De la culture cellulaire à l’expression de protéines impliquées dans la réorganisation du cytosquelette

Nicolas Bertrand & Myriam Baratin

TD1 Initiation à la culture cellulaire

TD2 Les différentes méthodes de transfection cellulaire Les petites protéines G de la famille Rho

TD3 Description des protocoles

Initiation à la culture cellulaire

Culture primaire/secondaire

Les milieux de culture/maintien des lignées

Les paramètres physico-chimiques

Matériel et instruments

La congélation

Les contaminations

C'est une culture de cellules qui proviennent directement d'un tissu. Cette première culture pourra, par la suite, donner lieu à des cultures dites "secondaires« 

Traumatisme

Contamination

1- culture primaire/secondaire

Culture primaire

Culture secondaire

Des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). Ce sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

Transformation cellulaire: acquisition de caractères propres à la cellule maligne

Autonomie de croissance Perte de l’inhibition de contact Immortalité Indépendance vis-à-vis des facteurs de

croissance et des interactions avec la MEC Tumorigénicité chez la souris nude

Immortalisation cellulaire

Cellules post-criseImmortalisation spontanée

(fibroblastes murins)

Cellules immortalisées par l’expérimentateur(expression d’oncogènes viraux, de la télomérase)

Cellules tumoralesHela: carcinome

Raji: lymphome de Burkitt

How can cells be made immortal?Several methods exist for immortalizing mammalian cells in culture. Viral genes, including Epstein-Barr virus (EBV), Simian virus 40 (SV40) T antigen, adenovirus E1A and E1B, and human papillomavirus (HPV) E6 and E7 can induce immortalization by a process known as viral transformation. Although the process is reliable and relatively simple, these cells may become genetically unstable (aneuploid) and lose the properties of primary cells. For the most part, these viral genes achieve immortalization by inactivating the tumor suppressor genes that put cells into a replicative senescent state.The preferred method to immortalize cells is through expression of the telomerase reverse transcriptase protein (TERT), particularly those cells most affected by telomere length (e.g., human). This protein is inactive in most somatic cells, but when hTERT is exogenously expressed the cells are able to maintain telomere lengths sufficient to avoid replicative senescence. Analysis of several telomerase-immortalized cell lines has verified that the cells maintain a stable genotype and retain critical phenotypic markers.

Cell line

Species Cell type Year Estab.

MDCK dog kidney 1958CHO hamster ovary epithelial 1957CV-1/COS

monkey kidney 1964

NIH 3T3 mouse embryo fibroblast 1963Rat-1 rat embryo fibroblast 1968HeLa human cervical carcinoma 1951HEK-293

human embryonic kidney 1977

LNCaP human prostate tumor 1977MCF7 human mammary tumor 1973

Deux sources de cellules sont possibles :

1 - Les cellules circulantes (en suspension )sangmoelle osseuse liquides physiologiques

2- Cas des cellules à partir de tissus ou d'organes (adhérentes)

Designations: EL4 Depositors:  M Cohn Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: suspensionOrganism: Mus musculus (mouse)

Morphology:lymphoblast

Source:Disease: lymphoma Strain: C57BL/6N Cell Type: T lymphocyte;

Permits/Forms:In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location.

Applications: transfection host (Nucleofection technology from LonzaRoche FuGENE® Transfection Reagents)

Antigen Expression: H-2b; Thy-1.2Cytogenetic Analysis: modal number = 39

Comments:

EL4 was established from a lymphoma induced in a C57BL mouse by 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene. [22448] The cells are resistant to 0.1 mM cortisol and sensitive to 20 mcg/ml PHA. A subline (EL4.IL-2, ATCC TIB-181) that produces high levels of interleukin-2 (IL-2, interleukin 2) is available. Tested and found negative for ectromelia virus (mousepox).

Propagation:

ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: horse serum to a final concentration of 10%.Temperature: 37.0°C

Subculturing:

Medium Renewal: Every 2 to 3 days Cultures can be maintained by addition or replacement of fresh medium. Start cultures at 2 X 10 exp5 cells/ml and maintain between 1 X 10 exp5 and 1 X 10 exp6 cells/ml.

Preservation: culture medium 95%; DMSO, 5%

The ATCC Cell Biology Collection is the most comprehensive and diverse of its kind in the world, consisting of over 3,400 cell lines from over 80 different species. It holds over 950 cancer cell lines, 1,000 hybridomas and several special collections including stem cells.

American Type Culture Collection (ATCC)

a nonprofit organization in Rockville, Maryland

Pourquoi mettre des cellules en culture?

• Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire

Conservation des caractéristiques du tissu initial

• Accessibilité• Contrôle de l’environnement et de traitements

appliqués• Homogénéité des cellules• Matériel en grande quantité

Cycle de croissance d'une lignée cellulaire en culture in vitro

Immortalisation cellulaire: Acquisition de la capacité à se multiplier indéfiniment

Culture continue

Mort cellulaireNom

bre

de c

ellu

les

Temps (jours)

Phase de latencePhase exponentielle

Phase stationnaire

Phase de latencepas de division cellulairedépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulairePhase exponentiellePhase de division cellulaireTemps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h)Phase stationnaire Epuisement du milieu = arrêt de la proliférationPoursuite de la croissance cellulaire (repiquage) ou mort cellulaire

Cellules de mammifères

A priori, se rapprocher le plus possible des conditions du milieu intérieur

Reproduction et maintien d’un environnement physiologiqueParamètres physiologiques

Température 37°C, permissivité faible

Ions inorganiques aspect qualitatif et osmolarité

pO2 et pCO2

pH 7.2-7.5 Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%)CO2 + H2O HCO3- + H+

Indicateur coloré: Rouge de Phénol

Hygrométrie 85% (évaporation)

Lumière visible à éviter

Fourniture d’aliments essentiels

Métabolisme énergétique

Biosynthèse

Catalyse enzymatique (vitamines, oligoéléments)

Surface de culture

Cas des cellules adhérentes avec dépendance à l’ancrage

Mise à disposition de molécules de transport

Pour Hormones

Oligoéléments

Lipides

Mise à disposition de facteurs d’adhérence

En fonction de la capacité des cellules utilisées à produire ces facteurs en plus ou moins grande quantité

Mise à disposition de molécules informatives

Hormones

Facteurs de croissance

Reproduire l’environnement physiologique

Les milieux

La base: milieu synthétique- acides aminés- sels minéraux- NRJ (glucose/glutamine)- Vitamines (fragiles, ne pas autoclaver)

Les Suppléments- Indéfini: sérum (albumine/transferrine/hormones)

extrait de tissus milieu conditionné

- Défini: Facteurs de croissance

Les antibiotiques- Éliminer complètement le contaminant microbien- Ne pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules- Compatible avec les autres éléments du milieu- Large spectre d’action

a.a. essentielsbesoin en a.a. pour les

cellules dans l'organisme eten culture

a.a. synthétisés par descellules spécialisées dans

l'organisme donc à rajouteren culture

a.a. synthétisés par lescellules dans l'organisme et

en culture

arginine glutamine glycinehistidine cystéine alanine

isoleucine tyrosine serineleucine asparaginelysine acide aspartique

méthionine acide glutamiquephénylalanine proline

thréoninetryptophane

valine

Glycine 75 30 0.4

L-Arginine hydrochloride 211 84 0.398

L-Cystine 2HCl 313 63 0.201

L-Glutamine 146 584 4

L-Histidine hydrochloride-H2O 210 42 0.2

L-Isoleucine 131 105 0.802

L-Leucine 131 105 0.802

L-Lysine hydrochloride 183 146 0.798

L-Methionine 149 30 0.201

L-Phenylalanine 165 66 0.4

L-Serine 105 42 0.4

L-Threonine 119 95 0.798

L-Tryptophan 204 16 0.0784

L-Tyrosine disodium salt dihydrate 261 104 0.398

L-Valine 117 94 0.803

Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X) liquid (high glucose)

Contains 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine and 25 mM HEPES buffer but no sodium pyruvate or phenol red.

VitaminsCholine chloride 140 4 0.0286D-Calcium pantothenate 477 4 0.00839Folic Acid 441 4 0.00907Niacinamide 122 4 0.0328Pyridoxine hydrochloride 206 4 0.0194Riboflavin 376 0.4 0.00106Thiamine hydrochloride 337 4 0.0119i-Inositol 180 7.2 0.04Inorganic SaltsCalcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.8

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404 0.1 0.000248

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120 97.67 0.814

Potassium Chloride (KCl) 75 400 5.33Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 3700 44.05

Sodium Chloride (NaCl) 58 4750 81.9Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 138 125 0.906

Other ComponentsD-Glucose (Dextrose) 180 4500 25HEPES 238 5958 25.03

Technical Resources - Media FormulationsAdvanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (1X) liquid

Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a defined media formulation designed to reduce significantly the amount of serum required for cultivating mammalian cell in vitro. This enhanced standard basal formulation allows for a 50 - 80% reduction in the required serum supplementation with no cell adaptation needed. Suitable for the growth of maintenance of a variety of common cell lines including MDBK Hep-2 COS-7 A549 MDCK WI-38 and others this medium supports cell growth and morpholigical characteristics of both adherent and non-adherent cell lines. It is formulated without L-glutamine for increased stability. Supplementation with L-glutamine is required. Recommended concentration of serum is 1 - 5%; the concentration must be adjusted for each individual cell line to achieve optimal results.

Amino AcidsGlycine 75 37.5 0.5L-Alanine 8.9 ∞L-Arginine hydrochloride 84 ∞L-Asparagine 13.2 ∞L-Aspartic acid 13.3 ∞L-Cystine 2HCl 63 ∞L-Glutamic Acid 14.7 ∞L-Histidine hydrochloride-H2O 42 ∞

L-Isoleucine 105 ∞L-Leucine 105 ∞L-Lysine hydrochloride 146 ∞L-Methionine 30 ∞L-Phenylalanine 66 ∞L-Proline 11.5 ∞L-Serine 52.5 ∞L-Threonine 95 ∞L-Tryptophan 16 ∞L-Tyrosine disodium salt dihydrate 104 ∞

L-Valine 94 ∞

Vitamins

Ascorbic Acid phosphate 2.5 ∞

Choline chloride 4 ∞

D-Calcium pantothenate 477 4 0.00839

Folic Acid 441 4 0.00907Niacinamide 4 ∞

Pyridoxine hydrochloride 4 ∞

Riboflavin 0.4 ∞

Thiamine hydrochloride 4 ∞

i-Inositol 7.2 ∞Inorganic Salts

Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.8

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 0.1 ∞

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 97.67 ∞

Potassium Chloride (KCl) 400 ∞

Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 3700 ∞

Sodium Chloride (NaCl) 6400 ∞

Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4-H2O) 125 ∞

ProteinsAlbuMAX® II 400 ∞

Human Transferrin (Holo) 7.5 ∞

Insulin Recombinant Full Chain 10 ∞

Trace Elements

Ammonium Metavanadate 0.0003 ∞

Cupric Sulfate 0.00125 ∞Manganous Chloride 0.00005 ∞Sodium Selenite 0.005 ∞Other ComponentsD-Glucose (Dextrose) 4500 ∞Ethanolamine 1.9 ∞Glutathione (reduced) 307 1 0.00326Phenol Red 15 ∞Sodium Pyruvate 110 ∞

•Ethanolamine•Glutathione (reduced)•Ascorbic acid phosphate•Insulin•Human (holo) transferrin•AlbuMAX™ (a lipid-rich bovine serum albumin)•Trace salts sodium selenite, ammonium matavanadate, cupric sulfate, and manganous chloride

Each Advanced™ medium is the standard published basal formulation, supplemented with NEAA and sodium pyruvate.  We’ve also added these ingredients to allow serum reduction:

Contaminations

Contaminants biologiquesBactériesLevures/moisissures VirusMycoplasmes

Contaminants chimiquesEndotoxinesQualité du plastiqueReste de détergentTrace d’aluminiumRésidus désinfectants

Contamination croiséeAutres cellules

Micro-organisme procaryote de type bactérien, dépourvu de paroi rigide (possédant une simple membrane) et capable de multiplication autonome.

Mycoplasme

Un antibiotique[1] (du grec anti : « contre », et bios : « la vie ») est une substance qui a une action spécifique de bloquage ou même de destruction des bactéries. Pour les autres micro-organismes, on utilise le terme d'« antifongique » s'il s'agit de lutte contre les champignons, ou d'« antiviral » s'il s'agit de lutte contre les virus.Cette substance peut avoir une action toxique directe, c'est-à-dire bactéricide ; son efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des micro-organismes (action bactériostatique).

Antibiotiques doivent:Eliminer complètement le contaminant microbienNe doivent pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellulesCompatible avec les autres éléments du milieuLarge spectre d’action

Beta-lactamine

Beta-lactamine

Aminoside

Les pénicillines sont des antibiotiques bêta-lactamines. À la base, la pénicilline est une toxine qui provient de la moisissure penicillium provenant du champignon Penicillium notatum et qui est inoffensive pour l'homme.

Les pénicillines ont pour formule chimique :

R-C9H11N2O4S

où R est une chaîne variable.

Les pénicillines et les autres antibiotiques β-lactames agissent par inhibition de la formation des liens inter-peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. La moitié bêta-lactame des pénicillines se lie à l'enzyme (transpeptidase) qui devrait se lier aux molécules de peptidoglycane des bactéries et empêche ainsi la multiplication des bactéries.

Pénicilline G

Les pénicillines A sont des aminopénicilline à spectre élargi. L'ampicilline et surtout l'amoxicilline sont ses deux principaux représentants.

La streptomycine est un antibiotique antibactérien cytostatique et cytotoxique. Il appartient à la classe des aminosides (ou aminoglycosides)

Il fut isolé à partir d'une souche d'actinobactérie Streptomyces griseus

Le spectre d'action de la streptomycine est assez large puisqu'elle peut agir sur certains bacilles gram négatifs (comme Escherichia coli) ou certains cocci gram positifs (comme le Staphylococcus aureus). Cet antibiotique agit également sur Mycobacterium tuberculosis, et fut d'ailleurs le premier antibiotique contre la tuberculose.

Action par fixation sur la petite sous-unité des ribosomes eubactériens: synthèse protéique aberrante.

Effet bactéricide.

La tétracycline est un antibiotique produit par une bactérie du genre Streptomyces. Elle est indiquée contre nombre d'infections bactériennes.

La tétracycline empêche la fixation de l'aminoacyl-ARNt entrant dans le site A du ribosome.Effet bactériostatique.Spectre : bactéries Gram positif et Gram négatif

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments

NON!!!

Matériel et instruments

PSM: Poste de Sécurité Microbiologique (de type II)

Ne pas introduire trop d'objets perturbe le flux & la sécurité manipulateurNe pas introduire d'objet poussiéreux colmate le filtre Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérileProcéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marcheNe pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérileL'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interditeIl est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile

Matériel et instruments

Microscope inversé à contraste de phase

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Étuve à CO2

Technique Aseptique pour culture cellulaire

Hygiène: cheveux attachesSe laver les mains avant après. Port de gants blouse Ethanol 70% mais attention à la perméabilitéLa peau contient naturellement des bactéries et des champignons qui adorent les milieux de cultureTout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile flasques pipettes Environnement: PSM poste de sécurité microbiologique Nettoyage des hottes:

TFD7 ou RBS détergent désinfectantEau EthanolNettoyer les flacons à mettre sous la hotte

Congélation/Décongélation

ButsPréserverÉviter sénescenceLimiter risque de contaminationMinimiser les variations génétiques (perte ou doublement des chromosomes)

Agents cryo-protecteursDMSO Glycérol

Quand/CommentPhase exponentielle, suspension entre 106 et 108 cellules par mLOn congèle dans le milieu completTemps d’équilibration avec les cryoprotecteurs à la température du laboratoireCongélation graduelle à -40°C/-80°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans l’azote liquide (-196°C)

Décongélationrapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité

Pendant ces phases, on limite les autres stress appliqués aux cellules

Fourchette de température critique -15°C/-60°C

Jusqu’à -5°C, pas de congélation du milieu ni des liquides intracellulaires

Entre -5°C et -15°C, le milieu commence à congeler mais pas les liquides intracellulaires

conséquence: les cellules se déshydratent (l’eau intracellulaire sort)

Le refroidissement lent permet une déshydratation efficace et limite la congélation intracellulaire qui entraîne la mort de la cellule. Plus les cellules sont grandes et plus le refroidissement en général doit être lent.

Cette première condition doit être remplie mais n’est pas suffisante.En effet, il semble que les changements de forme induit par la perte d’eau et ceci en présence de quantité de glace extracellulaire croissantes sont anisotropes (distorsion), ce qui provoquerait des lésions cellulaires. D’autre part, l’augmentation de concentration des solutés serait aussi délétère.Le refroidissement est lent, on augmente la durée d’exposition aux forces de distorsion.Les agents cryoprotecteurs agiraient en diminuant le problème: ils permettent d’augmenter la fraction non congelée et donc limite la déshydratation et l’action des forces de distorsion.

La vitesse de décongélation est importante aussi. En général, une décongélation et un réchauffement trop lent sont délétères pour la survie des cellules.