NLRP3 inflamassoma: uma plataforma molecular importante no

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO – USP

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

BÁSICA E APLICADA

NLRP3 inflamassoma: uma plataforma molecular

importante no controle da infecção por Leishmania spp.

DJALMA DE SOUZA LIMA JÚNIOR

Ribeirão Preto 2013

DJALMA DE SOUZA LIMA JÚNIOR

NLRP3 inflamassoma: uma plataforma molecular

importante no controle da infecção por Leishmania spp.

Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Imunologia Básica e Aplicada Orientador: Prof. Dr. Dario Simões Zamboni

Ribeirão Preto 2013

III

Trabalho realizado no Laboratório de Patogenicidade Microbiana e Imunidade Inata,

Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina-

Universidade de São Paulo, com auxílio financeiro do TDR/WHO, INCTV/CNPq e FAPESP

IV

Nome: Djalma de Souza Lima Júnior Título: NLRP3 inflamassoma: uma plataforma molecular importante no controle da infecção por Leishmania spp..

Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para a obtenção do grau de Doutor

em Ciências.

Área de concentração: Imunologia

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof (a). Dr (a). Dario S. Zamboni Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Julgamento: ____________________________ Assinatura:___________________________

Prof (a). Dr (a). Fernando Q. Cunha Instituição Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto


Prof (a). Dr (a). Angela K. Cruz Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto


Prof (a). Dr (a). Mauro M. Teixeira Instituição:Universidade Federal de Minas Gerais


Prof (a). Dr (a). Vera Lucia G. Calich Instituição:Universidade de São Paulo


V

“O que prevemos raramente ocorre; o que menos esperamos

geralmente acontece” (Benjamin Disraeli)

“O cientista não se distingue por aquilo que acredita, mas pela maneira e pelo

motivo de sua crença. Suas crenças não são

baseadas na autoridade ou na intuição, mas sim nas evidências”

(Karl Kautsky)

Lima-Júnior, D .S. Dedicatória

VI

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho a meu pai,

Djalma Liberato de Souza Lima, pelo

amor incondicional e apoio constante

mesmo diante de sua ausência.

Dedico também à minha namorada

Lílian, que ao longo desses quatro

anos me apoiou incondicionalmente.

Lima-Júnior, D .S. Agradecimentos

VII

AGRADECIMENTOS

Ao prof. Dr. Dario Simões Zamboni, por ter me recebido tão bem em seu laboratório,

pela orientação, confiança e pelo exemplo de organização, dedicação e amor à pesquisa.

Agradeço infinitamente a oportunidade de fazer parte de um grupo de tão alto nível e por ter

me mostrado que a ciência é feita de muito trabalho, dedicação e principalmente detalhes.

Ao prof. Dr. João Santana da Silva, pela co-orientação, pelas conversas e sugestões

que foram extremamente importantes para o desenvolvimento desse trabalho. Pelo exemplo

de honestidade, amor e dedicação à ciência.

Aos professores Dr. Marcelo Torres Bozza, Dr. Fernando de Queiroz Cunha, Dr. José

Carlos Alves Filho e Dra. Vânia Bonato pelo aprendizado, convivência e constante

disponibilidade em ajudar.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Patogenicidade Microbiana: Dra. Larissa

Cunha, Dra. Juliana Issa, Dr. Luís Henrique (Beraba), Dr. Marcelo Pereira, Dr. Jonilson

Berlink, Catarina, Mariana, Alexandre, Karol, Tiago (Tiki), Daiane (Jabuzinha), Danielle,

Graziele, Juliana Ribeiro, Talita e Natália pela amizade, harmoniosa convivência e integração,

tornando extremamente prazerosa a realização deste trabalho. Um agradecimento especial à

Dra. Larissa Cunha por toda a paciência, disponibilidade e valiosa colaboração na realização

deste trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Imunoparasitologia, tanto aqueles que fazem parte do

grupo quanto aqueles que passaram por lá, mas que fizeram parte da história desta tese, seja

auxiliando em experimentos, discussões de resultados ou simplesmente pelo companheirismo

e amizade: profa. Dra. Vanessa Carregaro, Dr. Diego Costa, Prof. Dr. Tiago Mineo, Prof. Dr.

Fredy Gutierrez, Dra. Denise Fonseca, Dra. Luciana Benevides, Dra. Renata Sesti, Dra. Maria

do Carmo, Dra. Grace Kelly, Dr. Gustavo Garcia, Maria Cláudia, Tiago Medina, Fernanda,


VIII

Manuela, Gustavo (cabelo vermelho), Laís, Marcela Davoli (Marcelona), Marcela Françozo

(Marcelinha), Murilo, Rodrigo, Frederico, Natália (Ketelut) e Ricardo.

À Maira Nakamura, pela amizade, por toda a paciência, disponibilidade e ajuda nas

compras de reagentes para o laboratório e organização do mesmo, sendo de grande

importância na realização deste trabalho.

À Ana Cristine S. Ferreira, por todo o apoio, disponibilidade, dedicação ao trabalho,

sempre me incentivando e demonstrando grande satisfação em escutar e resolver os

problemas reacionados à pós-graduação.

Aos amigos de outros laboratórios, em especial: Dra. Wendy, Dr. Rodrigo, Isa,

Aninha, Ana Flávia, Tiago Malardo, Rafael Sanches (Panda) e Jhimmy Talbot pela ajuda e

ótima convivência.

Ao Wander (Negão), Lúcia (Tia Lúcia), Dona Vera e Dona Lúcia pela ótima

convivência durante esses anos e pela enorme boa vontade em atender a todos os meus

pedidos referentes ao material utilizado no trabalho ou à limpeza.

Aos técnicos do biotério, Júlio, Rubinho, Edinélson, Devanir, Adriana e Rubilan pela

amizade, paciência e inestimável ajuda com os animais.

A todos os funcionários do departamento de Bioquímica e Imunologia, que de forma

direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.

A todos que contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigado!

Agradecimentos Especiais

À minha família, pelo incentivo, amor e confiança, comemorando comigo as minhas

realizações.

À Lílian, minha namorada, pelo amor, carinho, compreensão, paciência e

principalmente pelo apoio e respeito às minhas escolhas.


IX

Aos irmãos “Leishmanióticos”, profa. Dra. Vanessa Carregaro e Dr. Diego Luís Costa,

que foram mais que colegas, no início me ensinando com paciência e dedicação as técnicas e

procedimentos, pela constante disponibilidade em ajudar, mas acima de tudo por serem

pessoas tão grandiosas.

Aos amigos prof. Dr. Tiago Mineo e prof. Dr. Fredy Gutierrez, pelos ensinamentos,

dedicação, trabalho e responsabilidade que foram essenciais para a realização desse trabalho.

A vocês dedico meu maior respeito.

Fontes financiadoras: FAPESP (processo nº 2009/05054-6), INCTV/CNPq,

TDR/WHO, FAEPA e Pró-Reitoria de Pós Graduação, pela concessão da bolsa e pelo apoio

financeiro que contribuíram diretamente para o desenvolvimento desse trabalho, bem como

para a participação em eventos científicos, que foram de grande importância para minha

formação acadêmica, científica e profissional.

Lima-Júnior, D. S. Resumo

X

RESUMO

Parasitos do gênero Leishmania são agentes causadores da leishmaniose em humanos,

doença que afeta mais de 12 milhões de pessoas, sendo que 350 milhões correm o risco de

contrair a doença em todo mundo. Os parasitos replicam no interior de macrófagos e

modulam negativamente diversas vias de sinalização nessas células, incluindo aquelas

envolvidas na ativação da imunidade inata. Os principais mecanismos responsáveis pela

resistência do hospedeiro envolvem a expressão de NOS2 e produção de óxido nítrico, um

processo regulado de forma transcricional que ainda não é completamente entendido em

macrófagos infectados com Leishmania. Estudos têm demonstrado que a ativação de

receptores da imunidade inata em células, tais como macrófagos, é crucial para a iniciação da

resposta imune. Essa iniciação é alcançada quando receptores presentes nas células do

hospedeiro detectam componentes microbianos ou sinais de perigo. Membros da família dos

receptores do tipo NOD, dentre eles o NLRP3, tem emergido como importantes sensores de

micróbios e danos celulares. NLRP3 regula a formação do inflamassoma, uma plataforma

molecular que contém a caspase-1 ativa. Esse receptor pode ser ativado pela geração de

espécies reativas de oxigênio, efluxo de K+, dano lisossomal ou após o reconhecimento de

patógenos intracelulares. Neste estudo, nós avaliamos o envolvimento do inflamassoma de

NLRP3 na resistência do hospedeiro contra Leishmania. Nós demonstramos que o

inflamassoma de NLRP3 é uma importante plataforma da imunidade inata para a restrição da

infecção por Leishmania tanto in vitro quanto in vivo. A ativação do inflamassoma de NLRP3

foi crítica para o controle da replicação do parasito em culturas de macrófagos e in vivo,

demonstrado através da infecção de camundongos deficientes para o inflamassoma com L.

(L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis e L. (L.) infantum chagasi. A produção de IL-1β

mediada pelo inflamassoma foi crucial para a resistência do hospedeiro à infecção, uma vez

Lima-Júnior, D. S. Resumo

XI

que sua sinalização via IL-1R/MyD88 foi importante e suficiente para induzir a produção de

óxido nítrico mediado pela NOS2. Neste trabalho, nós identificamos uma plataforma

molecular crítica para a resistência contra a infecção por Leishmania spp. e descrevemos os

mecanismos moleculares que explicam a produção de óxido nítrico induzida por Leishmania.

Dessa forma, este estudo liga a sinalização imune inata em macrófagos com a resistência do

hospedeiro a doenças crônicas e persistentes como a leishmaniose.

Lima-Júnior, D. S. Abstract

XII

ABSTRACT

Parasites of the Leishmania genus are the causative agents of leishmaniasis in humans,

a disease that affects more than 12 million people and threatens over 350 million people

worldwide. The parasites replicate intracellularly in macrophages and impair/bypass several

signaling pathways in these cells, including those involved in the activation of innate

immunity. The main mechanisms underlying host resistance involve the production of NOS2-

induced nitric oxide, which is a transcriptionally regulated process that is not completely

understood in Leishmania-infected macrophages. Studies have demonstrated that activation of

innate immunity receptors in cells such as macrophages is crucial for the initiation of immune

response. Initiation is achieved when host cell receptors sense microbial components or

damage signals. Members of the Nod-like receptor family of proteins, including NLRP3, have

emerged as important innate immune sensors of microbes and cellular damage. NLRP3

regulate the assembly of the inflammasome, a molecular platform that contains active

caspase-1. It can be activate by reactive oxygen species generation, efflux of k+, lysosomal

damage or after sensing intracellular pathogens. In this study, we evaluate the involvement of

NLRP3 inflammasome in the host resistance against Leishmania. We demonstrate that the

NLRP3 inflammasome is a major innate immune platform for the restriction of Leishmania

infection both in vitro and in vivo. The activation of the NLRP3 inflammasome was critical

for the control of parasite replication in cultured macrophages and in vivo, as demonstrated

through the infection of inflammasome-deficient mice with L. (L.) amazonensis, L. (V.)

braziliensis and L. (L.) infantum chagasi. The inflammasome-driven IL-1β production was

found to be critical for the host resistance to infection because its signaling via IL-1R/MyD88

was required and sufficient to induce the NOS2-mediated production of nitric oxide. In this

work, we elucidate the major signaling platform for the host resistance against Leishmania

Lima-Júnior, D. S. Abstract

XIII

spp. infection and describe the molecular mechanisms that explain the Leishmania-induced

nitric oxide production. Thus, these studies couple the innate immune signaling in

macrophages with the host resistance to chronic and persistent life-threatening diseases, such

as leishmaniasis.

Lima-Júnior, D. S. Índice

XIV

ÍNDICE

DEDICATÓRIA ............................................................................................................. VI AGRADECIMENTOS .................................................................................................. VII

RESUMO ........................................................................................................................... X ABSTRACT ................................................................................................................... XII

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XVII LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................. XX

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 23 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 32

2.1. Leishmaniose: Características gerais e epidemiologia ...................................... 32

2.2. Agente etiológico e ciclo biológico da leishmaniose ........................................... 33

2.3. Manifestações clínicas da leishmaniose ............................................................... 35

2.4. Eventos iniciais da infecção por Leishmania ...................................................... 38

2.5. Leishmaniose murina e a relação parasito-hospedeiro ..................................... 39

2.6. Resposta imune inata a Leishmania: receptores do tipo Toll ........................... 43

2.7. Receptores do tipo NOD/ Inflamassoma ............................................................. 47

2.8. Sinalização de receptores NLRs sinergiza e complementa a sinalização de

receptores TLRs .......................................................................................................... 61

3. OBJETIVOS ................................................................................................................ 66

3.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 66

3.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 66

4. ANIMAIS, MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 68

4.1 Animais ................................................................................................................... 68

4.2 Parasitos e infecção experimental ........................................................................ 68

4.3 Curso de infecção ................................................................................................... 69

4.4 Quantificação da carga parasitária ...................................................................... 69

4.5 Obtenção do antígeno de Leishmania amazonensis ............................................ 70

4.6 Diferenciação de macrófagos a partir de células da medula óssea .................... 70


XV

4.7 Marcação da caspase-1 ativa ................................................................................ 71

4.8 Detecção da ativação de caspase-1 e IL-1β por Western Blotting ...................... 72

4.9 Transdução de macrófagos primários com Asc-GFP e quantificação dos focos

de Asc ........................................................................................................................... 73

4.10 Determinação dos níveis de IL-1β in vitro ......................................................... 74

4.11 Avaliação da fagocitose e atividade leishmanicida de macrófagos .................. 74

4.12 Detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) .............................................. 76

4.13 Cultivo de células ex vivo ..................................................................................... 77

4.14 Dosagem de citocinas ........................................................................................... 77

4.15 Produção de óxido nítrico ................................................................................... 78

4.16 Extração de RNA e síntese de cDNA .................................................................. 79

4.17 Análise da expressão gênica por meio de reações de PCR em tempo real ..... 80

4.18 Análise Estatística ................................................................................................ 81

4. RESULTADOS ............................................................................................................ 83 4.1 O inflamassoma é ativado em resposta à infecção por Leishmania .................. 83

4.2 A ativação de caspase-1 mediada por L. amazonensis depende de Nlrp3 ......... 85

4.3 A ativação do inflamassoma de Nlrp3 induzido por L. amazonensis é

dependente de produção de ROS, efluxo de potássio e liberação de catepsinas ... 88

4.4 O inflamassoma de Nlrp3 contribui para a restrição da multiplicação de L.

amazonensis em macrófagos ...................................................................................... 96

4.5 O inflamassoma de Nlrp3 contribui para o controle da multiplicação de L.

amazonensis in vivo ................................................................................................... 100

4.7 IL-1β derivada do inflamassoma é crítica para o controle da infecção por

Leishmania mediado por óxido nítrico ................................................................... 107

4.8 O inflamassoma de Nlrp3 é crítico para resistência do hospedeiro contra a

infecção por L. braziliensis e L. infantum chagasi, mas não por L. major ............ 113

5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 123


XVI

6. SUMÁRIO .................................................................................................................. 132

7. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 134 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 136

9. ANEXOS .................................................................................................................... 162 9.1 Anexo 1: Artigo publicado .................................................................................. 162

9.2 Anexo 2: Repercussão desse trabalho no cenário nacional e internacional.....163

Lima-Júnior, D. S. Lista de Figuras

XVII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática da estrutura dos receptores do tipo NOD....................50 Figura 2. Representação esquemática da cascata de ativação dos NLRs.................................51 Figura 3. Organização estrutural do inflamassoma dos NLRPs..............................................53 Figura 4. TLRs e NLRs cooperam no reconhecimento e resposta a diversos componentes patogênicos ativando mecanismos inflamatórios......................................................................64 Figura 5. Caspase-1 é ativada em reposta à infecção por L. amazonensis...............................85 Figura 6. L. amazonensis induz aumento na produção de IL-1β em macrófagos de forma dependente de caspase-1 ..........................................................................................................87 Figura 7. O inflamassoma de Nlrp3 é requerido para a ativação de caspase-1 em macrófagos infectados por L. amazonensis..................................................................................................88 Figura 8. A infecção por L. amazonensis induz a formação de focos de Asc..........................90 Figura 9. Catepsinas e efluxo de potássio são requeridos para a ativação do inflamassoma induzido por L. amazonensis.....................................................................................................91 Figura 10. A produção de espécies reativas de oxigênio induzida pela infecção com L. amazonensis é independente da ativação do Inflamassoma......................................................93 Figura 11. Espécies reativas de oxigênio são requeridas para a ativação do inflamassoma induzido por L. amazonensis.....................................................................................................94 Figura 12. Bloqueio de ROS durante a fagocitose de L. amazonensis inibe a ativação do inflamassoma............................................................................................................................97 Figura 13. Tratamento com inibidores de espécies reativas de oxigênio não induz morte celular ou apoptose....................................................................................................................98 Figura 14. Ativação do inflamassoma ocorre de maneira independente da ativação de NOX2........................................................................................................................................99 Figura 15. A ativação do inflamassoma de Nlrp3 é critico na restrição da multiplicação de L. amazonensis em macrófagos...................................................................................................101


XVIII

Figura 16. Componentes do inflamassoma não são requeridos para a internalização de L. amazonensis por macrófagos..................................................................................................103 Figura 17. A ativação do inflamassoma de Nlrp3 é critico na restrição da multiplicação de L. amazonensis em macrófagos...................................................................................................104 Figura 18. Catepsinas, efluxo de potássio e espécies reativas de oxigênio são importantes para o controle da replicação de L. amazonensis em macrófagos...........................................105 Figura 19. Inflamassoma de Nlrp3 é importante para a restrição da infecção in vivo por L. amozonensis............................................................................................................................107 Figura 20. Inflamassoma de Nlrp3 é importante para a restrição da infecção in vivo por L. amozonensis............................................................................................................................108 Figura 21. Ativação do Inflamassoma é crítica para a produção de IL-1β ex vivo................110 Figura 22. IL-1β contribui para a eliminação do parasito (dependente da ativação do

inflamassoma), através de mecanismos dependentes de NO..................................................112

Figura 23. IL-1β e IFN-γ possuem efeito aditivo na eliminação do parasito (dependente da

ativação do inflamassoma), através de mecanismos dependentes de NO...............................114

Figura 24. O inflamassoma é importante para a expressão de Nos2 e produção de NO in vivo

e ex vivo em reposta à infecção por L. amazonensis...............................................................116

Figura 25. IFN-γ é importante para a produção de IL-1β e óxido nítrico ex vivo.................117

Figura 26. Sinalização pelo receptor de IL-1 é importante para o controle da infecção por L.

amazonensis em macrófagos e in vivo....................................................................................118

Figura 27. O inflamassoma de Nlrp3 é ativado em macrófagos após a infecção com diferentes

espécies de Leishmania...........................................................................................................120

Figura 28. A ativação do inflamassoma não é necessária para o controle da infecção in vivo

por L. major.............................................................................................................................121

Figura 29. O inflamassoma de Nlrp3 contribui para o controle da infecção in vivo por L.

braziliensis..............................................................................................................................122


XIX

Figura 30. O inflamassoma contribui para a resistência à infecção in vivo por L. infantum

chagasi....................................................................................................................................123

Lima-Júnior, D. S. Lista de Abreviaturas e Siglas

XX

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APC: Célula apresentadora de antígeno

ASC: Apoptosis-associated Speck-like protein containg a CARD

Asc−/−: Deleção homozigótica do gene para a molécula ASC

BMDMs: Macrófagos derivados de células da medula óssea

CARD: Domínio de recrutamento de caspase

Caspase-1−/−: Deleção homozigótica do gene para a enzima caspase-1

DAMPs: Padrões moleculares associados a danos

DC: Célula dendrítica

IFN-γ: Interferon-gama

IL: Interleucina

IL-12p40: Subunidade p40 da IL-12

NOS2: Óxido nítrico sintase 2

Nos2−/−: Deleção homozigótica do gene para óxido nítrico sintase induzível

NO: Óxido nítrico

LPG: Lipofosfoglicano

LPS: Lipopolissacarídeo

NAIP: Proteína inibidora de apoptose neuronal

NF-κB: Fator nuclear κB

NLR: Receptor do tipo NOD

Nlrp: NLR family, pyrin domain containing

Nlrp3: NLR family, pyrin domain containing 3

Nlrp3−/−: Deleção homozigótica do gene para o receptor NLRC4

NOD: Domínio de oligomerização nuclear

PAMPs: Padrões moleculares associados a patógenos

Lima-Júnior, D. S. Lista de Abreviaturas e Siglas

XXI

PBS: Salina tamponada com fosfato

PRRs: Receptores de reconhecimento padrão

rIFN-γ: Interferon gama recombinante

Th: T “helper”

Th1: T “helper” tipo 1

Th2: T “helper” tipo 2

TLR: Receptor do tipo Toll

TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa

NaCl: Cloreto de sódio

KCl: Cloreto de potássio

UV: Ultravioleta

Introdução

Lima-Junior, D. S. Introdução

23

1. INTRODUÇÃO

A leishmaniose constitui um espectro de doenças causadas por protozoários do gênero

Leishmania, parasitos intracelulares obrigatórios de células do sistema fagocítico

mononuclear, compreendendo espécies responsáveis por diferentes patologias. São

transmitidos aos hospedeiros vertebrados por meio de vetores, insetos do gênero Phlebotomus

no velho mundo e Lutzomyia no novo mundo (flebotomíneos). Ela está presente em todos os

continentes, com exceção da Antártida e Oceania, e é a segunda causa de morte entre as

doenças parasitárias. Estima-se que 350 milhões de pessoas correm o risco de contrair

leishmaniose anualmente no mundo, sendo que cerca de 12 milhões estão infectadas. O fato é

que aproximadamente dois milhões de novos casos surgem por ano (1-1,5 milhões de casos de

leishmaniose tegumentar americana (LTA) e 500.000 de leishmaniose visceral) sendo que

destes, em média 70.000 resultam em óbito (WHO, 2010). Esta alta incidência da doença,

acompanhada por lesões incapacitantes, desfigurantes e algumas vezes fatais, levou a

Organização Mundial de Saúde a incluir a leishmaniose entre as seis endemias mais

importantes no mundo.

Dentre os países da América latina, o Brasil é o país com maiores índices da doença,

sendo que a forma mais comum causada pelo parasito é a leishmaniose tegumentar americana.

A distribuição geográfica da leishmaniose no Brasil é ampla e tem sido registrada em todo o

território nacional (BRASIL, 2010). De 1990 a 2010 foram detectados em média cerca de 20

novos casos por 100.000 habitantes no Brasil, sendo que todas as unidades federadas

registraram casos autóctones da doença. As regiões Norte e Nordeste vêm contribuindo com o

maior número de casos registrados no período de 1990 a 2010 – cerca de 40% e 35%,

respectivamente (BRASIL, 2010). No estado de São Paulo, de 1975 a 2008, foram registrados

12.978 casos. Destes, 621 só em 2001. Na região leste do estado de São Paulo, tem crescido o

número de casos autóctones de LTA desde 1975 (DA SILVA, 2012). No período de 1985 a


24

1998, o atendimento de casos de LTA no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (SP) tem

sido de um caso novo/mês (MEDEIROS, 1999) e de 2004 a 2009, de 4 a 5 casos novos por

mês (dados não publicados).

As formas clínicas apresentadas pelas diferentes Leishmanioses podem ser citadas

como: Leishmaniose visceral que é sistêmica e caracterizada pelo acometimento do baço,

fígado, linfonodo e medula óssea, consistindo a forma mais grave da doença; Leishmaniose

cutânea que se apresenta classicamente por pápulas que evoluem para úlceras com bordas

elevadas e fundo granuloso, sendo a forma clínica mais comum da doença; a forma cutânea

difusa que é caracterizada pelo aparecimento de lesões difusas não ulceradas por toda a pele; e

a forma mucocutânea que é caracterizada por destruição progressiva local do tecido mucoso e

submucoso da boca e nariz (BARRAL-NETTO et al., 1998).

Dentre as espécies causadoras de leishmaniose no Brasil, Leishmania (Leishmania)

amazonensis e Leihsmania (Viania) braziliensis são importantes agentes responsáveis pela

leishmaniose tegumentar na região amazônica, induzindo as formas cutânea e mucocutânea da

doença (REITHINGER et al., 2007). É estimado que aproximadamente 10% dos casos de

leishmaniose cutânea progride para a forma mucocutânea da doença, que usualmente

apresenta lesões secundárias destrutivas na mucosa nasal e bucal (HARTLEY et al., 2012).

Embora a conversão da forma cutânea para a forma mucocutânea da doença esteja associada

com o genótipo do parasito e a resposta imune do hospedeiro, as características específicas da

resposta imune que dirigem a forma cutânea e mucocutânea da doença não estão claras

(Revisado em KAYE; SCOTT, 2011). Outra importante espécie do gênero Leishmania é a

Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, que é muito recorrente no Brasil e Índia e causa a

forma visceral da doença, forma essa que se não tratada pode levar ao óbito (CHAPPUIS et

al., 2007).

A resposta imune protetora contra Leishmania é principalmente mediada por células.


25

Pouco se sabe sobre a participação de anticorpos nessa resposta, embora a presença de

anticorpos específicos seja comum na LTA (SARAVIA et al., 1989). De maneira geral, a

resposta imune inicia-se quando macrófagos ou células dendríticas infectadas pelo parasito

produzem IL-12, que age sobre células NK e NK-T estimulando a produção de IFN-γ, que

tem papel relevante na diferenciação de linfócitos T virgens no subtipo Th1, também

produtores de IFN-γ (MARTIN-FONTECHA et al., 2004; SCHARTON-KERSTEN;

SCOTT, 1995). O IFN-γ produzido inicialmente pelas células NK induz a secreção de IL-12

por células apresentadoras de antígenos (células dendríticas, macrófagos, monócitos,

linfócitos B) e por polimorfonucleares (PMN). A produção inicial de IL-12 pode também ser

desencadeada pela fagocitose e reconhecimento do parasito pelos receptores da imunidade

inata (SUTTERWALA; MOSSER, 1999b) e amplificada por IFN-γ. A citocina IL-12, por sua

vez, amplifica a produção de IFN-γ pelas células Th1, estabelecendo, assim, uma importante

alça de feedback positiva (BELOSEVIC et al., 1989; HEINZEL et al., 1995). Além disso, o

IFN-γ produzido por essas células, juntamente com o TNF-α, produzido pelo macrófago

infectado age na estimulação da produção de radicais de oxigênio e nitrogênio, especialmente

o óxido nítrico no interior dos macrófagos, culminando na eliminação dos parasitos (KEMP,

1997). O óxido nítrico, bem como espécies reativas de oxigênio, é fundamental na atividade

leishmanicida exercida pelos macrófagos, uma vez que foi demonstrado aumento da carga

parasitária quando a óxido nítrico sintase induzível (NOS2) ou a produção de espécies

reativas de oxigênio era deletada em animais nocautes ou bloqueada com inibidores

(DIEFENBACH et al., 1998; EVANS et al., 1993; GANTT et al., 2001; MUKBEL et al.,

2007; MURRAY; NATHAN, 1999). Porém, os mecanismos que regulam a produção desses

agentes leishmanicidas não estão completamente elucidados. Vale ressaltar, que além das

células NK e Th1, considerada como as principais fontes de IFN-γ, parecem existir outras

fontes alternativas de IFN-γ, como células NK-T (LAUWERYS et al., 2000) e células T


26

CD8+ (Revisado em SACKS; NOBEN-TRAUTH, 2002).

Dados da literatura demonstraram que as células da imunidade inata possuem

receptores codificados em linhagens germinativas responsáveis pelo reconhecimento de

padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) incluindo ácidos nucleicos,

componentes de paredes celulares de fungos e bactérias, proteínas flagelares, dentre outros

(JANEWAY, JR.; MEDZHITOV, 2002; KARIN; LAWRENCE; NIZET, 2006). A primeira

família desses receptores estudada em detalhes foi a dos receptores do tipo Toll (TLRs – Toll

Like Receptors) (MEDZHITOV, 2001). Os TLRs constituem uma família de 11 proteínas

transmembranas que reconhecem diferencialmente PAMPs através de um domínio

extracelular, iniciando uma resposta inflamatória a partir de um domínio intracelular. Os

TLRs ligam à MyD88 ou TRIF, proteínas que interagem com várias outras moléculas em uma

cascata sinalizadora que leva à translocação de NF-kB e produção de citocinas, tais como IL-

12. Em adição, MyD88 é uma proteína adaptadora essencial na sinalização de citocinas como

IL-1 e IL-18 (TAKEUCHI; AKIRA, 2002), sendo portanto de grande importância para o

desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1. Camundongos deficientes de MyD88

apresentam uma alta susceptibilidade à infecção por L. major devido à polarização da resposta

imune para o padrão Th2 via dependente de IL-4 (DEBUS et al., 2003). Além disso, MyD88

mostrou-se importante para o controle da infecção in vivo induzida por L. braziliensis

(VARGAS-INC et al., 2009). Outros trabalhos tem demonstrado a importância de receptores

Toll-like específicos na montagem de uma resposta imune eficiente contra parasitos do gênero

Leishmania, tais como TLR2, TLR3, TLR4, TLR7 e TLR9, os quais contribuem para um

eficiente controle da infecção por L. major e L. braziliensis (BECKER et al., 2003; BOU

FAKHER et al., 2009; DE VEER et al., 2003; KROPF et al., 2004a; KROPF et al., 2004b;

LIESE; SCHLEICHER; BOGDAN, 2007; MULLER et al., 1997; POLTORAK et al., 2000;

SCHAMBER-REIS et al., 2013a; WEINKOPFF et al., 2013). Além disso, TLR2 e TLR3


27

participam da fagocitose e estão envolvidos na secreção de NO e TNF-α em infecções com L.

donovani (FLANDIN; CHANO; DESCOTEAUX, 2006). Entretanto, a resistência do

hospedeiro mediada por TLRs não explica totalmente a imunidade inata frente à infecção por

Leishmania, uma vez que camundongos MyD88–/– infectados por esse parasito ainda

produzem altos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e IFN-γ), apresentam lesões

menos evidentes que animais altamente susceptíveis como BALB/c e ainda são capazes de

controlar a infecção (DEBUS et al., 2003; MURAILLE et al., 2003; VARGAS-INC et al.,

2009). Neste contexto, esses achados sugerem que outros receptores da imunidade inata, além

dos TLRs, contribuem para a indução de uma imunidade protetora frente à infecção por

parasitos do gênero Leishmania.

Nos últimos anos, uma nova família de receptores da imunidade inata foi descrita, os

receptores do tipo NOD (NLRs – Nod Like Receptors). Diferente dos receptores Toll-like

(receptores transmembranares), os NLRs consistem de proteínas solúveis que se encontram no

citoplasma e sinalizam em resposta a patógenos intracelulares. Esses receptores são capazes

de reconhecer peptideoglicanos de paredes celulares bacterianas (MARTINON et al., 2004),

sinais endógenos de perigo como o acúmulo de cristais de ácido úrico (SHI; EVANS; ROCK,

2003) e baixas concentrações de potássio intracelular (MARTINON; BURNS; TSCHOPP,

2002), dentre outros.

Os NLRs apresentam uma estrutura característica, composta por três domínios: um

domínio carboxi-terminal LRR que é responsável pelo reconhecimento do ligante; um

domínio NOD (“Nucleotide-binding Oligomerization Domain”), responsável pela

oligomerização do receptor após sua ativação; e um domínio amino-terminal distinto, o qual

desencadeia a função efetora do receptor (ATHMAN; PHILPOTT, 2004b). Na ausência de

infecção, o NLR encontra-se em uma forma inativa; as regiões efetoras permanecem

protegidas pela região LRR o que bloqueia sua ativação. A ligação de moléculas ao LRR


28

promove uma modificação estrutural no receptor resultando na exposição de sítios de ligação

ao ATP, permitindo assim a ligação de ATP ao domínio NOD, o qual se oligomeriza

promovendo uma sinalização celular característica de cada NLR (ZINK et al., 2002). NLRs

incluem proteínas tais como NOD1 (do inglês, nucleotide-binding and oligomerization

domain 1), também conhecido como CARD4; NOD2 (também conhecido como CARD15)

(INOHARA et al., 2005); NALPs (proteínas contendo domínios NACHT, LRR e pyrin);

NLRC4 ou IPAF (fator ativador da protease ICE, enzima conversora de IL-1), também

conhecido como CARD12 (ou CLAN) e NAIPs (proteínas inibidoras de apoptose neuronal)

(TING; KASTNER; HOFFMAN, 2006).

Dentre os NLRs, os receptores NOD1 e NOD2 atuam regulando a expressão

transcricional de genes envolvidos na resposta inflamatória contra micróbios patogênicos,

incluindo bactérias e protozoários (MAGALHAES et al., 2011). Outros receptores NLRs

regulam processos pós-transcricionais que levam à formação do inflamassoma, uma

plataforma molecular composta pela caspase-1 ativa (MARTINON; MAYOR; TSCHOPP,

2009). Dentre os NLRs ativadores do inflamassoma podemos incluir os NAIPs, que ativam o

inflamassoma após o reconhecimento do sistema de secreção do tipo III bacteriano ou de

flagelina bacteriana, em um processo que requer outra proteína NLR denominada

NLRC4/IPAF (KOFOED; VANCE, 2011; ZHAO et al., 2011). Por outro lado, outro

receptor ativador do inflamassoma denominado NLRP3 requer a proteína adaptadora ASC

(apoptosis-associated speck-like containing a CARD domain) para ativar caspase-1

(MARTINON; MAYOR; TSCHOPP, 2009). O inflamassoma de NLRP3 é o mais bem

estudado devido sua associação com importantes doenças metabólicas e inflamatórias

crônicas, tais como Alzheimer, diabetes tipo II, obesidade, arteriosclerose e doenças

intestinais (WEN; TING; O'NEILL, 2012). Acredita-se que o NLRP3 responde à

perturbações no citoplasma da célula do hospedeiro, que podem ser causadas por PAMPs (por


29

exemplo RNA) ou por agentes estressantes, tais como toxinas bacterianas, micróbios

formadores de poro e estruturas cristalinas que rompem a membrana celular (MARTINON;

MAYOR; TSCHOPP, 2009). É bem estabelecido que o inflamassoma de NLRP3 responde à

perturbações nas membranas de células da imunidade inata e, sendo assim, essa característica

leva ao conceito que NLRP3 é um sensor de dano, podendo assim ser ativado por DAMPs

(Damage-associated molecular patterns).

Através de mecanismos ainda desconhecidos, a ativação do inflamassoma de NLRP3 e

concomitante ativação de caspase-1, requer o efluxo de K+ (sendo impedida por inibidores de

transportadores de K+), catepsinas lisossomais e espécies reativas de oxigênio (DOSTERT et

al., 2008; FRANCHI et al., 2007a; HORNUNG et al., 2008; PETRILLI, 2007). Uma vez

ativada, caspase-1 induz a secreção não convencional de diversas proteínas do hospedeiro e

uma forma específica de morte celular, denominada piroptose (BERGSBAKEN; FINK;

COOKSON, 2009; KELLER et al., 2008). As proteínas secretadas incluem citocinas, tais

como IL-1β, que é regulada a nível transcricional pela sinalização dos receptores TLRs e

posteriormente processada e secretada através de um processo dependente do inflamassoma

(MARIATHASAN et al., 2006).

A ativação do inflamassoma em reposta à infecção por patógenos intracelulares tem

sido extensivamente investigada. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos pelos

quais a ativação do inflamassoma restringe a replicação de patógenos intracelulares. Modelos

bacterianos de infecção têm demonstrado que o inflamassoma de NAIP5/NLRC4 participa no

controle da infecção por bactérias flageladas, tais como Legionella pneumophila, Salmonella

typhimurium, Shigella flexneri e Pseudomonas aeruginosa (MARIATHASAN et al., 2004;

SUTTERWALA et al., 2007; SUZUKI, 2007; ZAMBONI et al., 2006). Entretanto, apesar de

extensivas caracterizações do papel dessas plataformas moleculares na restrição da replicação

de patógenos tanto in vivo quanto in vitro, os mecanismos envolvidos na resistência do


30

hospedeiro são largamente desconhecidos. Além disso, nada se sabe a respeito do

envolvimento do inflamassoma de NLRP3 na infecção provocada por parasitos do gênero

Leishmania. Dessa forma, torna-se de grande importância determinar o papel do

inflamassoma de NLRP3, bem como os mecanismos envolvidos na ativação da imunidade

inata mediada por essa plataforma molecular, durante a infecção por Leishmania. A

determinação do papel desse receptor inato frente à infecção por Leishmania tem o potencial

de abrir novas perspectivas para o tratamento e profilaxia desta infecção, que acomete cerca

de 12 milhões de pessoas ao redor do mundo, bem como de outras doenças inflamatórias

crônicas.

Revisão

Bibliográfica

Lima-Junior, D. S. Revisão Bibliográfica

32

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Leishmaniose: Características gerais e epidemiologia

A leishmaniose constitui um espectro de doenças causadas por protozoários do gênero

Leishmania, parasitos intracelulares de células do sistema fagocítico mononuclear,

compreendendo espécies responsáveis por diferentes patologias. O gênero Leishmania é

composto de aproximadamente 30 espécies, sendo que 20 delas têm sido encontradas

causando infecção em humanos, as quais são zoonóticas ou têm recentes origens zoonóticas.

Sua distribuição é determinada por características climáticas, seus vetores, sistemas de

reservatórios, ou ambos, logo é dependente de características ambientais específicas

(ASHFORD, 2000).

A primeira descrição da doença foi feita em 1756, mas foi em 1903 que Leishman

identificou o parasito no baço de um paciente com a forma visceral da doença, fato esse

responsável pelo nome dado ao gênero. No Brasil, o parasito causador da doença cutânea foi

identificado como Leishmania braziliensis em um paciente de Além Paraíba, na fronteira dos

estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais (VIANNA, 1911). Hoje, sabe-se que a leishmaniose

pode ser causada por grande número de espécies e é transmitida por fleblotomíneos dos

gêneros Phlebotomus, presentes no Velho Mundo, e Lutysomyia presentes no Novo Mundo. A

doença é classificada em quatro principais formas clínicas: cutânea localizada (LCL),

mucocutânea (LMC), difusa (LCD) e visceral (LV), sendo que no novo mundo as três

primeiras formas são agrupadas em uma única denominação: leishmaniose tegumentar

americana (LTA).

A leishmaniose está presente em quase todos os continentes, com exceção da Antártida

e Oceania, e é a segunda causa de morte entre as doenças parasitárias. Estima-se que

mundialmente 350 milhões de pessoas corram o risco de contrair a doença, cerca de 12

milhões estão infectadas e aproximadamente dois milhões de novos casos surjam por ano (1-


33

1,5 milhão de casos de leishmaniose cutânea e 500.000 de leishmaniose visceral), sendo que

destes, em média 70.000 resultam em óbito (WHO, 2010).

No Brasil, a distribuição geográfica da leishmaniose é ampla e tem sido registrada em

todo o território nacional (BRASIL, 2010). De 1990 a 2010 foram detectados em média cerca

de 20 novos casos por 100.000 habitantes, sendo que todas as unidades federadas registraram

casos autóctones da doença. As regiões Norte e Nordeste vêm contribuindo com o maior

número de casos registrados no período de 1990 a 2010 – cerca de 40% e 35%,

respectivamente (BRASIL, 2010). No estado de São Paulo, de 1975 a 2008, foram registrados

12.978 casos. Destes, 621 só em 2001. Na região leste do Estado de São Paulo, tem crescido o

número de casos autóctones de LTA desde 1975. No período 1985 a 1998, o atendimento de

casos de LTA no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (SP) tem sido de um caso novo/mês

(MEDEIROS, ROSELINO, 1999) e de 2002 a 2005, de 4 a 5 casos novos por mês (dados não

publicados).

2.2. Agente etiológico e ciclo biológico da leishmaniose

Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários unicelulares, digenéticos,

pertencentes à ordem Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae. A identificação

taxonômica do gênero foi, durante muitos anos, baseada nos aspectos clínicos da doença.

Atualmente, o gênero é subdividido em dois subgêneros, Viannia e Leishmania, levando-se

em conta parâmetros tradicionais (expressão clínica, epidemiologia e distribuição geográfica)

e o perfil de colonização do tubo digestivo do vetor. O subgênero Viannia agrupa espécies

que inicialmente se desenvolvem no intestino posterior e mais tarde no intestino anterior do

inseto transmissor, e o subgênero Leishmania agrupa espécies que se desenvolvem

exclusivamente nos intestinos médio e anterior do flebotomíneo (RYAN; LAINSON; SHAW,

1987).


34

O parasito apresenta dois estágios principais no seu ciclo vital. No trato digestivo dos

flebotomíneos fêmeas, se reproduzem as formas flageladas denominadas promastigotas. São

alongadas, possuem flagelo livre e duas principais moléculas de superfície: o lipofosfoglicano

(LPG) e a glicoproteína 63 (gp63) (WOLDAY et al., 1999). Cada promastigota possui 6x106

cópias de moléculas de LPG e 5x106 cópias de gp63 (BOUVIER; ETGES; BORDIER, 1985)

que lhes protegem de processos microbicidas, tais como a lise mediada pelo complemento,

ação de radicais de oxigênio e hidrolases presentes no mamífero e no inseto transmissor

(ILGOUTZ; MCCONVILLE, 2001). Nos hospedeiros mamíferos, dentro do vacúolo

parasitóforo nos macrófagos, os parasitos se multiplicam na forma amastigota (Mendonza-

Léon e cols., 1996). As amastigotas são arredondadas e possuem flagelo involuído. São

altamente resistentes ao ambiente hostil presente dentro do fagolisossoma de macrófagos.

Acredita-se que tal capacidade seja devido a moléculas glicoconjugadas, tais como

glicoinositolfosfolipídios (GIPLs) e o LPG presentes em sua superfície (ILG, 2000) ou

proteofosfoglicanos (PPG) secretados pelo parasito (PETERS; STIERHOF; ILG, 1997).

O ciclo biológico da leishmaniose se inicia quando a fêmea do inseto vetor pica o

animal vertebrado infectado e, durante o repasto, ingerem macrófagos infectados com

amastigotas de Leishmania. No lúmen intestinal, ocorre o rompimento do macrófago,

liberando as formas amastigotas que sofrem divisão binária e se transformam em

promastigotas, que se dividem rapidamente, colonizando o trato digestivo médio e anterior do

flebotomíneo. No intestino médio do inseto há a transformação de amastigotas em

promastigotas procíclicas que são pequenas, ovóides, com pouca motilidade, multiplicam-se

intensamente e em seguida vão se tornando promastigotas longas, afiladas e com muita

motilidade. Posteriormente, transformam-se em promastigotas metacíclicas, que são

pequenas, afiladas e com grande motilidade (SACKS; BRODIN; TURCO, 1990; SARAIVA

et al., 1995). Algumas dessas formas migram para o esôfago, faringe e probóscida do


35

flebotomíneo e são inoculadas durante o repasto sanguíneo, reiniciando assim o ciclo no

hospedeiro vertebrado (Revisado em SACKS; KAMHAWI, 2001).

Dentre as muitas espécies de Leishmania já descritas, causadoras de leishmaniose

animal ou humana, Leishmania (Leishmania) amazonensis é um importante agente etiológico

da leishmaniose tegumentar humana e apresenta amplo espectro de formas clínicas (BARRAL

et al., 1991b). Dados recentes indicam que L. (L.) amazonensis está expandindo sua

distribuição geográfica no Brasil, sendo responsável por sintomas clínicos não usuais em

novas áreas de transmissão (ZEREDO-COUTINHO et al., 2007). Recentemente, foram

observados casos de Leishmaniose Tegumentar Americana envolvendo L. (L.) amazonensis

na região nordeste do Estado de São Paulo (MEDEIROS; SILVA, JR.; ROSELINO, 2008).

Adicionalmente, é interessante salientar que a infecção humana por L. (L.)

amazonensis ocorre principalmente em interações acidentais, uma vez que o principal

hospedeiro mamífero desse parasito presente no ecossistema natural são roedores silvestres,

como Proechymis spp. Tais roedores não apresentam lesões cutâneas detectáveis durante o

desenvolvimento do parasito (FORTEA et al., 2007), em oposição às numerosas

manifestações clínicas observadas na doença humana.

2.3. Manifestações clínicas da leishmaniose

As leishmanioses podem ser divididas em dois tipos, de acordo com os órgãos que

acometem: Leishmaniose Tegumentar (Leishmaniose Tegumentar Americana, no Novo

Mundo e Leishmaniose Tegumentar do Velho Mundo), que acomete a pele e mucosas, e a

Leishmaniose Visceral, que acomete as vísceras, principalmente baço, fígado e medula óssea.

A leishmaniose visceral, que é a forma mais grave da doença, pode ser causada por

L. infantum e L. donovani no Velho Mundo e L. chagasi no Novo Mundo. A febre baixa é o

principal sintoma no início da doença, mas outros sintomas como a perda de peso, anemia,


36

hepatoesplenomegalia, caquexia e depressão funcional da medula óssea podem surgir de

acordo com a progressão da visceralização (WHO, 2007). Pode ocorrer também

imunossupressão generalizada, que é freqüente causa de morte. Entretanto a infecção humana

por L. donovani nem sempre resulta em doença, pois muitos pacientes podem apresentar um

curso de infecção subclínico somente pela presença de anticorpos específicos (SACKS et al.,

1987).

As espécies responsáveis pela leishmaniose tegumentar no Novo Mundo são:

L. brazieliensis, L. peruviana, L. guyanensis, L. lainsoni, L. naiffi, L. shawi, L. colombiensis,

L. panamensis, L. venezuelensis, L. amazonensis e L. mexicana (GRIMALDI, JR.; TESH,

1993). L. tropica, L. major e L. aethiopica são as espécies descritas no Velho Mundo

(ASHFORD; BETTINI, 1987).

Clinicamente, a leishmaniose tegumentar apresenta-se de maneira variada, desde as

formas inaparentes ou com ulcerações de pele, que podem ser discretas ou extensas e com

evolução espontânea para cura após alguns meses, até aquelas com ulcerações múltiplas ou

disseminadas. A manifestação clínica mais freqüente da doença é a leishmaniose cutânea

localizada, que se caracteriza por lesões ulceradas, únicas, de bordas elevadas e circulares,

com pouca secreção e indolores, podendo haver casos de controle da infecção com cura

espontânea (HERWALDT; ARANA; NAVIN, 1992; MARSDEN et al., 1984). A

leishmaniose cutânea localizada pode ser causada principalmente pelas espécies L.

amazonensis, L. braziliensis, L. guyanensis, L. panamensis, L. peruviana, L. mexicana e L.

venezuelensis no novo mundo e L. major, L.tropica e L. aethiopica, no velho mundo

(BAILEY; LOCKWOOD, 2007; REITHINGER et al., 2007) .

A forma disseminada é caracterizada por úlceras típicas, associadas a inúmeras lesões

papulares ou acneiformes, decorrentes de disseminação hematogênica, podendo, por

contigüidade comprometer a mucosa (CARVALHO, 1994; COSTA et al., 1986). É causada


37

pelas espécies L. aethiopica, no velho mundo e L. amazonensis, L. mexicana e L.

venezuelensis no novo mundo (BAILEY; LOCKWOOD, 2007; REITHINGER et al., 2007).

A leishmaniose cutânea difusa, causada por L. (L.) amazonensis é uma forma grave não

responsiva ao tratamento, anérgica e muito rara. É caracterizada predominantemente por

nódulos múltiplos, onde se observa extraordinária riqueza parasitária, podendo ocorrer

também lesões tuberosas, placas e raramente aparecem ulcerações (LLANOS-CUENTAS et

al., 1984).

A forma mais grave do espectro clínico é a cutâneo-mucosa, ou espúndia, que

apresenta significante morbidade e pode levar a um curso fatal. É caracterizada por lesão na

mucosa nasal, que pode expandir e acometer palato mole e duro, úvula, faringe, gengivas e

lábio superior. Paradoxalmente, essas lesões mucosas contêm um número bastante reduzido

de parasitos. O intenso infiltrado inflamatório resulta em exuberante aumento do nariz e do

lábio superior, conferindo à lesão um aspecto tumoral e desfigurante. A perfuração do septo

nasal é observada em torno de 42% dos pacientes, podendo afetar a mucosa traqueobrônquica

e esôfago (BITTENCOURT; BARRAL, 1991; MARSDEN, 1986). No velho mundo, é

causada pelas espécies L. tropica, L. major, L. aethiopica e L. infantum (ALIAGA et al.,

2003; KHARFI et al., 2003; MORSY et al., 1995) e no novo mundo, inclusive no Brasil, a

espécie causadora mais freqüente é a L. braziliensis, mas também pode ser causada pelas

espécies L. panamensis, L. guyanensis , L. mexicana e L. amazonensis (BARRAL et al.,

1991a; DESJEUX, 1996; GRIMALDI, JR.; DAVID; MAHON-PRATT, 1987; MARSDEN,

1986; REITHINGER et al., 2003; SANTRICH et al., 1990; SARAVIA et al., 1985).

Neste contexto, vale ressaltar que a importância da leishmaniose tegumentar reside

não somente na alta incidência e ampla distribuição geográfica, mas também na possibilidade

de assumir formas que podem determinar lesões desfigurantes, incapacitantes e algumas vezes

fatais, o que levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a incluir a doença entre as onze


38

endemias mais importantes do mundo (TDR, 2004).

2.4. Eventos iniciais da infecção por Leishmania

Durante a picada da fêmea do flebótomo, promastigotas metacíclicas, presentes nas

glândulas salivares, são inoculadas junto com a saliva, no lago sanguíneo produzido pelo

traumatismo da probóscida do flebótomo, na derme do hospedeiro mamífero (RIBEIRO,

1995). A quantidade de promastigotas inoculadas varia de acordo com a intensidade de

infecção do flebótomo. O número de promastigotas inoculadas parece ser importante no

desenvolvimento da resposta imune. Estima-se que os flebótomos podem inocular de 0 a 1000

promastigotas na derme do hospedeiro mamífero (WARBURG; SCHLEIN, 1986), o que

possivelmente entra como fator importante na variação da intensidade da infecção. Outros

fatores relevantes são as substâncias presentes na saliva do flebótomo (GILLESPIE; MBOW;

TITUS, 2000). Algumas delas podem induzir resposta Th2 e exacerbação da lesão, mesmo em

camundongos naturalmente resistentes (BELKAID et al., 1998; MBOW et al., 1998).

Entretanto, com L. braziliensis, o efeito da exacerbação da doença na presença de saliva

parece ser dependente da composição salivar da espécie do flebótomo, uma vez que a

inoculação de L. braziliensis (106-107 promastigotas) junto com a saliva de Lutsomyia

whitmani leva ao desenvolvimento de lesões que apresentam cura espontânea (BEZERRA;

TEIXEIRA, 2001), enquanto que a inoculação do mesmo parasito (106-107 promastigotas)

com saliva de L. longipalpis causa lesões cutâneas nodulares progressivas, que não se curam

(LIMA; TITUS, 1996).

Uma vez na derme, as promastigotas metacíclicas podem penetrar em granulócitos,

macrófagos (LIMA et al., 1998; POMPEU et al., 1991) ou em células dendríticas (CDs)

(MOLL, 2000). Leishmania pode sobreviver dentro de neutrófilos nas primeiras horas ou

primeiros dias após a infecção (LAUFS et al., 2002; VAN et al., 2004) e pode atrasar,


39

embora não evite a apoptose espontânea dos neutrófilos (AGA et al., 2002). Quando

macrófagos ingerem neutrófilos apoptóticos infectados (SAVILL et al., 1989), suas funções

microbicidas não são ativadas (MEAGHER et al., 1992; VAN et al., 2004). Desta forma

acredita-se que a leishmania estaria entrando no macrófago, a sua principal célula hospedeira,

de uma maneira silenciosa (LASKAY; VAN; SOLBACH, 2003).

Embora a leishmania consiga diferenciar-se em amastigotas e proliferar dentro de

células dendríticas (PRINA et al., 2004), os macrófagos são as células hospedeiras

preferenciais, onde os parasitos proliferam intensamente nos vacúolos parasitóforos

(KONECNY et al., 1999). No entanto são as células dendríticas infectadas que migram para

o linfonodo regional (MOLL, 2000), e, ainda na pele, estas células podem sofrer influências

de quimiocinas ou citocinas liberadas por queratinócitos, neutrófilos, mastócitos e macrófagos

presentes no sítio de inoculação. Quimiocinas e seus receptores participam na regulação da

migração e das interações das células apresentadoras de antígeno (APCs) com os linfócitos. O

receptor de quimiocina CCR7 é importante na migração de células dendríticas maduras dos

tecidos paras as áreas T dos linfonodos (FORSTER et al., 1999), onde vai ocorrer a

sensibilização dos linfócitos pelas APCs (MOLL et al., 1993; PRINA et al., 2004). Diversas

células como as dendríticas, os macrófagos e os linfócitos B, podem apresentar antígenos às

células T, dando início à sensibilização e expansão das células efetoras. A diferenciação

linfocitária vai depender, entre outros fatores, do tipo de APC, das moléculas co-

estimulatórias expressas e das quimiocinas e citocinas que predominam no microambiente

nestes primeiros momentos da sensibilização linfocitária.

2.5. Leishmaniose murina e a relação parasito-hospedeiro

Os modelos de leishmaniose experimental têm trazido grande contribuição para o

esclarecimento da imuno-regulação da doença. A cura da leishmaniose cutânea é criticamente


40

dependente do desenvolvimento de uma resposta imune do tipo Th1. Qualquer falha na

montagem de uma eficiente resposta Th1 anti-leishmania resulta em doença progressiva e

morte (Revisado em SACKS; NOBEN-TRAUTH, 2002). As condições que desencadeiam a

diferenciação Th1 ou Th2 parecem ser multifatoriais. Alguns destes fatores têm sido

evidenciados, trazendo mais clareza para a compreensão da patogênese da leishmaniose,

embora ainda existam muitas lacunas.

A resposta imune protetora contra Leishmania é mediada principalmente por células.

Pouco se sabe sobre a participação de anticorpos nessa resposta, embora a presença de

anticorpos específicos seja comum na LTA (SARAVIA et al., 1989). De maneira geral, a

resposta imune inicia-se quando células apresentadoras de antígenos infectadas pelo parasito

produzem IL-12, que age sobre células NK estimulando a produção de IFN-γ e também sobre

a diferenciação dos linfócitos T imaturos no subtipo Th1, também produtores de IFN-γ. O

IFN-γ produzido por estas células, juntamente com o TNF-α, induz a estimulação da produção

de radicais de oxigênio e nitrogênio, responsável pela eliminação do parasito (KEMP, 1997).

Os mediadores mais bem descritos envolvidos na morte dos parasitos no interior de

macrófagos ativados são os radicais de oxigênio e nitrogênio. Os intermediários reativos que

têm sido implicados na morte da Leishmania incluem: superóxido, peróxido de hidrogênio,

radical hidroxil e óxido nítrico. Macrófagos residentes, que falham em conter o crescimento

da população de Leishmania, produzem estes radicais, mas em baixas quantidades se

comparados aos macrófagos ativados que secretam altos níveis destas moléculas reativas

(BRUNET, 2001). Os macrófagos ativados exibem significativo aumento do mRNA para

óxido nítrico sintase induzível (NOS2) e produzem grande quantidades de NO. A toxicidade

de NO contra protozoários do gênero Leishmania já foi confirmada em diferentes modelos

(BOGDAN, 2001; BRUNET, 2001; GANTT et al., 2001). Camundongos deficientes gerados

por mutação induzida do gene para NOS2 (Nos2−/−) são altamente susceptíveis ao parasito


41

(WEI et al., 1995), mostrando o importante papel dos radicais de nitrogênio em restringir o

crescimento da Leishmania in vivo. Porém, os mecanismos envolvidos na indução desses

mediadores leishmanicidas não estão bem estabelecidos.

Após os primeiros dias de ativação, em função das citocinas predominantes no

microambiente, ocorre a definição da diferenciação em Th1 ou Th2 (NAKAMURA et al.,

1997). Células NK e NK-T participam neste momento inicial secretando IFN-γ, que tem papel

relevante na sensibilização de células Th1 (MARTIN-FONTECHA et al., 2004;

SCHARTON-KERSTEN; SCOTT, 1995). IFN-γ produzido inicialmente por estas células

induz a secreção de IL-12 por APC (células dentríticas, macrófagos, monócitos e linfócitos B)

e por polimorfonucleares (PMN). A produção inicial de IL-12 pode ser desencadeada pela

fagocitose do parasito (SUTTERWALA; MOSSER, 1999a) e amplificada por IFN-γ. A

citocina IL-12, por sua vez, amplifica a produção de IFN-γ, estabelecendo, assim, uma

importante alça de regulação positiva (BELOSEVIC et al., 1989; HEINZEL et al., 1995). A

célula NK é considerada como a principal fonte de IFN-γ (SCHARTON; SCOTT, 1993), mas

existem outras fontes alternativas, como células NK-T (LAUWERYS et al., 2000) e células

TCD8+ (Revisado em SACKS; NOBEN-TRAUTH, 2002). Camundongos geneticamente

deficientes de células NK conseguem desenvolver resposta Th1 eficiente, com a produção de

IL-12 e IFN-γ, capazes de controlar a infecção por L. major, indicando que a IL-12 pode

induzir resposta Th1, independente de células NK, possivelmente pela ativação de células

NK-T (SATOSKAR et al., 1999).

A produção de IFN-γ nos primeiros três dias de infecção é crítica para a diferenciação

de linfócitos Th0 em Th1 e para inibir a diferenciação em Th2, e a APC desempenha papel

crítico neste momento (VON; UDEY, 2004). A infecção de células dendríticas com

amastigotas, na presença de IFN-γ, induz sua ativação, ocorrendo aumento na expressão de

moléculas MHC classe I e II, de moléculas co-estimuladoras (CD40, CD54, CD80 e CD86) e


42

de síntese de IL-12. Por outro lado, tem sido demonstrado que a infecção de macrófagos,

tanto com amastigotas quanto promastigotas, não induz ativação, nem secreção importante de

IL-12 (MAROVICH et al., 2000; REINER et al., 1994; VON et al., 1998). Outras citocinas,

como TNF-α, IL-1β, IL-15 e IL-18, potencializam o efeito da IL-12 na indução da produção

de IFN-γ por células NK (AKIRA, 2000; FEHNIGER et al., 1999; HUNTER;

CHIZZONITE; REMINGTON, 1995; SHER et al., 1993), propiciando as condições

necessárias para a proliferação de células Th1 efetoras.

Embora o fenótipo Th2, associado com a susceptibilidade à infecção, seja

caracterizado pela alta produção de IL-4, IL-10, IL-13 e TGF-β (HEINZEL et al., 1989;

LOCKSLEY; SCOTT, 1991; SCOTT, 1998), ainda não estão bem estabelecidas as condições

que o desencadeiam. As citocinas Th2 levam ao desenvolvimento de lesões graves em

animais infectados com L. major, provavelmente porque desativam macrófagos. IL-4, IL-13 e

TGF-β inibem a produção de intermediários reativos de oxigênio em macrófagos ativados

com IFN-γ (BOGDAN; ROLLINGHOFF; DIEFENBACH, 2000). Diversas células podem

participar na produção de IL-4 nestas primeiras horas de infecção. Neutrófilos, células T

CD4+ e NK1+ (BRANDT et al., 2000; NOBEN-TRAUTH; HU-LI; PAUL, 2000; 1999; VON

DER et al., 1996) são capazes de secretar IL-4 e com isso modular a resposta para

diferenciação de linfócitos T imaturos em linfócitos do tipo Th2. IL-13 é outra citocina que

favorece a progressão da doença. Ela apresenta ação sinérgica com a IL-4 (MATTHEWS et

al., 2000), mas pode também promover a doença, independente da presença de IL-4

(NOBEN-TRAUTH; PAUL; SACKS, 1999). Um microambiente com predomínio de IL-4,

IL-13 e IL-10 induz a diferenciação e proliferação de células Th2, levando à desativação dos

macrófagos, o que propicia a multiplicação do parasito e a progressão da doença. Por outro

lado, em determinadas concentrações, IL-4 presente durante a ativação inicial de células

dendríticas pode induzir um fenótipo de resistência em camundongos susceptíveis por levar à


43

diferenciação dessas células em CDs produtoras de IL-12 (BIEDERMANN et al., 2001). Por

tudo isso, ainda não é suficientemente clara a influência da produção inicial de IL-4 como

determinante para a susceptibilidade (JULIA; GLAICHENHAUS, 1999). A citocina IL-10,

apesar de não ser mediadora dominante na susceptibilidade de BALB/c à infecção por L.

mexicana ou L. amazonensis, tem papel importante na regulação do desenvolvimento de uma

resposta Th1 protetora e, se neutralizada junto com a IL-4, leva à resolução efetiva da doença

(PADIGEL; ALEXANDER; FARRELL, 2003). Sua elevada produção no início da infecção e

a inibição da produção de IFN-γ Leishmania-específica pode contribuir para que a resposta

seja direcionada para o tipo Th2 em camundongos BALB/c infectados com L. major

(CHATELAIN; MAUZE; COFFMAN, 1999).

2.6. Resposta imune inata a Leishmania: receptores do tipo Toll

Células da imunidade inata possuem receptores codificados em linhagens germinativas

responsáveis pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs)

incluindo – vírus, bactérias, fungos e protozoários (JANEWAY, JR.; MEDZHITOV, 2002).

Dentre os PAMPs estão os ácidos nucleicos, componentes de paredes celulares de fungos e

bactérias, proteínas flagelares, dentre outros (KARIN; LAWRENCE; NIZET, 2006). A

primeira família desses receptores estudada em detalhes foi a família dos receptores do tipo

Toll (Revisado em MEDZHITOV, 2001).

A proteína Toll foi inicialmente identificada em insetos frutíferos (Drosophila

melanogaster) estando envolvida na polaridade dorso-ventral durante o desenvolvimento

embrionário (LEMAITRE et al., 1996). Outros estudos demonstraram que a proteína Toll

desempenhava papel essencial na montagem de uma resposta imune eficaz contra o fungo

Aspergillus fumigatus (LEMAITRE et al., 1996). Estes estudos levaram à identificação de

homólogos das proteínas Toll em humanos e camundongos através de pesquisas em bancos de


44

dados, sendo esses denominados receptores Toll-Like (TLRs) (MEDZHITOV; PRESTON-

HURLBURT; JANEWAY, JR., 1997). Foram identificados, 10 e 13 membros TLR em

humanos e camundongos, respectivamente (Revisado em AKIRA; UEMATSU; TAKEUCHI,

2006). Os TLRs sinalizam via proteínas adaptadoras contendo domínio TIR tais como MyD88

(myeloid differentiation primary response gene 88), TIRAP [TIR-containing adaptor protein,

também conhecida como MAL (MyD88-adaptor-like)], TRIF [TIR-containing adaptor-

inducing IFN (interferon)-β] e TRAM (TRIF-related adaptor molecule). De forma geral, a

cascata de sinalização mediada pela ativação dos TLRs leva à ativação de MAPK (mitogen-

activated protein kinases) e fatores de transcrição tais como NF-κB (fator nuclear κB) e IRFs

(fatores reguladores de Interferon) induzindo a produção de citocinas inflamatórias e

interferons (IFNs) do tipo I.

Os membros da família dos TLRs são expressos em diversos tipos celulares, tais como

linfócitos T e B, células NK, células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células epiteliais e

endoteliais. No entanto, os TLRs possuem localizações celulares diferentes. TLR1, TLR2,

TLR4, TLR5 e TLR6 são expressos na superfície da célula, enquanto TLR3, TLR7, TLR8 e

TLR9 são expressos em vesículas endossomais.

Vários estudos têm demonstrado que diferentes receptores participam na fagocitose de

parasitos do gênero Leishmania por macrófagos, embora os eventos iniciais de sinalização

ainda sejam desconhecidos. Uma vez que estudos sugerem o papel dos TLRs no

reconhecimento de Plasmodium, Toxoplasma e Trypanosoma, vários grupos ao redor do

mundo têm trabalhado em pesquisas a respeito do papel desses receptores na leishmaniose

(ADACHI et al., 2001; CAMPOS et al., 2001; KEDZIERSKI et al., 2004; MUN et al.,

2003; SCANGA et al., 2002; YAROVINSKY; SHER, 2006). O primeiro estudo avaliando

TLRs e as vias dependentes de MyD88 na infecção por Leishmania major foi realizado por

Hawn et al. em 2002 (HAWN et al., 2002). Os autores demonstraram que houve menor


45

expressão de mRNA para IL-1α no grupo Myd88−/− e que os níveis de ativação do promotor

de IL-1α no grupo de animais Myd88+/+ foram semelhantes aos níveis obtidos com LPS

(grupo controle).

Um ano depois, Muraille et al. (2003) demonstraram a importância de MyD88 em

camundongos C57BL/6, um modelo de resposta Th1 dominante com tendência para cura

espontânea da lesão cutânea causada pela infecção por Leishmania major. Camundongos

Myd88−/− apresentaram maior número de lesões cutâneas comparados aos camundongos

Myd88+/+. O número de lesões apresentadas pelos animais Myd88−/−foi similar ao observado

em camundongos BALB/c, que possuem resposta Th2 dominante e tendência a ter maior

número e gravidade das lesões (MURAILLE et al., 2003). Além disso, foram observados

altos níveis de IL-4 e baixos níveis de IFN-γ e IL-12p40 no linfonodo drenante da lesão. Um

estudo semelhante foi realizado por Debus et al. (2003), no qual obtiveram os mesmos

resultados. Nesse estudo, foi avaliado um grupo de camundongos Myd88−/−, tratados com um

anticorpo monoclonal contra a IL-4, o que aumentou a resposta Th1 com elevados níveis de

IFN-γ (DEBUS et al., 2003).

Atualmente, diversos trabalhos têm descrito ligantes de TLRs presentes em parasitos

do gênero Leishmania bem como o papel de alguns desses receptores no controle da infecção.

Observou-se que a ativação de NF-κB e o aumento da produção de TNF-α e IL-12p40

mediado por LPG são dependentes de TLR2 e independentes de TLR4 (BECKER et al.,

2003; DE VEER et al., 2003). Além dos estudos envolvendo TLR2, trabalhos sobre TLR4

também têm obtido resultados promissores. Dados demonstraram que TLR4 era necessário

para um eficiente controle do parasito, provavelmente devido à atividade de NOS2 (KROPF

et al., 2004a; KROPF et al., 2004b). Em um estudo avaliando a ativação da inflamação

sistêmica, foi observado que a atividade leishmanicida de neutrófilos mediada pela enzima

elastase pancreática estava reduzida na ausência de TLR4 (RIBEIRO-GOMES et al., 2007).


46

Outros estudos demonstraram que camundongos com uma mutação no gene Tlr4 foram

incapazes de curar lesões cutâneas provocadas por Leishmania major (MULLER et al., 1997;

POLTORAK et al., 2000). Recentemente, trabalhos têm demonstrado a importância de TLR9

no controle da infecção por parasitos do gênero Leishmania. Na leishmaniose visceral,

provocada por L. donovani, foi observado que TLR9 era requerido para a ativação de células

NK e essencial na produção de IL-12 por células dendríticas (SCHLEICHER et al., 2007).

Além disso, foi observado que a sinalização via TLR9 era essencial para a ativação de células

NK em resposta a L. major in vivo (LIESE; SCHLEICHER; BOGDAN, 2007) e que a

ativação de CDs, dependente de TLR9, por DNA de L. major favorece o desenvolvimento de

resposta Th1 e conseqüente resolução da lesão (BOU FAKHER et al., 2009). Recentemente,

foi demonstrado que a sinalização via TLR9 é importante para o controle da infecção por L.

braziliensis de forma independente da produção de IFN-γ (WEINKOPFF et al., 2013). Outro

recente trabalho demonstrou que os receptores TLR3, TLR7 e TLR9 possuem um efeito

aditivo no controle da infecção por L. major, dependente da indução de uma robusta resposta

Th1 (SCHAMBER-REIS et al., 2013b).

Embora a família dos TLRs seja uma importante classe de sensores para a infecção por

parasitos do gênero Leishmania, existem indícios da existência de outros sistemas de

reconhecimento inato que realizam a mesma função. Um papel para o reconhecimento de

moléculas provenientes de Leishmania não baseado em TLR é indicado em estudos nos quais

foram utilizados camundongos deficientes para MyD88. Embora os camundongos Myd88−/−

infectados com Leishmania major apresentem maior susceptibilidade à infecção, o fenótipo

de lesão apresentado por esses animais foi inferior ao dos animais altamente susceptíveis,

como em camundongos BALB/c, e mantiveram a produção de pequenos níveis de citocinas

inflamatórias (IL-12 e IFN-γ) durante toda a infecção (DEBUS et al., 2003; MURAILLE et

al., 2003). Similar aos resultados previamente mencionados, o trabalho de Vargas-


47

Inchaustegui et al. (2009) demonstrou que durante a infecção por L. braziliensis camundongos

Myd88−/− foram capazes de controlar a infecção e produzir altos níveis de IL-12p40 e IFN-γ

em células dendríticas e T CD4+, respectivamente (VARGAS-INC et al., 2009).

2.7. Receptores do tipo NOD/ Inflamassoma

Nos últimos anos, uma nova família de receptores da imunidade inata foi descrita, os

receptores do tipo NOD (NLRs) que, diferentemente dos TLRs, consistem de proteínas

solúveis que se encontram no citoplasma (KUFER; FRITZ; PHILPOTT, 2005; MARTINON;

TSCHOPP, 2005). Esses receptores são capazes de reconhecer peptideoglicanos de paredes

celulares bacterianas (MARTINON et al., 2004), sinais endógenos de perigo como o acúmulo

de cristais de ácido úrico (SHI; EVANS; ROCK, 2003) e baixas concentrações de potássio

intracelular (MARTINON; BURNS; TSCHOPP, 2002), dentre outros.

Em humanos, a família dos NLRs é composta de 23 proteínas, e existem

aproximadamente 34 genes NLR em camundongos (TING et al., 2008). Homólogos dos

NLRs estão presentes em plantas (genes R – R para resistência) e animais, incluindo

organismos filogeneticamente mais primitivos, tais como o Zebrafish e ouriços do mar, apesar

de não serem encontrados em insetos e vermes (HIBINO et al., 2006; INOHARA; NUNEZ,

2003). Embora primariamente expressos em células imunes, incluindo linfócitos e células

apresentadoras de antígenos, tais como macrófagos e células dendríticas, os NLRs podem

também ser expressos em células não imunes, incluindo células epiteliais e mesoteliais

(CHEN et al., 2009). Os NLRs apresentam estrutura característica, composta por três

domínios: um domínio carboxi-terminal LRR que, assim como nos TLRs, são responsáveis

pelo reconhecimento da molécula antigênica; um domínio NOD (“Nucleotide-binding

Oligomerization Domain”), responsável pela oligomerização do receptor após a ligação ao

ATP; e um domínio amino-terminal distinto, o qual desencadeia a função efetora do receptor


48

(ATHMAN; PHILPOTT, 2004a) (Fig. 1). Na ausência de infecção, o NLR encontra-se em

uma forma inativa; as regiões efetoras permanecem protegidas pela região LRR, a qual

bloqueia sua ativação. A ligação de moléculas antigênicas ao LRR promove modificação

estrutural no receptor permitindo a ligação de ATP ao domínio NOD, o qual se oligomeriza

promovendo uma sinalização celular característica de cada NLR (ZINK et al., 2002) (Fig. 2).

NLRs incluem proteínas, tal como NOD1 (domínio 1 de oligomerização nuclear;

também conhecido como domínio 4 de recrutamento de caspase - CARD4), NOD2 (também

conhecido como CARD15) (INOHARA et al., 2005), NALPs (proteínas contendo domínios

NACHT, LRR e pyrin, atualmente nomeado como NLRP), IPAF (fator ativador da protease

ICE/caspase-1 - enzima conversora de IL-1; também conhecido como CARD12, CLAN e

atualmente chamado de NLRC4) e NAIPs (proteínas inibidora de apoptose neuronal) (TING;

KASTNER; HOFFMAN, 2006).

Os primeiros receptores NLRs reportados como receptores intracelulares microbianos

foram Nod1 e Nod2, e seus ligantes têm sido caracterizados como subcomponentes de

peptídeoglicano (PGN), denominados D-γ-glutamil-meso-DAP (mDAP) e muramil-

dipeptídeo (MDP), respectivamente (GIRARDIN et al., 2003a; GIRARDIN et al., 2003b).

Nod1 e Nod2 ativam NF-κB e MAPKs (proteínas kinase ativadoras de mitose), através da

oligomerização e recrutamento da proteína RIP2 - receptor-interacting protein 2, que resulta

na ativação do complexo kinase IκB (BERTIN et al., 1999; OGURA et al., 2001).

Fibroblastos embrionários de camundongos deficientes de RIP2 são incapazes de ativar NF-

κB em resposta a agonistas de Nod1 e Nod2, revelando o papel crucial da proteína adaptadora

RIP2 na sinalização desses receptores (KOBAYASHI et al., 2005b).

Ambos Nod1 e Nod2 têm sido demonstrados participar na detecção de uma variedade

de patógenos microbianos. In vitro, demonstrou-se que o Nod1 estava envolvido no


49

Figura 1: Representação esquemática da estrutura dos receptores do tipo NOD. Os NLRs são caracterizados por três domínios distintos: o domínio C-terminal constituído de regiões ricas em Leucina responsável pelo reconhecimento do ligante (LRRs); o domínio NOD, que medeia a oligomerização do receptor; e um domínio efetor, que pode ser um domínio pyrin (PYD), um CARD (domínio de recrutamento de caspase) ou um domínio BIR (repetições IAP de baculovírus). A maioria dos NLRs também contém um domínio associado ao NOD (NAD). Os NLRs compreendem duas grandes famílias: 14 membros NLRP/NALP contendo o domínio PYD e 5 membros NODs contendo CARD. As duas proteínas contendo o domínio CARD - CIITA e NLRC4/IPAF, e a proteína NAIP contendo BIR, constituem os membros NLRs remanescentes.

reconhecimento de patógenos intracelulares Gram-negativos como Escherichia colli (KIM;

LEE; KAGNOFF, 2004), Chlamydia spp. (OPITZ et al., 2005; WELTER-STAHL et al.,

2006), Campylobacter jejuni (ZILBAUER et al., 2007) e Salmonella spp. (HISAMATSU et

al., 2003). Embora tenha sido identificado inicialmente como um receptor para bactérias

Gram-negativas, Nod1 está implicado na resposta de células endoteliais contra Listeria

monocytogenes que carregam em seu PGN a subunidade meso-DAP (BONECA et al., 2007).

Adicionalmente, apesar de sua localização citosólica, o reconhecimento de microrganismos

extracelulares dependente de Nod1, tais como Pseudomonas aeruginosa e Helicobacter

pylori, também foi reportado (TRAVASSOS et al., 2005; VIALA et al., 2004). Nod2

Modificado de Meylan et al. Nature Reviews, 2006


50

Figura 2: Representação esquemática da cascata de ativação dos NLRs. Na ausência do estímulo, Nod2 ou Nalp3 permanecem em uma conformação de auto-inibição pela ligação dos domínios LRRs aos domínios CARDs. Quando moléculas antigênicas se ligam no domínio LRR (ligand binding) altera a conformação do receptor, permitindo o acesso do ATP ao domínio NBD (NOD). O ATP ligado ao domínio NOD altera a conformação do receptor (nucleotide binding), gerando assim a sua forma “ativa”, e o NLR oligomeriza em um complexo protéico utilizando o NOD como um domínio de oligomerização (oligomerization). A oligomerização do receptor recruta moléculas efetoras downstream da via de sinalização. O receptor Nod2 pode recrutar RIP2 kinase, que se auto-fosforila e ativa a cascata de sinalização subseqüente. Já o Nalp3 recruta a proteína adaptadora ASC e pró-caspase-1, que se auto-ativa e cliva substratos, tais como pró-IL-1β.

também tem sido implicado no reconhecimento citosólico de patógenos bacterianos. Em

estudos recentes, Nod2 foi identificado como mediador chave na resposta imune inata contra

S. pneuomoniae (OPITZ et al., 2005), M. tuberculosis (FERWERDA et al., 2005) e

Modificado de Wilmanski et al. Journal Leukocyte Biology, 2008


51

L. monocytogenes (KOBAYASHI et al., 2005a).

Alguns NLRs, diferentemente de Nod1 e Nod2, estão envolvidos tanto no

reconhecimento de moléculas microbianas, que são introduzidas por patógenos, quanto no

reconhecimento de fatores endógenos liberados de tecidos submetidos à destruição

(MEYLAN; TSCHOPP; KARIN, 2006). Este reconhecimento pode levar à ativação de

caspases inflamatórias como, por exemplo, caspase-1. Essas proteases conservadas

evolutivamente são produzidas como zimogênios com um pró-domínio de comprimento

variável seguido por uma pequena subunidade catalítica (LAMKANFI et al., 2002).

A caspase-1 é recrutada e ativada por complexos multi-protéicos conhecidos como

inflamassomas (MARTINON; BURNS; TSCHOPP, 2002). Os inflamassomas foram

inicialmente descritos como complexos multi-protéicos formados pela proteína adaptadora

intracelular ASC (apoptosis-associated speck-like protein containg a CARD, também

conhecida como TMS1) e um receptor NLR que funciona como um suporte molecular para a

ativação da caspase-1. O termo inflamassoma foi criado para descrever complexos de alto

peso molecular que ativam caspases inflamatórias induzindo a secreção de IL-1β

(MARTINON; BURNS; TSCHOPP, 2002) (Fig. 3). Inflamassoma é originado da palavra

inflamação que reflete a função deste complexo - e o sufixo "soma" proveniente da palavra

grega soma que significa corpo, freqüentemente utilizada em biologia celular e molecular para

definir entidades ou complexos moleculares, tais como proteassoma, lipossomas, ribossomas,

dentre outros (ZOU et al., 1999).

Atualmente, existem seis inflamassomas distintos caracterizados: o inflamassoma de

NLRP1, NLRC4/IPAF, NLRP6, NLRP12, AIM2 (um membro da família das proteínas

HIN200) e o inflamassoma NLRP3/NALP3. Diversos estudos têm auxiliado no entendimento

de como os inflamassomas operam. Após o reconhecimento de seus respectivos ligantes, os

receptores NLRs recrutam a proteína adaptadora ASC através de interações homofílicas PYD-


52

Figura 3: Organização estrutural do inflamassoma dos NLRPs. A estrutura central do inflamassoma é formada pelo receptor NLRP, a proteína adaptadora ASC e caspase-1. As interações homotípicas PYR-PYR são cruciais para o recrutamento do adaptador ASC e ativação das caspases inflamatórias. As regiões ricas em leucina reconhecem os sinais ativadores levando à oligomerização do domínio NOD e iniciando a formação do inflamassoma em forma de “dunet”. A atividade de processamento da IL-1β realizada pela caspase-1 provavelmente ocorre no centro do “dunet”.

PYD. ASC contém uma região N-terminal PYD e uma C-terminal CARD que permite o

recrutamento de caspases inflamatórias, especialmente caspase-1, para a plataforma de

sinalização através de interações CARD-CARD (MARIATHASAN; MONACK, 2007;

OGURA; SUTTERWALA; FLAVELL, 2006). Porém, tem sido descritos inflamassomas que

ativam a caspase-1 de maneira independente de ASC, como o inflamassoma de Nlrc4/Ipaf e

Nlrp1 (FRANCHI et al., 2007b; HSU et al., 2008; MARIATHASAN et al., 2004; SUZUKI,

2007). Além disso, recentemente foi descrito uma forma de ativação não canônica do

inflamassoma envolvendo uma protease relacionada à caspase-1, denominada caspase-11.

Nesse trabalho foi demonstrado que, embora caspase-11 seja dispensável para ativação de

caspase-1 após estimulação com ativadores canônicos de NLRP3 tais como ATP e Nigericina,

a maturação de caspase-1 e secreção de IL-1β em macrófagos infectados com as bactérias

entéricas E. coli, C. rodentium e V. cholerae bem como a susceptibilidade à doses letais de

LPS mostrou-se dependente de caspase-11 (KAYAGAKI et al., 2011). Corroborando com

Modificado de Ting et al. Nature Reviews Immunology, 2008


53

esses achados, foi observado que Lipídeo A derivado do LPS de E. coli ou S. typhimurium é

reconhecido no interior celular (de forma independente de TLR4) culminando com a ativação

de caspase-11 por um inflamassoma não canônico e que o tratamento de camundongos com

altas doses de LPS é capaz de induzir sepse letal de forma independente de TLR4 e

dependente de caspase-11 (KAYAGAKI et al., 2013).

A subfamília NLRP/NALP, a maior dentre os NLRs, contendo 14 NLRPs, possuem

domínios efetores característicos PYD (TSCHOPP; MARTINON; BURNS, 2003). Embora as

funções de muitos NLRPs sejam largamente desconhecidas, sabe-se que esses receptores,

após sua ativação formam inflamassomas, os quais são críticos para a produção de diversas

citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β e IL-18. Diversos tipos de inflamassoma de

NLRP têm sido identificados: o inflamassoma de NLRP1/NALP1 (formado por NLRP1, a

proteína adaptadora ASC, caspase-1 e caspase-5), o inflamassoma de NLRP2/3 (contendo

ASC, Cardinal – proteína similar à extensão C-terminal de NLRP1, Caspase-1 em adição a

NLRP2 e NLRP3) e os inflamassomas de NLRP6 (formado por NLRP6 ou NLRP12, a

proteína adaptadora ASC e caspase-1). Em todos os inflamassomas, a ativação de NLRPs,

através do seu domínio efetor PYD, recruta ASC (contendo domínio PYD e CARD) que, por

sua vez, interage com a caspase-1 através da interação CARD-CARD. NLRP1 também

recruta caspase-5, através seu domínio efetor adicional CARD ligado ao C-terminal, enquanto

que NLRP3 e NLRP6, deficiente de tal domínio CARD, recruta adicionalmente caspase-1

através da interação com uma proteína Cardinal contendo um domínio CARD. A proximidade

das caspases nos inflamassomas parece promover uma ativação cruzada, conduzindo assim à

maturação de citocinas proinflamatórias (MARTINON; TSCHOPP, 2004).

O inflamassoma de NLRP1 humano foi a primeira plataforma de ativação de caspase-

1 identificada (MARTINON; BURNS; TSCHOPP, 2002). Estudos usando NLRP1 purificado,

ASC e caspase-1 demonstraram que NLRP1 formava oligômeros com caspase-1 na presença


54

de MDP. Notavelmente, ASC não era essencial para este processo, embora a adição de ASC

aumentasse a ativação de caspase-1 in vitro mediada por NALRP1 (FAUSTIN et al., 2007).

Consistente com os resultados dos estudos humanos, ASC não é requerido para a ativação de

caspase-1 mediada por Nlrp1b (variante murino de NLRP1) em macrófagos de camundongos

(HSU et al., 2008), sugerindo que ASC atua como uma molécula adaptadora somente para

alguns subtipos de inflamassomas. O estímulo fisiológico necessário para a ativação de

NLRP1 não é conhecido, embora a ruptura celular pareça ser suficiente para induzir a

montagem do inflamassoma (GATTORNO et al., 2007). Nalrp1b foi demonstrado ser ativado

em resposta à toxina letal antraz, o que provoca ativação de caspase-1 e morte celular de

macrófagos (HAWKINS; LACHMANN; MCDERMOTT, 2003). Uma importante função

para o inflamassoma de Nalrp1b na defesa do hospedeiro é indicada pela observação que

camundongos com o alelo de “susceptibilidade” para Nalrp1b são mais susceptíveis à

infecção com B. anthracis (KANG et al., 2008).

No caso de Nlrc4/Ipaf, que contém um domínio N-terminal CARD ao invés de um

domínio N-terminal PYD, a interação com a proteína adaptadora ASC ou diretamente com a

região CARD da pró-caspase-1 através de interações homotípicas leva à formação do

inflamassoma ativando caspase-1 (MARIATHASAN; MONACK, 2007; OGURA;

SUTTERWALA; FLAVELL, 2006). O papel de ASC no inflamassoma de NLRC4 não está

claro, mas acredita-se que ASC possa estabilizar ou facilitar o recrutamento de caspase-1 por

Nlrc4. Alternativamente, NLRC4 pode cooperar com receptores NLRPs, ainda não definidos,

levando à ativação de caspase-1.

Diversos estudos demonstraram a importância do inflamassoma de Nlrc4 no controle

da infecção de camundongos por Salmonella typhimurium ou Legionella pneumophila. A

ativação de caspase-1 encontra-se totalmente abolida em macrófagos deficientes para Nlrc4

quando infectados com esses patógenos intracelulares (FRANCHI et al., 2006;


55

MARIATHASAN et al., 2006; MIAO et al., 2006). Além disso, Nlrc4 participa no controle

da infecção provocada por Shigella flexneri (GIRARDIN et al., 2001). S. flexneri induz

autofagia, que é facilitada em macrófagos deficientes para Nlrc4, mas não para ASC,

sugerindo que Nlrc4 fornece adicional meio de defesa do hospedeiro independente de ASC e

produção de IL-1β por inibir o processo de autofagia. Porém, diferentemente do que acontece

nas infecções por S. typhimurium e S. flexneri, o controle da infecção por L. pneumophila

requer dois NLRs murinos, Naip5 e Nlrc4, para a formação do inflamassoma e não requer

ASC (MOLOFSKY et al., 2006; REN et al., 2006; ZAMBONI et al., 2006). Foi observado

que a sinalização deficiente de Naip5 torna macrófagos permissivos à L. pneumophila apesar

da ativação de caspase-1, sugerindo que Naip5 possui funções adicionais além do seu papel na

ativação de Nlrc4 e caspase-1 (LAMKANFI et al., 2007). Consistente com os dados

observados em camundongos, linhagens de células humanas knockdown para NAIP ou

NLRC4 possuem aumentada susceptibilidade à infecção por L. pneumophila (VINZING et

al., 2008). Adicionalmente, foi demonstrado recentemente que Naip2 e Naip5 se ligam ao

Nlrc4 permitindo o reconhecimento de PrgJ e flagelina, respectivamente (KOFOED;

VANCE, 2011; ZHAO et al., 2011).

Recentemente descritos, o papel dos inflamassomas de NLRP6 e NLRP12 em

processos infecciosos é pouco conhecido. O receptor NLRP6 tem sido associado com a

manutenção da microbiota. NLRP6 é expresso principalmente em células do compartimento

não hematopoiético, onde atua para manter a homeostase intestinal por regular a composição

da microbiota. Camundongos deficientes para Nlrp6 são mais susceptíveis à colite induzida

por DSS (Dextran sulfato de sódio) e inflamação intestinal associada a tumores (CHEN et al.,

2011; ELINAV et al., 2011; NORMAND et al., 2011). Deficiência em Nlrp6 nas células

epiteliais intestinais de camundongos resultou em uma alterada composição da microbiota

intestinal caracterizada por um aumento na presença das espécies patogênicas Prevotellaceae


56

e TM7 (ELINAV et al., 2011). Similares mudanças na composição da microbiota foram

observadas em camundongos Asc−/−, Caspase-1−/− e Il-18−/− sugerindo que a ativação do

inflamassoma de Nlrp6 é importante para a manutenção de uma microbiota intestinal saudável

(ELINAV et al., 2011).

NLRP12 foi o primeiro NLR demonstrado capaz de associar-se com ASC em células

transfectadas, formando um inflamassoma responsável pela ativação da pro-IL-1β. Porém, o

papel desse inflamassoma na imunidade inata permanece incerto. Tanto funções

proinflamatórias quanto anti-inflamatórias têm sido descrita para o inflamassoma de NLRP12.

Estudos tem sugerido que NLRP12 é um antagonista de sinais proinflamatórios induzidos por

receptores TLRs, pela citocina TNF e Mycobaterium tuberculosis (WILLIAMS et al., 2005).

Nlrp12 também está relacionado com o controle da migração de células dentríticas e células

mieloides afetando a hipersensibilidade por contato (ARTHUR et al., 2010; JERU et al.,

2008; LICH et al., 2007; LICH; TING, 2007). Mutações no gene que codifica NLRP12,

assim como para NLRP3, estão ligadas a doenças inflamatórias intestinais. Pacientes com

mutações em NLRP12 estão sendo tratados com sucesso com anticorpo para IL-1

(HAWKINS; LACHMANN; MCDERMOTT, 2003; JERU et al., 2011; LACHMANN et al.,

2009). NLRP12, assim como NLRP6, também está relacionado com a manutenção da

homeostasia intestinal por fornecer proteção contra tumores intestinais (ZAKI et al., 2011).

NLRP12 age negativamente regulando a sinalização de NF-κB e é dispensável para ativar

caspase-1 por diferentes estímulos incluindo ATP, Salmonella typhimurium e espécies de

Listeria (ZAKI et al., 2011).

Recentemente, uma segunda classe de inflamassoma foi descrita. Diferente do

inflamassoma formado pelos NLRs, essa nova classe de inflamassoma é formada a partir da

ativação de proteínas que são codificadas por uma família de quatro genes humanos (IFI16,

AIM2, MNDA e IFIX) e 13 genes de camundongos. Essa família de proteínas é caracterizada


57

pela presença de uma região PYD e um ou dois domínios HIN-200 de ligação ao DNA

(SCHATTGEN; FITZGERALD, 2011). Até agora apenas AIM2 e IFI16 mostrou-se capaz de

formar o inflamassoma e ativar caspase-1. Diferente dos NLRs, AIM2 e IFI16 liga-se

diretamente ao seu ligante, que em ambos os casos é dsDNA. AIM2 e IFI16 não possuem a

região CARD, necessitando assim de ASC para o recrutamento da pro-caspase-1. AIM2 foi o

primeiro membro da família ligado às funções do inflamassoma e está localizado no citosol

onde reconhece dsDNA de vírus e bactérias (BURCKSTUMMER et al., 2009; HORNUNG

et al., 2009; ROBERTS et al., 2009). Outros trabalhos demonstraram que AIM2 é importante

para a ativação de caspase-1 em macrófagos infectados com F. tularensis e em resposta ao

DNA de vírus, tais como cytomegalovirus e vaccínia (FERNANDES-ALNEMRI et al., 2010;

JONES et al., 2010; RATHINAM et al., 2010; SAUER et al., 2010).

O receptor IFI16, similar ao AIM2, também tem sido descrito capaz de ativar o

inflamassoma. Em contraste ao AIM2, IFI16 está localizado principalmente no núcleo das

células, embora IFI16 citosólico também possa ser detectado em pequenas quantidades em

alguns tipos celulares. No citosol, IFI16 reconhece dsDNA, culminando com a produção de

interferons do tipo 1 (UNTERHOLZNER et al., 2010). Além disso, IFI16 é capaz de

reconhecer o genoma do vírus da herpes associado ao sarcoma de Kapsosi (KSHV) no núcleo

de células infectadas (KERUR et al., 2011). Em resposta ao KSHV, IFI16 e ASC translocam-

se do núcleo para a região citoplasmática perinuclear, onde eles formam o inflamassoma

recrutando caspase-1 (KERUR et al., 2011).

NLRP3 é um NLR que também participa na formação do inflamassoma através do

recrutamento de ASC e subseqüente ativação de caspase-1, com secreção de IL-1β e IL-18. O

inflamassoma de NLRP3 é de longe o mais bem estudado de todos os inflamassomas e pode

ser ativado por diversos tipos de estímulos tais como moléculas derivadas de patógenos, sinais

endógenos e de origem ambiental. O inflamassoma de NLRP3 pode ser ativado por diferentes


58

agentes infecciosos incluindo as bactérias patogênicas Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes

Chlamydia pneumoniae, Citrobacter rodentium e Escherichia coli (DUNCAN et al., 2009;

HARDER et al., 2009; HE et al., 2010; KAYAGAKI et al., 2011; KIM et al., 2010;

MEIXENBERGER et al., 2010; MUNOZ-PLANILLO et al., 2009; SHIMADA et al., 2011;

TOMA et al., 2010; WILLINGHAM et al., 2009); fungos patogênicos Candida albicans e

Aspergillus Fumigatus (GROSS et al., 2009; HISE et al., 2009); patógenos virais, tais como

Influenza A, vírus da encefalomiocardite, vírus da estomatite vesicular (ALLEN et al., 2009;

ICHINOHE; PANG; IWASAKI, 2010; RAJAN et al., 2011; THOMAS et al., 2009); e os

parasitos protozoários Schistosoma mansoni e Dermatophagoides pteronyssinus (DAI et al.,

2011; RITTER et al., 2010). Adicionalmente, Nlrp3 é capaz de responder ao MDP

(SUTTERWALA et al., 2006), bem como os compostos antivirais R837 e R848

(KANNEGANTI et al., 2006). Esse grande número de estímulos patogênicos capazes de

ativar NLRP3 sugere que este NLR reconhece micróbios indiretamente por monitorar os

níveis de DAMPs (danos moleculares associados a patógenos) derivados do hospedeiro que

são produzidos ou liberados como consequência de uma injúria tecidual ou celular mediada

por toxinas ou agentes infecciosos (Revisado em LAMKANFI; DIXIT, 2009).

Outra característica peculiar do receptor NLRP3 é a sua capacidade de responder a um

amplo repertório de agonistas que não são necessariamente de origem microbiana, mas são

sinais endógenos. Tem sido demonstrado que NLRP3 responde a mudanças nas concentrações

iônicas celulares, especialmente de potássio, que são produzidas, por exemplo, pela toxina

marinha maitotoxin e pelo ionóforo nigericina (MARIATHASAN, 2006). A ativação de

NLRP3 também é observada por cristais de ácido úrico (MARTINON et al., 2006), ATP

extracelular (MARIATHASAN, 2006) e amilóide-β (HALLE et al., 2008).

Diferente dos outros NLRs ativadores do inflamassoma, NLRP3 é expresso em baixas


59

quantidades em células apresentadoras de antígenos, tais como macrófagos e células

dendríticas. Consequentemente, um aumento na expressão de NLRP3 mediado pela ativação

de NF-κB é crítica para a ativação desse inflamassoma (BAUERNFEIND et al., 2009).

Entretanto, para que ocorra a ativação do inflamassoma de NLRP3, apenas o priming não é

suficiente sendo necessário que células expostas a agonistas de TLRs sejam

subsequentemente expostas a toxinas bacterianas, DAMPs ou substâncias cristalinas

(LAMKANFI; DIXIT, 2009; TSCHOPP; SCHRODER, 2010).

Apesar do número crescente de ativadores de NLRP3 e de evidências genéticas claras

que ligam esta via à atividade imunoestimulatória de diversas moléculas, o exato mecanismo

pelo qual NLRP3 é ativado ainda é desconhecido. Não existem evidências que NLRP3 liga

diretamente em algum desses conhecidos ativadores. A diversidade estrutural desses ligantes

sugere que algum mecanismo compartilhado está envolvido na oligomerização de NLRP3

ativando o inflamassoma. Três distintos mecanismos para a ativação do inflamassoma de

NLRP3 tem sido propostos. O primeiro envolve o efluxo de K+ através do receptor

purinérgico P2X7, outros canais de íons e toxinas formadoras de poros tais como nigericina,

maitotoxinas e hemolisinas (FRANCHI et al., 2007a; PERREGAUX; GABEL, 1994;

PETRILLI, 2007; WALEV et al., 1995). Entretanto, esses canais de íons e citotoxinas

também modulam as concentrações celulares de H+, Na+ e Ca+, sugerindo que o fluxo de íons

em geral pode culminar com a ativação de NLRP3 (LAMKANFI; DIXIT, 2009). Neste

contexto, foi observado que ativação de NLRP3 pela fagocitose de ácido úrico envolvia um

elevado influxo de Na+, seguido pelo influxo de água e queda nas concentrações de K+

compensando o aumento da osmolaridade intracelular (SCHORN et al., 2011).

Adicionalmente, o canal iônico (M2) intracelular expresso pelo influenza vírus contribui para

a ativação de NLRP3. Este canal iônico desacidifica o lúmen do complexo de golgi por

exportar íons H+ para o citosol, ativando assim o inflamassoma de NLRP3 (ICHINOHE;


60

PANG; IWASAKI, 2010). Recentemente, foi visto que o influxo de Na+ e principalmente o

efluxo de K+ estão relacionados com a ativação do inflamassoma de NLRP3 induzido por

diferentes toxinas bacterianas e materiais particulados (MUNOZ-PLANILLO et al., 2013).

Um segundo mecanismo proposto para a ativação do inflamassoma de NLRP3 é a

geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Diversos ativadores de NLRP3, tais como

ATP, nigericina, sílica, alume, ácido úrico induz a produção de ROS em macrófagos e

monócitos (CRUZ et al., 2007; ZHOU et al., 2011). Entretanto, a sinalização de TLRs induz

a produção de ROS, mas ainda assim falha em ativar o inflamassoma de NLRP3 na ausência

de um segundo estímulo. Concomitantemente, estudos demonstram que ROS mitocondrial

participa na up regulation de transcritos de NLPR3 e pro-IL-1β mediado por NF-κB ao invés

de ativar o inflamassoma de NLRP3 (BAUERNFEIND et al., 2011; BULUA et al., 2011).

O terceiro modelo propõe que a desestabilização da membrana fagolisossomal e

liberação citosólica de catepsinas lisossomais ativa NLRP3. A fagocitose de moléculas

particuladas e cristalinas pode causar dano à membrana lisossomal, e consequentemente levar

ao extravazamento de catepsinas lisossomais para o citosol. Produtos gerados a partir da

atividade proteolítica das catpsinas no citosol podem então ativar o inflmassoma de NLRP3. É

proposto que o processamento de componentes citoplasmáticos pela catepsina B age upstream

da ativação de NLRP3 induzida por sílica, alume e amiloide-β (HALLE et al., 2008;

HORNUNG et al., 2008). Além disso, a liberação de catepsina B está diretamente

relacionada à ativação de caspase-1 pelo ionóforo nigericina (HENTZE et al., 2003),

sugerindo um mecanismo único para a ativação de NLRP3 por estímulos particulados e não

particulados. Entretanto, foi demonstrado que a ativação do inflamassoma de NLRP3 não foi

afetada em macrófagos deficientes de catepsina B estimulados com hemozoína, cristais de

ácido úrico, sílica e alume, sugerindo uma redundância com outras catepsinas ou outras vias

que levam à ativação do NLRP3 (DOSTERT et al., 2009; TSCHOPP; SCHRODER, 2010).


61

No entanto, um mecanismo unificador que poderia explicar como o inflamassoma de NLRP3

é ativado permanece desconhecido.

2.8. Sinalização de receptores NLRs sinergiza e complementa a sinalização de receptores

TLRs

Existe grande sobreposição e aparente redundância na natureza no que diz respeito ao

reconhecimento de patógenos pelos diversos NLRs e TLRs e muitos desses receptores

convergem para vias comuns de sinalização (por exemplo, ativação de NF-κB e IL-1β). Uma

razão óbvia para a existência de múltiplos receptores apresentarem vias de sinalização

comuns é a potencialização da resposta inflamatória à infecção. Isto é consistente com o

sinergismo observado entre a sinalização de TLR e NLR em resposta ao PGN (FERWERDA

et al., 2005; NETEA et al., 2005; UEHARA et al., 2005) e entre agonistas de TLR e Nod2

(KOBAYASHI et al., 2005a). As funções entre NLRs e TLRs são naturalmente díspares

quanto à localização celular desses receptores, de tal forma que os NLRs adquiriram maior

importância na detecção de microrganismos intracitoplasmáticos.

Adicional evidência para a complementaridade de papéis entre TLRs e NLRs na resposta

inflamatória é observada durante a secreção de IL-1β. A liberação de IL-1β envolve dois

passos: (a) indução de pró- IL-1β, que é dependente de NF-κB, e (b) clivagem de pró- IL-1β

pela caspase-1 para a forma madura, IL-1β ativa. O primeiro passo requer a ativação de NF-

κB mediada por TLR (KANNEGANTI et al., 2007) entretanto, a ativação da caspase-1

ocorre independentemente de TLRs e exige a formação do inflamassoma (Fig. 4). Estas duas

partes da via, diferentemente regulada por TLRs e NLRs, podem servir como proteção contra

a produção excessiva de IL-1β, que pode causar algumas doenças, tais como vitiligo (JIN et

al., 2007), doença de Crohn (SAITOH et al., 2008) e gota (SOKOLOVSKA; HEM;

HOGENESCH, 2007). Do mesmo modo, múltiplos NLRs ou TLRs podem reconhecer


62

estímulos semelhantes, mas regularem de forma diferente pontos do mesmo processo.

Utilizando o exemplo de regulação da produção de IL-1β, a ativação da caspase-1 pela

estimulação por MDP requer a participação de Nlrp3 e ATP, mas não Nod2; no entanto, a

indução de mRNA para IL-1β, por outro lado, requer Nod2, mas não Nlrp3 (MARINA-

GARCIA et al., 2008). Portanto, semelhante à necessidade da sinalização via TLR para

promover a produção de pró-IL-1β através da ativação de NF-κB, no caso da indução de IL-

1β por MDP, NOD2 induz a transcrição de pró-IL-1β por NF-κB, enquanto que Nlrp3 medeia

o processamento de IL-1β através da ativação de caspase-1. Além disso, como descrito acima,

estudos têm sugerido que o reconhecimento de L. pneumophila por ambos Nlrc4 e Naip5 pode

resultar em atividades alternadas no sentido de restringir a replicação intracelular desse

parasito, e que o reconhecimento da flagelina desta bactéria ou de S. typhimurium por TLR5 e

Nlrc4 pode resultar na ativação de diferentes vias, NF-κB e ativação de caspase-1,

respectivamente (LAMKANFI et al., 2007; MIAO et al., 2007). Assim, a multiplicidade de

receptores envolvidos no reconhecimento do mesmo ligante permite não apenas evitar a

produção excessiva de citocinas inflamatórias (como IL-1β), que podem prejudicar o

hospedeiro, como também promover resposta controlada contra a infecção através da ativação

de vias distintas, mas cooperativas.

Atualmente, não restam dúvidas de que as diversas famílias de receptores da imunidade

inata, agindo isoladas ou em conjunto, estão envolvidas na indução de resistência e

susceptibilidade a infecções, como por exemplo, aquelas provocadas por parasitos do gênero

Leishmania. PAMPs derivados de Leishmania, dentre eles o LPG (FLANDIN; CHANO;

DESCOTEAUX, 2006), desencadeiam resposta imune inata que influencia diretamente na

montagem da resposta imune adaptativa. Diversos trabalhos têm demonstrado que receptores

do tipo NOD, dentre eles o receptor NLRP3, são importantes no reconhecimento citosólico de

diversos patógenos levando à ativação da reposta imune e controle da infecção. Porém, nada


63

Figura 4: TLRs e NLRs cooperam no reconhecimento e resposta a diversos componentes patogênicos ativando mecanismos inflamatórios. O reconhecimento de PAMPs por TLRs induz a síntese do precursor da IL-1β através da ativação de NF-κB. Bactérias e produtos bacterianos entram no citosol via toxinas formadoras de poros, sistema de secreção tipo III ou IV, ou ativação mediada por ATP do “Pannexin-1” poro. A ativação dos NLRs por PAMPs citosólicos resultam na formação dos inflamassomas ativadores de caspase-1 independentemente de TLRs. A caspase-1 ativa processa o precursor da IL-1β na forma madura da citocina, que é então secretada.

se sabe a respeito da interação entre o receptor NLRP3 bem como os componentes

formadores do seu inflamassoma na infecção provocada por parasitos do gênero Leishmania.

Visto que as vias de sinalização mediadas por NLRP3 são críticas na ativação de uma resposta

imune protetora contra patógenos, é de grande importância determinar o papel do

inflamassoma de NLRP3, bem como os mecanismos envolvidos na ativação da imunidade

inata durante a infecção por Leishmania. A determinação da importância desse receptor inato

frente à infecção por Leishmania tem o potencial de abrir novas perspectivas para o

Kanneganti et al. Immuity Review, 2007


64

tratamento e profilaxia desta infecção, que acomete cerca de 12 milhões de pessoas ao redor

do mundo, bem como de outras doenças inflamatórias crônicas.

Objetivos

Lima-Junior, D. S. Objetivos

66

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar o papel do inflamassoma de Nlrp3 no controle da infecção experimental por

parasitos do gênero Leishmania

3.2 Objetivos específicos

3.2.a. Determinar se a infecção por Leishmania é capaz de induzir a ativação de caspase-

1 em macrófagos

3.2.b. Verificar a formação de focos de Asc em macrófagos infectados com L.

amazonensis

3.2.c. Determinar o NLR responsável pela ativação do inflamassoma em resposta à

infecção por Leishmania

3.2.d. Determinar a importância do inflamassoma de Nlrp3 na atividade fagocítica e

leishmanicida de macrófagos

3.2.e. Determinar os mecanismos responsáveis pela ativação do inflmassoma de Nlrp3

durante a infecção por L. amazonensis

3.2.f. Avaliar a importância dos componentes do inflamassoma de Nlrp3 no controle da

infecção in vivo por parasitos do gênero Leishmania

3.2.g. Determinar o papel da IL-1β na resistência do hospedeiro durante a infecção por L.

amazonensis

3.2.h. Avaliar a importância do inflamassoma de Nlrp3 na expressão da enzima NOS2 e

produção de óxido nítrico durante a infecção in vitro e in vivo

Animais, Material e Métodos

Lima-Junior, D. S. Animais, Material e Métodos

68

4. ANIMAIS, MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos selvagens da linhagem C57BL/6, fêmeas, com 6 a 8

semanas de idade. Camundongos geneticamente deficientes para Asc (Asc−/−) e caspase-1

(Casp-1−/−) foram backcrossed com camundongos C57BL/6 por nove ou oito gerações,

respectivamente, para garantir similar background genético (KUIDA et al., 1995; LARA-

TEJERO et al., 2006). Camundongos Nlrp3−/− e Myd88−/− gerados em background C57BL/6

foram gentilmente cedidos pelo Dr. Vishva Dixit (Genentech, USA) (MARIATHASAN et

al., 2006) e Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan), respectivamente. Camundongos Il-

1r−/−, IFN-γ−/− e gp91phox−/− (Nox2−/−) foram obtidos do laboratório Jackson. Os camundongos

foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, ambiente com temperatura

controlada (22 a 25 °C) e receberam água e ração ad libitum. Os experimentos foram

conduzidos de acordo com o Comitê de Ética em pesquisa animal (CETEA) da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, SP (Processo Nº 097/2009).

4.2 Parasitos e infecção experimental

Formas promastigotas de parasitos Leishmania (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8),

Leishmania (L.) amazonensis expressando constitutivamente a proteína GFP (L.a.-GFP;

MHOM/BR/73M2269), Leishmania (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), Leishmania

(L.) major (MRHO/SU/59/P) e Leishmania (L.) infantum chagasi (HU-USF8) foram

cultivadas à 26ºC em meio de cultura Schneider (Sigma-Co, St. Louis, MO, EUA), contendo

20% de soro fetal bovino (SFB) - GIBCO, 100 unidades/mL de penicilina G potássica (USB

Corporation Clevelamd, OH USA) e 2% de urina humana masculina em garrafas de cultura

(Corning Incorporated, Corning NY-USA). Após sete passagens em cultura, os parasitos

foram serialmente passados em camundongos C57BL/6 a fim de manter sua virulência. As


69

formas promastigotas metacíclicas (infectivas) foram isoladas de culturas contendo parasitos

em fase estacionária de crescimento através de centrifugação em gradiente de densidade,

como descrito anteriormente (SPATH; BEVERLEY, 2001). Para infecções in vivo com L.

amazonensis, L. braziliensis e L. major, os camundongos foram inoculados com 10 µL de

salina tamponada com fosfato 0,1 M pH 7,2 (PBS) contendo 1 x 106 promastigotas em fase

estacionária de crescimento ou 1 x 105 promastigotas metacíclicas, por via intradérmica na

orelha esquerda. Para infecção com Leishmania infantum chagasi, os camundongos foram

inoculados com 1 x 107 promastigotas de fase estacionária por via intraperitoneal. O inóculo

foi feito em volume de 0,1 mL.

4.3 Curso de infecção

O curso de infecção foi acompanhado através da mensuração do desenvolvimento da

lesão. As orelhas infectadas e controle foram mensuradas semanalmente durante oito semanas

utilizando um paquímetro. O tamanho da lesão foi obtido pela diferença entre a medida da

orelha infectada e orelha controle.

4.4 Quantificação da carga parasitária

Com o intuito de se determinar o parasitismo durante o curso da infecção, a orelha

infectada, linfonodo drenante e baço foram coletados de forma asséptica em PBS. O número

de parasitos presentes nos órgãos avaliados foi determinado pela técnica de diluição limitante

(AFONSO; SCOTT, 1993) com algumas modificações. Resumidamente, os órgãos foram

triturados por meio de dissociadores de tecido (Medcons, Becton Dickinson, São José, Ca,

EUA) em um volume de 2 mL de meio de cultura Schneider (Sigma, St. Louis, MO, EUA)

suplementado com 20% de SFB (GIBCO), 100 unidades/mL de penicilina G potássica (USB)

e 2% de urina humana masculina. Os medcons foram então lavados com 10 mL de meio de


70

cultura. A suspensão celular foi então centrifugada a 1540 x g por 10 minutos para a

separação das células contendo os parasitos. Em seguida, o sedimento foi suspenso em 1 mL

de meio e distribuído em placas estéreis de 96 poços, sendo dispostos 200 µL da suspensão

por cavidade, em duplicata. Dessa suspensão foi retirada uma alíquota de 20 µL e adicionada

em outro poço contendo 180 µL de meio. Essa diluição de 1:10 foi feita onze vezes, sempre

trocando as ponteiras de um poço para outro. A placa foi então incubada a 25ºC e a

verificação do crescimento de parasitos feita após 10 dias de cultura. O resultado foi expresso

como média do -log10 do título de parasitos + 1.

4.5 Obtenção do antígeno de Leishmania amazonensis

O antígeno particulado foi obtido de culturas de L. amazonensis em fase logarítmica

de crescimento. Após quatro dias de cultura em garrafa de 175cm2 (Corning), foi feita a

contagem do número de parasitos presentes em 90 mL de cultura e posteriormente foram

realizadas duas lavagens com salina tamponada com fosfato (PBS - 0,1 M pH 7,2) seguido

por centrifugação (1540 x g /10 minutos). Após obtenção de 1x1010 parasitos

aproximadamente, armazenados a -20ºC a cada coleta, o antígeno foi preparado por choque

térmico. Os sedimentos foram descongelados a 37ºC e imediatamente recongelados em

nitrogênio líquido por sete vezes. Posteriormente foi feita dosagem de proteína pelo método

de Lowry (LOWRY et al., 1951) e alíquotas do antígeno foram armazenadas a -70ºC com

concentração ajustada para 1 mg/mL.

4.6 Diferenciação de macrófagos a partir de células da medula óssea

Macrófagos diferenciados de células precursoras da medula óssea (BMDMs) foram

utilizados como modelo para experimentos in vitro. As células precursoras de macrófagos

foram obtidas da medula óssea de fêmures e tíbias de camundongos e cultivadas em meio


71

RPMI condicionado, sendo suplementado com 20% de soro fetal bovino (GIBCO), 2 mM de

glutamina, 25 mM de HEPES pH 7,2, 100 unidades/mL de penicilina G potássica (USB) e

com 30% de sobrenadante de cultura de células L929 (meio R20/30) conforme descrito

previamente (WARREN; VOGEL, 1985), com algumas modificações. Resumidamente,

camundongos foram eutanasiados e seus fêmures e tíbias cuidadosamente removidos,

seccionados em ambiente estéril e lavados com PBS utilizando uma seringa com agulha 13 x

4,5 mm. As células recém colhidas foram lavadas e centrifugadas a 300 x g por 10 minutos e,

logo depois incubadas com tampão de lise de hemácias, lavadas e centrifugadas novamente

por mais 10 minutos. Em seguida, as células foram diluídas em meio R20/30 e distribuídas em

placas de cultura em volume de 10 mL por placa utilizada (um fêmur = 4 placas). Um total de

10 mL de meio R20/30 foi adicionado após quatro dias de cultura. Entre o sétimo e o oitavo

dia de cultura as células foram fenotipadas por citometria de fluxo - FACSCantoII (BD). Os

experimentos foram conduzidos com culturas de células possuindo no mínimo 80% de

positividade para CD11b e F4/80.

4.7 Marcação da caspase-1 ativa

Para avaliar a ativação da caspase-1, 1 x 106 macrófagos foram infectados por 6, 12,

24 ou 48 horas com L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major (10 parasitos/ célula ou nas

proporções indicadas). Os macrófagos foram removidos da placa com PBS gelado e

transferidos para um tudo de polipropileno. A marcação da caspase-1 ativa foi feita por uma

hora com o reagente carboxyfluorescein FLICA (FAM–YVAD–FMK, Immunochemistry

Technologies, LLC), como recomendado pelo fabricante. Após esse período, as células foram

lavadas por cinco vezes com PBS/Soro fetal bovino 1% e a aquisição das mesmas realizada

no citômetro de fluxo FACSCantoII (BD) sendo as análises realizadas por meio do software

“FlowJo” (Tree Star, Ashland, OR, EUA).


72

4.8 Detecção da ativação de caspase-1 e IL-1β por Western Blotting

Um total de 5 x 106 BMDMs foram adicionados em placas de 6 poços, ativados com

LPS ultrapuro (500 ng/mL, InvivoGen) por 4 horas e então infectados com L. amazonensis

(10 parasitos/célula) por 48 horas ou estimulados com 20 µM de nigericina por 40 minutos

em meio sem SFB. Os sobrenadantes foram coletados e precipitados com 50% de ácido

tricloroacético e acetona. As células remanescente nos poços foram lisadas com tampão RIPA

(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoxycholate,

and 0.1% SDS) contendo um coquetel de inibidores de protease (Roche). Os lisados e

sobrenadantes foram ressuspendidos em tampão de amostra contendo SDS (50 mM Tris ; pH

6,8), 2% SDS (USB Corporation, USA), 0,1% azul de bromofenol (Synth, USA), 10%

glicerol (USB Corporation, USA), 2,5% β-mercaptoetanol). As proteínas foram, então,

transferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare, USA) utilizando o sistema

de transferência Semidry Transfer Cell (Bio-Rad Laboratories, USA) a 15 volts por 40

minutos. Neste sistema foi utilizado tampão de transferência (50 mM Tris, 40 mM glicina e

10% metanol). As membranas foram bloqueadas por 12 horas a 4º C em tampão Tris (TBS –

Tris buffered saline) (25 mM Tris - Hexis Científica, BR, pH 7.4, 0,3 mM KCl - J.T. Backer e

140 mM NaCl – J.T. Bacher) contendo 0,1% Tween-20 (TBS-T) e 5% de leite em pó

desnatado. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com os anticorpos monoclonais

anti-caspase-1 p20 (clone 4B4 - Genentech) (1:250) e anti-IL-1β p-17 (1:200) (Sigma

Aldrich) por 1 hora à temperatura ambiente. As membranas foram então lavadas em TBS-T e

incubadas por 1 hora a 25º C com anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase

(diluição 1:3000; KPL, USA). Para a detecção das proteínas ligadas aos anticorpos

específicos foi utilizado o reagente ECL luminol (GE Healthcare) e filme Hyperfilm (GE

Healthcare).


73

4.9 Transdução de macrófagos primários com Asc-GFP e quantificação dos focos de Asc

Asc murino foi clonado no vetor pEGFP(N2) pEGFP(N2) utilizando os sítios de

restrição XhoI e BamHI. ASC-GFP e GFP foram clonados em um vetor retroviral específico

de camundongo pMSCV2.2 (Clontech). O sistema de vetor pCL (NAVIAUX et al., 1996) foi

usado para o empacotamento dos retrovírus presentes nas monocamadas de células Peak

transfectadas (ATCC CRL-2828, mantido in RPMI 1640 com 10% SFB). Três dias após a

transfecção, o sobrenadante das culturas contendo as partículas virais foi coletado,

centrifugado a 1000 rpm por 5 min e filtrado em filtros de 45 µm. Células da medula óssea de

camundongos caspase-1−/− foram isoladas e cultivadas (5 x 105/poço) em meio de

diferenciação de macrófagos (R20/30) como mencionado anteriormente (WARREN;

VOGEL, 1985). Após três dias de diferenciação, as células foram coletadas pela lavagem com

monocamadas de PBS gelado, centrifugadas, ressuspendidas em meio R20/30

complementado com o sobrenadante contendo partículas virais e cultivadas por quatro dias

adicionais. Os BMDMs transduzidos foram plaqueados em placas de 24 poços contendo

lamínulas de vidro de 13 mm e infectados com promastigotas de fase estacionária de L.

amazonensis (cinco parasitos/célula) ou promastigotas metacíclicas (três parasitos/célula). As

lamínulas foram fixadas com paraformaldeído a 4% após 2, 6 e 24 horas de infecção.

Posteriormente, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 (USB, Corporation)

0,3% por 10 minutos, lavadas e bloqueadas com PBS contendo albumina de soro bovino BSA

(Sigma) por 1 h, ambos os tratamentos à temperatura ambiente. As lamínulas foram então

incubadas com anticorpo policlonal anti-L. amazonensis (diluição 1:2000) por 1 h e após a

lavagem com PBS as lamínulas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com o

fluoróforo Alexa Fluor 594 (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA) por mais 1 h à

temperatura ambiente. As lamínulas foram invertidas em lâminas contendo o meio de

montagem com DAPI (Prolong Gold antifade reagent - Invitrogen). As células foram


74

analisadas em microscópio de fluorescência invertido (Leica DMI 4000B) utilizando uma

objetiva de 100X. As imagens foram processadas utilizando o software LAS AF (Leica

Microsystems) e o número de focos de Asc nas células infectadas foi quantificado.

4.10 Determinação dos níveis de IL-1β in vitro

Produção de IL-1β in vitro foi analisada em sobrenadantes de culturas de BMDMs pré-

estimulados com 500 ng/mL de LPS ultrapuro (InvivoGen) ou 10 ng/mL de recombinate

murino IFN-γ (Invitrogen) por seis horas e posteriormente infectados com promastigotas de L.

amazonensis, L. major ou L. braziliensis (10 parasitos/ célula) ou promastigotas metacíclicas

de L. amazonensis (um parasito/ célula) por 42 horas. Nigericina foi utilizado como controle

positivo para produção de IL-1β. Para a quantificação de IL-1β frente à inibição das

catepsinas, espécies reativas de oxigênio e efluxo de K+ BMDMs foram pré-ativados com

LPS ultrapuro (500 ng/mL, InvivoGen), tratados com o inibidor da liberação de catepsinas

CA-074-ME, os inibidores de efluxo de K+ glibenclamida e KCl ou os inibidores da produção

de ROS deferoxiamnia, rotenona, apocinina, DPI e DNP nas concentrações indicadas por duas

horas e então estimulados com L. amazonensis (10 parasitos/ célula) por 42 horas. O

tratamento com NaCl foi utilizado como controle negativo do bloqueio das vias mencionadas

acima.

4.11 Avaliação da fagocitose e atividade leishmanicida de macrófagos

Culturas de BMDMs foram ajustadas na concentração de 1 x 106 células/mL em meio

RPMI acrescido de 10% de SFB (GIBCO), 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES pH 7,2, 50

µM de 2-mercaptoetanol, 100 unidades/mL de penicilina G potássica (USB) e 5% de

sobrenadante de cultura de células L929 (meio R10/5). As células foram distribuídas em

placas de cultura de 24 poços (Becton Dickinson Labware, N.J, USA), sendo 0,5 mL por poço


75

e mantidas em repouso durante 90 a 120 minutos para a aderência. Foram realizadas duas

lavagens com PBS estéril a fim de remover as células não aderidas à placa. Para a infecção,

foram utilizados parasitos L. amazonensis expressando ou não a proteína GFP. Para a

avaliação da atividade leishmanicida, as culturas de macrófagos foram infectadas com

promastigotas de fase estacionária (10 parasitos/célula) ou promastigotas metacílicas (um

parasito/célula). Após seis horas de infecção foram realizadas três lavagens com PBS estéril

para a retirada dos parasitos extracelulares e posteriormente adicionado meio fresco. Em

alguns experimentos, a retirada dos parasitos extracelulares e adição de meio fresco foi

realizada após uma ou três horas de infecção. Nos experimentos envolvendo infecção com

L.a.-GFP, alguns poços foram mantidos não infectados como controles negativos de

fluorescência. A cultura foi então mantida a 33oC, em estufa de CO2 (5%). Após 24, 48, 72 e

96 horas de infecção foi determinada a atividade leishmanicida dos BMDMs por citometria de

fluxo (KRAM et al., 2008; MARIM et al., 2010) utilizando o BD FACSCanto II (BD

Biosciences) ou pela contagem de preparações celulares coradas por Giemsa, utilizando um

microscópio de luz com objetiva de 40X. Os dados de citometria de fluxo foram analisados

usando o software FlowJo (Tree Star). Nesta análise, dois parâmetros foram considerados: a

porcentagem de células infectadas e a média de intensidade de fluorescência integrada (iMIF),

que reflete a reposta funcional total frente a infecção e foi calculada pela multiplicação da

porcentagem de células infectadas pela média de intensidade de fluorescência da amostra

(DARRAH et al., 2007). Na análise das células coradas por Giemsa, as taxas de infecção

foram determinadas pela contagem de células infectadas e não infectadas (100-200 BMDMs)

e o número de amastigotas intracelulares presentes em cada célula. Em alguns experimentos, a

análise da fagocitose foi realizada utilizando diferentes concentrações de parasitos (um, 10 e

25 parasitos/células) após três horas de infecção. Quando indicado, BMDMs foram pré-

tratados por seis horas com recombinante murino IL-1β (eBioscience) ou IFN-γ (Invitrogen)


76

em concentrações que variaram de 0,1-1000 ng/mL ou com ambas as citocinas nas

concentrações indicadas. Para a inibição do receptor de IL-1, BMDMs foram previamente

tratados com antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Ra) (FERREIRA et al., 1988) em

diferentes concentrações (variando de 0,1-100 µg/mL) por três horas, antes da infecção por 48

horas. Para inibição de IFN-γ, BMDMs foram pré-tratados com 2 µg/mL de anticorpo anti-

IFN-γ (BioExcel/ West Lebanon, NH) na presença ou ausência de IL-1β (100 ng/mL) por seis

horas e posteriormente infectados com L. amazonensis por 42 horas. Para inibição das

catepsinas, efluxo de K+ e produção de óxido nítrico, BMDMs foram pré-tratados com

glibenclamida, CA-074-ME, KCl, NaCl, aminoguanidina ou L-NMMA nas concentrações

indicadas durante duas horas e então estimulados com L. amazonensis por 42 horas.

4.12 Detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS)

Liberação de espécies reativas de oxigênio extracelular por macrófagos foi mensurada

usando a inibição da redução de citocromo C pela superóxido dismutase (SOD), como

descrito por Johnston e Lehmeyer (JOHNSTON, JR.; LEHMEYER, 1976). Células foram

incubadas em RPMI sem Fenol-RED e estimuladas com L. amazonensis (10 parasitos/célula)

ou IFN-γ por 24 horas. Uma mistura de 800 µM de citocromo C tipo III (Sigma) e meio

RPMI sem Fenol-RED, com ou sem 15 µg/mL de SOD (Sigma), foi adicionada em cada poço

para iniciar a reação. A cultura de células foi mantida à 37ºC por 2 h sem agitação. Por fim, o

sobrenadante da cultura (100 µL) foi coletado e a absorbância (550 nm) foi mensurada em um

espectrofotômetro. Poços contendo macrófagos incubados com citocromo C na presença de

SOD foi usado como branco. Os resultados foram convertidos em nano moles de citocromo C

reduzido usando a fórmula ΔE550 nm= 2,1 x 104 M-1 cm-1 (MASSEY, 1959).

Para a detecção de ROS intracelular, BMDMs foram infectados ou não com

promastigotas de L. amazonensis ou tratados com PMA (100 ng/mL) por 24 horas. No fim da


77

incubação, uma concentração de 10 µM de dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)

foi adicionada à cultura celular e incubada por 30 minutos para permitir a ligação da sonda.

Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com PBS e a conversão da não

fluorescente H2DCFDA na espécie altamente fluorescente dichlorofluorescein (DCF) foi

mensurada por citometria de fluxo (BD FACSCanto II).

4.13 Cultivo de células ex vivo

Para a quantificação da produção de citocinas e óxido nítrico ex vivo, baços e

linfonodos retromaxilares drenantes, de camundongos infectados com 1 x 106 promastigotas

de L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) por duas e cinco semanas, foram dissociados

utilizando cell strainer (BD Biosciences). O “pellet” celular foi ressuspenso em 1 mL de meio

RPMI acrescido de 10% de SFB (para as células derivadas do linfonodo) ou 4 mL de tampão

de lise de hemácias (para as células derivadas do baço). Após incubação de quatro minutos a

37oC, as células do baço foram novamente centrifugadas a 300 x g por 10 minutos a 4°C e re-

suspensas em 1 mL de meio RPMI acrescido de 10% de SFB. Em seguida, foi realizada a

contagem das células em câmara de Neubauer, acertando-se a concentração celular para 5 x

106 células/mL, sendo 500 µL distribuídos por poço, em placas de 48 poços. Para a dosagem

de citocinas, as células foram estimuladas ou não com 50 µg/mL de antígeno particulado de L.

amazonensis. As culturas foram então incubadas a 37°C, com atmosfera de 5% de CO2 por 48

horas. As amostras foram armazenadas em tubos/placas a -70ºC.

4.14 Dosagem de citocinas

As citocinas IL-1β, e IFN-γ foram dosadas de acordo com protocolo sugerido pelos

fabricantes dos kits de ELISA, BD Bioscience. Brevemente, as placas foram sensibilizadas

overnight, com 100 µL por poço das soluções com anticorpo de captura diluídos nas


78

concentrações sugeridas pelos fabricantes. Após cinco lavagens com solução de lavagem

(PBS - Tween 20 a 0,05% - v/v), as placas foram incubadas com 200 µL de tampão de

bloqueio (PBS – 10% Soro Fetal Bovino) por poço, por uma hora, à temperatura ambiente.

Após cinco novas lavagens com PBS (Tween, 100 µL) das amostras e dos padrões com

concentrações conhecidas, foram incubados por duas horas em temperatura ambiente.

Novamente foram lavadas com PBS – Tween, e as placas, incubadas com 100 µL por poço

dos anticorpos de detecção biotinilados por mais uma hora à temperatura ambiente. Após

novas lavagens com PBS – Tween, as placas foram incubadas com avidina – peroxidase, por

30 minutos, à temperatura ambiente, em local protegido da luz. Após novas lavagens com

PBS - Tween, as placas foram incubadas com 100 µL de TMB (KPL, Inc. Gaithersburg, MD,

EUA), por 30 minutos em temperatura ambiente, em local protegido da luz, com posterior

bloqueio da reação, com de 50 µL de H2SO4 2M por poço. As placas foram lidas a 450 nM

em espectrofotômetro. As concentrações das citocinas específicas nos sobrenadantes foram

determinadas comparando-se a densidade óptica dos poços contendo as amostras a uma curva

padrão, obtida pelas densidades nos poços contendo as citocinas recombinantes de

concentração conhecida. O limite de detecção para as diferentes citocinas foi de 7,8 pg/mL.

4.15 Produção de óxido nítrico

A produção de NO por macrófagos foi mensurada pelo acúmulo de nitrito (NO2-) e

nitrato (NO3-) em sobrenadantes coletados após 24 e 48h de cultura, como previamente

descrito (GREEN; TANNENBAUM; GOLDMAN, 1981). Resumidamente, 50 µL de

reagente de Griess (diamina di-hidroclorido naftaleno - NEED) a 0.1% (Sigma) diluído em

água destilada e sulfanilamida a 1% (Sigma) diluída em ácido fosfórico a 5% (Merck S.A.,

Rio de Janeiro, RJ) foi adicionado em 50 µL de sobrenadante. Em seguida foi determinada a

absorbância (DO 540nm) em leitor de miniplacas. Os resultados expressos em µM foram


79

determinados pela comparação com a curva-padrão, obtida pelo uso de nitrito de sódio

(Vetec) em concentrações de 200 a 0.9 uM.

4.16 Extração de RNA e síntese de cDNA

A extração de RNA total foi realizada a partir de amostras obtidas de experimentos in

vitro, nos quais BMDMs foram infectados por L. amazonensis por 12 horas, e experimentos

in vivo, nos quais foram utilizadas a lesão e o linfonodo drenante de camundongos infectados

durante sete e 15 dias. As amostras foram coletadas utilizando-se o reagente Trizol

(Invitrogen ™, Carlsbad, CA, EUA) para posterior extração de RNA utilizando um kit

específico para tal (Promega, Madison, WI, EUA). Brevemente, para cada amostra, em um

tubo de fundo cônico de 1,8 mL, foi adicionado o reagente Trizol (1 mL/mg de tecido ou 1

mL para cada 2 x 106 células), sendo agitado por 30 segundos e deixado a temperatura

ambiente por 15 minutos. Para cada um mL da suspensão foram adicionados 200 µL de

clorofórmio (Sigma) e os tubos centrifugados a 12000 x g por 15 minutos a 4°C. A fase

aquosa foi transferida para um tubo novo, onde foi acrescentado etanol 70% em proporções

iguais à amostra (v/v). A solução amostra/etanol foi agitada delicadamente e transferida para

uma coluna de afinidade para RNA (Illustra RNAspin Mini – GE Healthcare, USA). Foram

adicionados tampões específicos, intercalados por rápidas centrifugações por 15 segundos a

8000 x g cada. Finalmente, após várias lavagens com estes diferentes tampões, as amostras de

RNA foram eluídas da coluna com 50 µL de água deionizada e livre de RNAse, sendo

armazenadas a –70º C, até a confecção do DNA complementar (cDNA). O DNA genômico

contido nas amostras foi digerido através do tratamento das mesmas com RQ1 RNAse-Free

Dnase (Promega), de acordo com as especificações do fabricante. Uma alíquota de 5 µL foi

utilizada para a obtenção da concentração de RNA/µL nas amostras, determinada por

espectometria a 260 nm utilizando-se o aparelho Biomate 3 Spectrophotometer


80

Thermospectronic (Rochester, NY, EUA).

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado através de uma reação de transcrição

reversa. Primeiramente, foi adicionado oligo-dT (500 mg/mL) (Invitrogen), dNTPs (10 mM)

(Invitrogen) e a enzima ImPromII Reverse Transcriptase (1 µL/reação) (Promega, USA) em

10 µL de solução contendo 1 µg de RNA e a reação mantida a 42º C durante 60 minutos.

Posteriormente, a reação foi inativada por 15 minutos a 70º C.

4.17 Análise da expressão gênica por meio de reações de PCR em tempo real

A expressão quantitativa de genes de citocinas e das enzimas NOS2, arginase I e

arginase II foi analisada através de reações de PCR em tempo real, utilizando-se o sistema

SYBR Green e o aparelho ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems,

Warrington, Reino Unido). Esse sistema (ABI Prism Software) realiza as reações de

amplificação, detecção e quantificação das amostras através de nucleases fluorogênicas

utilizadas na reação, sendo a expressão normalizada com base em controles endógenos.

Oligonucleotídeos foram sintetizados para tais reações com auxílio de software apropriado

(“Primer Express”, Applied Biosystems). O cDNA (2,5 ng/reação) sintetizado a partir do

RNA mensageiro, e oligonucleotídeos específicos (1-2 µg/reação), foram utilizados

juntamente com os tampões de reação contendo “SYBR Green” (Applied Biosystems), como

determinado pelo fabricante. As reações compreenderam 2 minutos a 50 ºC, 10 minutos a 95

ºC, e quarenta ciclos de 15 segundos a 95 ºC e 1 minuto a 58 ºC. Um ciclo final de 20 minutos

com temperatura crescente de 60 a 95 ºC foi empregado para a obtenção de uma curva de

dissociação dos produtos da reação, utilizada para a análise da especificidade de amplificação.

As condições de PCR para cada oligonucleotídeo utilizado foram padronizadas de acordo com

a concentração, temperatura de anelamento, ausência de formação de dímeros e eficiência de

amplificação dos genes alvos e controle interno (gene constitutivo). A positividade das


81

reações foi determinada baseada em controles negativos, não infectados. Os resultados foram

analisados com base no valor de TC (ciclo limiar) ou linha de corte, definido após a reação,

sendo este o ponto correspondente ao número de ciclos onde a amplificação atingiu um dado

limiar, que permitiu a análise quantitativa da expressão do fator avaliado. A determinação dos

níveis de expressão dos genes alvo foi realizada por meio da normalização das amostras

quanto à expressão constitutiva de β-actina. As amostras foram primeiramente expressas em

unidades arbitrárias e posteriormente calculado como aumento relativo da expressão em

células infectadas comparado com controles similares (camundongos ou cultura de

macrófagos de mesmo grupo) não infectados de acordo com a fórmula: mRNA = 2-(ΔΔ

Ct). As

sequências dos primers utilizados foram: β-actin-fwd, AGCTGCGTTTTACACCCTTT; β-

actin-rev, AAGCCATGCCAATGTTGTCT; NOS2-fwd, CGAAACGCTYCACTTCCAA;

NOS2-rev,TGAGCCTATATTGCTGTGGCT; IFN-γ-fwd, GCATCTTGGCTTTGCAGCT;

IFN-γ-rev, CCTTTTTCGCCTTGCTGTTG; TNF-α-fwd, TGTGCTCAGAGCTTTCAACAA;

TNF-α-rev, CTTGATGGTGGTGCATGAGA.

4.18 Análise Estatística

Os resultados estão representados como média mais desvio padrão (SD). Para

comparação entre múltiplos grupos, foi utilizada a análise de variância (two-way ANOVA ou

one-way ANOVA), seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Diferenças nos valores entre dois

grupos foram determinadas utilizando o teste t de Student. Todas as análises foram feitas com

o auxílio do software GraphPad-Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA, EUA).

Foram consideradas estatisticamente significativas as diferenças que apresentaram valores de

P igual ou menor a 0,05.

82

Resultados

Lima-Júnior, D. S. Resultados

83

4. RESULTADOS

4.1 O inflamassoma é ativado em resposta à infecção por Leishmania

A ativação de caspase-1 tem sido associada com a resposta de células do sistema

fagocítico (monócitos, células dendríticas e macrófagos) contra diferentes patógenos

bacterianos tais como Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Listeria

Monocytogenesis, S. typhimurium, S. flexneri e Legionella pneumophila. Esse processo ocorre

através da liberação de diversos antígenos (PAMPs) para o meio intracelular que se ligam em

receptores de reconhecimento padrão citosólicos culminando com a ativação de caspase-1

(MOLOFSKY et al., 2006; OZOREN et al., 2006; REN et al., 2006; SUTTERWALA et al.,

2006; ZAMBONI et al., 2006). No entanto, a habilidade de parasitos do gênero Leishmania

em ativar caspase-1 é desconhecida. Nesse contexto, nós avaliamos se o parasito L.

amazonensis era capaz de ativar vias de sinalização que culminavam na ativação endógena da

caspase-1 em macrófagos. Para isso, nós infectamos BMDMs de camundongos C57BL/6 e

Casp-1−/− com L. amazonensis e mensuramos a ativação de caspase-1 com uma sonda

fluorescente (5-carboxifluorescein-YVAD – FAM-YVAD) que se liga com alta afinidade à

forma ativa da caspase-1 (SMOLEWSKI et al., 2001; ZAMBONI et al., 2006). Foi

observado que L. amazonensis, induz a ativação de caspase-1 em macrófagos de

camundongos C57BL6, mas não em macrófagos Casp-1−/− (Fig. 5a-c). Nós então avaliamos a

secreção da forma ativa da citocina IL-1β uma vez que esse processo é dependente da

ativação de caspase-1. Foi visto que BMDMs de camundongos C57BL/6, mas não de

camundongos Casp-1−/−, pré-tratados com lipopolissacarídeo (LPS) ou interferon-γ IFN-γ

produziram quantidades significantes de IL-1β em reposta à infecção com L. amazonensis

(Fig. 6a,b). Nós ainda verificamos se a ativação de caspase-1 era induzida somente em

reposta ao parasito vivo. Para isso, BMDMs de camundongos C57BL/6 foram estimulados

com parasitos vivos ou mortos por calor, irradiação UV ou fixação com formaldeído e então


84

Figura 5: Caspase-1 é ativada em reposta à infecção por L. amazonensis. (a,b) Macrófagos derivados de células da medula óssea (BMDMs) de camundongos C57BL/6 e Caspase-1−/− (Casp-1−/−) foram infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula) durante 6, 12, 24 e 48 h e marcados com a sonda fluorescente FAM-YVAD. (a) Os histogramas verde, rosa, ciano e azul representam a marcação de macrófagos infectados após 6, 12, 24 e 48 h de infecção, respectivamente. O histograma vermelho indica BMDMs não infectados (NI). (b) Quantificação do experimento demonstrado em “a”, indicando a média da porcentagem de células FAM-YVAD+ + desvio padrão (SD) de um experimento feito em triplicata. “L.a” indica L. amazonensis. (c) Porcentagem de células FAM-YVAD+ de BMDMs de camundongos C57BL/6 e Casp-1−/− infectados com L. amazonensis a um MOI de 1, 5, 10 e 20 por 24 h. Os dados representam a média ± SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni) comparado com Casp-1−/−.


85

mensurado os níveis de IL-1β como medida indireta da ativação de caspase-1. Parasitos vivos

induziram efetivamente a secreção de IL-1β, enquanto que parasitos inviáveis (fervidos,

irradiados ou fixados) falharam em induzir IL-1β (Fig. 6c). Adicionalmente, observamos que

efeitos similares na indução de IL-1β ocorriam em reposta à infecção com formas

promastigotas metacíclicas de L. amazonensis (Fig. 6d).

4.2 A ativação de caspase-1 mediada por L. amazonensis depende de Nlrp3

A ativação de caspase-1 pode decorrer do reconhecimento de PAMPs por diversos

NLRs tais como Naip5, Nrc4, Nlrp1, Nlrp3 dentre outros. Assim, para determinar qual NLR é

responsável pela ativação de caspase-1 em reposta à L. amazonensis, nós realizamos

experimentos com BMDMs deficientes em importantes componentes do inflamassoma.

Através do ensaio de FAM-YVAD, nos demonstramos que BMDMs deficiente para Nlrp3 ou

para a proteína adaptadora Asc falharam em induzir a ativação de caspase-1 (Fig. 7a,b) e

secretar IL-1β após infecção com L. amazonensis (Fig. 7c). Neste experimento, nós também

usamos uma combinação de LPS e Nigericina, que é um conhecido ativador do inflamassoma

de Nlrp3 (MARIATHASAN et al., 2004; MARIATHASAN et al., 2006). Em adição, nós

realizamos análise de western blotting com BMDMs estimulados com Nigericina ou L.

amazonensis para confirmar a ativação do inflamassoma de Nlrp3 em reposta à infecção com

L. amazonensis. Foi observado que a infecção por L. amazonensis induziu o processamento e

secreção de caspase-1 p20 e IL-1β p19 em um processo dependente de Nlrp3, Asc e caspase-1

(Fig. 7d). Os reduzidos níveis de produção de IL-1β e clivagem de caspase-1 em macrófagos

infectados com L. amazonensis comparados com células tratadas com LPS e nigericina

suportam a hipótese de L. amazonensis pode modular ou inibir a ativação do inflamassoma

em alguns casos, uma característica que requer uma análise mais aprofundada. No entanto, o

inflamassoma é ativado em resposta à infecção por Leishmania, e para avaliar a formação do


86

Figura 6: L. amazonensis induz aumento na produção de IL-1β em macrófagos de forma dependente de caspase-1. (a,b) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 e Casp-1−/− foram estimulados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS (a) ou 10 ng mL−1 de IFN-γ (b) e posteriormente infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula) por 42 h. (c) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 foram pré-tratados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS e então estimulados com L. amazonensis viva (L.a), irradiada, fixada com formaldeído (L.a formald.) ou fervida na proporção de 10 parasitos/célula por 42 h. (d) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 e Casp-1−/− foram estimulados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS e posteriormente infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis (1 parasito/célula) por 42 h. NI, não infectado. A produção de IL-1β foi avaliada no sobrenadante livre de células por ELISA. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com Casp-1−/− (a,b,d) ou NI (c).


87

Figura 7: O inflamassoma de Nlrp3 é requerido para a ativação de caspase-1 em macrófagos infectados por L. amazonensis. (a,b) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Nlrp3−/− e Casp-1−/− foram infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula). Após 48 h de infecção, as células foram marcadas com FAM-YVAD e analisadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células positivas para FAM-YVAD (a) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (b). (c) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Nlrp3−/−e Casp-1−/− foram estimulados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS e então infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula) por 42 h ou tratados com 20 µM de Nigericina (Nig) por 1 h. A produção de IL-1β foi analisada no sobrenadante livre de células por ELISA. (d) BMDMs pré-tratados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS foram infectados (L.a) ou não (NI) com L. amazonensis a um MOI de 10 por 48 h. O immunoblotting indica a presença de casp-1 p45, casp-1 p20 e IL-1β p19 no sobrenadante da cultura de células (SN) e casp-1 p45 no lisado celular (Lis). Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com NI (a,b) ou BMDMs Asc−/−, Nlrp3−/− e Casp-1−/− similarmente tratados (c).


88

inflamassoma in situ, nós transduzimos BMDMs com um vetor retroviral codificando Asc

conjugado a GFP (Asc-GFP). Nós infectamos os BMDMs com L. amazonensis e observamos

a formação de focos de Asc em células infectadas após 2 e 6 h de infecção com promastigotas

em fase estacionária de crescimento ou promastigotas metacíclicas de L. amazonensis (Fig.

8a-d), indicando assim a formação do inflamassoma em resposta à infecção por L.

amazonensis.

4.3 A ativação do inflamassoma de Nlrp3 induzido por L. amazonensis é dependente de

produção de ROS, efluxo de potássio e liberação de catepsinas

Efluxo de potássio (HAMON; COSSART, 2011; MARIATHASAN et al., 2006) é

crítico para a ativação do inflamassoma de Nlrp3. Além disso, CA-074-ME (um composto

que inibe catepsina B e L) e glibenclamida (uma droga que inibe canais de potássio sensíveis

ao ATP) inibem a ativação de inflamassoma de Nlrp3 (HORNUNG et al., 2008;

LAMKANFI et al., 2009; MONTASER; LALMANACH; MACH, 2002). Para determinar os

mecanismos responsáveis pela ativação do inflamassoma de Nlrp3 em reposta à infecção por

L. amazonensis, nós inicialmente investigamos se glibenclamida, CA-074-ME e a adição de

potássio extracelular interferem com a ativação de caspase-1 durante a infecção de

macrófagos com L. amazonensis. Através de uma avaliação por citometria de fluxo de células

FAM-YVAD+ e secreção de IL-1β, observamos que ativação de caspase-1 induzida por L.

amazonensis foi inibida pela adição de glibenclamida, CA-074-ME, KCl, mas não NaCl, de

forma dose dependente (Fig. 9a-g).

Além dos mecanismos citados acima, diversos trabalhos têm demonstrado que a

ativação do inflamassoma de Nlrp3 é dependente da geração de espécies reativas de oxigênio

(DOSTERT et al., 2008; ZHOU et al., 2010; ZHOU et al., 2011). De fato, diversos

ativadores de Nlrp3 induzem a geração de ROS e em contrapartida, inibidores de ROS


89

Figura 8: A infecção por L. amazonensis induz a formação de focos de Asc. BMDMs obridos de camundongos Casp-1−/− foram transduzidos com um vetor retroviral codificando Asc-GFP e infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (5 parasitos/célula) (b,c) ou promastigotas metacíclicas (3 parasitos/célula) (d). (a) BMDMs Casp-1−/− não infectados expressando Asc-GFP disperso no citoplasma (verde). (b) BMDMs infectados com L. amazonensis (vermelho) por 2 h demonstrando formação de focos de Asc (verde). (c, d) Quantificação da porcentagem de BMDMs apresentando focos de Asc após 2, 6 e 24 h de infecção. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (one-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni) comparado com NI.


90

Figura 9: Catepsinas e efluxo de potássio são requeridos para a ativação do inflamassoma induzido por L. amazonensis. (a-c) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 foram pré-tratados por 2 horas com 100 µM de glibenclamida, incubados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula) e então avaliada a ativação de caspase-1 pela marcação com FAM-YVAD. (a) Os histogramas azul e verde representam a marcação de macrófagos infectados que foram tratados (Gliben+L.a) ou não tratados (L.a) com glibenclamida, respectivamente. O histograma vermelho representa BMDMs não tratados e não infectados (NI). A porcentagem de células positivas para FAM-YVAD (b) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (c) são demonstradas. (d-g) BMDMs foram primados com 500 ng mL−1 de LPS por 6 h, tratados por 2 h com diferentes concentrações de glibenclamida (d), CA-074-ME (e), KCl (f) ou NaCl (g) e posteriormente incubados com promastigotas de L. amazonensis a um MOI de 10. Após 40 h de infecção, a liberação de IL-1β foi analisada no sobrenadante por ELISA. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com NI.


91

bloqueiam a ativação doinflamassoma (DOSTERT et al., 2008). Nesse contexto, nós

investigamos se a produção de espécies reativas de oxigênio está envolvida na ativação do

inflamassoma de Nlrp3 induzida durante a infecção por L. amazonensis. Primeiramente, nós

investigamos se ativação do inflamassoma de Nlrp3 interferia na produção de espécies

reativas de oxigênio. Para isso, BMDMs de camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/−

foram infectados com L. amazonensis e avaliada a liberação de espécies reativas de oxigênio

para meio extracelular, pelo ensaio de redução do citocromo c, e a produção de ROS

intracelular pela marcação com a sonda H2DCFDA (carboxy derivative of fluorescein). Foram

observados níveis similares de ROS extracelular (Fig. 10a) e intracelular (Fig. 10b,c) em

macrófagos C57BL/6 comparados com macrófagos Asc−/− e Casp-1−/− após a infecção com L.

amazonensis. Estímulo com IFN-γ ou PMA foi utilizado como controle positivo para a

produção de superóxidos. Esses dados indicam que a que a infecção por L. amazonensis induz

a liberação de espécies reativas de oxigênio e produção de ROS intracelular de forma

independente da ativação do inflamassoma. Nosso próximo passo foi investigar se o

tratamento com drogas inibidoras de ROS interferia na ativação do inflamassoma induzida

pela infecção com L. amazonensis. A partir da análise por citometria de fluxo de células

FAM-YVAD+ e secreção de IL-1β, observamos que ativação de caspase-1 induzida por L.

amazonensis foi inibida pela adição dos inibidores de ROS rotenona, apocinina,

deferoxiamina, DPI e DNP (Fig. 11). Adicionalmente, verificamos se os efeitos de ROS na

ativação do inflamassoma induzido pela infecção por L. amazonensis ocorria nas fases iniciais

da infecção (durante a fagocitose) ou nas fases tardias (durante a replicação do parasito).

BMDMs de camundongos C57BL/6 foram tratados em diferentes condições com apocinina,

um inibidor reversível da produção de espécies reativas de oxigênio (AHMAD et al., 2012;

HEUMULLER et al., 2008; MATHENY; DEEM; COOK-MILLS, 2000; PHILLIPS et al.,

2010), infectados com L. amazonensis e analisada a ativação de caspase-1 pelo ensaio


92

Figura 10: A produção de espécies reativas de oxigênio induzida pela infecção com L. amazonensis é independente da ativação do Inflamassoma. (a) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram pré-tratados ou não com IFN-γ (10 ng mL−1) por 6 h e então infectados com promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento a um MOI de 10 por 18 h. A liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi quantificada pela redução de citocromo C como descrito em Animais, Material e Métodos. (b,c) BMDMs de camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram infectados com promastigotas de L. amazonensis a um MOI de 10 por 24 h e então analisada a produção de ROS por citometria de fluxo. PMA foi usado como controle positivo. A porcentagem de células positivas para FAM-YVAD (b) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (c) são demonstradas. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes.


93

Figura 11: Espécies reativas de oxigênio são requeridas para a ativação do inflamassoma induzido por L. amazonensis. (a,b) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 foram pré-tratados por 2 horas com 10 µM de rotenona (Roten), 100 µM de apocinina (Apoc), 10 µM de DPI ou 100 µM de DNP, incubados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula) e avaliada a ativação de caspase-1 pela marcação com FAM-YVAD. Após 24 h de infecção, a porcentagem de células positivas para FAM-YVAD (a) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (b) foram calculadas por citometria de fluxo. (c) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 foram primados com 500 ng mL−1 de LPS por 6 h, tratados por 2 h com 2 mM de deferoxiamina (Deferox), 10 µM de rotenona (Roten), 10 µM de DPI, 100 µM de apocinina (Apoc) ou 100 µM de DNP e posteriormente incubados com promastigotas de L. amazonensis a um MOI de 10. Após 40 h de infecção, a liberação de IL-1β foi analisada no sobrenadante por ELISA. (d,e) BMDMs foram primados com 500 ng mL−1 de LPS por 6 h, tratados por 2 h com diferentes concentrações de apocinina (d) ou NaCl (e) e posteriormente incubados com promastigotas de L. amazonensis a um MOI de 10. Após 40 h de infecção, a liberação de IL-1β foi analisada no sobrenadante por ELISA. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com NI.


94

de FAM-YVAD. Observamos que, similar ao tratamento contínuo com apocinina (-2 a 6), o

tratamento com apocinina durante as duas primeiras horas de infecção (durante a fagocitose

do parasito) inibiu a ativação de caspase-1 (Fig. 12). Por outro lado, a retirada da droga no

início da infecção (-2 a 0) ou o tratamento com apocinina após 4 h de infecção não foi capaz

de inibir a ativação da caspase-1 (Fig. 12). Esses resultados indicam que a produção de ROS

durante a fagocitose de L. amazonensis é crucial para a ativação do inflamassoma de Nlrp3.

De forma conjunta, os dados obtidos indicam que potássio, catepsinas, canais de potássio e

espécies reativas de oxigênio são requeridos para a ativação do inflamassoma de Nlrp3,

suportando assim o papel chave desse inflamassoma na ativação de caspase-1 durante a

reposta de macrófagos à infecção com L. amazonensis.

O tratamento com determinadas drogas ou altas concentrações das mesmas podem ser

citotóxicos. Dessa forma, verificamos a citotoxicidade dos inibidores de ROS utilizados nos

experimentos anteriores. Para isso, nós avaliamos os níveis de morte celular pela liberação de

lactato desidrogenase, incorporação de iodeto de propídeo (PI) e pela expressão de

fosfatidilserina na superfície celular de macrófagos pré-tratados com inibidores de ROS e

infectados com L. amazonensis. De forma geral, não observamos efeitos citotóxicos das

drogas inibidoras de ROS utilizadas para o tratamento dos BMDMs (Fig. 13). Uma única

exceção foi a alta liberação de LDH nas culturas de macrófagos tratados com DPI (Fig. 13a).

Por outro lado, quando analisamos a expressão de fosfatidilserina e incorporação de PI nas

culturas tratadas com DPI, nenhuma diferença em relação às culturas não tratadas (NT) foi

observada (Fig. 13b,c). Dessa forma, esses dados sugerem que o tratamento de macrófagos

com os inibidores de ROS nas condições e concentrações utilizadas nos experimentos

anteriores não induziram nenhum efeito citototóxico.

A produção fisiológica de espécies reativas de oxigênio pode ocorrer decorrente da

atividade mitocondrial, peroxissomas, citocromo P-450 e através da enzima NADPH oxidase


95

Figura 12: Bloqueio de ROS durante a fagocitose de L. amazonensis inibe a ativação do inflamassoma. BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 foram tratados com 100 µM de apocinina e infectados com promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento nas seguintes condições: 2 h antes da infecção, sendo mantido o tratamento durante as 6 h de infecção (-2 a 6), 2 h antes da infecção e mantido o tratamento durante as 2 primeiras horas de infecção (-2 a 2), 2 h antes da infecção e retirado o tratamento durante a infecção (-2 a 0) ou nas duas últimas horas de infecção (4 a 6). A porcentagem de células positivas para FAM-YVAD (a) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (b) foram calculadas por citometria de fluxo. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com NI.


96

(BALABAN; NEMOTO; FINKEL, 2005; GONZALEZ, 2005; GOTTLIEB, 2003;

HARRISON, 2004; MATA-GREENWOOD et al., 2006; MUELLER et al., 2005;

PRITCHARD, JR. et al., 2001; SCHRADER; FAHIMI, 2004; THANNICKAL; FANBURG,

2000). Trabalhos recentes têm demonstrado que existem diversas enzimas que compõem a

família das NADPH oxidases (atualmente chamadas de NOX). Os membros dessa família são

proteínas transmembranas que transportam elétrons através de membranas biológicas

reduzindo a molécula de O2 em superóxidos. Atualmente, existem diversos membros da

família NOX já caracterizados. Dentre eles, podemos destacar a enzima NOX1 (também

chamada de GP91-2), NOX2 (gp91phox), NOX3 (GP91-3), NOX4 (KOX-1) e NOX5. A partir

do exposto acima e dos dados anteriores que demonstram a importância de espécies reativas

de oxigênio na ativação do inflamassoma de Nlrp3 durante a infecção por L. amazonensis, nós

avaliamos se a produção de ROS mediada pela enzima NOX2 interferia na produção de IL-1β

em macrófagos ou ex vivo durante a infecção com L. amazonensis. Diferente de macrófagos

Asc−/− e Casp-1−/−, BMDMs de camundongos Nox2−/− apresentaram produção de IL-1β similar

àquela observada em culturas de macrófagos C57BL/6 após a infecção com L. amazonensis

(Fig. 14a). Resultados similares foram observados em culturas de células isoladas do baço de

camundongos C57BL/6, Casp-1−/− e Nox2−/− infectados com L. amazonensis (Fig. 14b). Esses

dados indicam que ativação de Nlrp3 durante a infecção por L. amazonensis é independente

da geração de ROS via NOX2.

4.4 O inflamassoma de Nlrp3 contribui para a restrição da multiplicação de L.

amazonensis em macrófagos

Visto que L. amazonensis ativa caspase-1 endógena em macrófagos e que a ativação de

caspase-1 está relacionada com o controle da replicação de diversos patógenos no interior de


97

Figura 14: Ativação do inflamassoma ocorre de maneira independente da ativação de NOX2. (a) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Nlrp3−/− e Nox2−/− foram estimulados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS, infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (10 parasitos/célula) por 42 h e analisada a produção de IL-1β por ELISA. (b) Camundongos C57BL/6, Casp-1−/−e Nox2−/− foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106 promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento. Após 8 semanas de infecção, células do baço foram cultivadas e estimuladas com 50 µg mL−1 de antígeno particulado de L. amazonensis (L.a Ag) por 48 h. Os níveis de IL-1β presentes no sobrenadante das culturas foram mensurados por ELISA. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata (a) ou com 4 camundongos por grupo (b) e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com meio.


98

macrófagos (MARIATHASAN et al., 2004; SUTTERWALA et al., 2006; WOLFERT et al.,

2002), nosso próximo objetivo foi avaliar o papel do inflamassoma no controle da replicação

de L. amazonensis em BMDMs. Para isso, avaliamos a replicação de promastigotas de fase

estacionária de L. amazonensis em BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 ou deficientes

para componentes do inflamassoma de Nlrp3. Além disso, utilizamos BMDMs de

camundongos Nos2−/−, uma vez que a óxido nítrico sintase induzível (NOS2) é a principal

enzima responsável pela produção de NO na leishmaniose, essencial para a restrição do

crescimento do parasito (LIEW et al., 1991; MUKBEL et al., 2007; STENGER et al., 1994).

Analisando os parasitos intracelulares após coloração por Giemsa observamos que, embora a

internalização do parasito pelos BMDMs fosse similar após 1 h de infecção, BMDMs

derivados de camundongos Asc−/−, Casp-1−/−, Nlrp3−/− e Nos2−/− apresentaram maior

porcentagem de células infectadas (Fig. 15a) e maior número de amastigotas por célula (Fig.

15b, c) após 24, 48, 72 e 96 h de infecção, comparado com BMDMs de camundongos

C57BL/6. Experimentos similares foram realizados utilizando formas promastigotas

metacíclicas de L. amazonensis e observamos que os parasitos replicavam mais

eficientemente em células Asc−/−, Casp-1−/−, Nlrp3−/− e Nos2−/− (Fig. 15d).

Adicionalmente, avaliamos a replicação de L. amazonensis em macrófagos por citometria

de fluxo e microscopia de fluorescência, usando L. amazonensis expressando

constitutivamente GFP (L.a-GFP). Inicialmente, para validar a eficiência da citometria de

fluxo, infectamos BMDMs de camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− com diferentes

MOIs de L.a-GFP por 3 h e determinamos a porcentagem de BMDMs GFP+ e a média da

intensidade de fluorescência integrada (iMIF) do parâmetro GFP. Analisando os resultados,

encontramos uma correlação direta entre o MOI utilizado para a infecção e a porcentagem de

BMDMs GFP+, bem como a iMIF de macrófagos infectados (Fig. 16). Além disso,

observamos que diferentes BMDMs apresentaram porcentagem similar e iMIF após 3 h de


99

Figura 15: A ativação do inflamassoma de Nlrp3 é critico na restrição da multiplicação de L. amazonensis em macrófagos. BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Nlrp3−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− foram incubados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis a um MOI de 10 ou promastigotas metacíclicas a um MOI de 1. (a-c) As células foram infectadas com parasitos em fase estacionária por 1 h, lavadas e incubadas por 24, 48, 72 e 96 h. Culturas foram fixadas, coradas com Giemsa e analisadas pra determinar a porcentagem de células infectadas (a), a média de amastigotas por célula (b) e o número de amastigotas contidos em cada célula (após 48 h de infecção) (c). (d) As células foram infectadas com promastigotas metacíclicas por 1 h, lavadas e incubadas por 24, 48, 72 e 96 h. Coloração com Giemsa foi usada para determinar a média do número de amastigotas por célula. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni) comparado com C57BL/6.


100

infecção com L. amazonensis. Os parasitos GFP+ foram então utilizados para avaliar o papel

do inflamassoma no controle da replicação intracelular do parasito por citometria de fluxo. As

cargas parasitárias detectadas nos BMDMs Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− foram

significativamente maiores quando comparadas àquelas encontradas em BMDMs de

camundongos C57BL/6, e foram similares àquelas observadas em BMDMs de camundongos

Nos2−/−, como demonstrado pela porcentagem de células GFP+ após 48 e 96 h de infecção

(Fig. 17a-c) e MIFs de BMDMs GFP+ durante a análise da cinética de crescimento com

duração até 96 h (Fig. 17d). A análise de microscopia de fluorescência demonstrou resultados

similares aos observados anteriormente, onde BMDMs de camundongos Asc−/−, Casp-1−/− e

Nlrp3−/− apresentaram maior quantidade de parasitos intracelulares comparados com BMDMs

de camundongos C57BL/6 após 48 h de infecção (Fig. 17e).

Posteriormente, investigamos se o tratamento de BMDMs com os inibidores do

inflamassoma de Nlrp3 descritos anteriormente afetavam no controle da replicação do

parasito. Observamos que BMDMs de camundongos C57BL/6 tratados com CA-074-ME,

glibenclamida, KCl, inibidores de ROS (apocinina, rotenona, DPI), mas não NaCl, foram

mais susceptíveis à replicação intracelular de L. amazonensis, como demonstrado pela

porcentagem de células GFP+ e iMIF dos BMDMs infectados. Entretanto, esses tratamentos

não alteraram a replicação do parasito em BMDMs Asc−/−, Casp-1−/− (Fig. 18). Em conjunto,

esses resultados mostram que a ativação do inflamassoma de Nlrp3 é crítico para a restrição

da replicação de L. amazonensis em macrófagos.

4.5 O inflamassoma de Nlrp3 contribui para o controle da multiplicação de L.

amazonensis in vivo

Como mencionado anteriormente, a resistência do hospedeiro frente a infecção por

Leishmania é determinada, principalmente, pela capacidade de macrófagos de conter a


101

Figura 16: Componentes do inflamassoma não são requeridos para a internalização de L. amazonensis por macrófagos. BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram incubados por 3 h com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis expressando constitutivamente a proteína GFP (L.a-GFP) a um MOI de 1 (a), 10 (b) ou 25 (c) e analisada a internalização por citometria de fluxo. Os histogramas verde, vermelho e azul representam a marcação de BMDMs C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/−, respectivamente. O histograma cinza representa macrófagos não infectados. (d, e) Quantificação dos experimentos demonstrados em a, b e c indicando a porcentagem de células GFP+ (d) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (e) para o parâmetro GFP. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes.


102

Figura 17: A ativação do inflamassoma de Nlrp3 é critico na restrição da multiplicação de L. amazonensis em macrófagos. BMDMs de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/−, Nlrp3−/− e Nos2−/− foram incubados com promastigotas de fase estacionária de L.a-GFP a um MOI de 10. A porcentagem de células GFP+ (a,c) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMIF) (b) para o parâmetro GFP após 48 h (a-c) e 96 h (a,b) de infecção foi quantificado por citometria de fluxo. (d) Média da intensidade de fluorescência de BMDMs infectados por 1, 24, 48, 72 e 96 h. (e) Imagens de microscopia de fluorescência de BMDMs de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− infectados por 48 h com La-GFP (verde). O núcleo foi marcado com DAPI e demonstrado em azul. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (a,b,d) ou teste t de Student (c)) comparado com C57BL/6.


103

Figura 18: Catepsinas, efluxo de potássio e espécies reativas de oxigênio são importantes para o controle da replicação de L. amazonensis em macrófagos. BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/−, Nlrp3−/− e Nos2−/− foram pré-tratados com CA-074-ME (100 µM), glibenclamida (100 µM) (Gliben), KCl (100 mM) ou NaCl (100 mM) (a,b) ou apocinina (100 µM) (Apoc), rotenona (10 µM) (Roten), DPI (10 µM) ou NaCl (100 mM) (c,d) e então incubados com promastigotas de fase estacionária de L.a-GFP a um MOI de 10. A porcentagem de células GFP+ (a) e a média de intensidade de fluorescência integrada (iMFI) (b) para o parâmetro GFP foram calculadas por citometria de fluxo. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com não tratado (NT).


104

replicação do parasito. Visto que macrófagos deficientes para componentes do inflamassoma

falham no controle da multiplicação intracelular de L. amazonensis, nosso próximo passo foi

verificar se o papel do inflamassoma de Nlrp3 no controle da infecção in vivo. Para isso,

utilizamos um modelo de infecção intradérmica na orelha, como descrito anteriormente

(BELKAID et al., 2000). Após a infecção com promastigotas em fase estacionária de

crescimento, observamos aumento significativo no tamanho da lesão e a presença de uma

intensa necrose cutânea na orelha de camundongos Asc−/−, Casp-1−/−, Nlrp3−/−, comparado

com camundongos C57BL/6 (Fig. 19a,b). Corroborando com aumento de lesão,

camundongos Asc−/−, Casp-1−/−, Nlrp3−/− também apresentaram maior carga parasitária na

orelha, linfonodo e baço, mensurada por diluição limitante de homogenatos dos órgãos após

oito semanas de infecção (Fig. 19c). Adicionalmente, realizamos infecções em camundongos

com background A/J, uma linhagem de camundongo resistente à infecção por L. amazonensis

(ANDRADE et al., 1984), para confirmar se o fenótipo observado anteriormente era limitado

ao background de camundongo C57BL/6, escolhido para nosso modelo experimental. Para

isso, geramos camundongos deficientes para caspase-1 no background A/J, backcrossing

camundongos que carregam o alelo deficiente para caspase-1 com camundongos A/J por 10

gerações. Os experimentos realizados com esta linhagem de camundongo demonstraram que

camundongos A/J deficiente para caspase-1 (A/J- Casp-1−/−) possuíam aumento no

desenvolvimento de lesão, intensa necrose cutânea e maior carga parasitária que

camundongos A/J selvagens, após infecção (Fig. 19d-f). Resultados similares (aumento no

desenvolvimento de lesão, intensa necrose cutânea e maior carga parasitária) foram obtidos

após a infecção de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− com 104 ou 105

formas promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, formas infectivas do parasito que são

injetadas no hospedeiro mamífero através da picada de insetos durante uma infecção natural

(Fig. 20). Esses resultados demonstram que independente do background do camundongo e


105

Figura 19: Inflamassoma de Nlrp3 é importante para a restrição da infecção in vivo por L. amozonensis. Camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− com background C57BL/6 (a-c) ou A/J e Casp-1−/− com background A/J (A/J-Casp-1−/−) (d-f) foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106 promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis. (a,d) O tamanho da lesão (em mm; para cada camundongo, a espessura da orelha infectada foi subtraída pela espessura da orelha controle não infectada) foi monitorado semanalmente. (b,e) Imagens representativas da lesão presente na orelha dos camundongos após 8 semanas de infecção. (c,f) A carga parasitária na lesão (orelha), linfonodo drenante da lesão e baço foi mensurada após 8 semanas de infecção pela técnica de diluição limitante como descrito em Animais, Material e Métodos. Os dados representam a média ± SD de 4 ou 5 camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em seis (a-c) ou três (d-f) experimentos independentes. Cada símbolo representado em c e f indica um camundongo. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (a,d) ou teste t de Student (c,f)) para Asc−/−, Casp-1−/−

e Nlrp3−/− comparado com C57BL/6 (a,c) ou A/J-Casp-1−/− comparado com A/J (d,f).


106

Figura 20: Inflamassoma de Nlrp3 é importante para a restrição da infecção in vivo por L. amozonensis. Camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− com background C57BL/6 foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 104 (a-c) ou 1 x 105 (d-f) promastigotas metacíclicas L. amazonensis. (a, d) O tamanho da lesão (em mm; para cada camundongo, a espessura da orelha infectada foi subtraída pela espessura da orelha controle não infectada) foi monitorado semanalmente. (b, e) Imagens representativas da lesão presente na orelha dos camundongos após 8 semanas de infecção. (c, f) A carga parasitária na lesão (orelha), linfonodo drenante da lesão e baço foi mensurada após 8 semanas de infecção pela técnica de diluição limitante como descrito em Animais, Material e Métodos. Os dados representam a média ± SD de 5 camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. Cada símbolo representado em c e f indica um camundongo. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (a, d) ou teste t de Student (c, f)) comparado com C57BL/6.


107

da forma do parasito utilizada para infecção, a ativação do inflamassoma de Nlrp3 é crucial

para o eficiente controle da multiplicação do parasito e resolução das lesões cutâneas

induzidas durante a leishmaniose experimental.

Para investigar a ativação do inflamassoma em camundongos infectados, quantificamos a

produção de IL-1β no sobrenadante de culturas de células obtidas do linfonodo drenante da

lesão e baço de camundongos infectados com L. amazonensis. Observamos aumento

significativo na produção de IL-1β por células do linfonodo e baço de camundongos C57BL/6

após duas ou cinco semanas de infecção. A produção de IL-1β detectada nos experimentos ex

vivo foi totalmente dependente da ativação do inflamassoma, uma vez que nenhuma produção

de IL-1β foi detectada no sobrenadante de culturas de células obtidas de camundongos Asc−/−

e Casp-1−/− (Fig. 21).

4.7 IL-1β derivada do inflamassoma é crítica para o controle da infecção por Leishmania

mediado por óxido nítrico

Uma vez que o processamento de IL-1β é estritamente dependente da ativação do

inflamassoma e que polimorfismos no gene da Il1β humana estão associados com a

severidade da doença (FERNANDEZ-FIGUEROA et al., 2012; MORAVEJ et al., 2012),

fomos então investigar o papel da IL-1β na resistência do hospedeiro à infecção por L.

amazonensis. Para avaliar especificamente o papel da IL-1β na restrição da Leishmania

dependente do inflamassoma, quantificamos a replicação do parasito em BMDMs de

camundongos C57BL/6 e deficientes para o inflamassoma que foram tratados com diferentes

concentrações de antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Ra). Foi observado que a inibição da

sinalização endógena do receptor de IL-1 resultou em aumento, dose-dependente, da

susceptibilidade de BMDMs de camundongos C57BL/6. De forma contrária, a

susceptibilidade de BMDMs Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− não foi afetada pelo tratamento com


108

Figura 21: Ativação do Inflamassoma é crítica para a produção de IL-1β ex vivo. Camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106

promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento. Após 2 (a,b) e 5 (c,d) semanas de infecção, células do baço (a,c) e linfonodo (b,d) foram cultivadas e estimuladas com 50 µg mL−1 de antígeno particulado de L. amazonensis (L.a Ag) por 48 h. Os níveis de IL-1β presentes no sobrenadante das culturas foram mensurados por ELISA. Os dados representam a média + SD de 4 camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com C57BL/6.


109

IL-1Ra (Fig. 22a). Nós ainda avaliamos o papel da IL-1β na atividade leishmanicida de

macrófagos, tratando BMDMs de camundongos C57BL/6 com IL-1β ou IFN-γ exógeno e

analisando a replicação do parasito. Similar ao tratamento com IFN-γ, BMDMs tratados com

IL-1β exógena apresentaram restrição da multiplicação do parasito de forma dose-dependente

(Fig. 22b). Para certificar se a atividade leishmanicida de BMDMs ativados com IL-1β

dependia de componentes do inflamassoma, tratamos BMDMs de camundongos C57BL/6,

Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− com IL-1β exógena e avaliamos a replicação do parasito.

Observamos que a adição de IL-1β exógena induziu aumento substancial na atividade

leishmanicida de BMDMs de camundongos C57BL/6 e, em menor extensão, em BMDMs de

camundongos deficientes para componentes do inflamassoma (Fig. 22c). Adicionalmente,

avaliamos se a IL-1β contribuía para a produção de óxido nítrico em BMDMs infectados.

Para isso, realizamos a dosagem de nitrito (NO2-) como medida indireta da produção de óxido

nítrico no sobrenadante de cultura de BMDMs de camundongos C57BL/6 que foram tratados

com IL-1β ou IFN-γ exógeno. Vale ressaltar que NO, quando livre, reage com oxigênio e

água para formar nitrito que se acumula e pode ser dosado no sobrenadante de cultura de

células. Foi encontrado aumento dose-dependente na produção de NO2- após o tratamento

com IL-1β ou IFN-γ (Fig. 22d). Além disso, BMDMs Asc−/−e Casp-1−/−, mas não BMDMs

Nos2−/−, foram capazes de produzir NO em reposta à IL-1β (Fig. 22e). Notavelmente, a

adição de IL-1β exógena somente restaurou parcialmente a atividade leishmanicida e a

produção de NO em BMDMs deficientes para componentes do inflamassoma (Fig. 22c,e).

Dessa forma, acreditamos que o inflamassoma está envolvido em processos adicionais que

levam à resistência de macrófagos.

Uma vez que o IFN-γ é crucial para produção de NO (MONCADA; PALMER;

HIGGS, 1991; NATHAN, 1992; WERNER-FELMAYER et al., 1990), investigamos a

importância inflamassoma na produção de IFN-γ em BMDMs infectados com L.


110

Figura 22: Produção de IL-1β, dependente do inflamassoma, contribui para a eliminação do parasito e produção de NO. (a) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− foram cultivados na concentração de 1 x 106 na presença ou ausência de diferentes concentrações do antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Ra). Após 3 horas, as células foram infectadas com promastigotas de L.a-GFP em fase estacionária de crescimento a um MOI de 10. A porcentagem de células GFP+ foi determinada por citometria de fluxo após 42 horas de infecção. (b-e) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 (b,d) ou de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− (c, e) foram tratados ou não com as concentrações indicadas de IFN-γ ou IL-1β por 6 h e então infectados com L.a-GFP a um MOI de 10. Após 42 horas de infecção, a porcentagem de células GFP+ foi calculada por citometria de fluxo (b,c) e os níveis de nitrito presentes no sobrenadante da cultura foram avaliados pelo ensaio de Griess (d,e). Os dados representam a média ± SD de um experimento feito em triplicata e são representativos dados obtidos em quatro (a), três (c,e) ou dois (b,d) experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (a,c,e) ou one-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (b,d)) para Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− comparado com C57BL/6 (a) ou culturas não tratadas (b-e).


111

amazonensis. Para isso, infectamos BMDMs de camundongos C57BL/6 e Casp-1−/− com L.

amazonensis e mensuramos a expressão de IFN-γ por quantitativa RT-PCR. Observamos que

BMDMs de camundongos Casp-1−/− apresentaram reduzida expressão de Nos2 e Ifng, mas

não de Tnfa (fator de necrose tumoral α), em reposta à infecção (Fig. 23a). Esses dados

indicam que o inflamassoma é requerido para uma eficiente produção de IFN-γ em BMDMs.

Nosso próximo passo foi tratar BMDMs com IFN-γ em combinação com IL-1β.

Observamos que a adição de ambas as citocinas complementou totalmente a produção de NO

e a restrição da multiplicação de L. amazonensis em BMDMs de camundongos Casp-1−/−

(Fig. 23b). Corroborando com o resultado anterior, quando adicionamos anticorpo específico

para IFN-γ nas culturas (bloqueando IFN-γ endógeno), IL-1β sozinha induziu controle similar

da multiplicação de L. amazonensis e produção de NO em BMDMs de camundongos

C57BL/6 e Casp-1−/− (Fig. 23b).

Finalmente, avaliamos o papel do óxido nítrico nos mecanismos leishmanicidas induzidos

por IL-1β e inflamassoma. Para isso, bloqueamos a produção endógena de NO, em BMDMs

de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− infectados com L. amazonensis, com

os inibidores de NO L-NMMA ou aminoguanidina. Observamos que ambas as drogas

afetaram a atividade leishmanicida de macrófagos derivados de camundongos C57BL/6,

porém nenhuma alteração no parasitismo de células deficientes para Asc, caspase-1 e Nos2

foi observada (Fig. 23c,d). Coletivamente, esses dados suportam fortemente o importante

papel de NO como uma molécula efetora que medeia a atividade leishmanicida de

macrófagos, através de mecanismos que envolvem a produção das citocinas IL-1β e IFN-γ

induzidas pela ativação do Inflamassoma.

Avaliações adicionais foram feitas para investigar se a modulação da produção de NO

pela IL-1β derivada do inflamassoma também estava associada com a regulação da expressão

da enzima NOS2 in vivo. Para isso, camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram


112

Figura 23: IL-1β e IFN-γ, dependentes do inflamassoma, possuem efeito aditivo na eliminação do parasito, através de mecanismos dependentes de NO. (a) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 e Casp-1−/− foram infectados com promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento a um MOI de 10 por 12 h. A expressão de Ifng, Nos2 e Tnfa foi determinada através de PCR em tempo real (qRT-PCR). Os níveis de expressão de mRNA foram normalizados pela expressão constitutiva do gene da β-actina. Os resultados foram calculados como aumento em relação à expressão obtida em células correspondentes não infectadas. (b) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6 e Casp-1−/− foram pré-tratados ou não com as concentrações indicadas de IFN-γ e/ou IL-1β por 6 horas e posteriormente infectados com L.a-GFP a um MOI de 10. Quando indicado, 2 µg mL−1 de anticorpo anti-IFN-γ foi adicionado nas culturas. Após 42 h de infecção, a porcentagem de células GFP+ foi calculada por citometria de fluxo e os níveis de nitrito aferidos usando o ensaio de Griess. (c,d) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nos2−/− foram pré-tratados por 3 h com diferentes concentrações de L-NMMA (c) ou aminoguanidina (Ag) (d) e então infectados com L.a-GFP a um MOI de 10. Após 42 h de infecção, a porcentagem de células GFP+ foi estimada por citometria de fluxo. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (b-d) ou teste t de Student (a)) comparado com C57BL/6.


113

infectados com L. amazonensis e a expressão de NOS2 foi avaliada por qRT-PCR.

Camundongos Asc−/− e Casp-1−/− demonstraram redução significativa nos níveis de

expressão de NOS2 tanto na orelha quanto no linfonodo, comparados com camundongos

C57BL/6 (Fig. 24a,b). Além disso, também observamos um evidente papel do inflamassoma

na indução de NO ex vivo, em resposta à infecção por L. amazonensis. Células obtidas do

linfonodo drenante da lesão e baço de camundongos C57BL/6 infectados, mas não de

camundongos Asc−/− e Casp-1−/−, produziram elevados níveis de NO após estimulação com

antígeno particulado de L. amazonensis (Fig. 24c,d). Este processo foi dependente da

produção de IFN-γ em reposta ao antígeno de L. amazonensis, uma vez que culturas ex vivo

de células do linfonodo ou baço de camundongos Ifng−/− não produziram IL-1β e NO em

reposta à estimulação com o antígeno (Fig. 25). Assim, esses resultados demonstram que a

ativação do inflamassoma é crucial para a indução da produção de NO in vivo por

mecanismos dependentes de IL-1β e IFN-γ.

Por fim, investigamos o papel da sinalização de IL-1 na restrição da infecção de

macrófagos, realizando experimentos com BMDMs de camundongos deficientes para IL-1R e

MyD88, ambos requeridos para a sinalização de IL-1. Vimos que BMDMs obtidos de

camundongos Il-1r−/− e Myd88−/− foram tão susceptíveis quanto BMDMs obtidos de

camundongos Asc−/− e Casp-1−/− após infecção com L. amazonensis (Fig. 26a,b).

Corroborando com esses achados, camundongos Il-1r−/− e Myd88−/− apresentaram

susceptibilidade similar a de camundongos Asc−/− e Casp-1−/− durante o curso da infecção por

L. amazonensis (Fig. 26c-e).

4.8 O inflamassoma de Nlrp3 é crítico para resistência do hospedeiro contra a infecção

por L. braziliensis e L. infantum chagasi, mas não por L. major

Evidências demonstram que a reposta imune contra distintas espécies de Leishmania e


114

Figura 24: O inflamassoma é importante para a expressão de Nos2 e produção de NO in vivo e ex vivo em reposta à infecção por L. amazonensis. Camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/−

foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106 promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento. (a,b) Após 7 e 15 dias de infecção, a expressão de Nos2 na orelha (a) e linfonodo (b) foi determinada por PCR em tempo real (qRT-PCR) e normalizada para gene da β-actina. Os níveis de expressão de mRNA foram calculados como aumento em relação à expressão obtida em camundongos correspondentes não infectados. (c,d) Camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram infectados por 2 e 5 semanas e então isoladas células do linfonodo (c) e baço (d). As células foram estimuladas com 50 µg mL−1 de antígeno particulado de L. amazonensis por 48 h e a quantidade de nitrito presente no sobrenadante da cultura foi aferida pelo ensaio de Griess. Os dados representam a média + SD de três camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni) comparado com C57BL/6.


115

Figura 25: IFN-γ é importante para a produção de IL-1β e óxido nítrico ex vivo. Camundongos C57BL/6, Asc−/−, Il-1r−/−e IFN-γ−/− foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106

promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento. Após 5 semanas de infecção, as células do baço (a,c,e) e linfonodo (b,d,f) foram estimuladas com 50 µg mL−1 de antígeno particulado de L. amazonensis (L.a Ag) por 48 h. Os níveis de IFN-γ (a,b) e IL-1β (c,d) presentes no sobrenadante das culturas celulares foram mensurados por ELISA. (e,f) Quantidade de nitrito presente no sobrenadante das culturas mensurado pelo ensaio de Griess. Os dados representam a média + SD de 4 camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com culturas não estimuladas (Meio).


116

Figura 26: Sinalização pelo receptor de IL-1 é importante para o controle da infecção por L. amazonensis em macrófagos e in vivo. (a,b) BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/−, Il-1r−/− e Myd88−/− foram infectados com promastigotas de L.a-GFP em fase estacionária de crescimento a um MOI de 10. Após 48 h de infecção, a porcentagem de células GFP+ (a) e a média da intensidade de fluorescência integrada (iMFI) foi calculada por citometria de fluxo. (c-e) Camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/−, Il-1r−/− e Myd88−/−foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106 promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento. (c) O tamanho da lesão (em mm; para cada camundongo, a espessura da orelha infectada foi subtraída pela espessura da orelha controle não infectada) foi monitorado semanalmente. (d) Imagens representativas da lesão presente na orelha dos camundongos após 8 semanas de infecção. (e) A carga parasitária na lesão (orelha), linfonodo drenante da lesão e baço foi mensurada após 8 semanas de infecção pela técnica de diluição limitante como descrito em Animais, Material e Métodos. Os dados demonstrados representam a média ± SD de um experimento feito em triplicata (a,b) ou 5 camundongos por grupo (c-e) e são representativos de dados obtidos em dois (a,b) ou três (c-e) experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student (a,b,e) ou two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (c)) comparado com C57BL/6.


117

mesmo dentro da mesma espécie, pode diferir significativamente (TACCHINI-COTTIER;

WEINKOPFF; LAUNOIS, 2012). Neste contexto, nosso próximo objetivo foi investigar se

ativação do inflamassoma ocorria em resposta à infecção por outras espécies de Leishmania e

se essa ativação contribuía para o controle da infecção. Inicialmente, infectamos BMDMs de

camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− com Leishmania (Leishmania) major,

L. (V.) braziliensis e L. (L.) infantum chagasi e avaliamos a ativação de caspase-1 e produção

de IL-1β por citometria de fluxo e ELISA, respectivamente. Marcação com FAM-YVAD e a

produção de IL-1β demonstraram que o inflamassoma de Nlrp3 foi ativado em BMDMs

infectados com L. major, L. braziliensis e L. amazonensis (Fig. 27). Nós então avaliamos o

papel do inflamassoma na restrição da infecção in vivo por L. major, L. braziliensis e L.

infantum chagasi. Surpreendentemente, diferente do encontrado durante a infecção com L.

amazonensis, nenhuma diferença significativa foi observada no desenvolvimento de lesão e

carga parasitária na orelha e linfonodo de camundongos C57BL/6 comparado com

camundongos deficientes para componentes do inflamassoma, após infecção intradérmica

com L. major (Fig. 28). Por outro lado, a infecção de camundongos com L. braziliensis e L.

infantum chagasi demonstraram que o inflamassoma possui um importante papel na restrição

da infecção in vivo induzida por essas duas espécies (Fig. 29 e 30). Esses dados em conjunto,

mostram que a ativação do inflamassoma é um importante processo na resistência do

hospedeiro contra a infecção induzida por diferentes espécies de parasitos do gênero

Leishmania.


118

Figura 27: O inflamassoma de Nlrp3 é ativado em macrófagos após a infecção com diferentes espécies de Leishmania. BMDMs obtidos de camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− foram infectados com promastigotas de L. amazonensis (L.a), L. major (L.m) ou L. braziliensis (L.b) em fase estacionária de crescimento a um MOI de 10. (a) Após 48 h de infecção, as células foram marcadas com FAM-YVAD e analisadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células FAM-YVAD+. (b) BMDMs foram pré-tratados por 6 h com 500 ng mL−1 de LPS e então infectados com promastigotas de fase estacionária de L. amazonensis (L.a), L. major (L.m) ou L. braziliensis (L.b) (10 parasitos/célula) por 42 h. A produção de IL-1β foi analisada no sobrenadante livre de células por ELISA. Os dados representam a média + SD de um experimento feito em triplicata e são representativos de dados obtidos em dois experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com não infectado (NI).


119

Figura 28: A ativação do inflamassoma não é necessária para o controle da infecção in vivo por L. major. Camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106 promastigotas de L. major em fase estacionária de crescimento. (a) O tamanho da lesão (em mm; para cada camundongo, a espessura da orelha infectada foi subtraída pela espessura da orelha controle não infectada) foi monitorado semanalmente. (b,c) A carga parasitária na lesão (orelha) (b) e linfonodo drenante da lesão (c) foi mensurada após 8 semanas de infecção pela técnica de diluição limitante como descrito em Animais, Material e Métodos. Os dados demonstrados representam a média ± SD de 5 camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (a) ou teste t de Student (b, c)) comparado com C57BL/6.


120

Figura 29: O inflamassoma de Nlrp3 contribui para o controle da infecção in vivo por L. braziliensis. (a,b) Camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 106 promastigotas de L. braziliensis em fase estacionária de crescimento. (c,d) Camundongos C57BL/6, Asc−/−, Casp-1−/− e Nlrp3−/− foram infectados por via intradérmica na orelha com 1 x 105 promastigotas metacíclicas de L. braziliensis. (a,c) O tamanho da lesão (em mm; para cada camundongo, a espessura da orelha infectada foi subtraída pela espessura da orelha controle não infectada) foi monitorado semanalmente. (b,d) A carga parasitária na lesão (orelha) e linfonodo drenante da lesão foi mensurada após 8 semanas de infecção pela técnica de diluição limitante como descrito em Animais, Material e Métodos. Os dados demonstrados representam a média ± SD de 4 (a,b) ou 5 (c,d) camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (a,c) ou teste t de Student (b,b)) comparado com C57BL/6.


121

Figura 30: O inflamassoma contribui para a resistência à infecção in vivo por L. infantum chagasi. Camundongos C57BL/6, Asc−/− e Casp-1−/− foram infectados por via intraperitoneal com 1 x 107 promastigotas de L. infantum chagasi em fase estacionária de crescimento. (a-d) A carga parasitária no baço (a,c) e fígado (b,d) o foi avaliada após 4 (a,b) e 8 (c,d) semanas de infecção pela técnica de diluição limitante como descrito em Animais, Material e Métodos. Os dados demonstrados representam a média ± SD de 5 camundongos por grupo e são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes. *P < 0.05 (teste t de Student) comparado com C57BL/6.

Discussão

Lima-Júnior, D. S. Discussão

123

5. DISCUSSÃO

O sistema imunológico de mamíferos inclui dois componentes distintos, porém

interdependentes: o sistema imune inato e o adaptativo. A resposta imune inata é responsável

pela detecção precoce e destruição de micróbios invasores, sendo dependente de um conjunto

limitado de receptores, codificados por genes da linhagem germinativa. Por outro lado, a

subsequente resposta imune adaptativa depende de uma diversidade enorme de receptores

gerados por rearranjos gênicos randômicos, responsáveis pela detecção de microrganismos e

desenvolvimento de uma reposta imune de memória (Revisado em JANEWAY, JR., 2002).

Embora a resposta imune adaptativa dependa da imunidade inata para seu início, bem como

para a natureza da resposta, ela pode também influenciar na resposta imune inata, levando a

interações sinérgicas entre as duas armas do sistema imune responsáveis pela remoção de

agentes patogênicos (HOEBE; JANSSEN; BEUTLER, 2004). Adicionalmente, o sistema

imune inato é responsável pelo monitoramento do ambiente interno do hospedeiro, a fim de

detectar qualquer anormalidade endógena de identidade própria (MEDZHITOV; JANEWAY,

JR., 2002).

Para iniciar a resposta imune inata, PRRs reconhecem padrões moleculares associados a

patógenos ativando várias cascatas de sinalização extracelulares e intracelulares capazes de

induzir diferentes tipos de respostas inflamatórias. Essas respostas são essenciais para a

remoção eficaz de agentes patogênicos, mas podem ativar respostas nocivas ao hospedeiro

como, por exemplo, a sepse (POLTORAK et al., 1998). No entanto, elas são rigorosamente

controladas pela associação a alças de regulação negativas e/ou por fatores anti-inflamatórios,

tais como TGF-β, IL-10 ou hormônios esteróides.

Intensos estudos envolvendo os receptores do tipo Toll têm nos levado a acreditar que a

resposta imune inata pode ser iniciada por um sistema de proteínas estruturalmente

relacionadas que funcionam como receptores para componentes microbianos específicos


124

(AKIRA; TAKEDA, 2004). Esse modelo de reconhecimento e resposta do hospedeiro,

entretanto, não é restrito aos TLRs. Marcantes evidências para essa observação surgiram de

descobertas nas quais membros da família NLR demonstraram atuar de modo similar aos

TLRs, também reconhecendo componentes microbianos, embora presentes no citosol ao invés

de na membrana celular ou de vesículas (INOHARA; NUNEZ, 2003; MARTINON;

TSCHOPP, 2005). Essa similaridade estende-se para a estrutura nos dois sistemas em que

ambos TLRs e NLRs reconhecem patógenos através de um domínio LRR. Porém, as vias de

sinalização desencadeadas pela ativação de TLRs ou NLRs possuem algumas diferenças.

A geração de uma resposta imune eficiente requer um efetivo reconhecimento de

patógenos pelo sistema imune inato, sendo essencial para a resistência contra diferentes

doenças, dentre elas a leishmaniose. A sinalização de TLRs dependente de MyD88 apresenta

um papel chave no reconhecimento de Leishmania, porém as espécies desse gênero são

imunologicamente silenciosas e capazes de modular eficientemente a resposta mediada pela

sinalização de PRRs em resposta à infecção (GREGORY; OLIVIER, 2005; SHIO et al.,

2012; SOONG, 2008; XIN; LI; SOONG, 2008). Nos últimos anos, diversos trabalhos têm

demonstrado a importância dos NLRs na montagem de imunidade inata eficiente contra

infecções provocadas pelos mais diversos patógenos. Dentre esses NLRs, destaca-se o

receptor Nlrp3 que, através de vias dependentes da molécula adaptadora ASC, ativa caspase-1

levando à produção de mediadores inflamatórios que participam diretamente no controle da

infecção provocada por diversos patógenos, tanto intra quanto extracelulares. Neste estudo

nós investigamos a participação do inflamassoma de Nlrp3 no controle da infecção

experimental por parasitos do gênero Leishmania.

Nossos resultados mostraram que BMDMs de camundongos C57BL/6 infectados com

diferentes espécies de Leishmania foram capazes de ativar caspase-1 endógena e induzir

secreção de IL-1β, sugerindo a participação dos receptores NLRs na resposta imune inata


125

induzida por esse patógeno. Sabe-se que a ativação de caspase-1 é decorrente do

reconhecimento mediado por NLRs de moléculas microbianas introduzidas por patógenos

e/ou fatores endógenos liberados de tecidos em destruição (MEYLAN, 2006). Já a secreção

de IL-1β, ocorre por um mecanismo não convencional de secreção de proteínas, dependente

da ativação de caspase-1 (KELLER et al., 2008). A ativação dos NLRs em reposta à

Leishmania foi então confirmada pela ausência de ativação de caspase-1 e secreção de IL-1β

em BMDMs deficientes para componentes do inflamassoma de Nlrp3 (Nlrp3, Asc e caspase-

1). Além disso, esse fenômeno foi ainda evidenciado pela indução de focos de Asc em

resposta à L. amazonensis. Diferentes trabalhos já haviam demonstrado que a infecção por

parasitos do gênero Leishmania induzia a produção de IL-1 (BERSUDSKY; APTE; EL-ON,

2000; DELFINO et al., 1995; FILIPPI et al., 2003; VON et al., 2003; XIN; LI; SOONG,

2007), porém as vias de sinalização envolvidas na produção dessa citocina ainda não haviam

sido descritas. Nosso estudo identificou que a ativação do receptor Nlrp3 e posterior ativação

de caspase-1 é crucial para a secreção de IL-1β durante a infecção por Leishmania.

Corroborando com esses achados, foi demonstrado recentemente que a ativação de Dectin-1 e

receptor de manose em resposta à infecção por L. infantum também contribui para a produção

de IL-1β, de forma dependente da ativação de caspase-1 (LEFEVRE et al., 2013).

Neste estudo, nós ainda verificamos os mecanismos responsáveis pela secreção de IL-

1β e ativação do inflamassoma em resposta à infecção por Leishmania. Para isso, BMDMs de

camundongos C57BL/6 foram infectados com parasitos vivos, irradiados, fixados com

formaldeído ou inativados por calor. Surpreendentemente, nós observamos que apenas na

presença do parasito vivo, ocorria a ativação de caspase-1 e eficiente secreção de IL-1β. Estes

resultados sugerem que fatores de virulência do parasito, bem como a invasão de parasitos

viáveis são críticos para a ativação do inflamassoma e secreção de IL-1β, que é consistente

com outros estudos que demonstraram que a invasão de macrófagos por patógenos viáveis é


126

necessária para a estimulação de vias que culminam com a ativação de caspase-1 (CHEN et

al., 2012; MCNEELA et al., 2010). Nós especulamos que processos que dependem de uma

participação ativa do parasito, tais como perturbação da membrana lisossomal, desbalanço

iônico (efluxo de K+) e indução de stress oxidativo são críticos para a ativação do

inflamassoma de Nlrp3. A desestabilização da membrana lisossomal por cristais de ácido

úrico ou colesterol, o fluxo de íons tais como Na+ e K+, e a geração de espécies reativas de

oxigênio são estímulos que podem ser detectados por Nlrp3 culminando com a ativação de

caspase-1 (CRUZ et al., 2007; MARTINON et al., 2006; MUNOZ-PLANILLO et al., 2013;

RAJAMAKI et al., 2010; ZHOU et al., 2010; ZHOU et al., 2011).

Para elucidar os mecanismos requeridos para a ativação do inflamassoma de Nlrp3

durante a infecção por L. amazonensis, nós realizamos experimentos bloqueando DAMPS que

ativam o receptor Nlrp3. A ativação de caspase-1 e liberação de IL-1β após a infecção com L.

amazonensis foi dependente da liberação de catepsinas, efluxo de potássio e geração de

espécies reativas de oxigênio. Uma vez que glibenclamida pode agir diretamente na inibição

da formação do inflamassoma de Nlrp3 de forma independente da inibição de canais de K+

(COLL; O'NEILL, 2011; LAMKANFI et al., 2009), nós utilizamos altas concentrações de

KCl para demonstrar que o efluxo de potássio é um mecanismo importante na ativação do

inflamassoma de Nlrp3 induzida por L. amazonensis. Adicionalmente, nós observamos que a

produção de ROS durante a fagocitose do parasito foi crucial para a ativação de caspase-1.

Corroborando com esses resultados, um trabalho recente demonstrou a ativação de caspase-1

mediada por Dectin-1 ou receptor de manose em reposta à infecção por L. infantum ocorreu

através de mecanismos dependentes da geração de ROS (LEFEVRE et al., 2013). Estudos

adicionais serão importantes para determinar os mecanismos upstream da ativação do

inflamassoma de Nlrp3 durante a infecção por Leishmania.


127

Diversos trabalhos têm demonstrado a importância da ativação de caspase-1 no

controle da replicação intracelular de diversos patógenos, tais como Salmonela (BRENNAN;

COOKSON, 2000; HERSH et al., 1999), Shigella (CHEN et al., 1996) e Legionella

(ZAMBONI et al., 2006). Neste estudo, demonstramos que a ativação do inflamassoma de

Nlrp3 levou a processos autônomos em macrófagos que culminaram com a restrição da

replicação intracelular dos parasitos. Esses processos ocorreram devido a produção de IFN-γ e

processamento de IL-1β, que culminaram com aumento na expressão de NOS2, enzima

relacionada com a restrição da replicação de Leishmania em macrófagos mediada pela

produção de NO (GREEN, 1990a; GREEN, 1990b; MUKBEL et al., 2007). Vale ressaltar

que a produção de NO está diretamente relacionada à ativação de NF-κB (FORSTERMANN;

KLEINERT, 1995; XIE; KASHIWABARA; NATHAN, 1994) e, uma vez secretada, a citocina

IL-1β sinaliza via IL-1R/MyD88 induzindo a ativação de NF-κB e assim aumentando a

expressão de genes proinflamatórios, dentre eles NOS2. Esses dados explicam recentes

trabalhos que demonstraram o papel chave da sinalização de IL-1β como fator determinante

para o desenvolvimento de formas controladas de leishmaniose em humanos (FERNANDEZ-

FIGUEROA et al., 2012; MORAVEJ et al., 2012). Polimorfismos no gene da IL-1β estão

associados com a severidade da doença, podendo levar ao desenvolvimento de casos graves

de leishmaniose visceral em pacientes com L. infantum chagasi ou formas difusas

incontroláveis de leishmaniose cutânea em pacientes infectados com Leishmania mexicana

(FERNANDEZ-FIGUEROA et al., 2012; MORAVEJ et al., 2012). Através do modelo

experimental de infecção em macrófagos e in vivo utilizado neste estudo, observamos que

macrófagos e camundongos deficientes para o receptor da IL-1 foram tão susceptíveis quanto

aqueles deficientes para Asc, Nlrp3 e caspase-1, indicando que a sinalização de IL-1 possui

um papel chave na restrição da replicação de Leishmania spp. de forma dependente do

inflamassoma. Dados publicados recentemente ressaltam os achados mencionados acima, uma


128

vez que foi observado que macrófagos estimulados com nanopartículas de PLGA (polyester

poly(lactide-co-glycolide acid)) carregadas com uma proteína de membrana de

Kinetoplastídeos de 11 kDa (KMP-11) diminuíram significativamente a replicação de L.

braziliensis no interior das células. Adicionalmente, a incubação de macrófagos com

nanopartículas de PLGA carregado com KMP-11 induziu a ativação de caspase-1 e secreção

de IL-1β sugerindo a participação do inflamassoma nesse processo. Por outro lado, a inibição

de caspase-1 em macrófagos estimulados com PLGA carregado com KMP-11 induziu

aumento na replicação do parasito (SANTOS et al., 2013). Outro trabalho publicado

recentemente por membros do nosso grupo demonstrou que BMDMs de camundongos

C57BL/6 tratados com IL-1β apresentaram maior controle na replicação de T. cruzi e aumento

na produção de óxido nítrico (SILVA et al., 2013).

Como mencionado anteriormente, a produção de IFN-γ e IL-1β mediada pelo

inflamassoma culminou em um efeito aditivo na indução de NO e consequente diminuição da

replicação do parasito em macrófagos. Além disso, observamos que a administração conjunta

de IFN-γ e IL-1β complementou totalmente a produção de NO e a restrição da multiplicação

de L. amazonensis em macrófagos Casp-1−/−. Esses dados corroboram e explicam um

trabalho publicado anteriormente (JUTTLER et al., 2007), no qual foi observado que em

diferentes tipos de células produtoras de NO presentes no sistema nervoso central, quando

inibida a ativação de caspase-1 e produção endógena de IL-1β, o tratamento com IFN-γ, TNF-

α ou ambas as citocinas não acarretava em um aumento de expressão da enzima NOS2, bem

como produção de óxido nítrico. A expressão de NOS2 e produção de NO induzida pelo

tratamento exógeno com IFN-γ e/ou TNF-α dependia de um mecanismo parácrino

envolvendo a forma ativa da citocina IL-1β produzida endogenamente, considerado um fator

chave desse mecanismo.


129

A susceptibilidade de camundongos à leishmaniose cutânea é caracterizada

principalmente pela incapacidade em montar uma eficiente imunidade inata contra o parasito.

Os eventos que direcionam o desenvolvimento dessa imunidade dependem

predominantemente da sinalização de PRRs durante a interação parasito-hospedeiro. Nesse

estudo foi demonstrado que a ativação do inflamassoma de Nlrp3 mostrou-se crítica para o

controle da replicação de L. amazonensis, L. braziliensis e L. infantum chagasi in vivo. Os

mecanismos envolvidos na susceptibilidade de camundongos deficientes para os componentes

do inflamassoma de Nlrp3 possivelmente dependem de IL-1, uma vez que camundongos Il-

1r−/− infectados apresentaram um perfil de susceptibilidade similar aos camundongos Asc−/−,

Nlrp3−/− e Casp-1−/−. Por outro lado, apesar do inflamassoma de Nlrp3 ser ativado em

macrófagos infectados com L. major, a ativação do inflamassoma foi dispensável para a

resistência do hospedeiro durante a infecção in vivo. É importante destacar que camundongos

de background C57BL/6 são naturalmente resistentes à infecção por L. major (Revisado em

SACKS; NOBEN-TRAUTH, 2002). Dessa forma, esse background genético altamente

restritivo pode fornecer mecanismos de resistência adicionais, suficientes para limitar a

replicação do parasito, dispensando a presença do eixo inflamassoma/IL-1. O dispensável

papel do inflamassoma na restrição da infecção por L. major corrobora com estudos anteriores

que demonstraram que a sinalização de IL-1 é dispensável para a resistência contra a infecção

por L. major em camundongos com background genético C57BL/6 (KAUTZ-NEU et al.,

2011; KOSTKA et al., 2006; SATOSKAR et al., 1998). Neste contexto, estudos futuros

serão importantes para investigarem o papel do inflamassoma e sinalização de IL-1 em um

modelo de camundongo com background genético susceptível à infecção por L. major.

Porém, independente do background genético, as infecções realizadas com espécies altamente

virulentas, que transpõem a resistência natural de camundongos C57BL/6 à infecção por


130

Leishmania, demonstraram o papel crítico do inflamassoma e da sinalização de IL-1 na

resistência do hospedeiro à infecção.

De forma geral, os dados obtidos nesse trabalho fornecem bases moleculares para a

resistência à infecção por Leishmania spp. Nossos dados evidenciam um modelo que conecta

moléculas e processos celulares importantes na resistência do hospedeiro, incluindo óxido

nítrico, MyD88 e sinalização da citocina IL-1. A identificação desta via fundamental na

resistência do hospedeiro à leishmaniose pode permitir o desenvolvimento de estratégias

terapêuticas que visem a modulação do inflamassoma e/ou da sinalização de IL-1 facilitando

o tratamento de doenças infecciosas crônicas, negligenciadas e às vezes fatais como a

leishmaniose.

Sumário

Lima-Júnior, D. S. Sumário

132

6. SUMÁRIO

– A Leishmania induz a ativação de caspase-1.

– O inflamassoma de Nlrp3 é ativado em reposta à infecção por Leishmania spp..

– A infecção por L. amazonensis induz a formação de focos de Asc em macrófagos.

– A ativação do inflamassoma de Nlrp3 durante a infecção por L. amazonensis ocorre por

mecanismos dependentes da liberação de catepsinas, efluxo de potássio e espécies reativas de

oxigênio.

– O Nlrp3 inflamassoma é critico para a restrição da multiplicação de L. amazonensis em

macrófagos.

– O Nlrp3 Inflmassoma é importante para o controle da infecção in vivo por L.

amazonensis.

– A ativação do inflamassoma é crucial para a produção de IL-1β ex vivo.

– A ativação do inflamassoma em reposta à infecção por L. amazonensis contribui para a

expressão de NOS2 in vivo e produção de NO ex vivo.

– IL-1β e IFN-γ derivados da ativação do inflamassoma exercem efeito aditivo para o

controle da infecção por L. amazonensis mediado por óxido nítrico.

– O inflamassoma de Nlrp3 é crítico para a resistência do hospedeiro contra a infecção

por L. braziliensis e L. infantum chagasi, mas não por L. major.

Conclusão

Lima Júnior, D. S. Conclusão

134

7. CONCLUSÃO

A ativação do inflamassoma de Nlrp3, durante a infecção por Leishmania, é crucial

para a resistência do hospedeiro à infecção. Esse controle é mediado por mecanismos

dependentes da produção de IL-1β e IFN-γ, os quais induzem a geração de óxido nítrico que

contribui para a restrição da replicação do parasito no interior de macrófagos.

Referências Bibliográficas

Lima Júnior, D. S. Referências Bibliográficas

136

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Anexos

Lima Júnior, D. S. Anexos

162

9. ANEXOS

9.1 Anexo 1: Artigo publicado

a r t i c l e s

nature medicine VOLUME 19 | NUMBER 7 | JULY 2013 909

Leishmaniasis is caused by protozoan parasites of the Leishmania genus, which includes several species wildly distributed in South America and Asia1. Whereas L. (L.) amazonensis and L. (Viannia) braziliensis induce the cutaneous and mucocutaneous forms of the disease, L. (L.) infantum chagasi causes a life-threatening visceral form of leishmaniasis1,2.

Leishmania parasites survive and multiply in macrophages, which are able to produce leishmanicidal products that contribute effec-tively to the restriction of parasite proliferation3–5. A potent leish-manicidal factor produced by macrophages is NO produced by the enzyme NOS2, which is tightly regulated in response to infection by pathways that are not completely elucidated6–8.

Macrophage activation is crucial for the initiation of protective immune responses to different diseases, including leishmaniasis. Activation is achieved when host cell receptors sense microbial com-ponents or stress signals. Members of the Nod-like receptor (NLR) family of proteins have emerged as important innate immune sen-sors of microbes and damage9. Certain NLRs regulate the assembly of the inflammasome, a multimeric complex that contains active caspase-1 (reviewed in ref. 10). The Nlrp3 inflammasome requires the adaptor protein Asc (also called Pycard) and has been extensively studied because of its association with important chronic inflam-matory diseases, including gout, Alzheimer’s disease and type 2 diabetes11. The Nlrp3 inflammasome responds to microbial RNA

and perturbations in the membranes of innate immune cells; this feature suggests that Nlrp3 is a sensor of damage (reviewed in ref. 10). Through mechanisms that are not yet elucidated, the assembly of the canonical Nlrp3 inflammasome requires the efflux of potassium (K)+ and is impaired by inhibitors of K+ transporters, lysosomal cathep-sins and reactive oxygen species12–15. Once activated, caspase-1 induces processing and secretion of IL-1β, which is transcriptionally regulated when microbial components are sensed by pattern recogni-tion receptors16.

The activation of the inflammasome in response to infection by intracellular pathogens has been extensively investigated. However, only a few studies have addressed the role of the inflammasome in the restriction of infection by these microbes, and the mechanisms that underlie inflammasome-mediated host resistance are largely unknown17–20. In this study we addressed the role of the inflamma-some in the host response to intracellular protozoan parasites of the Leishmania genus. We found that the Nlrp3 inflammasome is engaged in response to L. amazonensis infection and that activation of this molecular platform has a crucial role in the restriction of parasite replication both in isolated macrophages and in vivo. Notably, we found that IL-1β is important for host resistance to infection, as IL-1β signaling through IL-1R and MyD88 contributes to induce NOS2-mediated production of NO, which is a major host defense mecha-nism against Leishmania spp.

1Departmento de Biologia Celular, Molecular e Bioagentes Patogêncios, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. 2Departmento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. 3Departmento de Imunologia, Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. 4Departmento de Ciências Biológicas e Centro de Terapia Celular e Molecular, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil. 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA. 6Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA. 7Present addresses: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, Minas Gerais, Brazil (T.W.P.M.), and School of Medicine, Antonio Nariño University, Bogotá, Colombia (F.R.S.G.). Correspondence should be addressed to D.S.Z. ([email protected]).

Received 26 February; accepted 6 May; published online 9 June 2013; doi:10.1038/nm.3221

Inflammasome-derived IL-1β production induces nitric oxide–mediated resistance to LeishmaniaDjalma S Lima-Junior1,2, Diego L Costa2, Vanessa Carregaro2, Larissa D Cunha1, Alexandre L N Silva1, Tiago W P Mineo2,7, Fredy R S Gutierrez2,7, Maria Bellio3, Karina R Bortoluci4, Richard A Flavell5,6, Marcelo T Bozza3, João S Silva2 & Dario S Zamboni1

Parasites of the Leishmania genus are the causative agents of leishmaniasis in humans, a disease that affects more than 12 million people worldwide. These parasites replicate intracellularly in macrophages, and the primary mechanisms underlying host resistance involve the production of nitric oxide (NO). In this study we show that the Nlrp3 inflammasome is activated in response to Leishmania infection and is important for the restriction of parasite replication both in macrophages and in vivo as demonstrated through the infection of inflammasome-deficient mice with Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis and Leishmania infantum chagasi. Inflammasome-driven interleukin-1b (IL-1b) production facilitated host resistance to infection, as signaling through IL-1 receptor (IL-1R) and MyD88 was necessary and sufficient to trigger inducible nitric oxide synthase (NOS2)-mediated production of NO. In this manuscript we identify a major signaling platform for host resistance to Leishmania spp. infection and describe the molecular mechanisms underlying Leishmania-induced NO production.

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http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nm.3221

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910 VOLUME 19 | NUMBER 7 | JULY 2013 nature medicine

RESULTSThe inflammasome is activated in response to L. amazonensisAlthough caspase-1 is activated in macrophages in response to sev-eral intracellular and extracellular bacterial pathogens, the ability of parasites from the Leishmania genus to trigger caspase-1 activation is unknown. To determine whether macrophages activate caspase-1 in response to L. amazonensis infection, we infected bone marrow–derived macrophages (BMDMs) from C57BL/6 mice with station-ary-phase forms of L. amazonensis and directly measured caspase-1 activation using a fluorescent dye that stains the active form of cas-pase-1 (FAM-YVAD)20. We found that L. amazonensis infection trig-gered caspase-1 activation in C57BL/6 but not in caspase-1–deficient (Casp1−/−) BMDMs (Fig. 1a–c). The secretion of IL-1β is depend-ent on active caspase-1. We observed that BMDMs obtained from C57BL/6 mice, but not those from Casp1−/− mice, produced signifi-cant amounts of IL-1β in response to L. amazonensis infection in cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS) or interferon-γ (IFN-γ) (Fig. 1d,e). To further evaluate whether caspase-1 activation is induced in response to live parasites, we infected BMDMs with live or nonviable (dead) L. amazonensis parasites and measured IL-1β secretion. Live L. amazonensis effectively induced IL-1β secretion, whereas nonviable parasites (boiled, inactivated with ultraviolet light or formaldehyde fixed) did not induce IL-1β secretion (Fig. 1f). We also observed these effects in response to infection with metacyclic forms of the parasite (Fig. 1g).

To determine which NLR is responsible for caspase-1 activation in response to L. amazonensis infection, we performed experiments using BMDMs deficient in different inflammasome components. The FAM-YVAD assay revealed that BMDMs from Pycard−/−, Casp1−/− and Nlrp3−/− mice induced neither caspase-1 activation (Fig. 2a,b) nor IL-1β secretion after infection with L. amazonensis (Fig. 2c). In this experiment we also used a combination of LPS and nigericin, which induces activation of the Nlrp3 inflammasome16,17. Moreover, we per-formed western blot assays with BMDMs treated with nigericin or L. amazonensis to further confirm the activation of the Nlrp3 inflam-masome in response to L. amazonensis infection. We observed that

L. amazonensis infection induced the processing and secretion of the caspase-1 subunit p20 and the IL-1β subunit p19 in a Nlrp3-dependent, Asc-dependent and caspase-1–dependent manner (Fig. 2d). The reduced amount of IL-1β production and caspase-1 cleavage in L. amazonensis–infected macrophages as compared to cells treated with LPS and nigericin supports the hypothesis that L. amazonen-sis may modulate and perhaps inhibit inflammasome activation in some instances, a feature that will require further investigation. Nonetheless, the inflammasome is engaged in response to Leishmania infection, and to further evaluate inflammasome assembly in situ, we transduced BMDMs with a retroviral construct encoding GFP-tagged Asc (Asc-GFP). We infected the transduced BMDMs with L. amazonensis and found formation of Asc foci in the infected cells at 2 and 6 h after infection with either stationary-phase or metacyclic forms of L. amazonensis (Fig. 2e–h), thus indicating the assembly of the inflammasome in response to L. amazonensis infection.

Potassium efflux is crucial for the activation of the Nlrp3 inflam-masome16,21. Moreover, CA-074-ME (a compound that inhibits both cathepsin B and cathepsin L) and glibenclamide (a drug that inhibits ATP-sensitive potassium channels) both inhibit activation of the Nlrp3 inflammasome15,22,23. To further investigate the role of Nlrp3 in the activation of caspase-1 in response to L. amazonensis infection, we determined whether glibenclamide, CA-074-ME and extracellular K+ interfere with caspase-1 activation during the macrophage response to L. amazonensis infection. FAM-YVAD+ staining and IL-1β secre-tion demonstrated that the addition of glibenclamide, CA-074-ME or potassium chloride (KCl), but not sodium chloride (NaCl), impaired L. amazonensis–induced caspase-1 activation (Supplementary Fig. 1). Taken together these results indicate that potassium, cathepsins and K+ channels are all required for L. amazonensis–induced Nlrp3 inflam-masome activation, thus supporting a key role for this inflammasome in caspase-1 activation in BMDMs infected with L. amazonensis.

Inflammasome facilitates restriction of Leishmania infectionTo evaluate the role of the inflammasome in the restriction of L. amazonensis replication in BMDMs, we measured parasite

C57BL/6a

0 102 103

FAM-YVAD104 105

NI6 h12 h24 h48 h

FAM-YVAD0 102 103 104 105

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C57BL/6Casp1–/–Figure 1 Caspase-1 is activated in response to L. amazonensis infection. (a) Flow cytometry

analysis of C57BL/6 and Casp1−/− BMDMs infected with L. amazonensis at an MOI of 10 at 6 (green), 12 (purple), 24 (cyan) and 48 h (blue) of infection. The red-filled histograms indicate BMDMs that were not infected (NI). (b) Quantification of the average percentages of FAM-YVAD+ cells in the experiment in a. L.a, L. amazonensis. (c) Percentage of FAM-YVAD+ C57BL/6 and Casp1−/− BMDMs infected at an MOI of 1, 5, 10 or 20 for 24 h. (d,e) IL-1β production assessed by ELISA of C57BL/6 and Casp1−/− BMDMs stimulated for 6 h with 500 ng ml−1 LPS (d) or 10 ng ml−1 IFN-γ (e) and subsequently infected with L. amazonensis for 42 h. (f) IL-1β production assessed by ELISA of C57BL/6 BMDMs pretreated for 6 h with 500 ng ml−1 LPS and left uninfected or treated with live, irradiated, formaldehyde (formald.) fixed or boiled L. amazonensis at an MOI of 10 after 42 h of infection. (g) IL-1β production assessed by ELISA of C57BL/6 and Casp1−/− BMDMs stimulated for 6 h with 500 ng ml−1 LPS and infected with metacyclic forms of L. amazonensis at an MOI of 1 for 42 h. One representative of three (a–f) or two (g) independent experiments performed in triplicate is shown. Error bars (b–g), s.d. *P < 0.05 (two-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni’s post test (b,c) or Student’s t test (d–g)) compared to Casp1−/− (b–e,g) or NI (f).

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replication in BMDMs obtained from C57BL/6 or inflammasome- deficient mice. We also used BMDMs from Nos2−/− mice because NOS2-induced NO is essential for the restriction of parasite growth8,24,25. Although parasite internalization by the BMDMs was similar after 1 h of infection, the BMDMs from Pycard−/−, Casp1−/−, Nlrp3−/− and Nos2−/− mice had higher percentages of infected cells (Fig. 3a) and higher numbers of intracellular amastigotes (Fig. 3b,c) after 24, 48, 72 and 96 h of infection compared to C57BL/6 BMDMs. We performed similar experiments using metacyclic forms of L. amazonensis and found that the parasites replicated more efficiently in cells deficient in the inflammasome or NOS2 (Fig. 3d). To further evaluate L. amazonensis replication in BMDMs, we used GFP-expressing L. amazonensis (La-GFP+) to quantify parasite replication using flow cytometry. To validate the effectiveness of this method, we infected BMDMs with different multiplicities of infection (MOIs) of La-GFP+ for 3 h and determined the percentage of GFP+ BMDMs using flow cytometry. We observed a direct correlation between the MOI used for infection, the percentage of GFP+ BMDMs and the integrated mean fluorescence intensity (iMFI) of the infected BMDMs (Supplementary Fig. 2). We then used the La-GFP+ parasites to evaluate the role of the inflam-masome in the restriction of intracellular parasite replication using flow cytometry. We observed that the parasite loads in the Nlrp3−/−, Pycard−/− and Casp1−/− BMDMs were significantly higher than those in C57BL/6 BMDMs and were similar to those in Nos2−/− BMDMs, as demonstrated by the percentage of GFP+ BMDMs at 48 h after infec-tion (Fig. 3e) and the MFIs of the GFP+ BMDMs during a 96-h growth kinetics analysis (Fig. 3f). We further investigated whether treatment of the BMDMs with the inhibitors described above affects the restric-tion of parasite replication. We observed that the C57BL/6 BMDMs treated with CA-074-ME, glibenclamide or KCl, but not NaCl, were more susceptible to L. amazonensis replication, as demonstrated by the percentage of GFP+ BMDMs and the iMFIs of the infected BMDMs; however, these treatments did not alter parasite replication in Pycard−/− or Casp1−/− cells (Fig. 3g,h). Taken together, these results indicate that the activation of the Nlrp3 inflammasome is important for the restric-tion of L. amazonensis replication in BMDMs.

To evaluate the role of the inflammasome in infection of mice, we used an ear model of infection26. We observed a significant increase in the size of the lesions and skin necroses in the ears of Nlrp3−/−,

Pycard−/− and Casp1−/− mice compared to those in the ears of C57BL/6 mice (Fig. 4a,b). Consistent with the increased lesion size, Nlrp3−/−, Pycard−/− and Casp1−/− mice also harbored increased parasite loads in the ears, lymph nodes and spleen as measured by a limiting dilu-tion of organ homogenates after 8 weeks of infection (Fig. 4c). We obtained similar results in mice infected with metacyclic promas-tigotes of L. amazonensis, the infective forms of the parasite that are injected through insect bites in natural infections (Fig. 4d–f). We also performed infections in an A/J mouse background, which is resistant to L. amazonensis27, to evaluate whether the observed phenomena were limited to the mouse background chosen for our experimental model. Therefore, we generated caspase-1–deficient mice in an A/J background (A/J-Casp1−/−) by backcrossing mice carrying the caspase-1–deficient allele with A/J mice for ten generations. The experiments performed with this mouse strain indicated that the caspase-1 deficiency in A/J-Casp1−/− mice increased lesion develop-ment, skin necrosis and parasite load compared to infected A/J control mice (Fig. 4g–i). Taken together, these results suggest that regardless of the mouse background and parasite forms used for infection, the inflammasome is important for the efficient restriction of parasite infection in cutaneous leishmaniasis.

To investigate inflammasome activation in infected mice, we quantified the production of IL-1β in cells obtained from L. amazonensis–infected mice. We found substantial production of IL-1β in lymph-node and spleen cells obtained from C57BL/6 mice infected for 2 or 5 weeks. The production of IL-1β detected in these ex vivo experiments was dependent on the inflammasome, as we detected no IL-1β in the supernatants of cultures of cells obtained from infected Pycard−/− or Casp1−/− mice (Supplementary Fig. 3).

Inflammasome triggers NO-mediated resistance to infectionWe assessed the role of IL-1β in host resistance to L. amazonensis infection because the processing of this cytokine in BMDMs is dependent strictly on the inflammasome and because polymor-phisms within the human IL1B gene are associated with severity of disease28,29. We quantified parasite replication in C57BL/6 and inflammasome-deficient BMDMs treated with different concentra-tions of an IL-1R antagonist (IL-1Ra)30. We observed that inhibiting endogenous IL-1R signaling resulted in a dose-dependent increase

a30

NI

NINig

L.a* *

*

* * *

*

*

*

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NI L.a

NI L.a

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Casp-1 p20

Casp-1 p45

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C57BL/

6

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–

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–

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–

C57BL/

6LP

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L.a

LPS +

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Pycard–/

–

Casp1–/

–

Nlrp3–/

–

C57BL/6Pycard–/–

Casp1–/–

Nlrp3–/–

C57BL/

6

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–

Casp1–/

–

Nlrp3–/

–

6,000

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2,000

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0

1,200400300200100

0

1086420

10

8

6

4

2

0

NIL.a

Figure 2 The Nlrp3 inflammasome is required for caspase-1 activation in macrophages infected with L. amazonensis. (a,b) Flow cytometry analysis of FAM-YVAD staining of C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nlrp3−/− BMDMs infected with stationary-phase L. amazonensis at an MOI of 10 for 42 h. (c) IL-1β production from C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nlrp3−/− BMDMs stimulated for 6 h with LPS (500 ng ml−1) and infected with stationary-phase L. amazonensis at an MOI of 10 for 42 h or treated with 20 µM nigericin (Nig) for 1 h. (d) Immunoblotting for caspase-1 p20 and IL-1β p19 in cell-culture supernatants (SN) and cell lysates (Lys) of BMDMs stimulated for 6 h with LPS (500 ng ml−1) and infected or not infected with stationary-phase L. amazonensis at an MOI of 10 for 42 h. (e–h) Immunofluorescence and quantification of Casp1−/− BMDMs transduced with a retroviral construct encoding Asc-GFP and infected with stationary-phase L. amazonensis at an MOI of 5 (f,g) or with metacyclic promastigotes at an MOI of 3 (h). (e) Uninfected Casp1−/− BMDMs expressing Asc-GFP dispersed in the cytoplasm (green). (f) BMDMs infected with L. amazonensis (red) for 2 h showing the Asc-GFP foci (green). (g,h) Quantification of the percentage of Asc foci at 2, 6 and 24 h after infection of the BMDMs. One representative of three experiments performed in triplicate is shown throughout. Error bars (a–c,g,h), s.d. *P < 0.05 (Student’s t test (a–c) or one-way ANOVA with Bonferroni’s post test (g,h)) compared to NI (a,b,g,h) or similarly treated Pycard−/−, Casp1−/− and Nlrp3−/− BMDMs (c).

npg

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eric

a, In

c. A

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hts

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.

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in the susceptibility of C57BL/6 BMDMs to infection; in contrast, the susceptibility of Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− BMDMs was not affected by IL-1Ra treatment (Fig. 5a). To evaluate the role of IL-1β in the leishmanicidal activity of BMDMs, we treated C57BL/6 BMDMs with recombinant IL-1β or IFN-γ and measured parasite replication. We observed a dose-dependent restriction of parasite replication in BMDMs treated with either IL-1β or IFN-γ (Fig. 5b). To address whether the leishmanicidal activity induced through IL-1β required components of the inflammasome, we treated BMDMs from C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− mice with exogenous IL-1β and measured parasite replication. We observed that the addi-tion of exogenous IL-1β triggered pronounced leishmanicidal activity in C57BL/6 BMDMs and, to a lesser extent, in BMDMs obtained from inflammasome-deficient mice (Fig. 5c). To determine whether IL-1β contributes to NO production in infected BMDMs, we measured the

production of nitrite in the supernatants of L. amazonensis–infected C57BL/6 BMDMs treated with IL-1β or IFN-γ. We observed a dose-dependent production of NO2

− in response to either IFN-γ or IL-1β (Fig. 5d). BMDMs from Pycard−/− and Casp1−/− mice, but not Nos2−/− mice, produced NO in response to IL-1β (Fig. 5e). Notably, the addi-tion of exogenous IL-1β only partially restored the leishmanicidal activity (and NO production) in inflammasome-deficient BMDMs (Fig. 5c,e). Thus, we speculate that the inflammasome is involved in additional processes leading to macrophage resistance.

Because IFN-γ is crucial for NO production31–33, we investigated the requirement of the inflammasome for IFN-γ production in BMDMs infected with L. amazonensis. We infected BMDMs from C57BL/6 and Casp1−/− mice with L. amazonensis and measured the expression of IFN-γ using quantitative RT-PCR. We observed that caspase-1–deficient BMDMs had impaired expression of Nos2 and

g90

80

70

60

50

40

C57BL/

6

Pycard–/

–

Casp1–/

–

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cent

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***

C57BL/

6

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–

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–

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***

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6

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–

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–

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cent

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Nlrp3–/–

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103 )


Casp1–/–

Nlrp3–/–

Nos2–/–

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Nlrp3–/–

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l

Pycard–/–

Casp1–/–

Nlrp3–/–

Nos2–/–

C57BL/6

Medium CA-074-MEh

Gliben KCI NaCIFigure 3 L. amazonensis multiplication is increased in macrophages from inflammasome- deficient mice. (a–d) Giemsa staining of C57BL/6, Nlrp3−/−, Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− BMDMs infected with stationary-phase L. amazonensis at an MOI of 10 (a–c) or metacyclic promastigotes at an MOI of 1 (d) for 1 h, washed and incubated for 24, 48, 72 or 96 h. (e,f) Flow cytometry analysis of BMDMs infected for 48 h (e) or for 24, 48, 72 or 96 h (f) with stationary-phase L. amazonensis constitutively expressing GFP (La-GFP+). (g,h) Flow cytometry analysis of C57BL/6 BMDMs pretreated with CA-074-ME (100 µM), glibenclamide (Gliben; 100 µM), KCl (100 mM) or NaCl (100 mM) and subsequently incubated with La-GFP+ at an MOI of 10 for 48 h. One representative of three independent experiments performed in triplicate is shown throughout. Error bars (a–h), s.d. *P < 0.05 (two-way ANOVA with Bonferroni’s post test (a–d,f) or Student’s t test (e,g,h)) for Pycard−/−, Casp1−/−, Nlrp3−/− and Nos2−/− compared to C57BL/6 (a–f) or medium (g,h).

C57BL/6 Pycard–/–

Pycard–/

–

Pycard–/

–

Pycard–/

–

Pycard–/

–

Pycard–/

–

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C57BL/

6

Casp1–/

–

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–

C57BL/6 Casp1–/– Nlrp3–/–

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Casp1–/–

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A/J

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–

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**

* *2.0

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Time of infection (weeks)4 5 6 7 8

C57BL/6

Casp1–/–

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(mm

)

***

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1 2 3Time of infection (weeks)

4 5 6 7 8

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6

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–

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6

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–

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* * * *3210

87654

5.04.54.03.53.02.5

C57BL/

6

Casp1–/

–

Nlrp3–/

–

5432

C57BL/

6

Casp1–/

–

Nlrp3–/

–

3210

Figure 4 The Nlrp3 inflammasome is important for the in vivo restriction of L. amazonensis infection. (a–c) Quantification of lesion development (a), representative images of ear lesions after 8 weeks of infection (b) and limiting dilution analysis of parasite burden in the infected ear, draining lymph node and spleen at 8 weeks of infection (c) in C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nlrp3−/− mice in the C57BL/6 genetic background infected in the ear dermis with 106 stationary-phase L. amazonensis promastigotes. (d–f) As in a–c but using infection with 105 metacyclic promastigotes of L. amazonensis. (g–i) As in a–c but using A/J and A/J-Casp1−/− mice infected in the ear dermis with 106 stationary-phase L. amazonensis promastigotes. One representative of six (a–c) or three (d–i) independent experiments using four or five mice per group is shown (with the symbols in c, f and i each representing an individual mouse). Error bars (a,d,g), s.d. *P < 0.05 (two-way ANOVA with Bonferroni’s post test (a,d,g) or Student’s t test (c,f,i)) for Pycard−/−, Casp1−/− and Nlrp3−/− compared to C57BL/6 (a,c,d,f) or A/J-Casp1−/− compared to A/J (g,i).

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Ifng, but not Tnfa (tumor necrosis factor-α) RNA, in response to infection (Fig. 5f). These data indicate that the inflammasome is required for the efficient production of IFN-γ in BMDMs.

Next, we treated BMDMs with IFN-γ in combination with IL-1β and observed that the addition of both cytokines fully complemented Casp1–/– BMDMs for NO production and restriction of L. amazonensis infection (Fig. 5g). Accordingly, when we added antibodies specific to IFN-γ to the cultures (that is, blocking the endogenous IFN-γ), IL-1β alone induced similar production of NO and restriction of L. amazonensis infection in C57BL/6 and Casp1–/– BMDMs (Fig. 5g). To further evaluate the role of NO in leishmanicidal mechanisms induced through IL-1β and inflammasomes, we used the inhibitors L-NMMA and aminoguanidine to block the endogenous production of NO in L. amazonensis–infected BMDMs. We observed that both

drugs affected the leishmanicidal activity of C57BL/6 BMDMs but did not alter the parasitism of cells deficient in Asc, Casp1 or Nos2 (Fig. 5h,i). Collectively these data indicate that the inflammasome is important for NO-dependent restriction of parasite replication in BMDMs through mechanisms involving the production of IL-1β and IFN-γ.

The role of the inflammasome in the induction of NO produc-tion in response to L. amazonensis was also evident ex vivo. Cells obtained from the lymph nodes and spleens of infected C57BL/6, but not Pycard−/− or Casp1−/−, mice induced NOS2 expression and NO production after stimulation with L. amazonensis antigens (Supplementary Fig. 4a–d). This process was dependent on the IFN-γ produced in response to the L. amazonensis antigens, as the ex vivo cultures from Ifng−/− mice did not produce IL-1β and NO in response to antigen stimulation (Supplementary Fig. 5).

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*

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NO

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cent

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*

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Cytokines (ng ml–1)

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10 100


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Casp1–/–

Nos2–/–

C57BL/6Casp1–/–

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cent

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C57BL/6Casp1–/–

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cent

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ofG

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2.5

* * *

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cent

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000

* * *


Casp1–/–

Nos2–/–


Casp1–/–

Nos2–/–

Figure 5 IL-1β and IFN-γ contribute to inflammasome-dependent parasite elimination through NO-dependent mechanisms. (a) Flow cytometry analysis of C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− BMDMs pretreated for 3 h with IL-1Ra and infected with stationary- phase La-GFP+ at an MOI of 10 for 42 h. (b,c) Flow cytometry analysis of C57BL/6 (b) and C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− BMDMs treated or not with different concentrations of IFN-γ or IL-1β for 6 h and infected with La-GFP+ at an MOI of 10 for 42 h. (d,e) Nitrite concentrations, estimated by Griess assay, in the supernatants from the BMDMs cultures in b and c, respectively. (f) Expression of Ifng, Nos2 and Tnfa in C57BL/6 and Casp1−/− BMDMs infected with stationary-phase L. amazonensis promastigotes at an MOI of 10 for 12 h. The values are shown as the average fold change over uninfected controls. (g) Flow cytometry analysis and nitrite production of C57BL/6 and Casp1−/− BMDMs treated or not with the indicated concentrations of IFN-γ, IL-1β or both for 6 h and subsequently infected with La-GFP+ at an MOI of 10 for 42 h. Where indicated, 2 µg ml−1 of antibody to IFN-γ (anti–IFN-γ) was added to the cultures. (h,i) Flow cytometry analysis of C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− BMDMs pretreated for 3 h with different concentrations of L-NMMA (h) or aminoguanidine (Ag) (i) and subsequently infected with La-GFP+ at an MOI of 10 for 42 h. One representative of four (a), three (c,e–i) or two (b,d) independent experiments performed in triplicate is shown. Error bars (a–i), s.d. *P < 0.05 (two-way ANOVA with Bonferroni’s post test (a,c,e,g–i), one-way ANOVA with Bonferroni’s post test (b,d) or Student’s t test (f)) for Pycard−/−, Casp1−/− and Nos2−/− compared to C57BL/6 (a,h,i) or for Casp1−/− compared to C57BL/6 (f,g) or untreated cultures (b–e).

d Pycard–/– Casp1–/– ll1r–/– Myd88–/–C57BL/6

1 cm

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–

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–

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104 )

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–

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C57BL/

6

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–

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–

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–

Myd88

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** *

*

C57BL/

6

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–

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–

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**

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01 2 3 4 5 6 7 8

Lesi

on s

ize

(mm

)

Time of infection (weeks)

Pycard–/–

Casp1–/–

ll1r–/–

Myd88–/–

C57BL/6

Figure 6 IL-1R signaling is important for the control of L. amazonensis infection in macrophages and in vivo. (a,b) Flow cytometry analysis of C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/−, Il1r−/− and Myd88−/− BMDMs incubated for 48 h with stationary-phase La-GFP+ at an MOI of 10. One representative of two independent experiments performed in triplicate is shown. (c) Lesion development in C57BL/6, Pycard−/−, Casp1−/− Il1r−/− and Myd88−/− mice infected in the ear dermis with 106 stationary-phase L. amazonensis promastigotes. (d) Representative images of ear lesions after 8 weeks of infection in the mice in c. (e) Limiting dilution analysis of parasite burden in the infected ear, draining lymph node and spleen measured 8 weeks after infection in the mice in c. One representative of three independent experiments using five mice per group is shown in c and e (each symbol in e represents an individual mouse). Error bars (a–c), s.d. *P < 0.05 (Student’s t test (a,b,e) or two-way ANOVA with Bonferroni’s post test (c)) for Pycard−/−, Casp1−/−, Il1r−/− and Myd88−/− compared to C57BL/6.

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To further investigate the role of IL-1 signaling in the restriction of macrophage infection, we performed experiments with BMDMs from mice deficient in IL-1R or MyD88, which are both required for IL-1 signaling. We observed that the BMDMs obtained from Il1r−/− and Myd88−/−mice were as susceptible to infection as those obtained from Pycard−/− and Casp1−/− mice (Fig. 6a,b). Accordingly, Il1r−/− and Myd88−/− mice were as susceptible to infection as mice deficient in Asc and Casp1 (Fig. 6c–e).

We then examined the activation and role of the inflammasome in response to infection with other species of the Leishmania genus, namely Leishmania (Leishmania) major, L. (V.) braziliensis and L. (L.) infantum chagasi. FAM-YVAD staining and IL-1β production showed that the inflammasome is activated in BMDMs infected with L. major, L. braziliensis or L. amazonensis (Supplementary Fig. 6a,b). However, we detected no difference in lesion development or parasite burden in the ears and lymph nodes of C57BL/6 and inflammasome-deficient mice after intradermal inoculation of L. major (Supplementary Fig. 7). In contrast, the inflammasome was important for restric-tion of in vivo infection with L. braziliensis or L. infantum chagasi (Supplementary Fig. 8). Taken together, these results indicate that activation of the inflammasome is an important process in host resist-ance against infection with several species of the Leishmania genus.

DISCUSSIONThe generation of an appropriate immune response, which requires an effective innate immune recognition of parasites, is essential for human resistance against infectious diseases, including leishmania-sis. Although MyD88-dependent Toll-like receptor (TLR) signaling has been reported to be important for parasite recognition34,35, the species of Leishmania are known to be immunologically silent and bypass recognition by innate immune receptors during infection36–39. In this study we identified the inflammasome as a crucial innate immune platform for the recognition of Leishmania spp. Notably, the activation of the inflammasome leads to autonomous macro-phage mechanisms that culminate with the restriction of intracel-lular parasite replication. These processes involve the regulation of IFN-γ and processing of IL-1β, which facilitates the expression of NOS2, an enzyme that is required for NO-mediated restriction of Leishmania replication in macrophages6–8. These data explain recent reports indicating that IL-1β signaling is crucial for the determination of the severity of disease in humans28,29. Polymorphisms within the human IL1B gene are associated with severity of disease, which can lead to either the development of severe cases of visceral leishmaniasis in patients infected with L. infantum chagasi or uncontrolled diffuse forms of cutaneous leishmaniasis in patients infected with Leishmania mexicana28,29. In this study we found that macrophages and mice that were deficient in IL-1R were just as susceptible to infection as those deficient in Casp1, Asc or Nlrp3, which suggests that IL-1 signaling is important for the inflammasome-dependent restriction of Leishmania spp. replication.

Although the inflammasome is activated in BMDMs infected with L. major, it was dispensable for host resistance to infection. It is important to highlight that the C57BL/6 background is the canonical restrictive background for L. major infection (reviewed in ref. 40). Thus, in such a restrictive genetic background, additional resistance mechanisms may be sufficient to limit parasite replication regardless of the presence of the inflammasome–IL-1 axis. The dispensable role of the inflammasome in the restriction of L. major infection corrobo-rates previous reports indicating that IL-1 signaling is dispensable in resistance against L. major infection in mice with the C57BL/6 genetic

background41–43. In this context, future studies will be important to test the role of the inflammasome and IL-1 signaling in a mouse back-ground that is susceptible to L. major infection. Nonetheless, regard-less of genetic background, infections performed with highly virulent species, which bypass the C57BL/6-mediated natural resistance to infection, supported an important role of the inflammasome and IL-1 signaling in host resistance to infection. Our data favor a model that couples molecules and cellular process that are known to be important in host resistance, including IFN-γ, NO, MyD88 and IL-1 signaling. The identification of this pivotal pathway in host resistance to leish-maniasis may enable the development of future therapeutic strate-gies for the modulation of the inflammasome, IL-1 signaling or both to facilitate the treatment of chronic, life-threatening and neglected infectious diseases such as leishmaniasis.

METhODSMethods and any associated references are available in the online version of the paper.

Note: Supplementary information is available in the online version of the paper.

ACKNoWLeDGMeNTSWe are grateful to M. Nakamura for technical assistance, F. Cunha (Universidade de São Paulo, Brazil) for providing IL-1Ra and V. Dixit (Genentech, USA) for providing us with the Nlrp3−/− mice and the antibody to caspase-1 p20. This work was supported by grants from Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq), Núcleo de Apoio à Pesquisa em Doenças Inflamatórias (NAPDIN, grant 11.1.21625.01.0), Fundação de Amparo ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FAEPA), Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases/World Health Organization (TDR/WHO, grant A60999 to D.S.Z.) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, grant 2006/52867-4 to D.S.Z.). D.L.C., V.C., L.D.C., A.L.N.S. and D.S.L.-J. (grant 2009/05054-6) are supported by fellowships from FAPESP. R.A.F. is an Investigator of the Howard Hughes Medical Institute. D.S.Z., M.B., M.T.B. and J.S.S. are Research Fellows from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil.

AUTHoR CoNTRIBUTIoNSD.S.L.-J. designed and performed experiments, analyzed data, generated figures and wrote the manuscript. D.L.C., V.C., L.D.C. and A.L.N.S. designed and performed experiments and analyzed data. T.W.P.M., F.R.S.G. and M.T.B. helped with data interpretation, discussed the hypotheses and participated in manuscript preparation. M.B., K.R.B., R.A.F. and J.S.S. provided reagents and discussed the hypotheses. D.S.Z. supervised the project, designed the experiments, helped with data interpretation, participated in data analysis and wrote the manuscript.

CoMPeTING FINANCIAL INTeReSTSThe authors declare no competing financial interests.

Reprints and permissions information is available online at http://www.nature.com/reprints/index.html.

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ONLINE METhODSAnimals. Six- to 8-week-old-female mice were used for the infection experi-ments. Pycard−/− and Casp1−/− mice were previously described and back-crossed to C57BL/6 mice for nine and eight generations, respectively, to ensure similar genetic backgrounds44,45. The Nlrp3−/− mice were generated in the C57BL/6 background16. A/J, C57BL/6, Myd88−/−, Il1r−/− and Ifng−/− mice in the C57BL/6 background were obtained from the animal facilities of the Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, FMRP/USP. Caspase-1– deficient mice in an A/J background (A/J-Casp1−/− mice) were constructed by backcrossing mice carrying the caspase-1–deficient allele with A/J mice for ten generations. The mice were bred and maintained under specific patho-gen-free conditions at the animal facilities of the University of São Paulo, FMRP/USP. All of the mice experiments were conducted according to the guidelines of the institutional committee for animal care at the Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, FMRP/USP.

Parasites and infection. The parasite used were L. (L.) amazonensis PH8 strain (IFLA/BR/67/PH8), L. (L.) amazonensis 73M2269 strain (MHOM/BR/73M2269), which constitutively expresses GFP (La-GFP+), L. (V.) braziliensis M2903 strain (MHOM/BR/75/M2903), L. (L.) major LV39 strain (MRHO/SU/59/P) and L. (L.) infantum chagasi (HU-USF 8). The parasites were cultured at 26 °C in Schneider’s Drosophila medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), pH 7.0, supplemented with 20% heat-inactivated FCS (GIBCO BRL), 100 U ml−1 peni-cillin G potassium (USB Corporation, Cleveland, OH, USA), 2 mM l-glutamine and 2% human urine, pH 6.5. After seven culture passages, the parasites were serially passed in C57BL/6 mice to ensure that their virulence was maintained. The infective-stage metacyclic promastigotes of L. amazonensis were isolated from stationary cultures through density-gradient centrifugation as described previously46. For the L. amazonensis, L. braziliensis and L. major infections, the mice were infected with either 1 × 106 stationary-phase or 1 × 105 metacyclic promastigotes, which were suspended in 10 µl of PBS, through an intradermal injection into the left ear. The ear lesions were measured weekly with a dial gauge caliper and compared to the thickness of the uninfected contralateral ear. For the L. infantum chagasi infection, the mice were inoculated with 1 × 107 stationary- phase promastigotes through the intraperitoneal route. The parasite burdens were determined in the ear, spleen and liver and in retromaxilar lymph nodes draining from the side of the infection as described previously47.

BMDMs and infection. BMDMs were prepared as previously described48. Briefly, isolated femurs and tibia were flushed with PBS, and precursor cells were cultured in RPMI supplemented with 30% L929 cell-conditioned medium and 20% FBS48. After 7 d in culture, mature BMDMs were harvested and infected with stationary-phase promastigotes at an MOI of 10 or with metacyclic pro-mastigotes at an MOI of 1 (unless otherwise indicated). After 6 h of infection, the free parasites were washed, and fresh medium was added to the infected cultures. In some experiments, the free parasites were washed, and fresh medium was added to the infected cultures after 1 h of infection. The leishmanicidal activity of the cells was determined at 24, 48, 72 or 96 h after infection by flow cytometry using a FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences) and count-ing the Giemsa-stained cytospin preparations under a light microscope with a ×40 objective. The flow cytometric data were analyzed using FlowJo software (Tree Star). In this analysis, two parameters were considered: the percentage of infected cells and the iMFI, which reflects the total functional response toward the infection and is calculated by multiplying the number of infected cells by the MFI49. In the analysis of Giemsa staining, the infection rate was determined by scoring the infected and uninfected cells (100–200 BMDMs) and the number of intracellular amastigotes per infected BMDM. Where indicated, the BMDMs were pretreated for 6 h with recombinant mouse IL-1β (eBioscience) or IFN-γ (Invitrogen) in the range of 0.1–1000 ng ml−1 or with both cytokines at the indicated concentrations. For the inhibition of IL-1R, BMDMs were pretreated with 0.1–100 µg ml−1 of IL-1Ra30 for 3 h before infection for 48 h. For the inhibition of IFN-γ, BMDMs were pretreated with 2 µg ml−1 of antibodies to IFN-γ (BioXCell, clone XMG1.2) with or without IL-1β (100 ng ml−1) for 6 h and subsequently infected with L. amazonensis for 42 h. For the inhibition of cathepsins and the K+ efflux, the BMDMs were primed for 4 h with 500 ng ml−1

ultrapure LPS (InvivoGen, tlrl-peklps), treated with glibenclamide, CA-074-ME, KCl or NaCl at the indicated concentrations for 2 h and subsequently stimulated with L. amazonensis for 42 h.

ELISA and nitrite determination. IL-1β and IFN-γ production was assessed using IL-1β (BD Biosciences) and IFN-γ (BD Biosciences) ELISA kits. In vitro IL-1β production was analyzed in supernatants harvested from the BMDMs that were prestimulated with 500 ng ml−1 of ultrapure LPS (InvivoGen, tlrl-peklps) or 10 ng ml−1 of IFN-γ (Invitrogen) for 6 h and subsequently infected with stationary- phase promastigotes at an MOI of 10 or metacyclic promastigotes at an MOI of 1 for 42 h. For the ex vivo analysis of IL-1β and IFN-γ production, single-cell suspensions were prepared from the lymph nodes or spleen of mice infected for 2 or 5 weeks. The cell concentrations were adjusted to 5 × 106 cells ml−1 and plated at 0.5 ml per well in 48-well tissue-culture plates. The cells were stimulated with 50 µg ml−1 of L. amazonensis particulate antigens. The supernatants were harvested after 48 h, and the amounts of IL-1β and IFN-γ were measured using ELISA. NO2

− accumulation, as an indicator of NO production, was measured using Griess reagent50.

Endogenous caspase-1 staining using FAM-YVAD–fluoromethyl ketone (FMK). BMDMs were cultured and infected with stationary-phase L. amazonensis at an MOI of 10. After 6, 12, 24 or 48 h of infection, the BMDMs were stained for 1 h with FAM-YVAD-FMK (Immunochemistry Technologies) as recommended by the manufacturer’s instructions. Active caspase-1 was then measured by flow cytometry. The data were acquired on a FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences) and analyzed with FlowJo software (Tree Star).

Western blot analyses. A total of 5 × 106 BMDMs were seeded per well, primed with 500 ng ml−1 ultrapure LPS (InvivoGen, tlrl-peklps) for 4 h and then infected with L. amazonensis for 48 h or stimulated with 20 µM nigericin (Sigma-Aldrich) for 40 min in the absence of FBS. The supernatants were collected and pre-cipitated with 50% trichloroacetic acid and acetone. After their clarification by centrifugation, the cells were lysed in RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoxycholate and 0.1% SDS) in the presence of a protease inhibitor cocktail (Roche). The lysates and superna-tants were resuspended in Laemmli buffer, boiled, resolved by SDS-PAGE and transferred (Semidry Transfer Cell, Bio-Rad) to a 0.22-µm nitrocellulose mem-brane (GE Healthcare). The membranes were blocked in Tris-buffered saline (TBS) with 0.01% Tween-20 and 5% nonfat dry milk. The rat monoclonal anti-body to caspase-1 p20 (1:250, Genentech, 4B4), the goat antibody to IL-1β p-17 (1:200, Sigma Aldrich, I3767) and specific horseradish peroxidase–conjugated antibodies (1:3,000, KPL, 14-16-06 and 14-13-06) were diluted in blocking buffer for the incubations. The enhanced chemiluminescence luminol reagent (GE Healthcare) was used for antibody detection.

Retroviral transduction and quantification of Asc foci. Mouse Asc was cloned into the pEGFP(N2) vector (Clontech) using XhoI and BamHI restriction sites. Asc-GFP and GFP were cloned into the pMSCV2.2 mouse-specific retroviral vector (Clontech). The pCL vector system51 was used for packaging retroviruses in transfected monolayers of Peak cells (ATCC CRL-2828, maintained in RPMI 1640 with 10% FBS). The supernatant of the Peak cells was collected at 3 d after transfection, passed through a 0.45-µm filter and used for BMDM transduction. BMDMs were obtained from the femurs of Casp1−/− mice and seeded at 5 × 105 cells per well in differentiation medium (RPMI 1640 medium supplemented with 30% L929 cell-conditioned medium, 20% FBS, 100 U ml−1 penicillin and 100 µg ml−1 streptomycin) as previously described48. After differentiation for 3 d, the BMDMs were harvested and spun down, and the medium was replen-ished with retroviral-containing Peak cell supernatants complemented with RPMI 1640 containing 20% FBS and 25% LCCM. The BMDMs were fed with differentiation medium and cultured for an additional 4 d. The BMDMs were seeded at 2.0 × 105 cells in 24-well plates containing 12-mm glass cover slides. The infection was performed as described above with promastigotes of L. amazo-nensis (MOI 5) and fixed with 4% paraformaldehyde at 2, 6 or 24 h after infection. L. amazonensis was stained with in house–generated rabbit polyclonal antibody to L. amazonensis (1:3,000) and secondary antibody to rabbit IgG conjugated with Alexa 594 (1:300, Invitrogen, A11012). The cells were counterstained

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with DAPI, mounted using Prolong Gold Antifade Reagent (Invitrogen) and analyzed under fluorescence using a Leica DMI 4000B inverted microscope with a ×100 oil objective. The images were processed using LAS AF software (Leica Microsystems), and the number of Asc-GFP foci in the infected cells was quantified.

Real-time PCR. Total RNA was extracted from 1 × 106 Leishmania-infected BMDMs (MOI 10) using TRIzol reagent (Invitrogen). Contaminating DNA was removed with an RNAse-free DNAse set (Promega). cDNA was synthesized from 1 µg of RNA using the SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen). Subsequent real-time PCR was performed on an ABI PRISM 7000 sequence detector (Applied Biosystems) using SYBR Green (Invitrogen). The following primer sequences were used: Actb forward (5′-AGCTGCGTTTTACACCCTTT-3′), reverse (5′-AAGCCATGCCAATGTTGTCT-3′); Nos2 forward (5′-CGAA ACGCTYCACTTCCAA-3′), reverse (5′-TGAGCCTATATTGCTGTGGCT-3′); Ifng forward (5′-GCATCTTGGCTTTGCAGCT-3′), reverse (5′-CCTTTTT CGCCTTGCTGTTG-3′); and Tnfa forward (5′-TGTGCTCAGAGCTTTCAA CAA-3′), reverse (5′-CTTGATGGTGGTGCATGAGA-3′). The mRNA expres-sion levels were normalized to β-actin. The adjusted values were calculated using the following formula: 2−(CT target − CT β-actin), where CT is the cycle threshold. The fold change in the expression was calculated as the n-fold difference in expression in the infected cells compared to the uninfected cells.

Statistical analyses. For comparisons of multiple groups, two-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Bonferroni’s post test were used. The dif-ferences in values obtained for two different groups were determined using Student’s t test. Analyses were performed using Prism 5.0 software (GraphPad). A difference was considered statistically significant when P ≤ 0.05.

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Supplementary Information Titles

Journal: Nature Medicine Article Title: Inflammasome-derived IL-1! production induce nitric oxide–

mediated resistance to Leishmania Corresponding Author:

Dario S. Zamboni

Supplementary Item & Number

Title or Caption

Supplementary Figure 1 Cathepsins and potassium efflux are required for the L. amazonensis-induced inflammasome activation

Supplementary Figure 2 The inflammasome components are not required for the internalization of L. amazonensis by macrophages

Supplementary Figure 3 The inflammasome is required for IL-1! production ex vivo

Supplementary Figure 4 The inflammasome is important for NOS2 expression and NO production in vivo and ex vivo in response to L. amazonensis stimulation

Supplementary Figure 5 IFN-" is important for IL-1! and nitric oxide production ex vivo

Supplementary Figure 6 The inflammasome is activated in macrophages infected with L. amazonensis, L. major, and L. braziliensis

Supplementary Figure 7 Inflammasome activation is not necessary for the restriction of L. major infection

Supplementary Figure 8 The inflammasome accounts for the host resistance to L. braziliensis and L. infantum chagasi

Supplementary Methods Online Methods

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Lima Júnior, D. S. Anexos

163

9.2 Anexo 2: Repercussão desse trabalho no cenário nacional e internacional

Os anexos a seguir se referem à repercussão desse trabalho no cenário nacional e

internacional. Como mostrado no anexo 1, um dos trabalhos resultantes dessa tese foi publicado

na revista Nature Medicine, uma das mais conceituadas revistas de circulação internacional.

Além do impacto científico mundial, devemos destacar a importância desse trabalho para a

ciência nacional, uma vez que ele foi totalmente realizado em território nacional e por

pesquisadores brasileiros. Acreditamos que esse artigo tem papel importante para encorajar a

comunidade científica brasileira a buscar artigos de grande solidez científica. Tais artigos são

importantes, pois destacam nosso País (e nossa comunidade) no cenário internacional, e destacam

a comunidade científica brasileira diante do público leigo brasileiro.

Assim, considero as entrevistas apresentadas abaixo de grande importância, uma vez que

servem como pontes entre os pesquisadores e a sociedade. É a partir de textos didáticos, objetivos

e informativos como os contidos nessas entrevistas que podemos encurtar a distância

pesquisador-sociedade existente em nosso país. Além disso, iniciativas como essa são uma forma

de darmos um retorno para a sociedade, justificando todo o investimento despendido por ela em

ciência e educação.

Por fim, gostaria de destacar que as perspectivas futuras desse trabalho são amplas. Os

resultados obtidos nesse estudo auxiliaram significativamente na compreensão da patogênese e da

resposta imune na Leishmaniose. Acreditamos que esses dados poderão contribuir diretamente

para o futuro desenvolvimento de terapias efetivas e/ou vacinas contra a Leishmaniose e quem

sabe contra outras doenças provocadas por protozoários intracelulares.

05/07/13 15:25Desvendado mecanismo de defesa contra Leishmaniose | USP Ribeirão Preto

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Notícias - Ver todas (+) Sexta-Feira, 5/7/2013 - Ribeirão Preto - SP

CAPA21/6/2013

Desvendado mecanismo de defesa contraLeishmanioseAchado de pesquisadores da USP de Ribeirão Preto e festejado pela comunidade científica nacional, acaba de

ser publicado pela revista Nature.

Pesquisa, inteiramente realizada nos laboratórios da Faculdadede Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) da USP, conseguepreencher importantes lacunas, explicando como organismosde mamíferos debelam a infecção causada por um protozoáriodo gênero Leishmania. O trabalho revela os processosintracelulares, ocorridos em células de defesa de hospedeiros,em resposta à infecção pelo parasita da leishmaniose.

O líder da equipe, professor Dario Simões Zamboni (foto), contaque já era conhecida a ação do óxido nítrico para a morte doprotozoário. O óxido nítrico é uma molécula que cumpre uma

infinidade de funções no organismo. No sistema imunológico, é uma arma importante na defesa contramicróbios que causam doenças.

O que ainda não se sabia era como as células reconhecem a doença e ativam determinadas vias desinalização que levam à produção de óxido nítrico durante a leishmaniose. Esse estudo, coordenadopor Zamboni, investigou, tanto in vitro quanto em animais vivos, o efeito da Leishmania em células dedefesa (macrófagos) de camundongos.

Quando o organismo é atacado pelo protozoário que causa essa doença, os macrófagos o “fagocitam”(levam o patógeno para dentro dessas células). “Existe uma plataforma molecular que reconhece aLeishmania no interior dos macrófagos e sinaliza para o sistema imune, informando que se trata deuma infecção por um patógeno que pode causar danos ao organismo”, explica o pesquisador. Omacrófago então ativa essa plataforma, chamada inflamossoma, que é composta por várias proteínasque estão no citoplasma da célula. A seguir, o inflamossoma induz a produção de outra molécula, ainterleucina 1-beta (IL-1ß). Como uma mensageira imunológica, a IL-1ß se liga a receptores celularesque orientam o macrófago a produzir óxido nítrico e matar a Leishmania. Esse processo, afirma opesquisador, “leva à resistência dos mamíferos frente à leishmaniose”.

O achado dos pesquisadores de Ribeirão Preto é hoje festejado pela comunidade científica nacionale, pela importância, acaba de ser publicado pela revista Nature Medicine, em edição online do últimodia 9 de junho. Essa é a primeira vez que se descreve como esse mecanismo acontece - desde afagocitose da Leishmania, até a morte pelo óxido nítrico. “Colocamos algumas peças importantesnesse complexo quebra-cabeça que é a leishmaniose”, comenta Zamboni, já que até então só seconhecia alguns detalhes desse processo.

Resistência imunológica e importância para futuros tratamentos e vacinas

Ao mostrar como as células de defesa de um mamífero, hospedeiro da Leishmania, fagocitam ematam o parasita, os cientistas da USP de Ribeirão Preto dão um passo muito importante para oentendimento da resistência imunológica durante a leishmaniose. Como os experimentos tambémutilizaram animais vivos, conseguiram comprovar que, quando o animal infectado com a Leishmaniatem alguma deficiência nos genes do inflamossoma ou na sinalização por IL-1ß, ele apresenta umadoença muito mais grave. É que o sistema imunológico falha no controle da infecção.

Apesar de terem estudado camundongos, eles acreditam que o mesmo mecanismo aconteça com oshomens, uma vez que estudos realizados por outros grupos indicam que seres humanos commutações nos genes que realizam a sinalização por IL-1ß têm uma forma muito mais grave dadoença.

5/7/2013 - Ribeirão Preto - SP

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doença.

Além de ajudar na compreensão de respostas imunológicas, a pesquisa aponta armas para umadoença que acomete mais de 12 milhões de pessoas no mundo, segundo a Organização Mundial deSaúde (OMS). Zamboni explica que a Leishmania está entre os parasitas que oferecem os maioresproblemas à saúde pública humana. A doença está presente em diversos países de clima tropical,como a populosa Índia, países do Oriente Médio, da África e América Latina, incluindo o Brasil.

Segundo o Ministério da Saúde do Brasil, no período de 1991 a 2010, um dos tipos de leishmaniose, ategumentar americana, apresentou média anual de 27.374 casos. Ao longo desse período, observou-se uma tendência no crescimento da endemia. Atualmente, ela faz vítimas em todos os estadosbrasileiros.

A leishmaniose é transmitida pela picada de um pequeno inseto de cor amarelada, o flebotomíneo, etem diversos mamíferos como hospedeiros. Um problema particularmente grave para a leishmaniosevisceral humana, outro tipo frequente no Brasil, é a infeção de cães. Como portadores da doença, oscães infectados podem ser picados pelo inseto transmissor e posteriormente picar os seres humanos,transmitindo a doença. Como o cachorro acompanha o homem, ao se mudar de áreas endêmicaspara outras regiões do país, o animal traz consigo o parasita.

A equipe de Zamboni observou que o mecanismo de controle da infecção dependente doinflamassoma e IL-1ß funciona para três espécies de grande incidência no Brasil, aLeishmaniaamazonensis, a Leishmania brasiliensis, causadoras da leishmaniose tegumentar (feridasindolores na pele ou mucosas do indivíduo afetado), e a Leishmania infantum chagasi,responsável pela forma visceral, considerada o tipo mais grave, pois ataca o fígado, o baço e medulaóssea.

Saber como as células do corpo reconhecem parasitas e porque algumas pessoas são resistentes eoutras apresentam um quadro de doença muito ruim é importante para a busca de tratamentos ouvacinas. Para tratar a leishmaniose hoje, a medicina usa drogas que atuam no parasita. Nessesentido, o investimento em ciência e tecnologia por meio de investigação cientifica pode gerar maisconhecimentos acerca da doença e de como o sistema imune opera para levar os indivíduos àresistência. “Com esse conhecimento em mãos, poderá ser possível desenvolver vacinas eficazes,além de modular determinados processos para melhorar a imunidade dos indivíduos levando aocontrole da doença”, afirma o cientista.

Veja a matéria:

Por : Rita Stella

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05/07/13 15:29G1 - Pesquisa da USP sugere caminho para criar vacina contra leishmaniose - notícias em Ribeirão e Franca

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Ribeirão e Franca

24/06/2013 19h18 - Atualizado em 25/06/2013 00h42

Pesquisa da USP sugere caminho para criar vacina contraleishmanioseEstudo mostra a ação de células no combate à doença, diz pesquisador.Trabalho foi desenvolvido pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.Do G1 Ribeirão e Franca

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Um estudo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP) em Ribeirão Preto (SP) revelou pela primeira vez a ação de célulasdo sistema imunológico no combate à leishmaniose.

A pesquisa mostra o passo a passo dos processos intracelulares ocorridos em células de defesa dos organismos hospedeiros da doença, emresposta à infeccção pelo parasita da leishmaniose.

Segundo o professor Dario Simões Zambroni, coordenador da pesquisa, a descoberta deve ajudar no desenvolvimento de novos tratamentos epode até contribuir na criação uma vacina para o combate à doença.

Causada por protozoários, a leishmaniose é uma zoonose que tem como principais hospedeiros o cachorro e o homem. Nos seres humanos, atransmissão se dá pela picada de mosquitos hematófagos - que se alimentam de sangue -, como o mosquito-palha.

A manifestação da doença pode ser cutânea ou visceral, dependendo do gênero do parasita. A leishmaniose ataca as células que fazem parte dosistema imunológico do indivíduo.

"Nesse trabalho a gente consegue colocar várias peças no quebra-cabeças, que é a doença da leishmaniose, e entender como as células do nossosistema de defesa reconhecem e combatem o parasita que causa a doença. Quanto mais a gente entender a doença, maiores são as chances defazermos um medicamento racional que possa usar as vias conhecidas do sistema imune para matar a leishmaniose. Aumentam as chances defazer um novo medicamento que seja eficaz contra a doença ou eventualmente uma vacina para preveni-la", diz.

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Através da análise de células de camundongos - nos animais vivos e in vitro - os pesquisadores observaram a ação do óxido nítrico no combate aum dos protozoários causadores da leishmaniose.

De acordo com Zamboni, as moléculas de óxido nítrico atuam diretamente na defesa do organismo contra micróbios.

Embora a ação da molécula já fosse conhecida pela comunidade científica, a forma como as células se comportavam para ativar a produção deóxido nítrico ainda era um mistério.

"Ainda temos muito para entender como o sistema imunológico reconhece e combate a infecção. Quanto mais entendermos esse processo,maiores as chances de termos um tratamento eficaz contra a doença, que ocorre em todo o país", afirma o pesquisador.



Pesquisadores da USP analisamcomportamento de células do sistema imunológico no combate à leishmaniose. (Foto: Carlos Trinca/ EPTV)tópicos:

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Achado de pesquisadores da FMRP-USP acaba de ser publicado pelarevista Nature

Pesquisa, inteiramente realizada nos laboratórios daFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) da USP,consegue preencher importantes lacunas, explicando comoorganismos de mamíferos debelam a infecção causada porum protozoário do gênero Leishmania. O trabalho revela osprocessos intracelulares, ocorridos em células de defesa dehospedeiros, em resposta à infecção pelo parasita daleishmaniose. Doença que, no Brasil, é conhecida comoCalazar e “barriga d’água”.

O líder da equipe, professor Dario Simões Zamboni (foto),conta que já era conhecida a ação do óxido nítrico para amorte do protozoário. O óxido nítrico é uma molécula quecumpre uma infinidade de funções no organismo. No sistemaimunológico, é uma arma importante na defesa contramicróbios que causam doenças.

O que ainda não se sabia era como as células reconhecem a doença e ativam determinadas vias de sinalização quelevam à produção de óxido nítrico durante a leishmaniose. Esse estudo, coordenado por Zamboni, investigou, tanto invitro quanto em animais vivos, o efeito da Leishmania em células de defesa (macrófagos) de camundongos.

Quando o organismo é atacado pelo protozoário que causa essa doença, os macrófagos o “fagocitam” (levam opatógeno para dentro dessas células). “Existe uma plataforma molecular que reconhece a Leishmania no interior dosmacrófagos e sinaliza para o sistema imune, informando que se trata de uma infecção por um patógeno que podecausar danos ao organismo”, explica o pesquisador. O macrófago então ativa essa plataforma, chamada inflamossoma,que é composta por várias proteínas que estão no citoplasma da célula. A seguir, o inflamossoma induz a produção deoutra molécula, a interleucina 1-beta (IL-1ß). Como uma mensageira imunológica, a IL-1ß se liga a receptores celularesque orientam o macrófago a produzir óxido nítrico e matar a Leishmania. Esse processo, afirma o pesquisador, “leva àresistência dos mamíferos frente à leishmaniose”.

O achado dos pesquisadores de Ribeirão Preto é hoje festejado pela comunidade científica nacional e, pelaimportância, acaba de ser publicado pela revista Nature Medicine, em edição online do último dia 9 de junho. Essa é aprimeira vez que se descreve como esse mecanismo acontece - desde a fagocitose da Leishmania, até a morte peloóxido nítrico. “Colocamos algumas peças importantes nesse complexo quebra-cabeça que é a leishmaniose”, comentaZamboni, já que até então só se conhecia alguns detalhes desse processo.

Resistência imunológica e importância para futuros tratamentos e vacinas

Ao mostrar como as células de defesa de um mamífero, hospedeiro da Leishmania, fagocitam e matam o parasita, oscientistas da USP de Ribeirão Preto dão um passo muito importante para o entendimento da resistência imunológicadurante a leishmaniose. Como os experimentos também utilizaram animais vivos, conseguiram comprovar que, quandoo animal infectado com a Leishmania tem alguma deficiência nos genes do inflamossoma ou na sinalização por IL-1ß,ele apresenta uma doença muito mais grave. É que o sistema imunológico falha no controle da infecção.

Apesar de terem estudado camundongos, eles acreditam que o mesmo mecanismo aconteça com os homens, uma vezque estudos realizados por outros grupos indicam que seres humanos com mutações nos genes que realizam asinalização por IL-1ß têm uma forma muito mais grave da doença.

Além de ajudar na compreensão de respostas imunológicas, a pesquisa aponta armas para uma doença que acometemais de 12 milhões de pessoas no mundo, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS). Zamboni explica que aLeishmania está entre os parasitas que oferecem os maiores problemas à saúde pública humana. A doença está

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presente em diversos países de clima tropical, como a populosa Índia, países do Oriente Médio, da África e AméricaLatina, incluindo o Brasil.

Segundo o Ministério da Saúde do Brasil, no período de 1991 a 2010, um dos tipos de leishmaniose, a tegumentaramericana, apresentou média anual de 27.374 casos. Ao longo desse período, observou-se uma tendência nocrescimento da endemia. Atualmente, ela faz vítimas em todos os estados brasileiros.

A leishmaniose é transmitida pela picada de um pequeno inseto de cor amarelada, o flebotomíneo, e tem diversosmamíferos como hospedeiros. Um problema particularmente grave para a leishmaniose visceral humana, outro tipofrequente no Brasil, é a infeção de cães. Como portadores da doença, os cães infectados podem ser picados pelo insetotransmissor e posteriormente picar os seres humanos, transmitindo a doença. Como o cachorro acompanha o homem,ao se mudar de áreas endêmicas para outras regiões do país, o animal traz consigo o parasita.

A equipe de Zamboni observou que o mecanismo de controle da infecção dependente do inflamassoma e IL-1ß funcionapara três espécies de grande incidência no Brasil, a Leishmaniaamazonensis, a Leishmania brasiliensis, causadoras daleishmaniose tegumentar (feridas indolores na pele ou mucosas do indivíduo afetado), e a Leishmania infantum

chagasi, responsável pela forma visceral, considerada o tipo mais grave, pois ataca o fígado, o baço e medula óssea.

Saber como as células do corpo reconhecem parasitas e porque algumas pessoas são resistentes e outras apresentam umquadro de doença muito ruim é importante para a busca de tratamentos ou vacinas. Para tratar a leishmaniose hoje, amedicina usa drogas que atuam no parasita. Nesse sentido, o investimento em ciência e tecnologia por meio deinvestigação cientifica pode gerar mais conhecimentos acerca da doença e de como o sistema imune opera para levaros indivíduos à resistência. “Com esse conhecimento em mãos, poderá ser possível desenvolver vacinas eficazes, alémde modular determinados processos para melhorar a imunidade dos indivíduos levando ao controle da doença”, afirmao cientista.

As reportagens referentes ao assunto, produzida pela TV USP e veiculada no Jornal da EPTV, estão disponíveis nestaEdição, em "VÍDEOS EM DESTAQUE".

Referência: Portal de Informações da USP / Ribeirão Preto - Por : Rita Stella

Editor: Benedito Carlos MacielCorpo Editorial: Carlos Gilberto Carlotti Junior, Marcos Felipe Silva de Sá, Sandro Scarpelini

Coordenação Executiva: Célia Bíscaro, Raquel IlianoAssessoria Técnica: Vinicius Lima, Fábio Sant'Ana, José Franscisco da Silva, Kátia Suzuki,

Sidney Porcincula, Felipe Pellison, Leandro Barbosa, Luis Fernando CozinAssessoria: Luci Pugin, Fátima Breda, Marta Bárbara, Patrícia Souza Cainelli, Maria Aparecida Ferreira,

Daniel Watanabe, Daniel Menezes de Souza, Gilberto Soares Júnior, Michelle C. Lara, Cássio de Paula, Rodrigo Silva, Diego Torres, Marcos de Assis

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Estudo desvenda aspectos importantes para a compreensãoda leishmaniose

revistapesquisa.fapesp.br /2013/06/09/estudo-desvenda-aspectos- importantes-para-a-compreensao-daleishmaniose

Atores do sistema imunológico, o inflamassoma e a interleucina 1-beta têm papel central nadetecção do parasita

Um grupo de pesquisadores brasileiros que busca entender em detalhe os mecanismos deimunidade contra a leishmaniose acaba de conseguir umacontribuição importante. Dario Zamboni, da Faculdade deMedicina da Universidade de São Paulo (USP) emRibeirão Preto, e seus colaboradores mostraram o papelde um conjunto de proteínas chamado inflamassomanessa batalha, em artigo publicado neste domingo (9/6)no site da Nature Medicine. O trabalho foi realizadointeiramente em seu laboratório no interior paulista, noâmbito de um projeto do Programa JovensPesquisadores da FAPESP.

A leishmaniose é uma doença silenciosa no que dizrespeito à ativação do sistema imunológico. Osprotozoários do gênero Leishmania que causam tanto aversão visceral como a tegumentar se alojam dentro dascélulas sem matá- las, e não assolam o organismo inteirocomo acontece em muitas infecções bacterianas. “Umalesão cutânea de leishmaniose pode permanecer pormeses sem cicatrizar”, conta o biólogo Dario Zamboni.Em parte por isso, Leishmania é um parasita poucodetectado pelo sistema imunológico.

Já se sabia que uma arma importante usada pelo sistemaimunológico é o óxido nítrico, molécula que cumpre uma infinidade de funções no organismo, incluindo a defesacontra micróbios que causam doenças. “Ninguém sabia as vias de sinalização que levam à produção de óxidonítrico durante a leishmaniose”, explica o pesquisador. O estudo coordenado por ele examinou o efeito dainfecção por Leishmania em células de defesa (macrófagos) de camundongo in vitro, e também nos animais vivos.Descobriram que a infecção induz a agregação, dentro das células dos roedores, das proteínas que formam oinflamassoma. Este, por sua vez , altera outra molécula importante do sistema imunológico, a interleucina 1-beta(IL-1β), tornando-a ativa. A IL-1β funciona como uma mensageira imunológica: sai da célula e circula até encontraroutra célula infectada, em cuja superfície se liga a receptores que desencadeiam a sinalização para a síntese deóxido nítrico.

O mecanismo funciona, o estudo mostrou, para as espécies Leishmania amazonensis e L. brasiliensis, causadorasda leishmaniose tegumentar, e L. infantum chagasi, responsável pela forma visceral da doença. Em L. major,menos comum no Brasil, o estudo mostrou que os parasitas ativam o inflamassoma, mas esse efeito não énecessário para controlar a infecção. Ainda não está claro o que está por trás dessa diferença.

Apesar de ter estudado apenas camundongos nesse trabalho, Zamboni acredita que o mesmo aconteça emseres humanos. “Outros estudos mostraram que mutações em genes que participam da sinalização por IL-1βtambém afetam a suscetibilidade à leishmaniose em seres humanos”, explica.

A esperança é contribuir para possíveis tratamentos, mas esse ainda é um objetivo distante no horizonte. Nãohaverá uma solução simples como cápsulas de IL-1β, inclusive porque desequilíbrios nos teores e nofuncionamento dessa molécula estão por trás de uma série de doenças auto- inflamatórias. “Entender a doença,assim como os mecanismos de resistência, é fundamental para se desenvolver uma terapia racional e vacinascontra essa doença”, afirma Zamboni. Nesse caso, ele busca inspiração no que determina o sucesso – ou não –do próprio sistema imunológico nesse combate.

“O trabalho de Dario Zamboni e coautores é daqueles que desatam nós”, comenta Walter Colli, do Instituto de

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http://www.nature.com/naturemedicine

http://bv.fapesp.br/pt/auxilios/4181/reconhecimento-de-patogenos-bacterianos-por-receptores-intracelulares-e-sua-importancia-no-controle-/

Química da USP (IQ-USP). “Muitos patógenos que infectam células do sistema imune sobrevivem no interiordessas células estabelecendo uma convivência, já que nem destroem o hospedeiro nem são por ele destruídos.O hospedeiro combate o invasor, controlando a infecção. É como se fosse estabelecido um equilíbrio que torna adoença de progressão lenta, ainda que sempre presente.” Em sua avaliação, o trabalho de Zamboni elucidaesses mecanismos e dá um passo para compreender como o sistema imunológico combate esse e outrosintrusos.

Colli ressalta que Zamboni faz parte de uma linha de pesquisa com destaque no Brasil: fez Iniciação Científica nolaboratório de Isaac Roitman na Universidade de Brasília e doutorou-se sob a orientação de Michel Rabinovitch,na Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Depois de um pós-doutorado na Universidade Yale com CraigRoy, Zamboni se instalou na Faculdade de Medicina da USP de Ribeirão Preto. Dois alunos de Zamboni já foramagraciados com prêmios outorgados pela Sociedade Brasileira de Protozoologia (SBPz) por trabalhosapresentados sobre receptores intracelulares presentes nas células do sistema imune que participam da detecçãoe do controle de Leishmania e de Trypanosoma cruzi, um indício de que a escola de pensamento em que seformou continua a render frutos. “A lista de colaboradores de Zamboni mostra que, em algumas áreas, já temosmassa crítica para atuar coletivamente com projetos ousados e inovadores que visem, mais do que a quantidade,a qualidade em nossa produção científica”, avalia o professor do IQ-USP.

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776 VOLUME 14 NUMBER 8 AUGUST 2013 NATURE IMMUNOLOGY

Evolving awayViruses use specific host receptors to infect cells, and this frequently trig-gers an evolutionary ‘arms race’, with the host mutating receptors and the virus playing ‘catch-up’. In PLOS Biology, Sawyer et al. investigate how the host counters viruses that use highly conserved host receptors for entry. The transferrin receptor Tfr1 is used by certain viruses for entry into host cells, but because Tfr1 is critical for cell survival, it does not tolerate mutation well. By examining the structures and sequences of Tfr1 from different rodent species, the authors find that the entire receptor is highly conserved except for a few residues that undergo strong positive selec-tion. Those sequences overlap the interaction surfaces of arenaviruses and mouse mammary tumor viruses that use Tfr1 for entry and thereby impose strict barriers on infection. These findings offer insight into how the host can mutate critical housekeeping genes to impede the entry of viruses without affecting essential physiological functions. ZFPLOS Biol. (28 May 2013) doi:10.1371/journal.pbio.1001571

Metabolic control of cytokinesFull effector function of TH1 cells requires that the cells switch to aerobic glycolysis. In Cell, Pearce and colleagues report post-transcriptional regulation of mRNA encoding IFN-γ and IL-2 mediated by the enzyme GAPDH when cells switch their metabolism from oxidative phosphorylation to aerobic glycolysis. GAPDH binds to AU-rich elements in the 3´ untranslated region of mRNA to suppress protein translation. That effect is relieved by increasing the abundance of glyceraldehyde-3-phosphate, the GAPDH substrate produced during glycolysis. Studies of T cells with transgenic expression of green fluorescent protein–linked GAPDH, isolated from mice infected with Listeria monocytogenes, show that the expression of IFN-γ and IL-2 protein is inversely correlated with GAPDH abundance. Interestingly, expression of the inhibitory molecule PD-1 is higher in T cells with higher expression of GAPDH. The authors suggest that the availability of glucose as a carbon source serves to regulate T cell effector function by influencing GAPDH activity as either a post-transcriptional regulator or a catalytic enzyme in the glycolysis pathway. LADCell 153, 1239–1251 (2013)

Boosting cancer immunotherapyCD47 is an antiphagocytic ‘don’t eat me’ signal highly expressed by many cancer cells to avoid detection by macrophages. In Science, Weiskopf et al. use a high-affinity, in vitro–engineered variant of SIRPα, the ligand for CD47, to antagonize CD47 on cancer cells. The SIRPα variant competes with wild-type SIRPα for the same epitope, and binds human CD47 with greater affinity and has stronger antagonism than does wild-type SIRPα. The high-affinity SIRPα monomers do not induce macrophage phagocytosis on their own but act in synergy with tumor-specific antibodies to induce phagocytosis of tumor cells in vitro. In vivo, the high-affinity SIRPα monomers act as an adjuvant for tumor-specific antibodies to enhance macrophage infiltration, inhibit tumor growth and improve survival in various tumor models and have no cytotoxicity against untransformed cells that express CD47. Thus, these engineered SIRPα variants may provide a universal adjuvant for augmenting the efficacy of cancer immunotherapies. IVScience (30 May 2013) doi:10.1126/science.1238856

Written by Laurie A. Dempsey, Zoltan Fehervari & Ioana Visan

Barrier with a biteThe intestinal epithelium has a key role in limiting the dissemination of gut microbes through both its function as a physical barrier as well as its release of antimicrobial peptides. In Cell Host and Microbe, Hooper and colleagues demonstrate that bacteria-induced autophagy in intes-tinal cells is important for gut immunity. Challenging mice with inva-sive Salmonella serovar Typhimurium or Entercoccus faecalis triggers autophagy in the intestinal epithelium. The ability to invade the epithe-lium is critical for such a response, because the normal host microbiota or mutant bacteria unable to enter cells fail to elicit autophagy. Signaling via the pattern-recognition receptor adaptor molecule MyD88 in epi-thelium is also essential, but how this is ‘wired’ into the autophagocytic machinery is unclear. Finally, defective autophagocytosis specifically in intestinal epithelium leads to more dissemination of bacteria. Thus, epithelial cell–intrinsic autophagy is a further means by which gut bar-rier integrity is maintained. ZFCell Host Microbe (12 June 2013) doi:10.1016/j.chom.2013.05.004

NO to LeishmaniaLeishmaniasis, a prevalent parasitic disease that causes considerable morbidity, is dampened by the production of nitric oxide (NO) by macrophages. In Nature Medicine, Zamboni and colleagues show that the NLRP3 inflammasome is activated after infection with Leishmania and is required for optimal production of NO. Live parasites trigger assembly of NLRP3 inflammasomes, caspase-1 activation and release of IL-1β, but dead parasites do not. Signaling through the IL-1β receptor via MyD88 acts in synergy with IFN-γ to enhance expression of the gene encoding inducible NO synthase and elicit NO production. Mice deficient in the inflammasome components NLRP3, Asc or caspase-1 have a greater parasite burden, similar to that of mice that lack NO synthase. It remains unclear how Leishmania parasites trigger inflammasome activation; however, it probably involves active lysosomal membrane damage triggered by the parasite. LADNat. Med. (9 June 2013) doi:10.1038/nm.3221

Integration-induced deathThe mechanism by which human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the death of helper T cells has not been defined. In Nature, Cooper et al. show that virus-induced cell killing is triggered by viral integration and involves activation of the DNA damage–response pro-tein DNA-PK. Through the use of an integrase-deficient HIV-1 mutant virus and integrase inhibitors, the authors show that integration is both necessary and sufficient to trigger cell death by HIV-1. Integration elicits a cellular response to double-stranded DNA damage involving activation of DNA-PK, phosphorylation of the tumor suppressor p53 and cell death. A pharmacological integrase inhibitor abolishes HIV-1-induced killing of primary CD4+ T cells from acutely infected subjects, and inhibition of DNA-PK abolishes cell death during HIV-1 infection in vitro. These results suggest that inhibitors of these enzymes may improve T cell sur-vival and immunological function in HIV-1-infected people. IVNature (5 June 2013) doi:10.1038/nature12274

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Inflammasome is involved in parasite resistanceThis study identifies a role for the NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing 3) inflammasome in triggering the production of nitric oxide (NO), which is necessary for host resistance to Leishmania parasites. First, it was shown that infection of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) with Leishmania amazonensis induces caspase 1 activation and high levels of interleukin-1β (IL-1β) production. These effects were dependent on the presence of key inflammasome components (the adaptor protein ASC, caspase 1 and NLRP3) and potassium efflux, which is required for NLRP3 inflammasome activation. Second, it was shown that BMDMs that lack functional NLRP3 inflammasomes or that are deficient in inducible nitric oxide synthase 2 (NOS2) fail to restrict the intracellular replication of L. amazonensis. The assessment of skin lesions caused by L. amazonensis infection in various inflammasome-deficient mouse strains confirmed a key role for the NLRP3 inflammasome in controlling parasite load in vivo. Finally, signalling through the IL-1 receptor was shown to link the inflammasome-driven production of IL-1β to the NOS2-mediated production of NO for effective host resistance.ORIGINAL RESEARCH PAPER Lima-Junior, D. S. et al. Inflammasome-derived IL-1β production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nature Med. 19, 909–915 (2013)

O S T E O I M M U N O LO GY

The CD27–CD70 axis in osteoclast developmentThe engagement of CD70 on dendritic cells (DCs) and lymphocytes by CD27 sustains immune activation. Here, the CD27–CD70 axis is shown to also impede osteoclast development in the bone marrow. Cd27+/– mice that constitutively express a Cd70 transgene on DCs had increased trabecular bone mass compared with Cd27+/+ mice because of defective osteoclast differentiation. Osteoclast progenitors could be classified into a CD27hi subset, which could generate both osteoclasts and DCs, and a CD27low subset, which was fully commited to the osteoclast lineage. Constitutive CD70 signalling skewed osteoclast progenitors towards DC differentiation, which led to the defective development of osteoclasts. It will be interesting to assess whether chronic immune activation (including constitutive CD70 signalling) also affects the function of other haematopoietic progenitor cells in the bone marrow.ORIGINAL RESEARCH PAPER Xiao, Y. et al. Osteoclast precursors in murine bone marrow express CD27 and are impeded in osteoclast development by CD70 on activated immune cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1216082110 (2013)

T C E L L M E M O RY

Right time, right place for protectionOwing to their limited proliferative capacity and poor long-term survival, the CD27lowKLRG1hi subset of effector memory CD8+ T cells was assumed to have a small role in protection against secondary infections. Now, it has been shown that these cells in fact have a potent cytotoxic capacity and a distinct localization in the red pulp of the spleen, where they provide effective protection against secondary challenge with Listeria monocytogenes or vaccinia virus. The KLRG1hi population form the main secondary memory cell subset following antigen-specific boosting and are optimally placed to engage with invading pathogens. This study suggests that the composition and the location of CD8+ T cell populations might be the best predictors of vaccine efficacy.ORIGINAL RESEARCH PAPER Olson, J. A. et al. Effector-like CD8+ T cells in the memory population mediate potent protective immunity. Immunity 38, 1250–1260 (2013)

IN BRIEF

R E S E A R C H H I G H L I G H T S

NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY VOLUME 13 | AUGUST 2013

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NLRP3 inflamassoma: uma plataforma molecular importante no