2

Duncana NT2 8 .2116

NT3 8 .2306

NT5 8 .3008

NT4 8 .3332

NT1 8 1.3742

Sig. .062 1.000

benhla4

nt N

Subset for alpha =

0.05

1 2

Duncana NT2 8 .2792

NT3 8 .2813

NT5 8 .3589

NT4 8 .3733

NT1 8 1.6336

Sig. .217 1.000

57

Phụ lục 6: TỈ LỆ GIẢM BỆNH TRÊN LÁ VÀO 30. 40. 50 VÀ 60 NSS (%).

Descriptives

N Mean

Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence Interval

for Mean

Minimum Maximum

Lower

Bound

Upper

Bound

TLGBL1 NT1 8 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00

NT2 8 60.7854 21.98431 7.77263 42.4061 79.1648 33.33 81.78

NT3 8 59.8403 24.68948 8.72905 39.1993 80.4812 20.00 84.15

NT4 8 53.3284 20.59142 7.28017 36.1136 70.5433 24.24 74.56

NT5 8 49.4987 21.89408 7.74072 31.1948 67.8026 16.67 73.72

Total 40 44.6906 29.80361 4.71236 35.1589 54.2222 .00 84.15

TLGBL2 NT1 8 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00

NT2 8 76.0751 13.45421 4.75678 64.8271 87.3231 58.06 90.55

NT3 8 74.5112 15.14794 5.35561 61.8472 87.1752 56.45 89.06

NT4 8 66.6755 14.09847 4.98456 54.8889 78.4621 47.46 84.28

NT5 8 68.5791 16.86440 5.96247 54.4801 82.6780 49.15 85.91

Total 40 57.1682 31.79742 5.02761 46.9989 67.3375 .00 90.55

TLGBL3 NT1 8 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00

NT2 8 82.2803 3.52516 1.24633 79.3332 85.2274 75.63 86.07

NT3 8 82.0225 5.67280 2.00564 77.2799 86.7651 74.79 88.41

NT4 8 76.7590 6.97147 2.46479 70.9307 82.5873 68.42 85.88

NT5 8 77.7821 8.30439 2.93604 70.8395 84.7248 68.29 87.66

Total 40 63.7688 32.81448 5.18842 53.2742 74.2634 .00 88.41

TLGBL4 NT1 8 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00

NT2 8 82.5283 3.25273 1.15001 79.8089 85.2476 76.47 86.07

NT3 8 82.0406 5.64487 1.99576 77.3214 86.7599 75.00 88.41

NT4 8 76.0814 7.84387 2.77323 69.5238 82.6391 66.18 85.88

NT5 8 76.8729 9.36331 3.31043 69.0450 84.7008 65.67 87.66

Total 40 63.5047 32.79430 5.18523 53.0165 73.9928 .00 88.41

58

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

TLGBL1 Between Groups 20668.280 4 5167.070 12.942 .000

Within Groups 13973.662 35 399.247

Total 34641.942 39

TLGBL2 Between Groups 33176.404 4 8294.101 46.406 .000

Within Groups 6255.556 35 178.730

Total 39431.960 39

TLGBL3 Between Groups 40859.610 4 10214.902 314.941 .000

Within Groups 1135.201 35 32.434

Total 41994.811 39

TLGBL4 Between Groups 40601.670 4 10150.417 264.827 .000

Within Groups 1341.498 35 38.329

Total 41943.168 39

Multiple Comparisons

Dependent Variable (I) nt

(J)

nt

Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error Sig.

95% Confidence

Interval

Lower

Bound

Upper

Bound

TLGBL1 Dunnett t (2-sided)a NT2 NT

1 60.78541* 9.99059 .000 35.2306 86.3402

NT3 NT

1 59.84026* 9.99059 .000 34.2855 85.3950

NT4 NT

1 53.32844* 9.99059 .000 27.7737 78.8832

NT5 NT

1 49.49871* 9.99059 .000 23.9439 75.0535

TLGBL2 Dunnett t (2-sided)a NT2 NT

1 76.07508* 6.68450 .000 58.9769 93.1733

NT3 NT

1 74.51124* 6.68450 .000 57.4131 91.6094

NT4 NT

1 66.67548* 6.68450 .000 49.5773 83.7737

59

NT5 NT

1 68.57906* 6.68450 .000 51.4809 85.6772

TLGBL3 Dunnett t (2-sided)a NT2 NT

1 82.28028* 2.84756 .000 74.9966 89.5640

NT3 NT

1 82.02249* 2.84756 .000 74.7388 89.3062

NT4 NT

1 76.75903* 2.84756 .000 69.4753 84.0428

NT5 NT

1 77.78213* 2.84756 .000 70.4984 85.0659

TLGBL4 Dunnett t (2-sided)a NT2 NT

1 82.52829* 3.09550 .000 74.6104 90.4462

NT3 NT

1 82.04064* 3.09550 .000 74.1227 89.9586

NT4 NT

1 76.08143* 3.09550 .000 68.1635 83.9994

NT5 NT

1 76.87292* 3.09550 .000 68.9550 84.7909

a. Dunnett t-tests treat one group as a control. and compare all other groups against it.

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Phân tích Duncan

TLGBL1

nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2

Duncana NT1 8 .0000

NT5 8 49.4987

NT4 8 53.3284

NT3 8 59.8403

NT2 8 60.7854

Sig. 1.000 .312

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.000.

60

TLGBL2

nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2

Duncana NT1 8 .0000

NT4 8 66.6755

NT5 8 68.5791

NT3 8 74.5112

NT2 8 76.0751

Sig. 1.000 .208

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.000.

TLGBL3

nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2

Duncana NT1 8 .0000

NT4 8 76.7590

NT5 8 77.7821

NT3 8 82.0225

NT2 8 82.2803

Sig. 1.000 .084

TLGBL4

Nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2

Duncana NT1 8 .0000

NT4 8 76.0814

NT5 8 76.8729

NT3 8 82.0406

NT2 8 82.5283

61

Sig. 1.000 .063

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Phụ lục 7: TỈ LỆ BỆNH TRÊN BÔNG VÀ TỈ LỆ GIẢM BỆNH BÔNG VÀO 85

NSS

Descriptives

N Mean

Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence

Interval for Mean

Minimu

m

Maximu

m

Lower

Bound

Upper

Bound

benhbong NT1 8 2.3800 .03464 .01225 2.3510 2.4090 2.32 2.42

NT2 8 .3012 .01808 .00639 .2861 .3164 .28 .34

NT3 8 .4688 .01959 .00693 .4524 .4851 .44 .50

NT4 8 .6112 .02031 .00718 .5943 .6282 .58 .64

NT5 8 .6150 .03162 .01118 .5886 .6414 .58 .67

Total 40 .8752 .77119 .12194 .6286 1.1219 .28 2.42

TLGBB NT1 8 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00

NT2 8 87.3416 .74361 .26291 86.7199 87.9633 85.95 88.43

NT3 8 80.3013 .86792 .30686 79.5757 81.0269 78.88 81.28

NT4 8 74.3141 .87505 .30938 73.5826 75.0457 73.28 75.83

NT5 8 74.1443 1.60803 .56852 72.7999 75.4886 71.12 75.73

Total 40 63.2203 32.39780 5.12254 52.8589 73.5816 .00 88.43

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

benhbong Between Groups 23.171 4 5.793 8.716E3 .000

Within Groups .023 35 .001

Total 23.195 39

TLGBB Between Groups 40902.486 4 10225.622 1.098E4 .000

Within Groups 32.604 35 .932

Total 40935.090 39

62

Multiple Comparisons

Dependent Variable (I) nt (J) nt

Mean

Difference (I-

J) Std. Error Sig.

95% Confidence

Interval

Lower

Bound

Upper

Bound

benhbong Dunnett t (2-sided)a NT2 NT1 -2.07875* .01289 .000 -2.1117 -2.0458

NT3 NT1 -1.91125* .01289 .000 -1.9442 -1.8783

NT4 NT1 -1.76875* .01289 .000 -1.8017 -1.7358

NT5 NT1 -1.76500* .01289 .000 -1.7980 -1.7320

TLGBB Dunnett t (2-sided)a NT2 NT1 87.34160* .48258 .000

86.107

2 88.5760

NT3 NT1 80.30133* .48258 .000

79.066

9 81.5357

NT4 NT1 74.31411* .48258 .000

73.079

7 75.5485

NT5 NT1 74.14428* .48258 .000

72.909

9 75.3787

a. Dunnett t-tests treat one group as a control. and compare all other groups against it.

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Phân tích Duncan

benhbong

nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4

Duncana NT2 8 .3012

NT3 8 .4688

NT4 8 .6112

NT5 8 .6150

NT1 8 2.3800

Sig. 1.000 1.000 .773 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

63

TLGBB

nt N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4

Duncana NT1 8 .0000

NT5 8 74.1443

NT4 8 74.3141

NT3 8 80.3013

NT2 8 87.3416

Sig. 1.000 .727 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.000.

64

Phụ lục 8: HÌNH ẢNH THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG P.oryzae TRÊN

LÚA CỦA HAI CHỦNG XẠ KHUẨN

Hình 19. Dịch nuôi xạ khuẩn 7 ngày Hình 20. Xuất hiện bệnh sau 20NSS

64

Hình 22. Nghiệm thức NT2 50NSS Hình 21. Nghiệm thức NT1 50NSS Hình 23. NT3 50NSS

Hình 24. NT4 50NSS

Hình 25. NT5 50NSS

65

Phụ lục 9: HÌNH ẢNH NẤM ĐẠO ÔN CHỦNG LÊN LÚA

Hình 28. Đạo ôn cổ gié và cổ bông ở nghiệm thức NT1 (ĐC-)

Hình 27. Đạo ôn cổ lá (trái) và cổ bông (phải) ở nghiệm thức

NT1

Hình 26. Vết bệnh cấp 5 ở NT1

Hình 29. Bào tử và khuẩn lạc nấm đạo ôn P.oryzae

66

Phụ lục 10: HÌNH ẢNH MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƢỢC

Hi

Hình 30. Khuẩn lạc một số chủng xạ khuẩn

67

Phụ lục 11: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THU MẪU ĐẤT TẠI CÁC RUỘNG LÚA

Hình 31. Thu mẫu tại ruộng xã Định Mỹ