Embed Size (px)
Citation preview
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS
THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THỦY
Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 -
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **
NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS
THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN
Giáo viên hƣớng dẫn: Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng Nguyễn Nhƣ Nhứt
Thành phố Hồ Chí Minh- 2007 -
Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thanh Thủy
iii
LỜI CẢM ƠN
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã luôn trăn trở, lo lắng và động
viên để tôi có đƣợc ngày hôm nay.
Xin tỏ lòng biết ơn đến tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt quá trình học tại trƣờng.
Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến chị Trƣơng Phƣớc Thiên
Hoàng và anh Nguyễn Nhƣ Nhứt đã tận tình hƣớng dẫn, động viên tôi trong thời gian
thực hiện khóa luận.
Cảm ơn các anh và các bạn tại phòng sinh hóa ứng dụng của trƣờng Đại học
Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt
nghiệp.
Cảm ơn Hồng Vy và Phƣơng Uyên, hai ngƣời bạn thân nhất của tôi đã chia xẻ
và giúp đỡ tôi trong 4 năm học tại trƣờng.
iv
TÓM TẮT
Nguyễn Thanh Thủy, Đại học Nông Lâm TP. HCM
Đề tài nghiên cứu “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng
trong sản xuất dextrin”, thực hiện tại phòng sinh hóa và ứng dụng của trƣờng Đại học
Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM từ 19/03/2007 - 19/07/2007.
GVHD: ThS. Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng
ThS. Nguyễn Nhƣ Nhứt
Đối tƣợng nghiên cứu là α-amylase của Bacillus subtilis
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hoà tan trong nƣớc,
phƣơng pháp Heinkel xác định hoạt độ α-amylase để khảo sát thời gian nuôi cấy, tỷ lệ
tủa α-amylase bằng cồn 96% và (NH4)2SO4, khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến
khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis thích hợp để thu α-amylase là 48 giờ.
- Tỷ lệ tủa α-amylase bằng cồn 96% tốt nhất là 1 thể tích dịch chiết enzyme và 3
thể tích cồn. Thời gian tủa là 15 phút.
- pH và nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân của chế phẩm α-amylase là 6,0
và 55oC.
- Lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất từ sự thủy phân bột năng 10%.
v
ABSTRACT
NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city
Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state
fermentation and dextrin production application”. This thesis was carried out at
biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from
03/2007 to 09/2007.
We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein
concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, α-
amylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate. After
recovering α-amylase from fermented medium we examined starch hydrolysis
ability and dextrin production of α-amylase product.
Result experiments showed that:
- α-amylase activity was hightest at 48h incubation.
- Precipiating α-amylase by 96% ethanol was better than solid ammonium
sulfate and suitable volume ratio of extracted enzyme and ethanol for
precipitation was 1:3.
- Optimum temperature and pH for hydrolysis of purified α-amylase were
respective 55 degree C and 6,0.
- α-amylase had the most effective hydrolysis in 10% cassava starch fluid.
vi
MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn................................................................................................................ iii
Tóm tắt....................................................................................................................... iv
Abstract.......................................................................................................................v
Mục lục.......................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt...........................................................................................ix
Danh sách các hình......................................................................................................x
Danh sách các bảng....................................................................................................xi
Danh sách các sơ đồ...................................................................................................xii
Danh sách các đồ thị..................................................................................................xii
Danh sách các biểu đồ...............................................................................................xii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU.........................................................................1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
1.2. MỤC ĐÍCH......................................................................................................2
1.3. YÊU CẦU........................................................................................................2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................3
2.1. BACILLUS SUBTILI.....................................................................................3
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn.....................................................................................3
2.1.2. Phân loại...................................................................................................6
2.1.3. Bộ gen.......................................................................................................6
2.1.4. Ứng dụng..................................................................................................7
2.2. ALPHA-AMYLASE........................................................................................8
2.2.1. Khái niệm..................................................................................................8
2.2.2. Phân loại, danh pháp.................................................................................8
2.2.3. Cấu trúc phân tử........................................................................................ 8
2.2.4. Tính chất...................................................................................................9
2.2.5. Cơ chế xúc tác.........................................................................................10
2.2.6. Ứng dụng................................................................................................11
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT......................................12
vii
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt.......................................................................................12
2.3.2. Nuôi cấy chìm.........................................................................................12
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME...............................................................13
2.5. DEXTRIN......................................................................................................13
2.5.1. Phân loại.................................................................................................14
2.5.2. Tính chất.................................................................................................14
2.5.2.1. Độ nhớt........................................................................................15
2.5.2.2. Độ pH...........................................................................................16
2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin...........................................................16
2.5.2.4. Độ hòa tan....................................................................................16
2.5.2.5. Màu sắc........................................................................................16
2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin.......................................................................17
2.5.4. Ứng dụng................................................................................................18
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.........................................19
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM..........................................................................19
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................19
3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM...................................................................20
3.3.1. Xác định mật độ tế bào............................................................................20
3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy thích hợp......................................................20
3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%.................................................20
3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4..............................................................................21
3.3.5. Khảo sát thời gian tủa enzyme bằng cồn 96%.........................................21
3.3.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân của
α-amylase..........................................................................................................22
3.3.6.1. Nhiệt độ.......................................................................................22
3.3.6.2. pH................................................................................................22
3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin..................................................22
3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân của chế phẩm α-amylase với các
nguồn tinh bột.......................................................................................................22
3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột...................22
3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp.............................................23
3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU..............................................................23
viii
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................24
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY........................................24
4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ
(NH4)2SO4........................................................................................................................................................................................... 25
4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%..................................................24
4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4.................................................................................27
4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% .. 28
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE...........................................................29
4.4.1. Nhiệt độ...................................................................................................29
4.4.2. pH...........................................................................................................30
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN...........31
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM
α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT....................................................32
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN
THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE...................32
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................38
PHỤ LỤC
ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis Bacillus subtilis
GH Glycosidic Hydrolase
EC Enzyme Commission
DAP Diamoni Phosphate
MW Molecular Weight
Da Dalton
DE Dextrose equivalent
CT Canh trƣờng
dOD Delta optical density
DCE Dịch chiết enzyme
CPE Chế phẩm enzyme (đã sấy khô)
CP tƣơi Chế phẩm enzyme tƣơi
UI Unit International
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình thái Bacillus subtilis........................................................3
Hình 2.2. Bacillus subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử.....................................4
Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa...........................................................4
Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase..............................................................9
Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột.............................................11
Hình 2.5. Dextrin.......................................................................................................14
Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy......................................................25
Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ...............................................................25
Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase...........................................30
Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase..................................................................................36
Hình 4.5. Chế phẩm dextrin.......................................................................................36
xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis.......................................5
Bảng 2.2. phân loại của Bacillus subtilis...................................................6
Bảng 2.3. Một số tính chất của dextrin.......................................................................15
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase..........................24
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase.................................26
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase.....................................27
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase....................28
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase...................................29
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase...........................................30
Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96%.............................................31
Bảng 4.8. Dextrin tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10%.............................32
Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin..................................................................................33
Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10%....................................33
Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15%....................................34
Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20%....................................35
xii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột............................................17
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase.........................25
Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase...............................26
Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên hoạt độ α-amylase....................................27
Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên hoạt độ α-amylase...................28
Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase..................................29
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase..........................................31
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96%.........................................31
Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10%...................32
Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10%.................34
Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15%.................34
Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20%.................35
1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…
Trong công nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Thông qua
sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng nhƣ
dextrin, maltose, glucose…
Trƣớc đây, ngƣời ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với nền
công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc áp dụng
những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lƣợng lớn α-
amylase là rất cần thiết.
Dextrin là sản phẩm do sự thủy phân tinh bột của α-amylase. Ngoài giá trị dinh
dƣỡng, dextrin còn là một trong những yếu tố cải thiện tính chất, cảm quan của thực
phẩm. Vì vậy, dextrin ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm và
công nghiệp bánh kẹo.
Sản xuất dextrin từ tinh bột có thể dùng acid hay enzyme. Tuy nhiên, sản xuất
dextrin bằng acid có rất nhiều hạn chế là khó định hƣớng sản phẩm do tác dụng không
đặc hiệu của acid lên nguyên liệu, độc hại nên đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền,
lƣợng acid dƣ gây hƣ hỏng thiết bị và làm ô nhiễm môi trƣờng. Mặc khác, dextrin
thành phẩm có màu và vị đắng.
Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất
dextrin sẽ khắc phục đƣợc những hạn chế trên.
2
Dextrin thu đƣợc nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung tính,
ít ngọt, sạch khuẩn, khoáng và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong nhiều
ngành công nghiệp và trong y dƣợc.
Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu
nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”.
1.2. MỤC ĐÍCH
Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân của α-
amylase và tinh bột để thu nhận dextrin.
1.3. YÊU CẦU
- Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng bán rắn ở
điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trƣớc.
- Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy B.subtilis.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo
dextrin của chế phẩm α-amylase.
3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu
khí hay kỵ khí tùy ý. Thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất.
Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dƣỡng có dạng hình que, kích
thƣớc chiều rộng từ 0,7 - 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 - 3,0 μm. Không kết thành chuỗi, bắt
phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang.
Hình 2.1. Bacillus subtilis
(URL: http://www.ami-tech.co.kr/customer/img/img_08.jpg)
Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thƣớc chiều rộng 0,6 -
0,9 μm, chiều dài 1,0 - 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối
tế bào, phần lớn đƣợc tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có
khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (Trần Đỗ Quyên, 2004).
4
Hình 2.2. B. subtilis đang trong giai đoạn tạo bào tử. Cấu trúc
hình oval
ở trung tâm là bào tử (URL: ec.europa.eu/research/success/images/0291b.jpg).
Khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đĩa khuẩn lạc tròn, không đều hay phân
tán. Đƣờng kính khuẩn lạc từ 3 - 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cƣa. Sau 1
- 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).
Hình 2.3. Khuẩn lạc B. subtilis trên thạch đĩa
Trong môi trƣờng lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử
chiu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hƣ hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị
khó chịu.
Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhƣng không tạo
khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium).
Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí,
không sinh khí từ môi trƣờng lỏng chứa nitrate.
Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy
gelatine nhanh chóng.
5
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis
Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính Catalase +
Sinh Indol -
MR +
VP +
Sử dụng Citrate +
Khử Nitrate +
Tan chảy gelatin +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Manitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
(Theo Holt, 1992)
Nhiệt độ tối thích của B. subtilis vào khoảng 36 - 50oC. Nhiều loài vẫn phát
triển đƣợc ở 60oC. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển là 10 - 15% (Lƣơng Đức
Phẩm, 2000).
Ngƣời ta đã chứng minh B. subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism).
Chúng dùng cách này nhƣ một phƣơng pháp đơn giản để thoát khỏi những trƣờng hợp
điều kiện sống giới hạn.
B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau
nhƣ: subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins,
bacillanene, difficidin…(theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
6
Phân bố trong đất và các chất hữu cơ bị phân hủy và là một đối tƣợng dùng
trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí nghiệm (Trần Đỗ Quyên,
2004).
B. subtilis không đƣợc xem là mầm bệnh gây bệnh cho ngƣời. Chúng
thƣờng có trong thực phẩm nhƣng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm.
2.1.2. Phân loại
Bảng 2.2. Bảng phân loại của Bacillus subtilis
Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: subtilis
Tên kép
Bacillus subtilis
(Ehrenberg 1835
Cohn 1872)
2.1.3. Bộ gen
Năm 1997, ngƣời ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B.
subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn.
Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4100 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen
không thể thiếu đƣợc, 79 gen đƣợc dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có
liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.
7
2.1.4. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là
một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lƣợng khá lớn (15-20%)
từ tinh bột.
Trong y dƣợc, Bacillus subtilis đƣợc đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml
trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dƣờng ruột do lị
trực trùng, đắp các vết thƣơng lở loét ngoài da (Trần Đỗ Quyên, 2004).
Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây
bệnh nhƣ nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,... Ngƣời
ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp
các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium). Khả năng này đƣợc
ứng dụng trong kiểm soát sinh học.
Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức
ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trƣởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia
súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lƣợng nƣớc ao, hạn chế bệnh cho thủy
sản nuôi.
Hệ enzyme của B. subtilis đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa.
Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại của
nitrogen, carbon dioxide, và nƣớc.
Một chủng Bacillus subtilis đƣợc biết trƣớc đây là Bacillus natto đƣợc
dùng trong sản xuất thực phẩm thƣơng mại của Nhật tƣơng tự nhƣ thực phẩm
cheonggukjang của Hàn Quốc.
B. subtilis tái tổ hợp đƣợc sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates
(PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải nhƣ là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản
xuất PHA giảm.
8
2.2. ALPHA-AMYLASE
2.2.1. Khái niệm
α-amylase là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside nằm bên
trong phân tử tinh bột và glycogen.
Là một enzyme kim loại. Nếu không có sự hiện diện của ion Canxi trong phân
tử enzyme sẽ không hoạt động đƣợc.
α-amylase phân cắt cacbonhydrate chuỗi dài tạo maltotriose và maltose từ
amylose hay tạo maltose, glucose và dextrin từ amylopectin.
Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động
phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase. Ở động vật, α-amylase là enzyme tiêu
hóa chính.
2.2.2. Phân loại, danh pháp α-amylase
α-amylase: (1,4-α-D-glucan glucanhydrolase) thuộc nhóm enzyme thủy
phân (hydrolase), họ 13 (GH 13), mã số EC 3.2.1.1.
Xúc tác phản ứng nội thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucosidic trong chuỗi
đƣờng đa có chứa 3 hoặc nhiều hơn những đơn vị D-glucose liên kết với nhau ở vị
trí α-1,4.
Tên khác: glycogenase; endoamylase; Taka-amylase A. Tên
hệ thống: 1,4-α-D-glucan glucanhydrolase.
2.2.3. Cấu trúc phân tử
Gồm 3 tiểu đơn vị A, B, C. A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trƣng helix
(α/β)8 - barrel, đƣợc nối với tiểu đơn vị C (C-terminal) có cấu trúc 8 đoạn β-sheet
song song. Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β-sheet đƣợc lồng vào giữa đoạn β-sheet thứ
ba và đoạn β-helix thứ hai của tiểu đơn vị A. Tiểu đơn vị B quyết định độ bền và
liên kết enzyme và cơ chất. Một ion Canxi nối giữa hai tiểu đơn vị A và B.
Tùy thuộc vào dạng enzyme mà có thể có một số tiểu đơn vị khác đƣợc gắn vào
đầu C- hay đầu N- của phân tử protein.
Trung tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhóm -COOH và -NH2 (Trần Đỗ
Quyên, 2004).
9
Khối lƣợng phân tử α-amylase khác nhau ở các loài Bacillus.
α-amylase vi khuẩn công nghiệp chủ yếu đƣợc sản xuất từ B. subtilis var.
amyloliquefaciens và var. amylosacchariticus có trọng lƣợng phân tử (MW) là
49.000 dalton (Da) (theo Fisher và Stein, 1960) và 60.000 Da (Geranum, 1979). Khi có
mặt Zn, enzyme sẽ liên kết tạo dạng dimer có MW 100.000 Da.
α-amylase không chứa co-enzyme, tuy nhiên nó cũng cần 1 nguyên tử gam Ca2+
cho 1 mol enzyme để ổn định cấu trúc và ngăn không cho protease phân hủy enzyme
(Nguyễn Tiến Thắng, 2005).
Hình 2.4. Cấu trúc không gian của α-amylase.
(URL: plaza.snu.ac.kr/~sewonsuh/home/structures.html)
2.2.4. Tính chất α-amylase
Tính chấy đặc trƣng của α-amylase là khả năng dextrin hóa cao nên làm cho
phản ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Kết quả tác động của α-
amylase thƣờng làm giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột do đó ngƣời ta gọi α-
amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
α-amylase dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối, dung dịch đệm và
rƣợu loãng.
α-amylase hoạt động không cần chất hoạt hóa và cần Ca với vai trò là
một đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột. Canxi có tác dụng ổn định tốt α-
amylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng độ bền của α-amylase
10
trƣớc các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy của protease (Lƣơng Đức
Phẩm, 1998).
pH tối ƣu của α-amylase vi khuẩn trong khoảng 6,0 - 7,0. α-amylase bị
bất hoạt nhanh ở pH thấp 4,5 - 4,7 và khi có mặt các tác nhân tạo phức với Canxi nhƣ
EDTA, polyphosphate, oxalate, chlorine tự do và các chất oxy hóa (Nguyễn Tiến
Thắng, 2005).
α-amylase của vi khuẩn thƣờng bền nhiệt hơn α-amylase từ các loài vi
sinh vật khác và cây trồng, chúng vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ mà α-amylase của
nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt . Nhiệt độ tối ƣu của α-amylase trong khoảng 54 -
63oC (Hopek, 2006). Đối với α-amylase của Bacillus subtilis nhiệt độ tối ƣu có thể
đạt đến 70 - 80oC.
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần các amino acid khác
nhau, mỗi loại α-amylase đƣợc cấu tạo từ một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. Tuy
nhiên, hàm lƣợng tryptophan, tyrosine thƣờng chiếm ƣu thế. Các glutamic acid và
aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lƣợng amino acid cấu thành phân tử enzyme (Trần
Đỗ Quyên, 2004).
2.2.5. Cơ chế xúc tác
Phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase thƣờng xảy ra qua hai giai đoạn
Giai đoạn đầu là giai đoạn dịch hóa: chỉ một số liên kết trong phân tử bị
đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.
Giai đoạn tiếp theo là sự thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo
thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose và các dextrin phân tử
thấp. Tuy nhiên, thƣờng α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin
phân tử thấp, không cho màu với Iod và một ít maltose (Trần Đỗ Quyên, 2004).
α- amylase Tinh bột α-Dextrin + Maltose + Glucose
H2O
11
Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột
2.2.6. Ứng dụng của α-amylase
Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay do ứng dụng của nó trong nhiều
lĩnh vực nhƣ thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghiệp dệt, chăn nuôi…
Trong công nghiệp thực phẩm:
- Sản xuất rƣợu, bia, nƣớc trái cây.
- Sản xuất bánh, bánh mì: trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ cốc
nhƣng hàm lƣợng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải thiện
tính chất của bánh nhƣ làm tăng độ nở xốp và mùi vị của bánh.
- Chế biến tinh bột, sản xuất đƣờng maltose, syro glucose, syro
fructose. Dịch giàu glucose đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, công
nghiệp lên men, sản xuất nƣớc trái cây, làm mứt. Glucose tinh thể đƣợc sử dụng
trong y tế, trong khẩu phần dinh dƣỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền. Syro
fructose đƣợc dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lƣợng, bánh kẹo, nƣớc quả
và sản phẩm sữa…
Làm mềm vải trong công nghiệp dệt:
Trong sản xuất vải có giai đoạn hồ hóa làm vải chắc hơn, ngƣời ta hồ hóa
bằng tinh bột. Sau khi dệt ngƣời ta phải loại bỏ chất tham gia hồ hóa bằng cách xử lý
với α-amylase.
Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa:
Bổ sung hỗn hợp α-amylase, cellulase, β-glucanase… vào sinh khối cỏ ủ chua
nhằm tăng năng suất tiêu hóa của vật nuôi.
12
Bổ sung α-amylase, protease vào khẩu phần thức ăn cho heo con dƣới 5 tuần
tuổi nhằm gia tăng tốc độ phát triển của heo con, ngăn phát sinh bệnh tiêu chảy phổ biến
ở heo con (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).
Trong y học: chẩn đoán bệnh lâm sàng các bệnh thông thƣờng và các bệnh
thiếu enzyme.
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT SẢN XUẤT ENZYME
Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phƣơng
pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.
Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng rắn (bề mặt) có một số ƣu
việt hơn so với phƣơng pháp chìm. Do lƣợng nƣớc trong cơ chất thấp nên enzyme
và những sản phẩm khác ở trạng thái cô đặc vì vậy dễ tinh sạch. Nuôi cấy bề mặt dễ
sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme. Không cần trang thiết bị phức tạp, chủ
yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp (Lƣơng Đức
Phẩm, 1998).
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo môi trƣờng cho vi sinh vật
phát triển trên bề mặt môi trƣờng. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng lỏng hoặc sử dụng
môi trƣờng đặc (môi trƣờng bán rắn).
Ở môi trƣờng lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trƣờng tạo thành
váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng từ
dung dịch môi trƣờng, oxy không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3.2. Nuôi cấy chìm
Phƣơng pháp này ngƣời ta sử dụng môi trƣờng lỏng và đƣợc thực hiện trong
những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH.
Phƣơng pháp nuôi cấy chìm có ƣu điểm chiếm ít diện tích nhƣng có nhƣợc
điểm là dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao.
13
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME
Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nƣớc nên có thể tách chiết
enzyme từ canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm.
Để tinh sạch enzyme ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn
bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự,
2000).
Phƣơng pháp tinh sạch enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là
phƣơng pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton).
Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung môi
sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự, 2005).
Thông thƣờng ngƣời ta thêm 3 - 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nƣớc chiết
enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải đƣợc làm lạnh
xuống 3 - 5oC. Phƣơng pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme,
dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung môi bằng chƣng
cất.
Phƣơng pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để kết
tủa. Muối trung tính thƣờng dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 - 60 % so với dịch chiết
enzyme (Lƣơng Đức Phẩm, 1998).
2.5. DEXTRIN (theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Xuân Thủy, 2001)
Dextrin là sản phẩm đƣợc tạo thành do sự thủy phân tinh bột mà giá trị
tƣơng đƣơng dextrose (DE) đạt đƣợc nhỏ hơn 20. Dextrin có công thức tổng quát
giống với cacbonhydrate nhƣng chiều dài chuỗi ngắn hơn và mức độ phức tạp cũng
thấp hơn.
14
Hình 2.5. Dextrin
(http://www.infomed.co.il/Images/Glossary/g_1014.jpg)
2.5.1. Phân loại
Dextrin có thể ở dạng polymer mạch thẳng, phân nhánh hay polymer mạch
vòng (cyclodextrin).
Dựa vào phƣơng pháp xử lý ngƣời ta chia dextrin thành 4 nhóm chính:
Dextrin thu nhận dƣới tác động của enzyme.
Các dextrin vòng Sardinger thu nhận dƣới tác động của vi khuẩn
Bacillus macerans lên tinh bột.
Các dextrin thu đƣợc bằng cách dùng acid để thủy phân tinh bột trong môi
trƣờng nƣớc.
Các pirodextrin gồm các sản phẩm thu nhận đƣợc bằng xử lý nhiệt (có hay
không có acid) lên tinh bột.
Dựa vào tính tan, ngƣời ta phân loại dextrin nhƣ sau (Lê Hồng Phú, 2000):
Amylosedextrin: tan trong rƣợu 25%, không tan trong rƣợu 40%
Erythrodextrin: tan trong rƣợu 70%, không tan trong cồn tuyệt đối.
Achrodextrin: tan trong cồn tuyệt đối.
2.5.2. Tính chất
Đặc tính của dextrin tùy thuộc vào chỉ số DE đạt đƣợc, thƣờng có độ nhớt cao vì
chứa một lƣợng lớn các polysaccharide trọng lƣợng lớn.
Dextrin có bản chất keo, nhƣng mức phức tạp về phân tử thì lại thấp hơn.
15
Dextrin đƣợc xử lý enzyme tạo maltose, thủy giải bằng acid tạo glucose. Cho
nhiều màu sắc khác nhau với dung dịch Iod. Dextrin có mức độ phức tạp cao cho màu
xanh hoặc đỏ tía. Các dextrin có mức độ phân tử trung bình cho màu đỏ và các dextrin
có mức độ phân tử thấp hơn sẽ không tạo màu với Iod.
Dextrin tan trong nƣớc tạo dung dịch trong nhƣ nƣớc trái cây, nhƣng khi có
glycogen dung dịch dextrin sẽ có màu trắng đục.
Bảng 2.2. Một số tính chất của dextrin
DE pH
4 - 7 4,0 - 5,0
9 -12 4,0 - 4,7
13 - 19,5 4,0 - 5,1
2.5.2.1. Độ nhớt
Tính chất
Độ nhớt cao, rất ít hút ẩm, ít ngọt, hòa tan tới 15% chất khô, bột
mịn.
Glucose 0,3% chất khô, maltose 0,9% chất khô
Rất ít hút ẩm, ít ngọt, ít hóa màu nâu, hòa tan tới 30% chất
khô
Glucose 0,8% chất khô
Maltose 2,9% chất khô
Ít hút ẩm, ít biến màu nâu, ngọt nhẹ, hòa tan tới 60 - 70%
chất khô
Glucose 1,3 - 1,6% chất khô, maltose 4,8 - 5,8% chất khô.
Độ nhớt là một trong những yếu tố quan trọng trong ứng dụng của dextrin, lợi
dụng độ nhớt này mà ngƣời ta sản xuất huyết tƣơng trong y học.
Độ nhớt dextrin đƣợc đo bằng Sangtipuaz bởi các pipet chuyên dụng hoặc các
công cụ chuẩn khác.
Độ nhớt phụ thuộc vào nguồn tinh bột, nhiệt độ, nồng độ acid, độ pH và tuổi
của dung dịch.
16
2.6.2.2. Độ pH
pH ảnh hƣởng đến dextrin thành phẩm, độ keo tụ và kết dính.
Trong quá trình thủy giải, độ acid làm biến đổi tinh bột hay dextrin phân tử
lƣợng lớn tạo dung dịch loãng. Dù đƣợc trung hòa trở lại bằng Na2CO3 hoặc NH3
trƣớc khi đóng gói, nhƣng acid với một lƣợng dƣ vẫn ảnh hƣởng tính keo trong quá
trình tích lũy.
2.6.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin
Sự gia tăng độ nhớt gây ra do sự đông lại hoặc do sự thoái biến của dung dịch
dextrin, đặc biệt là những dextrin ít hòa tan.
Khi thêm vào dung dịch dextrin chất làm đông đặc (Tetraborate Natri 5 -
20%) thì độ nhớt của dextrin gia tăng, thêm các chất nhƣ urea, dicyandiamide,
salisilic acid, formaldehyde, các muối guanadin sẽ làm giảm độ nhớt. Thêm urea có thể
thích hợp để dung dịch dextrin ở trạng thái lỏng.
2.6.2.4. Độ hòa tan
Giai đoạn đầu của sự dextrin hóa, không có biến đổi lớn về độ tan của
dextrin trong nƣớc lạnh. Ở nhiệt độ 130 - 140oC, khi có acid thì độ hòa tan nhanh
chóng đạt 100% nhƣng hồ nóng từ sản phẩm này không bền và lúc làm lạnh thì
không tạo nên các gel đặc.
2.6.2.5. Màu sắc
Màu của dextrin phụ thuộc độ acid và nhiệt độ dextrin hóa.
Các sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ thấp thƣờng cho màu trắng, còn những sản
phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ cao có thể màu nâu. Độ acid cao ở một nhiệt độ nhất định
thƣờng làm sẫm màu sản phẩm do quá trình caramel hóa.
Có thể tẩy trắng dextrin với các peroxide hydrogen và bisulfite natri trong hệ
thống acid hay peborat natri trong dung dịch kiềm.
17
2.5.3. Qui trình sản xuất dextrin (Nguyễn Xuân Thủy,
2001)
Dung dịch tinh bột
pH thích hợp
Hồ hóa
to = 90 - 100oC
t = 2 - 3 phút
+ enzyme
Dịch hóa
to thích hợp
t = 30 - 150 phút
Bất hoạt enzyme
Gia nhiệt
Hạ pH
Ly tâm
Dung dịch dextrin có lẫn các loại đƣờng
Tủa dextrin bằng cồn 96o
Ly tâm loại nƣớc và đƣờng hòa tan
Dextrin sấy khô
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột
18
2.5.4. Ứng dụng
Dextrin là sản phẩm trung gian giữa tinh bột và đƣờng đơn hay đƣờng đôi.
Bản chất là đƣờng nên chúng tƣơng đối đƣợc cơ thể dễ hấp thu hơn tinh bột.
Dextrin đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vì chúng không có độc tố và
giá thành thấp. Đƣợc sử dụng nhƣ dịch keo có thể hòa tan trong nƣớc nhƣ hồ dán,
dùng làm tác nhân hóa dày trong chế biến thực phẩm và tác nhân kết dính trong dƣợc
phẩm.
Đƣờng malto-dextrin chủ yếu dùng làm thức ăn cho trẻ em, thực phẩm ăn
kiêng với lƣợng nhỏ calo pha loãng (Janusz vaf Anna, 2004), làm chất thơm hay màu
thực phẩm, dùng trong công nghiệp dƣợc phẩm.
Một số dextrin đƣợc sử dụng thay thế cho chất béo trong các sản phẩm nhƣ bơ
và mỡ gầy.
Trong công nghiệp rƣợu bia, dextrin đƣợc đƣa vào để ổn định lƣợng dextrin trong
sản phẩm, vừa là cơ chất cho quá trình lên men vừa tăng chất lƣợng, tạo cảm quan tốt cho
sản phẩm.
Trong y học, dextrin đƣợc pha chế với glucose 5%, NaCl 9‰ hay sorbitol 5%
tạo dung dịch huyết tƣơng, dung dịch này dùng để chữa trị cho bệnh nhân mất máu
nhiều (Lê Hồng Phú, 2000).
19
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Khóa luận đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa trƣờng Đại học
Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian tiến hành: từ 19/03/2007 đến 19/07/2007.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguồn gốc vi khuẩn
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis do công ty TNHH Gia Tƣờng cung cấp.
Nguyên liệu
- Cám bắp, bã đậu nành, bột năng Vĩnh Thuận, bột nếp Vĩnh Thuận, bột gạo
Vĩnh Thuận, bột bắp Tài Ký.
Thiết bị và dụng cụ
- Cân điện tử - Pipet
- Tủ lạnh - Micropipet
- Bể điều nhiệt - Bercher
- Nồi hấp - Erlen
- Tủ sấy - Bình định mức
- Máy ly tâm - Ống đong
- Máy đo mật độ quang - Khay nhựa…
Hóa chất
- Cồn 96% - Iod
- NaCl - HCl
- NaOH - Na2HPO4
- (NH4)2SO4 - NaH2PO4 …
20
Các loại môi trƣờng
Môi trƣờng giữ giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar).
Môi trƣờng nhân giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton). Môi
trƣờng nuôi cấy bán rắn.
Thành phần và tỷ lệ các loại môi trƣờng đƣợc trình bày chi tiết ở mục 1 phần
phụ lục.
3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.1. Xác định mật độ tế bào Bacillus subtilis trong dịch
tăng sinh Cách tiến hành:
Dùng que cấy vòng cấy chuyển 1 vòng vi khuẩn B. subtilis từ ống giống
vào erlen chứa 20 ml môi trƣờng tăng sinh đã khử trùng, lắc đều và đặt trên máy lắc (120
- 180 vòng/phút).
Sau 24 giờ kiểm tra số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng
phƣơng pháp đếm khuẩn lạc (đƣợc trình bày ở mục 2.1 và 2.2 của phần phụ lục).
3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ƣu
Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn (35 g/erlen) đƣợc khử trùng ở 1atm trong 45 phút
và để nguội khoảng 40 - 50oC. Cấy 5% dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi
trƣờng nuôi cấy. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 - 32oC), trong thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ.
Canh trƣờng sau khi nuôi cấy đƣợc sấy khô ở 50oC.
Cân 1 g canh trƣờng đã sấy khô hòa trong 100 ml nƣớc cất, đem ly tâm 3000
vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme pha loãng 100 lần. Từ dịch pha loãng này
tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính α-
amylase theo phƣơng pháp Heinkel (xem mục 2.5 phần phụ lục).
3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%
Trong thí nghiệm này dùng phƣơng pháp tủa enzyme bằng cồn 96% lạnh
(xem mục 2.3 phần phụ lục).
Cân 5 g canh trƣờng đã sấy khô và nghiền nhỏ hòa trong 80 ml nƣớc cất,
lắc đều trong 15 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch chiết enzyme.
21
Lấy 10 ml dịch chiết enzyme trên đem tủa với cồn 96% đã để lạnh khoảng 4oC
theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5, lắc đều, để lạnh trong 15 phút rồi lấy ra đem ly
tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cồn, thu cặn lắng và hòa trong 5 ml đệm
acetate pH = 5,0. Định mức với nƣớc cất thành 100 ml.
Hút 1 ml dịch enzyme này đem định lƣợng protein theo phƣơng pháp
Lowry (xem mục 2.6 phần phụ lục) và xác định hoạt tính theo phƣơng pháp
Heinkel.
Hiệu suất thu hồi hoạt độ amylase từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức:
Hoạt độ α-amylase sau tủa H (%) = x 100
Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa
Hiệu suất thu hồi protein từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức:
Lƣợng protein sau tủa H (%) = x 100
Lƣợng protein sau tủa
3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4
Tƣơng tự, chuẩn bị dịch chiết enzyme từ canh trƣờng giống nhƣ phần tủa bằng
cồn 96%.
Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 (xem mục 2.6 phần phụ lục). Cho từ từ
vào các erlen chứa 10 ml dịch enzyme đã để lạnh, lắc đều trong 10 phút. Sau đó đem để
lạnh. Sau 10 phút, đem ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. Các bƣớc kế tiếp tiến
hành giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%.
3.3.5. Khảo sát thời gian tủa cồn 96%
Các bƣớc tiến hành giống nhƣ phần khảo sát tỷ lệ cồn, nhƣng thể tích cồn ở thí
nghiệm này không thay đổi. Tỷ lệ cồn 96% và enzyme là tỷ lệ thích hợp đã xác định
đƣợc ở mục 3.3.3.
Kiểm tra hoạt tính α-amylase và định lƣợng protein với thời gian tủa là 15, 30,
45, 60 và 75 phút.
22
3.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng năng thủy phân
tinh bột của chế phẩm α-amylase
3.3.6.1. Nhiệt độ phản ứng
Cân 0,03 g chế phẩm α-amylase tinh sạch sơ bộ bằng cồn 96% đã sấy khô hòa
trong 50 ml nƣớc cất, pha loãng thêm 100 lần. Đo hoạt tính α-amylase theo phƣơng
pháp Heinkel ở các giá trị nhiệt độ: 30, 40, 45, 50, 55, 60 và 65oC.
3.3.6.2. pH
Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của các giá trị pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 và 6,6 lên
hoạt độ α-amylase ở nhiệt độ thích hợp.
Kiểm tra hoạt tính α-amylase ở mỗi giá trị pH theo phƣơng pháp Heinkel.
3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn 96% thích hợp để thu dextrin
Tinh bột sau khi hồ hóa đƣợc để nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho chế
phẩm enzyme (CPE) đã pha loãng vào (xem mục 2.7 phần phụ lục). Sau 30 phút đem
ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tinh bột thừa.
Dịch ly tâm đƣợc cho vào các erlen có chứa cồn theo các tỷ lệ 1:2, 1:3 và
1:4, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch cồn và cân lƣợng dextrin thu
đƣợc.
3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase
3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột
Thực hiện phản ứng thủy phân với các nguồn tinh bột khác nhau: bột gạo, bột
năng, bột nếp, bột bắp ở nồng độ 10%.
Tiến hành: 2 g tinh bột đƣợc hồ hóa trong 18 ml dung dịch đệm ở giá trị pH tối
ƣu; làm nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho vào 0,5 ml chế phẩm α-amylase đã pha
loãng 200, 400, 600 lần, khuấy đều, liên tục.
Sau 10 phút, cho 5 ml HCl 5% để dừng phản ứng. Ly tâm loại bỏ tinh bột thừa,
dịch ly tâm đƣợc tủa cồn để thu dextrin. Cân lƣợng dextrin tạo thành và so sánh khối
lƣợng dextrin có đƣợc giữa các nguồn tinh bột.
23
Hiệu suất thu dextrin tính theo công thức:
H (%) =Dextrin thu đƣợc (g)
x 100Tinh bột ban đầu (g)
3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp
Sau khi chọn đƣợc nguồn tinh bột thích hợp, tiến hành khảo sát lƣợng
dextrin tạo thành ở các nồng độ tinh bột là 10%, 15% và 20%.
Cho thể tích và độ pha loãng CPE thích hợp vào 20 g hồ tinh bột với nồng độ
tinh bột 10% và 15% và 20%. Thời gian khảo sát là 10, 20, 30 và 40 phút.
3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu đƣợc xử lý sai số và vẽ đồ thị, biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel
2003.
24
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY B. SUBTILIS
Tiến hành thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.2, canh trƣờng nuôi cấy sau các thời
điểm 24, 36, 48, 60, 72 giờ đƣợc kiểm tra hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel. Thời
gian nuôi cấy 48 giờ α-amylase có hoạt độ cao nhất là 468865 UI/g canh trƣờng
(CT). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase
Tinh bột bị Thời gian Hoạt độ
Độ pha loãng ∆OD thủy phân(giờ) (UI/g CT)
(mg/ml)
24 10000 0,296 ± 0,0006 5,227 ± 0,011 52272 ± 105
36 80000 0,261 ± 0,0018 4,585 ± 0,032 366817 ± 3802
48 100000 0,267 ± 0,0012 4,689 ± 0,021 468865 ± 2108
60 100000 0,252 ± 0,0017 4,427 ± 0,030 442700 ± 3042
72 100000 0,231 ± 0,0009 4,044 ± 0,016 404365 ± 1610
Trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 24 - 36 giờ hoạt độ của amylase tăng
nhanh là do Bacillus subtilis trong giai đoạn phát triển và phân chia tối đa.
Tại thời điểm 48 giờ, mật độ B. subtilis ổn định và lƣợng α-amylase sinh ra đạt
cực đại nên hoạt độ α-amylase lúc này cao nhất. Từ 48 giờ trở đi, vi khuẩn chết dần do
cạn dinh dƣỡng và hầu nhƣ không sinh α-amylase nữa; trong khi đó, lƣợng nƣớc có
trong canh trƣờng trong thời gian dài làm hoạt độ α-amylase giảm dần.
Hoạt
độ (
UI/g C
T)
25
500000
400000
300000
200000
10000052272
0
24
468865
366817
36 48
Thời gian (giờ)
442700
404365
60 72
Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase
Hình 4.1. Môi trƣờng
bán
rắn trƣớc khi nuôi cấy
Hình 4.2. Canh
trƣờng
nuôi cấy sau 48 giờ
4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH SƠ BỘ α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ
(NH4)2SO4
4.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%
Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa là 50205,64 (UI/10ml dịch chiết enzyme), hàm
lƣợng protein có trong 10 ml dịch chiết enzyme trƣớc tủa là 97,032 mg/10ml. Sau
khi tủa, ly tâm loại bỏ cồn và đo hoạt tính bằmg phƣơng pháp Heinkel kết hợp định
lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry theo phần 3 mục 3.3.3; chúng tôi ghi nhận
ở tỷ lệ cồn 96% và enzyme là 3:1, α-amylase có hoạt độ cao nhất là 45607,75
Hoạt
độ (
UI/100 m
l CP t
ƣơi)
26
UI/100ml chế phẩm α-amylase tƣơi). Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 4.2 và đồ
thị 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase
Hiệu suất Hiệu suấtProtein Hoạt độ
Enzyme/cồn thu hồi thu hồi hoạt(mg/100ml CP tƣơi) (UI/100ml CP tƣơi)
protein (%) độ (%)
1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698
1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751
1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842
1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206
1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
1
4560844056 44284
43219
4367
2 3 4 5
Vcồn/Venzyme
Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase
Ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn còn thấp chỉ kết tủa đƣợc một lƣợng nhỏ protein
(α-amylase) nên hoạt độ α-amylase thấp. Nhƣng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lƣợng
protein thu đƣợc cao hơn, song hoạt độ α-amylase lại thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai
tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt độ α-amylase
giảm.
Hoạt
độ (
UI/100 m
l CP t
ƣơi)
27
4.2.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa α-amylase bằng (NH4)2SO4
Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phần 3 mục 3.3.4. Kết quả ghi nhận ở bảng
4.3 và đồ thị 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase
Độ bão Hàm lƣợng protein
hòa (%) (mg/100 ml CPtƣơi )
50 14,805 ± 0,118
55 15,846 ± 0,101
60 16,293 ± 0,195
65 16,683 ± 0,108
70 19,037 ± 0,166
Hiệu suất Hiệu suấtHoạt độ
thu hồi thu hồi hoạt(UI/100 ml CP tƣơi )
protein (%) độ (%)
15,02 31835,132 ± 205,852 61,73
16,08 36916,077 ± 73,132 71,58
16,53 37575,282 ± 20,283 72,86
16,92 37281,175 ± 123,378 72,29
19,31 36926,219 ± 126,669 71,60
50000
40000
30000
20000
10000
50
3757536916 37281
369331835
55 60 65 70
(NH4)2SO4 (% độ bão hòa)
Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase
Tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α-amylase có hoạt độ cao nhất. Ở
70%, hoạt độ α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein.
Theo bảng 4.2 và 4.3, tủa bằng cồn 96% hoạt độ của α-amylase và lƣợng
protein thu hồi đƣợc cao hơn khi tủa bằng (NH4)2SO4. Vì vậy, chúng tôi chọn cồn 96%
là tác nhân thích hợp dùng để tủa α-amylase.
Hoạt
độ (
UI/100 m
l CP t
ƣơi)
28
4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA CỒN 96%
Tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian tủa theo phần 3 mục 3.3.5. Theo
kết quả ghi nhận ở bảng 4.4, thời gian tủa tốt nhất đối với α-amylase là 15 phút.
Thời gian tủa càng dài lƣợng protein thu đƣợc càng nhiều nhƣng hoạt độ của
α-amylase không tăng do lƣợng α-amylase bị biến tính tăng theo thời gian tiếp xúc với
cồn 96%.
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase
Hiệu suất Hiệu suấtThời gian Hàm lƣợng protein Hoạt độ
thu hồi thu hồi hoạttủa (phút) (mg/100ml CP tƣơi) (UI/100ml CP tƣơi)
potein (%) độ (%)
15 21,493 ± 0,134 22,15 50369,23 ± 139,424 93,24
30 22,164 ± 0,127 22,84 48741,50 ± 30,425 90,23
45 23,069 ± 0,101 23,77 45942,42 ± 91,274 85,05
60 23,842 ± 0,228 24,57 45729,45 ± 121,699 84,65
75 24,324 ± 0,077 25,07 44497,24 ± 290,234 82,37
6000050369
50000
40000
30000
15
4874245942 45729
44497
30 45 60 75
Thời gian (phút)
Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase
Hoạt
độ (
UI/g C
PE)
29
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG
THỦY PHÂN TINH BỘT CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE
Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.6. Sau khi đo hoạt tính bằng phƣơng pháp
Heinkel, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
4.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase
Nhiệt độ (oC) ∆OD
30 0,285 ± 0,0041
40 0,320 ± 0,0018
45 0,326 ± 0,0015
50 0,423 ± 0,0010
55 0,446 ± 0,0009
60 0,414 ± 0,0018
65 0,309 ± 0,0038
Tinh bột bị thủy Hoạt độ
phân (mg) (UI/g CPE)
5,032 ± 0,075 838742 ± 12462
5,662 ± 0,032 943708 ± 5366
5,781 ± 0,027 963484 ± 4421
7,536 ± 0,018 1256069 ± 3042
7,962 ± 0,016 1327060 ± 2683
7,375 ± 0,032 1229194 ± 5366
5,464 ± 0,069 910748 ± 11519
1500000
1300000
1100000
900000
700000
500000
1327061
1256069
943708 963484
838742
30 35 40 45 50 55
Nhiệt độ (oC)
1229194
910748
60 65
Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase
30
Theo số liệu bảng 4.5 cho thấy nhiệt độ tối ƣu của α-amylase là 55oC với hoạt
độ cao nhất là 1327061 (UI/g chế phẩm enzyme). Ở 60oC, hoạt độ α-amylase bắt đầu
giảm xuống.
4.4.2. Ảnh hƣởng của pH
Cố định ở nhiệt độ tối thích là 55oC, thực hiện phản ứng thủy phân với giá
trị pH thay đổi theo phần 3 mục 3.3.6.2. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.6 và đồ thị
4.6.
pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6
Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase
Tinh bột bị thủypH ∆OD Hoạt độ (UI/g CPE)
phân (mg/ml)
5,8 0,433 ± 0,0033 7,734 ± 0,060 1255562 ± 9988
6,0 0,438 ± 0,0035 7,810 ± 0,064 1301707 ± 10685
6,2 0,419 ± 0,0013 7,469 ± 0,024 1244914 ± 4057
6,4 0,421 ± 0,0009 7,515 ± 0,016 1238829 ± 2683
6,6 0,402 ± 0,0003 7,156 ± 0,006 1192684 ± 1014
Từ bảng 4.6, chúng tôi thấy ở 55oC, pH tối ƣu của α-amylase là 6,0 với hoạt
độ là 1301707 (UI/g chế phẩm enzyme).
Hoạt
độ (
UI/g C
PE)
Dextr
in (
g)
31
1400000
13017071300000
1200000
1100000
1000000
1244914
12555621238829
1192684
5,8 6 6,2 6,4 6,6
pH
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN 96% TỦA DEXTRIN
Bảng 4.7. Lƣợng dextrin thu đƣợc ở các tỷ lệ cồn 96%
Cồn 96% : dịch dextrin Khối lƣợng dextrin (g)
1:1 0,31 ± 0,021
2:1 1,29 ± 0,009
3:1 1,18 ± 0,019
4:1 1,17 ± 0,015
1,5 1,29
1,0
0,5 0,31
0,0
1 2
1,18 1,17
3 4 Vcồn/Vdextrin
Biểu đồ 4.1. Lƣợng dextrin thu đƣợc từ các tỷ lệ cồn 96%
Dextr
in (
g)
32
Tỷ lệ cồn 96% để thu dextrin là 2:1, tỷ lệ cồn tăng thì khối lƣợng dextrin
thu đƣợc giảm do lƣợng cồn càng nhiều làm cho lƣợng nƣớc trong dextrin tách ra
càng nhiều.
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE VỚI
CÁC NGUỒN TINH BỘT
Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.8 với bột bắp, bột nếp, bột gạo, bột
năng ở nồng độ 10%, 0,5 ml enzyme, thời gian thủy phân là 15 phút. Kết quả đƣợc ghi
nhận ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Lƣợng dextrin (g) tạo thành do α-amylase thủy phân tinh bột 10%
Độ pha loãng Khối lƣợng dextrin (g)
CPE Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng
200 1,03 ± 0,058 1,31 ± 0,032 0,99 ± 0,023 1,39 ± 0,018
400 1,40 ± 0,084 1,58 ± 0,061 1,23 ± 0,026 1,94 ± 0,044
600 1,35 ± 0,087 1,56 ± 0,04 1,45 ± 0,031 1,87 ± 0,053
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
1,94 1,87
1,58 1,56
1,31 1,39 1,40 1,35 1,451,23
1,03 0,99
200 400 600
Độ pha loãng enzyme (lần)
Bột gạo
Bột nếp
Bột bắp
Bột năng
Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ tinh bột 10%
33
Bảng 4.9. Hiệu suất thu dextrin
Độ pha loãng Hiệu suất thu dextrin (%)
CPE (lần) Bột gạo Bột nếp Bột bắp Bột năng
200 51,67 ± 2,89 65,50 ± 1,61 49,33 ± 1,17 69,67 ± 0,08
400 69,83 ± 4,21 79,00± 3,04 61,33 ± 1,30 96,83 ± 2,19
600 67,67 ± 4,34 78,00 ± 2,02 72,50 ± 1,53 93,50 ± 2,65
Từ bảng 4.8 và bảng 4.9 cho thấy lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất khi sử dụng
cơ chất là bột năng ở độ pha loãng CPE là 400 lần với lƣợng dextrin thu đƣợc là 1,94
gam, hiệu suất 96,83%.
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY
PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE
Theo bảng 4.8 và 4.9, chúng tôi thấy α-amylase thủy phân tốt ở độ pha
loãng 400 lần. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm này với chế phẩm α-amylase pha
loãng 400 lần.
Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát sơ bộ sự thủy phân tinh bột với các thể
tích α-amylase pha loãng 400 lần, chúng tôi chọn ra những thể tích thích hợp để thực
hiện thí nghiệm này: thể tích α-amylase cho vào 20 g hồ tinh bột năng 10% và 15% là
0,5 ml enzyme; 20 g hồ tinh bột năng 20% là 1,5 ml enzyme. Kết quả ghi nhận ở bảng
4.10, 4.11 và 4.12.
Bảng 4.10. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 10%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 1,93 ± 0,032 96,5 ± 1,61
20 1,86 ± 0,015 93,17 ± 2,73
30 1,72 ± 0,055 85,83 ± 0,77
40 1,62 ± 0,032 81,17 ± 1,59
Dextr
in (
g)
Dextr
in (
g)
34
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1,93 1,861,72 1,62
10 20 30 40Thời gian thủy phân (phút)
Biểu đồ 4.3. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 10%
Sau khi thủy phân hết tinh bột, α-amylase sẽ chuyển sang thủy phân
dextrin. Vì vậy, nếu kéo dài thời gian thủy phân lƣợng dextrin thu đƣợc sẽ thấp dần.
Bảng 4.11. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 15%
Thời gian thủy phân (phút) Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
10 2,01 ± 0,071 67 ± 2,36
20 2,37 ± 0,065 78,89 ± 2,16
30 2 ± 0,081 66,67 ± 2,69
40 1,93 ± 0,069 64,22 ± 2,31
3,0
2,5 2,01
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
10
2,37 2,03
20 30
1,93
40
Thời gian thủy phân (phút)
Biểu đồ 4.4. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 15%
Dextr
in (
g)
35
Bảng 4.12. Hiệu suất thu dextrin khi thủy phân bột năng 20%
Thời gian thủy phân (phút)
10
20
30
40
Khối lƣợng dextrin (g) Hiệu suất (%)
2,25 ± 0,072 56,25 ± 1,81
2,507 ± 0,086 62,67 ± 2,14
2,363 ± 0,102 59,08 ± 2,54
2,303 ± 0,064 57,58 ± 1,59
4,0
3,0 2,512,25 2,36 2,30
2,0
1,0
0,0
10 20 30 40
Thời gian thủy phân (phút)
Biểu đồ 4.5. Khối lƣợng dextrin thu đƣợc khi thủy phân hồ bột năng 20%
Đối với hồ bột năng 15% và 20%, do nồng độ tinh bột cao làm cho khả
năng thủy phân tinh bột của α-amylase giảm nên hiệu suất thu dextrin không cao. Ở
30 và 40 phút mặc dù lƣợng tinh bột vẫn còn nhiều nhƣng lƣợng dextrin thu đƣợc vẫn
không tăng.
Khối lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều nhất khi thủy phân bột năng 10% là 1,93 g
đạt hiệu suất là 96,5% và thời gian thủy phân là 10 phút (theo bảng 4.10).
Đối với dung dịch bột năng 15%, lƣợng dextrin nhiều nhất là 2,37 g, hiệu suất
78,89% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.11).
36
Dung dịch bột năng 20% có lƣợng dextrin cao nhất là 2,5 g, hiệu suất
62,67% và thời gian thủy phân là 20 phút (theo bảng 4.12).
Hình 4.4. Chế phẩm α-amylase Hình 4.5. Chế phẩm dextrin
37
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu α-amylase từ Bacillus subtilis là 48 giờ.
- Tinh sạch sơ bộ dịch chiết α-amylase từ canh trƣờng nuôi cấy bằng cồn
96% tốt hơn (NH4)2SO4 với tỷ lệ cồn 96% thích hợp nhất là 1:3 với hiệu suất thu
enzyme theo hoạt độ là 90,84% và gian tủa là 15 phút.
- Nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động thủy phân của α-amylase tƣơng ứng là
55oC và 6,0.
- Lƣợng dextrin thu đƣợc cao nhất (1,94 g) đạt hiệu suất 96,83% khi thủy
phân bột năng (khoai mì) 10%.
5.2. ĐỀ NGHỊ
- Tối ƣu các điều kiện nuôi trên khay để thu α-amylase có hoạt độ cao hơn.
- Tủa enzyme ở nhiều nồng độ cồn khác nhau.
- Xác định lƣợng tinh bột có trong các nguồn tinh bột khảo sát.
- Định lƣợng dextrin thật trong chế phẩm dextrin.
- Tách và khảo sát tính chất các phân đoạn dextrin từ sản phẩm dextrin thu
đƣợc; nghiên cứu ứng dụng chế phẩm dextrin vào trong chế biến thực phẩm và y
dƣợc.
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt 1. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Nhƣ Nhứt, 2006. Phương pháp kiểm tra
một số enzyme dùng trong chăn nuôi. Giáo trình khoa Sinh Học Bộ môn Sinh Hóa Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh, tr. 16 - 17.
2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp, 2004. Thực tập lớn sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, TP. Hồ Chí Minh, tr. 36 - 46.
3. Lê Hồng Phú, 2000. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số loại tinh bột bằng sự thủy giải bởi acid HCl. Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.
4. Lƣơng Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nôngnghiệp Hà Nội, tr. 249 - 257.
5. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
7. Nguyễn Quỳnh Nam, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Echerichia coli gây bệnh tiêu chảy tr ên heo. Luận văn tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Tiến Thắng, 2002. Giáo trình Công nghệ enzyme. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, TP. Hồ Chí Minh, tr. 42- 73.
9. Nguyễn Thị Nhƣ Thủy, 2005. Khảo sát các đặc tính của enzyme amylase thu nhận từ hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Khóa luận cử nhân khoa học ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
10. Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006. Khảo sát khả năng tổng hợp α-amylase và một số điều kiện kỹ thuật ảnh hưởng lên quá trình tăng sinh của Bacillus
39
sp. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Xuân Thủy, 2001. Khảo sát qui trình điều chế dextrin từ một số
loại tinh bột bằng sự thủy giải bởi enzyme. Khóa luận cử nhân khoa học
ngành Sinh Học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP. Hồ Chí Minh.
12. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ Thuật Sinh Hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
13. Trần Đỗ Quyên, 2004. Thu nhận và khảo sát hoạt tính của chế phẩm
alpha amylase từ Bacillus subtilis. Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành
Sinh Hóa, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM.
14. Trần Linh Thƣớc, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực
phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục, tr. 65 - 71.
Tài liệu tiếng Anh
15. K. Clarkson, B. Jones, R. Bott, B. Bower, G. Chotani, T. Becker, Enzymes: Screening, Expression, Design and Production, Enzymes in Farm Animal Nutrition (Michael R. Bedford, Gary G. Partridge). CABI publishing, OCAB International, 2001, p. 337 - 346.
Tài liệu từ internet
16. Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú. Nghiên cứu các điều
kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis. < http://www.hau1.edu.vn/tc_khktnn/upload%5CVoNhanHau_kt&cn52005.pdf>
17. Steven J. McWethy, Paul A. Hartman. Purification and Some
Propeerties of an Extracellular Alpha-amylase from Bactriodes
amylophilus. Journal of Bacteriology, March. 1977, p. 1537 - 1544. (URL: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=235133)
18. Janusz Kapusniak, Anna Tyflewska. The utilisation of dextrins from the
thermolysis of starch with biogenic amino acids by Lactobacillus
rhamnosus bacteria. Food, Agriculture & Enviroment Vol 2 (1): 153 -
159. 2004, Science and Technology, WFL Publisher. <URL: http://www.world-food.net/scientificjournal/2004/issue1/pdf/food/f27.pdf>
40
19. Hopek M., Ziobro R, Achremowicz B., 2006. Comparison of the effects
of microbial a-amylase and scalded flour on bread quality. Acta Sci. Pol,
Technol. Aliment .5(1), 97 - 106. <URL: http://www.food.actapol.net/pud/8_1_2006.pdf>
20. O. S. AZEEZ, 2005. Production of Dextrins from Cassava Starch.
Chemical Engineering Department, Federal University of Technology, Minna, Nigeria, Lenardo Journal of Sciences ISSN 1583 - 0233.
<URL: http://ljs.academicdirect.org/A07/09_16.pdf>
21. Dextrin. The Colombia Encylopedia, Sixthedition. Copyright 2001 - 05 Colombia University Press.
<URL:http:// www.bartleby.com/65/de/dextrin.html>
22. Bacillus subtilis <URL: http://en.wikipedia.org/wiki/ Bacillus subtilis>
<URL: http://www.epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra009.htm>
41
PHỤ LỤC
1. THÀNH PHẦN MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƢỜNG
1.1. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar
Giá đậu 100g
D-glucose 50g
Pepton 10g
Agar 20g
Nƣớc cất đủ 1000 ml
pH = 7
Đun sôi 100g giá với 1000 ml nƣớc cất trong 30 phút, để nguội. Lọc nƣớc giá
bằng vải lọc và định mức lại cho đủ 1000 ml. Cho glucose, pepton, agar vào và đun
sôi, khuấy đều. Phân vào từng ống nghiệm, mỗi ống khoảng 10 ml môi trƣờng, hấp
khử trùng ở 1atm trong 30 phút. Các ống nghiệm sau khi hấp đƣợc để nghiêng.
1.2. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton
Giá đậu 100g
D-glucose 50g
Pepton 10g
Nƣớc cất đủ 1000 ml
pH = 7
Cho Glucose, pepton vào nƣớc chiết giá, khuấy đều và cho vào các erlen. Hấp khử
trùng ở 1atm trong 30 phút.
42
1.3. Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn
Bã đậu nành 50g
Cám bắp 50g
NaCl 0.36g
CaCl2 0.6g
DAP 0.2g
MgSO4 0.5g
Nƣớc cất đủ 135 ml
pH = 7
2. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.1. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Khác với phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi, phƣơng pháp đếm
khuẩn lạc cho phép xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong
mẫu.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ nhạy cao, cho phép định lƣợng vi sinh vật ở
mật độ thấp trong mẫu.
Cách thực hiện
- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Mẫu đƣợc pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: hút 1 ml mẫu
(hoặc dung dịch có độ pha loãng trƣớc đó) vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất đã khử
trùng, lắc đều.
- Sau khi đã pha loãng thành các nồng độ 10-3,10-4, 10-5, 10-6,… hút 1 ml dịch pha
loãng ở mỗi nồng độ cho vào đĩa petri. Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trƣờng đã khử
trùng và để nguội đến 45 - 50oC vào đĩa petri có mẫu.
- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngƣợc chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch
giống đƣợc trộn đều trong môi trƣờng cấy.
- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngƣợc đĩa.
- Sau 24 giờ tiến hành đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa.
43
Tính kết quả
Mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng D i
đƣợc tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình /đĩa
Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của M i ở các
nồng độ pha loãng khác nhau.
2.2. Phƣơng pháp đo độ
đục
Nguyên tắc
Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ
huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh
sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới.
Tế bào vi sinh vật cũng là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm
môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào.
Tiến hành
- Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào:
Các huyền phù của vi sinh vật cần kiểm nghiệm đƣợc pha loãng và đo OD610nm đạt
các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5.
Dùng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù
này.
Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tƣơng ứng với mỗi độ đục. Vẽ
đƣờng biểu diễn của log(N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành). Xác định khoảng
tuyến tính giữa log(N/ml) và OD610nm.
- Xác định mật độ tế bào theo độ đục:
Đo độ đục của huyền phù tế bào cần xác định mật độ
Từ trị số OD610nm đo đƣợc, dựa vào đƣờng tƣơng quan giữa log(N/ml) và độ đục
OD610nm suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10a với a = log(N/ml).
44
2.3. Phƣơng pháp tinh sạch enzyme
bằng cồn
Nguyên tắc
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số
đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử có hằng số điện
môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulphoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với
các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung
dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn
cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó, độ hòa tan của
những phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi
hiện hữu của môi trƣờng.
Cách tiến hành
Sau khi cho cồn vào, enzyme sẽ bị kết tủa. Ly tâm loại cồn, thu tủa enzyme.
Tủa enzyme đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm acetate (pH=5) và đo hoạt tính
enzyme bằng phƣơng pháp Heinkel kết hợp với định lƣợng protein bằng phƣơng pháp
Lowry.
2.4. Phƣơng pháp tủa enzyme bằng
(NH4)2SO4
Nguyên tắc
Ở nồng độ muối cao thì khả năng hòa tan của enzyme giảm mạnh và có xu
hƣớng kết lắng vì nồng độ muối cao làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm
protein bị mất nƣớc.
Cách tiến hành
Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 ứng với các nồng độ bão hòa trong 10 ml dịch
chiết enzyme (xem bảng 2.1).
Bảng 2.1. Khối lƣợng tƣơng ứng các độ bão hoà
Độ bão hoà 50 55 60 65 70
(%)
(NH4)2SO4
3,1 3,51 3,9 4,3 4,72(gram)
45
Cho 10 ml dịch chiết enzyme vào erlen và đƣa vào máy khuấy từ, cho từ từ
muối vào. Sau 30 phút lấy ra ly tâm.
2.5. Phƣơng pháp
Heinkel
Thực hiện
Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1%, 2
ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0. Lắc đều, để ống nghiệm trong tủ ấm ở
30oC, 15 - 20 phút để dung dịch đạt đến 30oC. Thêm 1 ml dung dịch enzyme đã pha
loãng và đạt đến 30oC vào ống nghiệm. Lắc đều và tiếp tục giữ ở 30oC trong 30
phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5 ml dung dịch HCl 1N để dừng
phản ứng.
Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra đối chứng tƣơng tự nhƣ trên
nhƣng cho dung dịch HCl vào trƣớc rồi cho enzyme vào.
Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm và đối chứng cho vào ống nghiệm mới, thêm vào 9 ml dung
dịch Iod pha loãng 450 lần. Lắc đều, so màu ở bƣớc sóng 560 nm. Lấy hiệu số đọc đƣợc
trên máy giữa mẫu đối chứng và thí nghiệm đối chiếu với đƣờng cong tiêu chuẩn, tính số
mg tinh bột đã bị thủy phân.
Cách tính
Đơn vị hoạt động của enzyme là lƣợng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh
bột thành các sản phẩm không tạo màu với Iod sau 30 phút ở điều nhiệt độ thí
nghiệm.
Hoạt độ A = Số mg tinh bột bị phân giải * Độ pha loãng (UI).
2.6. Phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hòa tan trong
nƣớc
Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lƣợng của những
amino acid này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau
có hàm lƣợng các amino acid này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có
màu. Cƣờng độ màu của phức này tỷ lệ với hàm lƣợng Tyrosin và Tryptophan
46
(cũng là lƣợng protein). Vì thế ta có thể dùng phƣơng pháp so màu để xác định hàm
lƣợng protein.
Hóa chất
Dung dịch albumin 0,1%: cân chính xác 0,1 g albumin pha với nƣớc cất thành
100 ml.
Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa trong NaOH 0,1N thành 100 ml
Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O hòa trong natri citrate 1% thành 100 ml
Dung dịch C: hỗn hợp A và B theo tỉ lệ 49:1. dung dịch C pha trƣớc khi dùng 30
phút.
Thuốc thử Folin: pha loãng 3 lần từ Folin đậm đặc.
Cách tiến hành
+ Lập đồ thị chuẩn:
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có các nồng độ: 0, 50, 100, 150, 200, 250
μg/ml từ dung dịch albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nƣớc cất theo các tỷ lệ khác
nhau (xem bảng 2.1)
Bảng 2.2. Cách pha các nồng độ albumin
Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Albumin 1% (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Nƣớc cất (ml) 10 9,5 9 8,5 8 7,5
Protein (µg/ml) 0 50 100 150 200 250
Hút 0,4 ml dung dịch albumin đã pha loãng theo bảng 3 từ các ống 1 - 6 cho vào 6
ống nghiệm mới theo thứ tự. Thêm vào 2 ml dung dịch C, lắc đều, để yên ở nhiệt độ
phòng trong 5 phút. Thêm 0,2 ml Folin, lắc đều, để yên 5-10 phút, thêm nƣớc cất đủ 5
ml. So màu ở bƣớc sóng 750 nm.
Xác định trị số mật độ quang của các ống, từ đó xây dựng đồ thị biểu diễn sự biến
thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml).
47
+ Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu:
Hút vào ống nghiệm 0,4 ml dung dịch mẫu thí nghiệm. Thêm vào 2 ml dung dịch
C, lắc đều, để yên trong 5 phút.
Thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 5 - 10 phút, thêm nƣớc cất cho đủ
5 ml. Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 750 nm.
Cách tính
Từ đƣờng chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein, từ đó suy
ra hàm lƣợng protein của nguyên liệu là a (μg/ml)
Lƣợng protein (M) có trong 1 g nguyên liệu đƣợc tính theo công thức:
M= a x 10 -3 x n m
mg protein/g
Với a: hàm lƣợng protein (μg/ml dung dịch)
n: hệ số pha loãng mẫu
m: khối lƣợng nguyên liệu lấy phân tích (g)
2.7. Phƣơng pháp thu nhận dextrin
Các bƣớc tiến hành:
- Dịch hóa: trong thời gian hồ hóa tinh bột, ta để dung dịch enzyme ở nhiệt
độ thích hợp để enzyme đƣợc hoạt hóa. Tinh bột đƣợc hồ hóa và làm nguội khoảng
50oC, sau đó bổ sung enzyme vào dung dịch hồ tinh bột. Từ lúc cho enzyme vào,
khuấy liên tục, khuấy kỹ để tạo sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất đồng đều. Thời
gian từ lúc hồ hóa tinh bột đến lúc làm nguội và cho enzyme vào khoảng 5 phút.
- Khi hồ tinh bột bắt đầu lỏng ra, tính thời gian.
- Bất hoạt enzyme: sau mỗi thời gian khảo sát ta bất hoạt enzyme nhằm đảm bảo
chính xác các thông số đo tại thời điểm khảo sát bằng cách làm lạnh và thêm 5 ml dung
dịch HCl 5%.
- Sau đó ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, tủa cồn thu dextrin, đem sấy khô ở 70 -
80oC.
Log (
N/m
l)
48
2.8. Đồ thị chuẩn xác định mật độ tế bào
Bảng 2.3. Giá trị OD610nm tƣơng ứng mật độ tế bào
OD610nm
Mật độ trung bình
(N/ml)
Log (N/ml)
0,12
15,333x106
7,186
0,221
34x106
7,531
0,306
52,333x106
7,719
0,41
100,333x106
8,001
0,53
141x106
8,149
8,4
8,0
7,6
7,2
6,8
0,1
y = 2,3588x + 6,9686
R2 = 0,9725
0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
OD610nm
Đồ thị 2.1. Sự tƣơng quan giữa giá trị OD61onm và mật độ tế bào
2.9. Đồ thị chuẩn xác định lƣợng tinh bột bị thủy phân theo
phƣơng pháp Heinkel
Bảng 2.4. Giá trị OD650nm tƣơng ứng hàm lƣợng tinh bột
Tinh bột (mg/ml) 0 2 4 6 8 10
OD trung bình 0,016667 0,139 0,2497 0,3673 0,467 0,56167
dOD560nm 0 0,1223 0,233 0,3507 0,450333 0,545
dO
DdO
D
49
0,6 y = 0,0561x
0,5 R2 = 0,997
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10
tinh bột (mg/ml)
Đồ thị 2.2. Sự tƣơng quan giữa giá trị OD560nm và hàm lƣợng tinh bột (mg/ml)
2.10. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp LOWRY
Bảng 2.5. Giá trị OD750nm tƣơng ứng với các nồg độ albumin
Albumin (μg/ml) 0 50 100 150 200 250
OD750nm trung bình 0,043 0,1117 0,1683 0,2253 0,277 0,33133
dOD 0 0,0687 0,1253 0,1823 0,234 0,28833
0,35 y = 0,0012x0,3 R2 = 0,9961
0,25 0,2
0,15 0,1 0,05
0
0 50 100 150 200 250
albumin (μg/ml)
Đồ thị 2.3. Sự tƣơng quan giữa giá trị OD750nm và hàm lƣợng protein
50
2.11. Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis
Bảng 2.6. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase
Thời gian (giờ)Số lần
1 2 3Trung
Phƣơng sai bình
Sai số
24
∆OD
Lƣợng tinh bột (mg/ml)
0,297 0,295 0,296
5,245 5,209 5,227
0,296 1E-06
5,227 0,0003332
0,0006
0,0105
Hoạt độ (UI/g CT) 52454,27 52089,17 52271,72 52272,38 33324,117 105,395
∆OD 0,264 0.262 0,258 0,261 9,33E-06 0,0018
36 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,634 4,597 4,524 4,585 0,0031103 0,0322
Hoạt độ (UI/g CT) 367790,03 361948,7 375092,2 366817,31 43365784 3802,008
∆OD
Lƣợng tinh bột48 (mg/ml)
0,267 0,265 0,269
4,689 4,652 4,725
0,267 4E-06
4,689 0,001333
0,0012
0,0211
Hoạt độ (UI/g CT) 468865,3 465214,3 472516,2 468865,26 13329647 2107,894
∆OD 0,256 0,251 0,251 0,252 8,33E-06 0,0017
60 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
4,488 4,397 4,397 4,427 0,002777 0,0304
Hoạt độ (UI/g CT) 448784,9 439657,4 439657,4 442699,56 27770097 3042,482
∆OD 0,233 0,233 0,230 0,231 2,33E-06 0,0009
72 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
4,068 4,050 4,013 4,044 0,0007776 0,0161
Hoạt độ (UI/g CT) 406798,6 404973,1 401322,2 404364,3 7775627,2 1609,93
2.12. Kết quả tủa enzyme bằng cồn 96% và (NH4)2SO4
Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase
Trƣớc tủaHoạt độ (UI/ml dịch chiết enzyme)
5020,56Hoạt độ (UI/10ml DCE)
50205,64Hoạt độ (UI/100ml CPE tƣơi)
Enzyme/cồn TrungPhƣơng
Sai số
Hiệu suất
Lần 1 Lần 2 Lần 3 bình sai (%)
1:1 4001,80 4640,72 4458,17 4366,90 108303,38 190,003 8,698
1:2 44025,66 43934,38 44208,21 44056,08 19439,07 80,497 87,751
1:3 45303,50 45577,32 45942,42 45607,75 102749,4 185,067 90,842
1:4 44345,12 44071,29 44436,39 44284,27 36101,13 109,698 88,206
1:5 43341,10 43614,92 42702,18 43219,40 219383,77 270,422 86,085
51
Bảng 2.8. Hàm lƣợng protein tƣơng ứng các tỷ lệ cồn 96% và α-amylase
Trƣớc tủa
Enzyme/cồn
Protein (mg/ml DCE) 9,703
Protein (mg/100ml CP tƣơi )
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
Protein (mg/10ml DCE) 97,032
HiệuPhƣơng sai Sai số suất
(%) 1:1 10,900 10,112 10,375 10,462 0,1609487 0,232 10,78
1:2 14,883 16,809 16,196 15,963 0,9682472 0,568 16,45
1:3 22,193 21,405 21,668 21,756 0,1609487 0,232 22,42
1:4 22,894 23,069 23,419 23,127 0,0715328 0,154 23,83
1:5 23,638 23,463 23,988 23,696 0,0715328 0,154 24,42
Bảng 2.9. Hoạt độ α-amylase sau khi tủa bằng (NH4)2SO4
Trƣớc tủaHoạt độ (UI/ml DCE)
5157,47
Hoạt độ (UI/10ml DCE)
51574,76
Độ bão hòa (%) Lần 1
Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Phƣơng
Lần 2 Lần 3 TB sai
HiệuSai số suất
(%) 50 31571,450 31693,149 32240,796 31835,132 127125,3 205,852 61,73
55 37017,493 36774,095 36956,644 36916,077 16044,95 73,132 71,58
60 37595,565 37595,565 37534,715 37575,282 1234,227 20,283 72,86
65 37078,343 37504,290 37260,892 37281,175 45666,38 123,378 72,29
70 36743,670 36865,369 37169,617 36926,219 48134,84 126,669 71,60
Bảng 2.10. Hàm lƣợng protein tƣơng ứng các độ bão hoà (NH4)2SO4 dùng tủa
α-amylase
Trƣớc tủa
Độ bão hòa (%) Lần 1
Protein (mg/ml DCE)
9,85
Protein (mg/100ml CP tƣơi)
Lần 2 Lần 3
Protein (mg/10ml DCE)
98,57Hiệu
Phƣơng sai Sai số suất TB (%)
50 14,825 14,591 15,000 14,805 0,0420113 0,118 15,02
55 16,021 15,846 15,671 15,846 0,0306569 0,101 16,08
60 15,904 16,488 16,488 16,293 0,1135441 0,195 16,53
65 16,605 16,546 16,897 16,683 0,0351987 0,108 16,92
70 19,173 19,231 18,706 19,037 0,0828872 0,166 19,31
52
2.13. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96%
Bảng 2.11. Hoạt độ α-amylase sau các thời gian tủa cồn 96%
Trƣớc tủa
Phút Lần 1
Hoạt độ (UI/ml DCE)
5020,56
Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi)
Lần 2 Lần 3
Hoạt độ (UI/10ml DCE)
50205,64
HiệuTrung Phƣơng sai Sai số suất bình (%)
15 50277,96 50186,68 50643,06 50369,23 58317,204 139,424 93,24
30 48680,65 48771,93 48771,93 48741,50 2777,010 30,425 90,23
45 45759,87 46033,69 46033,69 45942,42 24993,087 91,274 85,05
60 45486,05 45851,15 45851,15 45729,45 44432,155 121,699 84,65
75 44253,84 44162,57 45075,31 44497,24 252707,884 290,234 82,37
Bảng 2.12. Hàm lƣợng protein tƣơng ứng các thời gian tủa cồn 96%
Trƣớc tủa
Phút
Protein (mg/ml DCE) 9,703
Protein (mg/100ml CP tƣơi)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
Protein (mg/10ml DCE) 97,032
HiệuPhƣơng sai Sai số suất
TB (%) 15 21,230 21,580 21,668 21,493 0,0536496 0,134 22,15
30 22,193 22,368 21,931 22,164 0,0485401 0,127 22,84
45 23,244 23,069 22,894 23,069 0,0306569 0,101 23,77
60 23,463 23,813 24,251 23,842 0,1558393 0,228 24,57
75 24,294 24,469 24,207 24,324 0,0178832 0,077 25,07
53
2.14. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của CPE
Bảng 2.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của chế phẩm α-amylase
Nhiệt độ (oC)Số lần
1 2 3Trung
Phƣơng sai bình
Sai số
∆OD 0,279 0,284 0,293 0,285 5,03333E-05 0,0041
30 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
4,917 5,008 5,172 5,032 0,0167731 0,075
Hoạt độ(UI/g CP) 819473 834686 862068 838742 4,66E+08 12462
∆OD 0,317 0,323 0,320 0,320 9,33333E-06 0,0018
40 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 5,601 5,711 5,674 5,662 0,0031103 0,032
Hoạt độ (UI/g CP) 933566 951821 945736 943708 86395857,8 5366
∆OD
Lƣợng tinh bột 45 (mg/ml)
0,326 0,324 0,329
5,775 5,738 5,830
0,326 6,33333E-06
5,781 0,0021105
0,0015
0,027 Hoạt độ(UI/g CP) 962469,8 956385 971597 963484 58625760,65 4420
50
∆OD
Lƣợng tinh bột (mg/ml)
0,425 0,422 0,422
7,573 7,518 7,518
0,423 3E-06
7,536 0,0009997
0,0010
0,018
Hoạt độ(UI/g CP) 1262154 1253027 1253027 1256069 27770097,15 3042
∆OD 0,445 0,446 0,448 0,446 2,33333E-06 0,0009
55 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
7,938 7,956 7,992 7,962 0,0007776 0,016
Hoạt độ(UI/g CP) 1323004 1326046 1332131 1327060 21598964,45 2683
60
∆ODLƣợng tinh bột
(mg/ml)
0,411 0,417 0,413
7,327 7,436 7,363
0,414 9,33333E-06
7,375 0,0031103
0,0018
0,032
Hoạt độ(UI/g CP) 1221081 1239336 1227166 1229194 86395857,8 5366
65
∆ODLƣợng tinh bột
(mg/ml)
0,310 0,302 0,315
5,483 5,337 5,574
0,309 4,3E-05
5,464 0,0143294
0,0038
0,069
Hoạt độ(UI/g CP) 913790 889450 929003 910748 398038059 11519
54
2.15. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của CPE
Bảng 2.14. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của chế phẩm α-amylase
pHSố lần
1 2Trung
3 bìnhPhƣơng sai Sai số
5,8
∆OD
Lƣợng tinh bột (mg/ml)
Hoạt độ(UI/g CT)
0,427
7,619
1269760, 5
0,424
7,564
1260633
0,416 0,422
7,418 7,533
1236293 1255562
3,23333E-05 0,0033
0,010774798 0,060
299299936 9988
6,0
∆OD
Lƣợng tinh bột (mg/ml)
Hoạt độ (UI/g CT)
0,4345 0,4445
7,755 7,938
1292579 1323004
0,4335 0,438
7,737 7,810
1289537 1301707
3,7E-05 0,0035
0,012329923 0,064
342497865 10685
∆OD 0,4215 0,4175 0,4175 0,419 5,33333E-06 0,0013
6,2 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
7,518 7,445 7,445 7,469 0,001777286 0,024
Hoạt độ(UI/g CT) 1253027 1240857 1240857 1244914 49369062 4057
∆OD 0,4185 0,4165 0,4155 0,417 2,33333E-06 0,0009
6,4 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
7,463 7,427 7,409 7,433 0,000777563 0,016
Hoạt độ(UI/g CT) 1243899 1237814 1234772 1238829 21598964 2683
∆OD 0,402 0,402 0,401 0,402 3,33333E-07 0,0003
6,6 Lƣợng tinh bột (mg/ml)
7,162 7,162 7,144 7,156 0,00011108 0,006
Hoạt độ(UI/g CT) 1193698 1193698 1190656 1192684 3085566 1014
