St. Laurent Institute

МИЭТ

Секвенирование одиночных молекул ДНК и РНК

Существующие и разрабатываемые технологии секвенирования одиночных молекул ДНК и РНК

Докладчик: Трошин В.В. vladislav.troshin@gmail.com

Контакты: Чаплыгин Е.Ю.chaplyginey@gmail.com

Проблемы существующих технологий секвенирования ДНК и РНК

Для секвенирования нужна сложная обработка ДНК и РНК

Все современные технологии секвенирования используют дополнительные нуклеотиды, метки, амплификацию и другие методы, которые вводят количественные ошибки и артефакты.

Использование амплификации и лигации, как промежуточных шагов в приготовлении библиотек сильно искажает исходную популяцию ДНК/РНК. Это особенно важно для количественного измерения уровня различных молекул РНК.

A T A G AGGC T A GC T GT AG A CG CT C

A ? ? G AGGC T A GC T GT AG A CG CT C

A ? ? G A?GC T A G? T GT AG A CG ?T C

A ? ? G A??C T A G? T ?T A? A CG ?T C

A ? ? G A??C T A G? T ?T ?? A ?G ?T C

С каждой стадией увеличивается число ошибок…

Рак может быть вызван перерождением всего одной клетки. Ни одна из современных технологий не позволяет понять какой именно и почему…

Усреднение информации

Все современные технологии позволяют получить только усреднённую информацию со множества копий ДНК из множества клеток, тогда как генетические механизмы даже двух соседних клеток могут различаться (например, различие раковой и нормальной или нервной клетки и клетки глии, или даже двух соседних нервных клеток).

Выделить ДНК и/или РНК и их надёжно (без сильной амплификации) проанализировать из той единственной клетки, что привела к образованию опухоли невозможно.

Проблема определения модификаций ДНК и РНК

Все современные технологии секвенирования (оптические и полупроводниковые) позволяют считывать только последовательность основных 4 нуклеотидов (A, T/U, G, C в ДНК и РНК). В действительности, в ДНК и РНК присутствуют более 200 различных модификаций этих нуклеотидов, каждая со своей биологической функцией.

Ни одна из существующих технологий не может считать последовательность модификаций нуклеотидов.

Есть технологии для прочтения отдельных модификаций, но это увеличивает количество необходимых операций по подготовке ДНК к секвенированию.

Транскрипция Трансляция ДНК

Белки

Секвенирование РНК

Ни одна из существующих технологий не позволяет полноценно проводить секвенирование РНК без ее трансформации в ДНК. Это усложняет технологию и приводит к большому числу ошибок.

Нуклеотидная последовательность ДНК, составляющая генетический код, несет в себе информацию о наследственных признаках всех живых организмов. Т.е. информациюо функционировании и внешнем виде человека, животных, растений, бактерий, грибов, вирусов и других организмов.

Существующие технологии секвенирования одиночных

молекул нуклеиновых кислот

Pacific Bioscience (PACBIO RS II)

Принцип работы этого устройства основан на использовании свойств ближнего (эванесцентного) поля.

Для освещения объекта и детектирования сигнала используется апертура, размер которой может быть существенно меньше длины волны (d << λ). Это необходимо для локализации электромагнитного поля.

Т.е. это тысячи флюоресцентных микроскопов…

Для подтверждения факта регистрации присоединения нуклеотида используются флюоресцентные метки.

По различным характеристикам флюоресценции в некоторых случаях возможно определение химических модификаций нуклеотидов.

Helicos Biosciences

Работа этого устройства основана на регистрации флюоресценции при присоединении меченых нуклеотидов.

Технология Helicos – закономерное развитие первых NGS систем до уровня секвенирования одиночных молекул.

Увидеть и секвенировать одиночные молекулы ДНК и РНК в оптический микроскоп!

7500 фрагментов. Изображение с 1-ой из 4-х ПЗС-матриц Heliscope.Т.е. 500 Mbp/run

Почти все существующие NGS системы, как для секвенирования массивов копий фрагментов ДНК, так и одиночных молекул – специализированные микроскопы.

Исключение: «полупроводниковые технологии». Принцип регистрации какого-либо сигнала при присоединении отдельных нуклеотидов сохраняется.

Нуклеотидная последовательность ДНК, составляющая генетический код, несет в себе информацию о наследственных признаках всех живых организмов. Т.е. информациюо функционировании и внешнем виде человека, животных, растений, бактерий, грибов, вирусов и других организмов.

Проблемы существующих технологий секвенирования одиночных молекул

Малая интенсивность сигнала – требуются дорогие чувствительные детекторы.

Сигнал исходит только с единственной молекулы – высокий процент ошибок при считывании.

Подготовка чипов требует сложных технологий микроэлектроники. Например, электронной литографии.

Высокая техническая сложность и чувствительность к внешним условиям – вибрациям, колебаниям температуры и т.д. Требуется соответсвующая защита.

При всем этом перспективность подхода мотивирует многие

компании разрабатывать новые технологии

секвенирования одиночных молекул

Секвенирование с использованием пор

Для секвенирования с использованием пор предлагают различные технологии. В общем виде технологии основаны на том, что при прохождении ДНК через пору регистрируется какой-либо сигнал.Это может быть ионный ток, туннельный ток, изменение ёмкости, флюоресценция и т.д.Предложено несколько технологий для создания таких систем.

Секвенирование с использование зондовых микроскопов

Технологии основаны или на прямой визуализации молекул ДНК или РНК, или на добавлении меток для определения нуклеотидов.

Основной недостаток такого подхода – трудности при работе в жидкости.

Кроме перечисленных технологий предлагается большое число различных подходов для секвенирования нуклеиновых кислот

Создание различных микросенсоров. Т.е. регистрация изменения pH, температуры, электрических характеристик.

Использование различных методик электронной микроскопии – метки на основе тяжёлых металлов, изменение характеристик рассеяния электронов и т.д.

Использование изменения различных оптических характеристик.

Но, все эти методики не предназначены для чтения модификаций нуклеотидов.

Использование спектроскопии Комбинационного рассеяния (Рамановского рассеяния) для

секвенирования ДНК и РНК

Tip-Enhanced Raman Spectroscopy of Single RNA Strands: Towards a Novel Direct-Sequencing MethodElena Bailo and Volker Deckert

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 1658 –1661

Физическая реализуемость подхода уже продемонстрирована

Работу по этому направлению ведут многие компании…

Такие как Intel, IBM, HP и многие другие…

Почему?

- Возможно чтение модификаций нуклеотидов;

- Не требуется использование меток;

- ДНК или РНК может находится в нативной среде.

Нуклеотидная последовательность ДНК, составляющая генетический код, несет в себе информацию о наследственных признаках всех живых организмов. Т.е. информациюо функционировании и внешнем виде человека, животных, растений, бактерий, грибов, вирусов и других организмов.

Какую технологию предлагает разработать наша компания?

Компания «Нано Вижин» предлагает разработать технологию спектрального секвенирования одиночных молекул ДНК и РНК

- Чтение химических модификаций нуклеотидов

- Секвенирование одиночных молекул ДНК и РНК

- Нет необходимости в амплификации

- Секвенирование транскриптов целиком и ДНК хромосомной длины

Каким образом?

Рамановская (КР) спектроскопия

Уменьшение частотырассеянного излученияназывается Стоксовымрассеянием.

Лазерноеизлучение.

Отраженное и рассеянное излучение.

Рамановскийспектр (спектр КР)

Отраженное и рассеянное излучение.

Спектры КРвозникаютпри любомизлучении,но толькопри исполь-зованиилазерного излученияможнорасшифро-ватьспектры.

1. Большинство органических веществ имеет рамановский (КР) спектр. 2. Каждое вещество имеет свой рамановский (КР) спектр.

3. Зная рамановский (КР) спектр, можно понять с какого органического соединения он получен.

Есть рассеяние сувеличением частоты,но оно гораздо слабее Стоксова рассеяния.

Рамановская (КР) спектроскопия ДНК

H

G

Цитозин

В общем виде спектр ДНК илиРНК состоит из спектров соста-вляющих эти молекулы частей.

Для расшифровки последова-тельности азотистых основанийв нуклеиновой кислоте необходи-мо знать, какому основаниюсоответствует тот или иной пикв общем спектре.

В зависимости от числа различ-ных оснований в участке ДНК,с которого получают спектр,различным будет и общий спектрс молекулы.

В общих спектрах, полученныхметодами классической или конфокальной спектроскопии,собраны отдельные спектры от 450-1500 нуклеотидов.

Это затрудняет расшифровкунуклеотидной последова-тельности ДНК. Поэтому необходимы другие методы получения спектров.

Длина волны по которой получали изображение

Спектральная микроскопия

При совмещении оптического микроскопа со спектрометром с участка образца в фокусе микроскопа можно получить спектр или изображение по одной из длин волн.

Такой способ может подтвердить факт наличияДНК на поверхностиили в образце и даже приблизительно датьего положение.

При хорошей фокусировке и использовании чувствительных детекторов можнополучить спектр с области размером в половину длины волны.

Образец

Образец

Спектр по всему изображению

Точка в которой получали спектр

Спектр в точке В “точке” получения спектра может находиться огромное число молекул.Спектр будет состоять из отдельных спектров всех соединений, но определитьможно только вещества с самой большойконцентрацией.

Изображение по выбранной длине волны

Конфокальная спектроскопия

При совмещении конфокального микроскопа со спектрометром можно получать конфокальные спектральные изображения.

Этот метод позволяет получить спектры в отдельныхточках и построить из точек карту распределениявеществ в образце и их концентрацию. Данный метод широко используется в современныхнаучных и аналитических лабораториях по всемумиру.

Образец

Изображение

Общий спектр

Спектры в отдельных точках

Спектроскопия одиночных молекул ДНК

Образец

В оптический микроскоп будет видно только ровнуюповерхность.Отдельные молекулы ДНКне видны.

Спектральное изображениеполучается размытым.В каждой точке собраны спектры от сотеннуклеотидов.

Точное положение и последова-тельность нуклеотидов в ДНК определить нельзя. Определяется только факт наличия на поверхности нуклеиновых кислот.

Изображение ДНК

При таком методе нельзя восстановить нуклеотидную последовательность ДНК или РНК. Таким образом, необходимо увеличить интенсивность спектров и увеличить разрешение.Но в рамках классических методов микроскопии это практически невозможно без применениядополнительных соединений или методов исследования.

Поверхностный плазмонный резонансПадающее излучение

Частицы или молекулы на поверхности

Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа

При наложении двух колебаний с совпадающей частотойнаблюдается увеличение амплитуды колебаний (резонанс)

Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа

Первоначальные колебания

Колебания с увеличившейся амплитудой

Поверхностный плазмонный поляритон,электромагнитная волна, возникающая привзаимодействии света с колебаниями электронов на поверхности. При взаимо-действии с частицами на поверхности илинеровностями поверхности часть энергии поляритона испускается в виде излучения.При совпадении частот происходит усилениеамплитуды такого излучения. Т.н. плазмонныйрезонанс.

резонанс.Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа

Свободные электроны - составляют свобо-дный электронный газ

Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа

Ионы металла - узлы кристаллической решетки

Плазмон - квазичистица, квант колебаний свободного электронного газа

При наложении двух колебаний с совпадающей частотойнаблюдается увеличение амплитуды колебаний (резонанс)

Рассеянноеизлучение

Усиленное излучение

Усиление наблюдается на многих металлах.Окисление поверхности ослабляет сигнал и вноситспектры оксидов.Самый интенсивный сигналможно получить на нано-структурированных меди,серебре и золоте.Поверхность должна бытьшероховатой (перепад несколько нанометров) илисостоять из наночастиц.

Спектральное изображениеи спектр в одной из точек вслучае нахождения ДНК наповерхности (без эффектаусиления).

Поверхностно-усиленная спектроскопия ДНК

29

Cu

79

Au

47

Ag

Металлическая подложка

Где-то там ДНК.

Область усиления

Спектральное изображениеи спектр в одной из точек вслучае нахождения ДНК наповерхности (с эффектомусиления, например на поверхности серебра).

Сфокусиро-ванный ла-зерный луч

Поверхностно-усиленная спектроскопия ДНККак это выглядит на практике?

Если на поверхность серебра осадить молекулы ДНК или РНК, то при получении спектра комбинационного рассеяния наблюдается усиление сигнала.

Характерные пики химических связей в молекулах нуклеиновых кислот позволяют понять из каких нуклеотидов состоит выбранный участок ДНК или РНК.

Спектр в каждой точке

Полное изображение содержит спектр в каждой точке и состоит из тысяч отдельных спектров.

Расшифровка спектров позволяет расшифровать последовательность

На изображениях спектральная картина распределения ДНК по поверхности серебра. Изображение составлено из 5000 индивидуальных спектров. На одном из спектров показано к какому основанию относится тот или иной пик.

Прямое секвенирование ДНК

Для прямого секвернирования одиночных молекул ДНК или РНК методами оптической спектроскопии необходимо устройство, подходящее под определенные требования.

Специализированный чип

Усиление на зондах

Усиление на подложках

Методики подготовки образцов

Лазеры для спектроскопии

Чувствительный детектор

Конфокальный спектрометр

Нужны интенсивные спектры ДНК

Нужны спектры с минимального количества ДНК

Необходимо регистрировать слабые спектры

Необходимо визуализировать отдельные молекулы ДНК

Необходимо устройство для точного перемещения

Необходимо устройство для сканирования

Нужны спектры ДНК

Как устроен чип для секвенирования?

Или так…

A - ЛазерB - Оптико-механический модульC - Оптический микроскопD - Спектральный конфокальный модульE - CCD матрицаF - Лазерный конфокальный модуль

Прямое секвенирование ДНК. Схема прибора.

Специализированный чип для секвенирования