8/6/2019 Non Porous Polystyene Divenyl

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 3 , V o l . 2 1 , N o . 5 1 0 6 1 - 1 0 6 6

H i g h - r e s o l u t i o n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f DNA f r a g m e n t so n n o n - p o r o u s p o l y ( s t y r e n e - d i v i n y l b e n z e n e ) p a r t i c l e sC h r i s t i a n G . H u b e r , P e t e r J . O e f n e r 1 , E u g e n P r e u s s 2 a n d G u n t h e r K . B o n n 1I n s t i t u t e o f R a d i o c h e m i s t r y , L e o p o l d - F r a n z e n s - U n i v e r s i t y , I n n r a i n 5 2 a , A - 6 0 2 0 I n n s b r u c k , 1 D e p a r t m e n to f A n a l y t i c a l C h e m i s t r y , J o h a n n e s - K e p l e r - U n i v e r s i t y , A l t e n b e r g e r s t r a f l e 6 9 , A - 4 0 4 0 L i n z a n d2 I n s t i t u t e o f M e d i c i n a l C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y , L e o p o l d - F r a n z e n s - U n i v e r s i t y , F r i t z - P r e g l - S t r a B e 3 ,A - 6 0 2 0 I n n s b r u c k , A u s t r i aR e c e i v e d J a n u a r y 1 1 , 1 9 9 3 ; A c c e p t e d F e b r u a r y 2 , 1 9 9 3

ABSTRACTDNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s a n d PCR p r o d u c t s w e r es e p a r a t e d b y means o f i o n - p a i r r e v e r s e d - p h a s e h i g h -p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o n a l k y l a t e d n o n -p o r o u s p o l y ( s t y r e n e - d i v i n y l b e n z e n e ) p a r t i c l e s w i t h amean d i a m e t e r o f 2 . 1 A m . O p t i m u m r e s o l u t i o n waso b t a i n e d b y u s i n g a n a c e t o n i t r i l e g r a d i e n t i n 1 0 0 mMo f t r i e t h y l a m m o n i u m a c e t a t e a n d a c o l u m n t e m p e r a t u r eo f 5 0 O C . T h i s a l l o w e d t h e s e p a r a t i o n o f DNA f r a g m e n t sd i f f e r i n g i n c h a i n l e n g t h b y 1 - 5% u p t o a s i z e o f 5 0 0b a s e p a i r s . PCR p r o d u c t s c o u l d b e a n a l y z e d d i r e c t l yi n l e s s t h a n t w o m i n u t e s w i t h a c o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t y o f a t l e a s t 3 0 0 n g / m l . C o m p a r e d w i t h a n i o n -e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o r g e l e l e c t r o p h o r e s i s n od e s a l t a t i o n o f t h e p u r i f i e d DNA m o l e c u l e s i s r e q u i r e db e c a u s e t h e v o l a t i l e b u f f e r s y s t e m c a n b e r e a d i l ye v a p o r a t e d . S u b s e q u e n t l y , t h e m e t h o d was u s e d f o rt h e s e m i q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o fm u l t i d r u g r e s i s t a n c e g e n e s i n m o n o n u c l e a r w h i t e b l o o dc e l l s .I N T R O D U C T I O NR e s t r i c t i o n e n z y m e m a p p i n g a n d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n h a v eg a i n e d t r e m e n d o u s p o p u l a r i t y i n m o l e c u l a r b i o l o g y a n d c l i n i c a ld i a g n o s t i c s . T h e s t a n d a r d m e t h o d f o r t h e s e p a r a t i o n o f DNAf r a g m e n t s i s e l e c t r o p h o r e s i s i n p o l y a c r y l a m i d e a n d a g a r o s e g e l s( 1 ) . D e s p i t e i m p r e s s i v e a d v a n c e s , h o w e v e r , m o d e r ne l e c t r o p h o r e s i s i s s t i l l , f o r t h e m o s t p a r t , a c o l l e c t i o n o f m a n u a l l yi n t e n s i v e m e t h o d o l o g i e s t h a t c a n n o t b e r u n u n a t t e n d e d a n d t h a ta r e p r o n e t o i r r e p r o d u c i b i l i t y a n d p o o r q u a n t i t a t i v e a c c u r a c y .T h e r e c e n t i n t r o d u c t i o n o f f u s e d s i l i c a c a p i l l a r i e s a s t h em i g r a t i o n c h a n n e l i n e l e c t r o p h o r e s i s h a s b e e n a b i g s t e p f o r w a r di n p u t t i n g e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n s o n t h e s a m e i n s t r u m e n t a lf o o t i n g a s h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( 2 , 3 ) . W i t hr e g a r d t o t h e s e p a r a t i o n o f d o u b l e - s t r a n d e d DNA f r a g m e n t s , t h r e ed i f f e r e n t a p p r o a c h e s h a v e b e e n r e p o r t e d . T h e f i r s t o n e i s b a s e do n t h e u s e o f l o w- o r z e r o - c r o s s l i n k e d p o l y a c r y l a m i d e - f i l l e dc a p i l l a r i e s , w h i c h a l l o w e d t h e r e a l i z a t i o n o f u p t o f i v e m i l l i o nt h e o r e t i c a l p l a t e s p e r m e t e r a n d , h e n c e , t h e r e s o l u t i o n o f DNA

f r a g m e n t s t h a t d i f f e r e d b y l e s s t h a n 1 0 b a s e p a i r s , i f t h e i r o v e r a l ll e n g t h w a s n o t l a r g e r t h a n a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 b a s e p a i r s ( 4 , 5 ) .H o w e v e r , g e l - f i l l e d c a p i l l a r i e s a r e d i f f i c u l t t o p r e p a r e a n d , d u et o t h e d e s t r u c t i o n o f t h e g e l m a t r i x a t h i g h c u r r e n t d e n s i t i e s ,r e s o l v i n g p o w e r c a n n o t b e m a i n t a i n e d f o r l o n g p e r i o d s o f t i m e .M o r e o v e r , i t i s n o t p o s s i b l e t o d e l i v e r t h e s a m e a m o u n t o f e a c hD NA s p e c i e s , b e c a u s e s a m p l e s c a n o n l y b e i n j e c t e de l e c t r o k i n e t i c a l l y . T h e r e f o r e , s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s h a v e e x p l o r e dt h e f e a s i b i l i t y o f s e p a r a t i n g DNA f r a g m e n t s i n f r e e s o l u t i o n u s i n gm i c e l l a r b u f f e r s y s t e m s c o n t a i n i n g e i t h e r c e t y l t r i m e t h y l -a m m o n i u m b r o m i d e ( 6 ) o r s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( 7 ) . H o w e v e r ,t h i s a p p r o a c h d o e s n o t y i e l d t h e s a m e d e g r e e o f r e s o l u t i o n a so b t a i n e d b y m e a n s o f g e l - f i l l e d c a p i l l a r i e s . F i n a l l y , t h e c o m b i n e du s e o f h y d r o x y e t h y l c e l l u l o s e a n d e t h i d i u m b r o m i d e w a s f o u n dt o o f f e r b o t h t h e s a m e r e s o l u t i o n a s s e e n w i t h g e l - f i l l e d c a p i l l a r i e sa s w e l l a s t h e a d v a n t a g e o f h y d r o s t a t i c i n j e c t i o n ( 8 ) .H o w e v e r , a l l c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e t i c a p p r o a c h e s t o t h ea n a l y s i s o f DN A r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s a n d , e s p e c i a l l y ,p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) p r o d u c t s r e q u i r e t h e i rd e s a l t a t i o n b e c a u s e o t h e r w i s e t h e s a l t s w i l l c a u s e c o n s i d e r a b l eb a n d b r o a d e n i n g d u e t o t h e c o n d u c t i v i t y d i f f e r e n c e b e t w e e n t h es a m p l e z o n e a n d t h e s u r r o u n d i n g b u f f e r . I n t h i s r e s p e c t , l i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e s a r e f a r l e s s a f f e c t e d . T h e m e t h o dm o s t c o m m o n l y u s e d f o r t h e s e p a r a t i o n o f D NA m o l e c u l e s i sa n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . T h e e a r l i e s t a t t e m p t s w e r ec a r r i e d o u t o n c o l u m n s f i l l e d w i t h p o l y c h l o r o t r i f l u o r o e t h y l e n ep o w d e r c o a t e d w i t h a t r i a l k y l m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( 9 - 1 1 ) .H o w e v e r , i n s u f f i c i e n t c o a t i n g o f t h e m a t r i x w i t ht r i a l k y l m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d e r e s u l t e d i n c o n s i d e r a b l e l o s so f DNA. T h e s u b s e q u e n t l y i n t r o d u c e d p o r o u s a n i o n - e x c h a n g es u p p o r t s Mono Q a n d Mono P a l l o w e d t h e s e p a r a t i o n o f DNAr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s w i t h i n a w i d e r a n g e o f s i z e , b u t r e s o l u t i o no f f r a g m e n t s l a r g e r t h a n 2 0 0 b a s e p a i r s g e n e r a l l y d e c l i n e d r a p i d l ya n d s e p a r a t i o n s o f DNA m o l e c u l e s u p t o a l e n g t h o f 5 0 0 b a s ep a i r s t o o k a l m o s t f o u r h o u r s ( 1 2 ) . A c o n s i d e r a b l e r e d u c t i o n i nt i m e o f a n a l y s i s t o l e s s t h a n 1 5 m i n u t e s a s w e l l a s a s i g n i f i c a n te n h a n c e m e n t i n r e s o l u t i o n w a s a c h i e v e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o fn o n - p o r o u s p a r t i c l e s t o w h i c h d i e t h y l a m i n o e t h y l g r o u p s h a d b e e nb o n d e d c h e m i c a l l y ( 1 3 , 1 4 ) . H o w e v e r , r e t e n t i o n b e h a v i o u r w a s

Q - D I 1 9 9 3 O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s

8/6/2019 Non Porous Polystyene Divenyl

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1 0 6 2 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 3 , V o l . 2 1 , N o . Sn o t f o u n d t o b e a d i r e c t f u n c t i o n o f c h a i n l e n g t h a n d , s e c o n d l y ,t h e i s o l a t e d DNA f r a g m e n t s w er e e l u t e d i n a s a l t g r a d i e n t w h i c hh a d t o b e r e m o v e d b e f o r e t h e DNA m o l e c u l e s c o u l d b e e m p l o y e di n s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s s u c h a s DNA s e q u e n c i n g .

I o n - p a i r r e v e r s e d - p h a s e h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( I P - R P - H P L C ) i s a w e l l - e s t a b l i s h e d t e c h n i q u ef o r s e p a r a t i n g m o n o - a n d o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 5 - 1 8 ) . T h e p r i n c i p a lf e a s i b i l i t y o f s e p a r a t i n g DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s b y m e a n s o fI P - R P - H P L C o n u n c o a t e d p o l y c h l o r o t r i f l u o r o e t h y l e n e p o w d e rh a s b e e n d e m o n s t r a t e d a s e a r l y a s 1 9 7 9 ( 1 9 ) , b u t a t t e m p t s t ot r a n s f e r t h e r e s u l t s t o c o m m e r c i a l p a c k i n g m a t e r i a l s w er e n o ts u c c e s s f u l t i l l 1 9 8 6 , when E r i k s s o n e t a l . ( 2 0 ) p u b l i s h e d t h es e p a r a t i o n o f DNA m o l e c u l e s o n a P e p R P C ( C 2 / C 1 8 ) c o l u m n ,t h e p a c k i n g o f w h i c h i s b a s e d o n porous s i l i c a . H o w e v e r ,c o m p l e t e s e p a r a t i o n o f r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s up t o a s i z e o f 6 0 0b a s e p a i r s t o o k more t h a n 3 h o u r s , w h i c h m a k e s t h e m e t h o di m p r a c t i c a l f o r b o t h a n a l y t i c a l a s w e l l a s p r e p a r a t i v e p u r p o s e s .N e v e r t h e l e s s , b o t h s t u d i e s c o n f i r m e d t h a t s e p a r a t i o n o f r e s t r i c t i o nf r a g m e n t s i n I P - R P - H P L C d e p e n d s m a i n l y o n t h e c h a i n l e n g t h .

B a s e d o n r e c e n t a d v a n c e s i n t h e s y n t h e s i s o f non-porouss t y r e n e - d i v i n y l b e n z e n e c o p o l y m e r s a n d t h e i r a p p l i c a t i o n t o t h er a p i d a n a l y s i s o f p r o t e i n s ( 2 1 ) a n d i n c o m b i n a t i o n w i t h a n i o n -p a i r i n g r e a g e n t t o t h e s e p a r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 7 , 1 8 ) ,we now e x p l o r e t h e a p p l i c a b i l i t y o f non-porous a l k y l a t e dp o l y ( s t y r e n e - d i v i n y l b e n z e n e ) p a r t i c l e s ( P S - D V B ) t o t h e s e p a r a t i o no f DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s a n d PCR p r o d u c t s .

MATERIALS AND M ETHODSC h e m i c a l sS t y r e n e , d i v i n y l b e n z e n e ( D V B ) , p o l y v i n y l a l c o h o l ( P V A ) , a n d1 - c h l o r o o c t a d e c a n e w e r e p u r c h a s e d f r o m R i e d e l - d e H a e n ( S e e l z e ,F R G ) . HPLC g r a d i e n t - g r a d e a c e t o n i t r i l e a n d m e t h a n o l a s w e l la s t e t r a h y d r o f u r a n e a n d a l u m i n i u m c h l o r i d e w e r e o b t a i n e d f r o mM e r c k ( D a r m s t a d t , F R G ) . B u f f e r s w e r e p r e p a r e d u s i n g a s t o c ks o l u t i o n o f 2 M H P L C - g r a d e t r i e t h y l a m m o n i u m a c e t a t e ( T E A A ,A p p l i e d B i o s y s t e m s , S a n J o s e , C A , USA) a n d h i g h - p u r i t y w a t e r( E p u r e , B a r n s t e a d C o . , N e w t o n , MA, U S A ) . A c r y l a m i d e , T r i s ,b o r i c a c i d , a n d EDTA w e r e p u r c h a s e d f r o m B i o - R a dL a b o r a t o r i e s ( R i c h m o n d , C A , U S A ) .DNA s i z e s t a n d a r d sS i z e s t a n d a r d s o f d o u b l e - s t r a n d e d DNA w e r e p u r c h a s e d f r o mB o e h r i n g e r M a n n h e i m ( p B R 3 2 2 D N A - H a e I l d i g e s t , M a n n h e i m ,FRG) a n d U SB ( D X - 1 7 4 D N A - H i n c d d i g e s t , U n i t e d S t a t e sB i o c h e m i c a l , C l e v e l a n d , OH, U S A ) .I s o l a t i o n o f b l o o d c e l l sP e r i p h e r a l v e n o u s b l o o d f r o m c o n t r o l s a n d p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o mB-CLL w a s c o l l e c t e d i n 1 0 - m l t u b e s c o n t a i n i n g h e p a r i n asa n t i c o a g u l a n t . M o n o n u c l e a r c e l l s w e r e i s o l a t e d b y d e n s i t yg r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n ( L y m p h o p r e p , N y c o m e d A S , O s l o ,N o r w a y ) . A f t e r r e m o v i n g t h e s e c e l l s f r o m t h e p l a s m a - F i c o l li n t e r f a c e , t h e y w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h MOP S (DM E Mb u f f e r e d w i t h 2 5 mM 3 - N - m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ) .RNA i s o l a t i o n a n d reverse t r a n s c r i p t i o nF o l l o w i n g tw o w a s h e s w i t h i c e - c o l d p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ,t o t a l RNA was i s o l a t e d f r o m m o n o n u c l e a r c e l l s b y t h e g u a n i d i n et h i o c y a n a t e - a c i d p h e n o l e x t r a c t i o n m e t h o d ( 2 2 ) . S u b s e q u e n t l y ,f i r s t - s t r a n d s y n t h e s i s o f cDNA was a c c o m p l i s h e d i n a 0 . 6 mLE p p e n d o r f t u b e b y a d d i n g 5 0 0 n g o f RNA t o a t o t a l v o l u m e o f

5 0 , u L o f 5 0 mM T r i s H C l , pH 8 . 3 , 5 0 mM K C l , 8 mMM g C l 2 , 5 A g BSA ( P h a r m a c i a , U p p s a l a , S w e d e n ) , 1 mM o fe a c h d N T P , 2 5 0 p m o l r a n d o m h e x a n u c l e o t i d e p r i m e r s , 2 0 mMg - m e r c a p t o e t h a n o l , 1 . 2 5 U r R N a s i n r i b o n u c l e a s e i n h i b i t o r( C a t . N o . N 2 5 1 1 , P r o m e g a , M a d i s o n , W I , U S A ) , a n d 1 2 0 UM - M L V r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( M 5 3 0 1 , P r o m e g a ) . T h e r e a c t i o nw a s c a r r i e d o u t a t 3 7 C f o r 1 h o u r a n d t h e n s t o p p e d b y b o i l i n gt h e s a m p l e f o r 2 m i n a n d c o o l i n g i t o n i c e a f t e r w a r d .P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o nPCR w a s p e r f o r m e d i n a 0 . 6 m L E p p e n d o r f t u b e b y a d d i n g 2A L o f cDNA o r 2 0 n g o f t o t a l R NA t o a t o t a l v o l u m e o f 5 0 y I Lo f 1 0 mM T r i s . H C l , pH 9 . 0 , 5 0 mM K C l , 1.5mM M g C l 2 , 0 . 2mM o f e a c h d N T P , 0 . 1 m g / m l g e l a t i n , 0 . 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , 0 . 5, u M o f e a c h p r i m e r , a n d 3 U TaqDNA P o l y m e r a s e ( C a t . N o .M 1 8 6 1 , P r o m e g a ) . T h e s e q u e n c e s o f t h e p r i m e r s u s e d f o r t h ea m p l i f i c a t i o n o f 0 2 - m i c r o g l o b u l i n ( 5 'I-ACCCCCACTG-AAAAA G A T G A a n d 5'I-ATCTTCAAACCTCCATGATG) a sw e l l a s t h e m u l t i d r u g r e s i s t a n c e (MDR) g e n e 1(5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG a n d 5 ' - G T T C A A A C T T -CTGCTCCTGA) w e r e e x a c t l y a s d e s c r i b e d b y N o o n a n e t a l .( 2 3 ) . T o g e t h e r w i t h t h e p r i m e r s u s e d f o r t h e a m p l i f i c a t i o n o fM D R - 3 , w h i c h w e r e M D R - 3 / 2 0 6 1 , 5'-TGTCAGAAGAGCC-TT GAT GT GG, a n d M D R - 3 / 2 1 9 3 , 5 '-TGGCAATGGCACATA-CTGTTCC, r e s p e c t i v e l y , t h e y w e r e s y n t h e s i z e d o n a n a u t o m a t e dDNA S y n t h e s i z e r ( M o d e l 3 8 1 A , A p p l i e d B i o s y s t e m s , S a n J o s e ,C A , U S A ) u s i n g p h o s p h o r a m i d i t e c h e m i s t r y a n d p u r i f i e d b ym e a n s o f o l i g o n u c l e o t i d e p u r i f i c a t i o n c a r t r i d g e s ( C a t . N o .4 0 0 7 7 1 , A p p l i e d B i o s y s t e m s ) . T h i r t y c y c l e s o f a m p l i f i c a t i o n w e r ec a r r i e d o u t i n a t h e r m o c y c l e r ( M J R e s e a r c h I n c . , MA, U S A )w i t h a 9 4 C d e n a t u r a t i o n s t e p f o r 3 5 s , a 5 7 C a n n e a l i n g s t e pf o r 3 0 s , a n d a 7 3 C e x t e n s i o n s t e p f o r 6 0 s . B e g i n n i n g a t c y c l e1 6 e a c h f o l l o w i n g DNA s y n t h e s i s s t e p w a s e l o n g a t e d f o r 5 s .F i n a l l y , s a m p l e s w e r e c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e .P u r i f i c a t i o n o f P CR p r o d u c t sI n o r d e r t o o b t a i n a s t a n d a r d f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f a c a l i b r a t i o nc u r v e s e v e r a l PCR s a m p l e s c o n t a i n i n g a 4 0 4 - b p p r o d u c t w e r ep o o l e d a n p u r i f i e d b y m e a n s o f s i z e - e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y ,f o r w h i c h p r e p a c k e d B i o - S p i n 3 0 ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ,H e r c u l e s , C A , U S A ) c o l u m n s w e r e u s e d . T h e c o l u m n s w e r ew a s h e d t h r e e t i m e s w i t h TE b u f f e r , b e f o r e 6 0 A L o f PCR s a m p l ew e r e a p p l i e d t o t h e t o p o f t h e g e l b e d . T h e c o l u m n w a sc e n t r i f u g e d i n a s w i n g i n g b u c k e t a t 110xg f o r 4 m i n . T h i sp r o c e d u r e w a s r e p e a t e d t w o t i m e s w i t h 8 0 A L o f TE b u f f e r . T h ee l u t e d DN A w a s t h e n p r e c i p i t a t e d w i t h 0 . 1 v o l u m e o f 3 M s o d i u ma c e t a t e , pH 5 . 0 , a n d 1 v o l u m e o f i s o p r o p a n o l , s t o r e d a t -20 C o v e r n i g h t , a n d c e n t r i f u g e d a t 1 5 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n . T h es u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h e p e l l e t w a s r i n s e d w i t h 75%e t h a n o l , d r i e d u n d e r v a c u u m a n d u s u a l l y r e s u p e n d e d i n 2 2 , t Lo f TE b u f f e r p r i o r t o a n a l y s i s b o t h b y m e a n s o f s p e c t r o p h o t o m e t r y( L a m b d a 2 UV/VIS S p e c t r o p h o t o m e t e r , P e r k i n E l m e r ,U b e r l i n g e n , F R G ) , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e c o n t e n t o f p u r i f i e dPCR p r o d u c t , a s w e l l a s b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y .H i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h yT h e HPLC s y s t e m c o n s i s t e d o f a h i g h - p r e c i s i o n pump ( M o d e l4 8 0 G T , G y n k o t e k , G e r m e r i n g , F R G ) , a d e g a s s e r ( L i l i p u t ,G y n k o t e k ) , a c o l u m n o v e n ( M o d e l STH 5 8 5 , G y n k o t e k ) , av a r i a b l e w a v e l e n g t h U V - m o n i t o r ( M o d e l U V D - 1 6 0 , G y n k o t e k ) ,a b i o c o m p a t i b l e s a m p l e i n j e c t i o n v a l v e ( M o d e l 9 1 2 5 , R h e o d y n eI n c . , C o t a t i , C A , USA) w i t h a 1 0 - , t l s a m p l e l o o p , a n d a P C -b a s e d d a t a s y s t e m ( G y n k o S o f t , V e r s i o n 3 . 1 2 , G y n k o t e k ) .

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 3 , V o l . 2 1 , N o . 5 1 0 6 3PS-DVB b e a d s w e r e p r e p a r e d b y a t w o - s t e p m i c r o s u s p e n s i o nm e t h o d ( 1 7 , 2 4 ) . S u b s e q u e n t l y , p a r t o f t h e m a t e r i a l w a s a l k y l a t e du n d e r F r i e d e l - C r a f t s c o n d i t i o n s ( A u s t r i a n p a t e n t f i l e d , N o .2 2 8 5 / 9 2 ) . D e p e n d i n g o n th e d i m e n s i o n s o f t h e s t a i n l e s s s t e e lc o l u m n u s e d f o r p a c k i n g , e i t h e r 0 . 6 g ( 3 0 x 4 . 6 mmI . D . ) o r 1 . 1

g ( 5 O x 4 . 6 mm I . D . ) o f t h e m o d i f i e d b e a d s w e r e s u s p e n d e d i nt e t r a h y d r o f u r a n e . T h e n t h e s l u r r y w a s s o n i c a t e d a n d p a c k e d i n t ot h e c o l u m n a t a pressure o f 7 0 M Pa w i t h t h e use o f a n a i r - d r i v e npump ( M o d e l M a x i m a t o r M SF 1 1 1 , Amman n T e c h n i k , K o l l i k e n ,C H ) a n d m e t h a n o l a s t h e d r i v i n g s o l v e n t . T h e r e a f t e r , m e t h a n o lw a s r e p l a c e d w i t h w a t e r a t t h e s a m e i n l e t pressure.G r a d i e n t p r o f i l e s a r e g i v e n o n e a c h c h r o m a t o g r a m . T h eaqueous b u f f e r w a s 0 . 1 M TEAA, pH 7 . 0 , t h r o u g h o u t t h e s t u d y .I n o r d e r t o k e e p t h e c o n c e n t r a t i o n o f TEAA c o n s t a n t a n d n o tt o b e a f f e c t e d b y v o l u m e c o n t r a c t i o n d u r i n g m i x i n g o f o r g a n i cs o l v e n t s w i t h w a t e r , t h e m o b i l e p h a s e w a s p r e p a r e d a s f o l l o w s :f o r a 2 5 % s o l u t i o n o f a c e t o n i t r i l e i n 0 . 1 M TEAA, 5 0 m l o f t h e2 M TEAA s t o c k s o l u t i o n w e r e a d d e d t o 2 5 0 m l o f a c e t o n i t r i l ei n a 1 0 0 0 m l v o l u m e t r i c f l a s k a n d t h e f i n a l v o l u m e w a s m a d eu p t o 1 0 0 0 m l b y t h e a d d i t i o n o f w a t e r .P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i sT e n / t L o f e a c h P CR s a m p l e o r c h r o m a t o g r a p h i c a l l y i s o l a t e dDNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t w e r e s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d eg e l s i n TBE b u f f e r ( 9 0 mM T r i s - b o r a t e , 1 mM E DT A, p H 8 . 3 ) .S e p a r a t i o n s w er e c a r r i e d o u t i n a s m a l l v e r t i c a l M i n i - P r o t e a n I Ie l e c t r o p h o r e s i s c e l l ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ) a t a c o n s t a n t v o l t a g eo f 8 0 V f o r 9 0 m i n . S u b s e q u e n t l y , t h e g e l s w e r e s t a i n e d i n as o l u t i o n o f 0 . 5 , u g / m L e t h i d i u m b r o m i d e i n TBE b u f f e r f o r 2 5m i n a n d p h o t o g r a p h e d .RESULTS AND DISCUSSIONC h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s t a t i o n a r y p h a s eB e c a u s e o f t h e i r u n i f o r m s i z e ( 2 . 1 0 . 1 2 i t m , N = 2 5 7 ) , n os i e v i n g o f t h e u n m o d i f i e d non-porous PS-DVB p a r t i c l e s w a sr e q u i r e d f o l l o w i n g t h e i r s y n t h e s i s . B o t h t h e n a r r o w s i z ed i s t r i b u t i o n a s w e l l a s t h e n o n - p o r o s i t y o f t h e p a r t i c l e s a l l o w am i n i m i z a t i o n o f t h e l e n g t h o f d i f f u s i o n p a t h s . T h i s y i e l d s b o t ha n o p t i m u m o f r e s o l u t i o n a s w e l l a s a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i nt i m e o f a n a l y s i s c o m p a r e d t o a porous s t a t i o n a r y p h a s e ( 2 0 ) .A n o t h e r m a j o r a d v a n t a g e o f t h e non-porous PS-DVB a d s o r b e n ti s t h a t t h e t o t a l l y o r g a n i c p o l y m e r i s o p e r a b l e o ve r a w i d e p H -r a n g e , t y p i c a l l y 1 - 1 3 , w i t h o u t an y d a m a g e o c c u r r i n g t o t h ep a c k i n g . T h i s r e s u l t s i n h i g h c o l u m n l i f e - t i m e a n d a l l o w s t h e e a s yr e g e n e r a t i o n o f a d e t e r i o r a t e d c o l u m n w i t h aqueous s o d i u mh y d r o x i d e or o r g a n i c s o l v e n t s . A s s e e n i n F i g u r e l a , dsDNAr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s l a r g e r t h a n a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 b a s e p a i r si n l e n g t h c o u l d n o t b e r e s o l v e d s u f f i c i e n t l y o n u n m o d i f i e d P S -DVB p a r t i c l e s . A s i n t h e case o f o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 8 ) , a ni m p r o v e m e n t i n r e s o l v i n g p o w e r w a s o b t a i n e d upo n i n c o r p o r a t i o no f p o l y v i n y l a l c o h o l d u r i n g p o l y m e r i s a t i o n ( F i g . l b ) . An evenh i g h e r d e g r e e o f r e s o l u t i o n , w h i c h e v e n a l l o w e d t h e e f f i c i e n ts e p a r a t i o n o f dsDNA f r a g m e n t s l a r g e r than 2 0 0 b a s e p a i r s i n s i z e ,w a s a c h i e v e d b y a l k y l a t i n g t h e PS-DVB p a r t i c l e s w i t h o c t a d e c y lgroups ( F i g . I c ) . T h i s i s a consequence o f t h e e f f e c t i v e s h i e l d i n go f t h e a r o m a t i c r i n g s o f t h e PS-DVB m a t r i x w h i c h o t h e r w i s eu n w a n t e d l y i n t e r a c t w i t h t h e n u c l e o b a s e s t h a t r e p r e s e n t th eh y d r o p h o b i c m o i e t i e s o f t h e a m p h i p h i l i c p o l y n u c l e o t i d e s .O p t i n i z a t i o n o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n sF i g u r e 2 s h o w s , t h a t t h e r e s o l u t i o n o f DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t si n c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f TEAA i n t h e m o b i l e

A0.002AU

I

I1 1 ^ AA

F i g u r e 1 . C o m p a r i s o n o f u n c o a t e d ( a ) a n d c h e m i c a l l y m o d i f i e d ( b , c ) PS-DVBp a r t i c l e s i n t h e a n a l y s i s o f D NA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . C o l u m n s : ( a ) P S - D V B ,( b ) PS-DVB-PVA a n d ( c ) P S - D V B - C 1 8 , 2 . 1 / A m , 3 0 x 4 . 6 mm I . D . ; m o b i l ep h a s e : 0 . 1 M TEAA, pH 7 . 0 ; l i n e a r g r a d i e n t f r o m 7 . 5 - 1 3 . 7 5 % a c e t o n i t r i l e i n4 m i n , f o l l o w e d b y 1 3 . 7 5 - 1 6 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n 6 m i n ; f l o w - r a t e : 1 m l / m i n ;t e m p e r a t r e : 5 0 C ; d e t e c t i o n : UV, 2 5 4 n m ; s a m p l e : p B R 3 2 2 D N A - H a e I I I d i g e s t ,0 . 5 A g .

1 4 A1 4 . '

1 1 . !

8 1

0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 50 0 600b a s e p a i r sF I g u r e 2 . E f f e c t o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f TEAA i n t h e e l u a n t o n t h e c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n o f DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . C o l u m n : P S - D V B - C 1 8 , 2 . 1 A m ,3 0 x 4 . 6 mm I . D . ; m o b i l e p h a s e : ( a ) 0 . 0 2 5 M, ( b ) 0 . 0 5 M, ( c ) 0 . 0 7 5 M, ( d )0 . 1 M, a n d ( e ) 0 . 1 2 5 M TEAA, r e s p e c t i v e l y , pH 7 . 0 ; l i n e a r g r a d i e n t f r o m7 . 5 - 1 3 . 7 5 % a c e t o n i t r i l e i n 4 m i n , f o l l o w e d b y 1 3 . 7 5 - 1 6 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n6 m i n ; f l o w - r a t e : 1 m l / m i n ; t e m p e r a t u r e : 5 0 C ; d e t e c t i o n : U V , 2 5 4 n m ; s a m p l e :p B R 3 2 2 D N A - H a e H I d i g e s t , 0 . 5 j i g .

p h a s e . T h i s i s e s p e c i a l l y t r u e f o r f r a g m e n t s l a r g e r t h a n 3 0 0 b a s ep a i r s i n l e n g t h . In t h i s c o n n e x i o n , i t i s i m p o r t a n t t o u n d e r s t a n dt h e p r i n c i p a l m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n I P - R P - H P L C ( 1 5 ) . F i r s t l y ,t h e r e t e n t i o n sequence i s c o n t r o l l e d b y t h e c h a r g e o f t h ep o l y n u c l e o t i d e s , thus d e t e r m i n i n g t h e n u m b e r o f i o n p a i r s f o r m e d .T h i s e n a b l e s I P - R P - H P L C t o s e p a r a t e p o l y d e o x y n u c l e o t i d e sr e l i a b l y a c c o r d i n g t o t h e i r c h a i n l e n g t h , l a r g e l y i r r e s p e c t i v e o ft h e i r b a s e c o m p o s i t i o n ( 1 9 , 2 5 ) . S e c o n d l y , t h e d e g r e e o f r e t e n t i o ni s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e c h a i n l e n g t h o f t h e n - a l k y l g r o u po f t h e i o n p a i r i n g r e a g e n t . H o w e v e r , t r i e t h y l a m m o n i u m a c e t a t e

6 I % a c e t o n i t r i l e3 .

7- ~ ~ ~ 0 0 m 0 0mT---am* m --nnI

8/6/2019 Non Porous Polystyene Divenyl

4/6

1 0 6 4 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 3 , V o l . 2 1 , N o . 5

0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 500 600base p a i r s

F i g u r e 3 . P e r c e n t a g e o f a c e t o n i t r i l e n e e d e d f o r e l u t i o n o f r e s t r i c t i o n f r a g m e n t sf r o m p B R 3 2 2 DNA c l e a v e d w i t h H a e l I , d e p e n d i n g o n t h e TEAA c o n c e n t r a t i o n .C h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s a s i n F i g . 2 .

65 -

4 -321 .

0

R s7 S r__--.~/I~~,

I - - - 1 6 2 M 2 0 - . - 3 9 2 / 4 9 5 --770_1057. 2 . 4 . 6 . 8 1

flow r a t e [ m l / m i n ] 1 . 2

F i g u r e 5 . E f f e c t o f e l u a n t f l o w - r a t e o n t h e r e s o l u t i o n o f s e l e c t e d p a i r s o f DNAr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s f r o m t h e p B R 3 2 2 D N A - H a e I l d i g e s t . C o l u m n : P S - D V B -C 1 8 , 2 . 1 A m , 3 0 x 4 . 6 mm I . D . ; m o b i l e p h a s e : 0 . 1 M TEAA, pH 7 . 0 ; l i n e a rg r a d i e n t f r o m 7 . 5 - 1 3 . 7 5 % a c e t o n i t r i l e i n 4 m i n , f o l l o w e d b y 1 3 . 7 5 - 1 8 . 7 5 %a c e t o n i t r i l e i n 1 2 m i n ; f l o w - r a t e : 0 . 2 - 1 m I / m i n ; t e m p e r a t u r e : 5 0 C ; d e t e c t i o n :U V , 2 5 4 n m ; s a m p l e : I X - 1 7 4 D N A - H i n c I l d i g e s t , 0 . 6 5 p g .

F i g u r e 4 . E f f e c t o f c o l u m n t e m p e r a t u r e o n t h e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o fDNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . C o l u m n : P S - D V B - C 1 8 , 2 . 1 p m , 3 0 x 4 . 6 mm I . D . ;m o b i l e p h a s e : 0 . 1 M TEAA, pH 7 . 0 ; l i n e a r g r a d i e n t f r o m 7 . 5-1 3 . 7 5 % a c e t o n i t r i l ei n 4 m i n , f o l l o w e d b y 1 3 . 7 5 - 1 6 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n 6 m i n ; f l o w - r a t e : 1 m l / m i n ;t e m p e r a t u r e : 20-70 C ; d e t e c t i o n : UV, 2 5 4 nm; s a m p l e : p B R 3 2 2 D N A - H a e E l Id i g e s t , 0 . 5 p 4 g .w a s n o t o n l y c h o s e n b e c a u s e i t a l l o w s t h e f a s t e r e l u t i o n o fp o l y n u c l e o t i d e s c o m p a r e d t o t h e more c o m m o n l y u s e dt e t r a b u t y l a m m o n i u m s a l t s b u t a l s o b e c a u s e i t ca n b e r e m o v e d

F i g u r e 6 . H i g h - r e s o l u t i o n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f 3 1 DNA r e s t r i c t i o nf r a g m e n t s . C o l u m n : P S - D V B - C 1 8 , 2 . 1 p m , 5 0 x 4 . 6 mm I . D . ; m o b i l e p h a s e : 0 . 1M T E A A , pH 7 . 0 ; l i n e a r g r a d i e n t f r o m 8 . 7 5 - 1 1 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n 2 m i n ,1 1 . 2 5 - 1 4 . 5 % a c e t o n i t r i l e i n 1 0 m i n , 1 4 . 5 - 1 5 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n 4 m i n , a n d1 5 . 2 5 - 1 6 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n 4 m i n ; f l o w - r a t e : 1 m l / m i n ; t e m p e r a t u r e : 5 0 C ;d e t e c t i o n : U V , 2 5 4 n m ; s a m p l e : p B R 3 2 2 D N A - H a e H I d i g e s t , 0 . 7 5 g g , a n d4 X - 1 7 4 D N A - H i n c I d i g e s t , 0 . 6 5 p 4 g , r e s p e c t i v e l y .b y e v a p o r a t i o n ( 2 0 ) . T h i r d l y , p o l y n u c l e o t i d e s a r e r e t a i n e d t h el e s s t h e h i g h e r t h e s o l v e n t s t r e n g t h o f t h e m o b i l e p h a s e .F i g u r e 3 s h o w s t h e e f f e c t o f TEAA i n d e t a i l . A b o v e ac o n c e n t r a t i o n o f 7 5 mM o f TEAA, i o n - p a i r f o r m a t i o n h a s r e a c h e dn e a r l y i t s maximum w i t h r e g a r d t o DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t ss h o r t e r t h a n 2 0 0 b a s e p a i r s , b e c a u s e t h e i r r e t e n t i o n b e h a v i o u rr e m a i n s a l m o s t t h e s a m e . T h i s i s r e f l e c t e d i n t h e p e r c e n t a g e o fa c e t o n i t r i l e n e e d e d f o r t h e i r e l u t i o n . O n l y f o r l o n g e r f r a g m e n t s ,a f u r t h e r i n c r e a s e i n r e t e n t i o n i s n o t e d a n d t h e r e f o r e , m o r ea c e t o n i t r i l e i s r e q u i r e d t o e l u t e t h e m . A s f a r a s r e s o l u t i o n i sc o n c e r n e d , t h e i n c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f TE AA f r o m 2 5

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5/6

N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 3 , V o l . 2 1 , N o . 5 1 0 6 5- . - 5 8 7- 4 3 4. - . . - 2 6 7-1 3 2- - 1 3 2- - - 8 0

b i - - 5 1

. 2 4. 2 2. 2 0. 1 8

. 1 6

. 1 4

. 1 2. 1 0

. 0 8*NN co>* N.te q

c o t oCL

. 0 1 . 1 II g 9 I n j e t e d

F i g u r e 9 . D e p e n d e n c e o f t h e p e a k h a l f - w i d t h o n s a m p l e l o a d i n g . C o l u m n : P S -D V B - C 1 8 , 2 . 1 i t m , 5 0 x 4 . 6 mm I . D . ; m o b i l e p h a s e : 0 . 1 M T E A A , pH 7 . 0 ;l i n e a r g r a d i e n t f r o m 1 2 . 5 - 1 7 . 5 % a c e t o - n i t r i l e i n 5 m i n ; f l o w - r a t e : 0 . 7 5 m l / m i n ;t e n p e r a t u r e : 5 0 C ; d e t e c t i o n : U V , 2 5 4 n m ; s a m p l e : 4 0 4 - b p PCR p r o d u c t , p u r i f i e db y s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y .8 m i n

F i g u r e 7 . H i g h - r e s o l u t i o n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f three PCR p r o d u c t ss p i k e d w i t h r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s f r o m a p B R 3 2 2 D N A - H a e J l d i g e s t . C o l u m n :P S - D V B - C I 8 , 2 . 1 A m , 5 0 x 4 . 6 mm I . D . ; m o b i l e p h a s e : 0 . 1 M TEAA, pH 7 . 0 ;l i n e a r g r a d i e n t f r o m 7 . 5 - 3 . 7 5 % a c e t o n i t r i l e i n 4 m i n , f o l l o w e d b y1 3 . 7 5 - 1 6 . 2 5 % a c e t o n i t r i l e i n 6 m i n ; f l o w - r a t e : 1 m l / m i n ; t e m p e r a t u r e : 5 0 C ;d e t e c t i o n : UV, 2 5 4 a m ; s a m p l e : 1 2 0 , 1 3 2 a n d 1 6 7 - b p PCR p r o d u c t s , r e s p e c t i v e l y ,a n d 0 . 5 j i g o f a p B R 3 2 2 D N A - H a e I l d i g e s t ; U = u n s p e c i f i c PCR p r o d u c t . T h ei s o l a t e d r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o f t h e p B R 3 2 2 D N A - H a e I l d i g e s t were s u b s e q u e n d ys e p a r a t e d o n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l i n TBE b u f f e r f o r 9 0 m i n a t 8 0 V . G e l sw er e t h e n s t a i n e d i n TBE b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 5 , u g / m L e t h i d i u m b r o m i d e f o r 2 5m i n a n d p h o t o g r a p h e d .

1 0 pek w r a ( m A U - m l n )

. 0 1 . 1 I p i gF i g u r e 8 . C a l i b r a t i o n curve f o r a 4 0 4 - b p PCR p r o d u c t .

t o 1 2 5 mM i n t h e e l u a n t r e s u l t e d i n a l i n e a r e n h a n c e m e n t i ns e p a r a t i o n e f f i c i e n c y .F i g u r e 4 i l l u s t r a t e s t h e i m p a c t o f c o l u m n t e m p e r a t u r e o n t h er e s o l u t i o n o f DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . I t i s e v i d e n t t h a tr e t e n t i o n t i m e s i n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g c o l u m n t e m p e r a t u r e .C o n c o m i t a n t l y , r e s o l u t i o n a l s o i m p r o v e s a n d r e a c h e s i t s o p t i m u ma t a t e m p e r a t u r e o f 5 0 'C . The i n c r e a s e i n r e t e n t i o n i s mostp r o b a b l y t h e consequence o f a d e f o l d i n g a n d a d e r o t a t i n g o f t h ed o u b l e h e l i x , w h i c h exposes m o r e p h o s p h a t e g r o u p s f o r i o n - p a i rf o r m a t i o n a n d , c o n s e q u e n t l y , e n a b l e s s t r o n g e r i n t e r a c t i o n o f t h eDNA m o l e c u l e s w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e . A t e v e n h i g h e rt e m p e r a t u r e s , h o w e v e r , a r a p i d d e c r e a s e i n s e p a r a t i o n e f f i c i e n c yi s n o t e d . T h i s p h e n o m e n o n i s n o t r e l a t e d t o t h e m a t r i x , b e c a u s es i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t h p u r e PS-DVB. Th e

2T0.002 AU

I

I

0

4

2 m i nF i g u r e 1 0 . H i g h - s p e e d c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s e s o f P C R - p r o d u c t s . C o l u m n : P S -D V B - C 1 8 , 2 . 1 z m , 3 0 x 4 . 6 mm . D . ; m o b i l e p h a s e : 0 . 1 M TEAA, p H 7 . 0 ;l i n e a r g r a d i e n t f r o m 10-15% a c e t o n i t r i l e i n 2 m i n ; f l o w - r a t e : 1 . 5 m l / m i n ;t e m p e r a t u r e : 5 0 C ; d e t e c t i o n : UV, 2 5 4 a m ; s a m p l e : ( a ) n o r m a l m o n o n u c l e a rw h i t e b l o o d c e l l s , ( b ) c h r o n i c l y m p h a t i c l e u k e m i a ; 1 = u n s p e c i f i c PC R p r o d u c t ,2 = ( 3 2 - m i c r o g l o b u l i n ( 1 2 0 b p ) , 3 = m u l t i d r u g r e s i s t a n c e gene I I ( 1 3 2 b p ) , 4= m u l t i d r u g r e s i s t a n c e gene I ( 1 6 7 b p ) .

d e c r e a s e i n r e s o l u t i o n a n d t h e f i n a l f a i l u r e t o r e s o l v e t h e r e s t r i c t i o nf r a g m e n t s a t a l l i s r a t h e r d u e t o t h e d e n a t u r a t i o n o f t h e DNAm o l e c u l e s , w h i c h occurs i n non-aqueous s o l u t i o n s e a r l i e r t h a ni n aqueous s o l u t i o n s ( 2 6 ) .T h e f l o w - r a t e o f t h e e l u a n t a l s o e x e r t s a s i g n i f i c a n t i m p a c t o nr e s o l u t i o n ( F i g . 5 ) . I n t h e case o f r e l a t i v e l y s m a l l d o u b l e - s t r a n d e dp o l y n u c l e o t i d e s u p t o a c h a i n l e n g t h o f 2 0 0 b a s e p a i r s a n i n c r e a s ei n t h e f l o w - r a t e o f t h e e l u a n t a l l o w s a c o n c o m i t a n t e n h a n c e m e n ti n r e s o l u t i o n d u e t o t h e m i n i m i z a t i o n o f d i s p e r s i o n . B u t t h e l o n g e rt h e DNA m o l e c u l e s grow, t h e m o r e p r o m i n e n t b e c o m e s t h e i rm a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e t o move b e t w e e n t h e s t a t i o n a r y a n d t h em o b i l e p h a s e . T h i s causes a n i n c r e a s e i n p e a k w i d t h w i t hi n c r e a s i n g f l o w - r a t e . T h e r e f o r e , a f l o w - r a t e a s l o w a s 0 . 4 m l / m i n

mAU

d N T P s &primers

l n

2 4

1 8 -

1 2 -

6 -

p e a k h a l f - w i d t h ( m i n )

- u n

a T - - T6 -2 46

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6/6

1 0 6 6 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 3 , V o l . 2 1 , N o . 5i s p r e f e r a b l e f o r t h e s e p a r a t i o n o f d o u b l e - s t r a n d e d p o l y n u c l e o t i d e sl a r g e r t h a n a p p r o x i m a t e l y 6 0 0 b a s e p a i r s .F i g u r e 6 s h o w s t h e s e p a r a t i o n o f a m i x t u r e o f 3 1 DNAr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o b t a i n e d b y t h e c l e a v a g e o f p B R 3 2 2 DNAw i t h H a e I f a n d 4 ' X - 1 7 4 DNA w i t h H i n c H , r e s p e c t i v e l y . I t c a nb e c l e a r l y s e e n t h a t u n d e r o p t i m i z e d c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n so n e b a s e - p a i r r e s o l u t i o n i s o b t a i n e d f o r f r a g m e n t s s h o r t e r t h a na p p r o x i m a t e l y 1 5 0 b a s e p a i r s . T h e r e a f t e r , s e p a r a t i o n e f f i c i e n c yd e c r e a s e s g r a d u a l l y .Q u a n t i t a t i o n o f P C R p r o d u c t sF i g u r e 7 s h o w s t h e s e p a r a t i o n o f t h r e e PCR p r o d u c t s s p i k e d w i t ha p B R 3 2 2 D N A - H a e I H d i g e s t . S u b s e q u e n t l y , t h e i n d i v i d u a lr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s w e r e i s o l a t e d a n d s u b j e c t e d t op o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n o r d e r t o c o n f i r m t h e i re l u t i o n o r d e r . I t i s e v i d e n t t h a t I P - R P - H P L C a l l o w s t h e s e p a r a t i o no f DNA m o l e c u l e s a c c o r d i n g t o t h e i r s i z e . T h i s i s i n c o n t r a s tt o a n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( 1 2 , 1 3 ) w h i c h f a i l e d t os e p a r a t e t h e s a m e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s a c c o r d i n g t o t h e i r l e n g t h ,b e c a u s e A T - p a i r s h a v e b e e n s h o w n t o i n t e r a c t m o r e s t r o n g l y w i t ht h e s t a t i o n a r y p h a s e t h a n G C - p a i r s ( 1 2 ) .T h e c h r o m a t o g r a m a l s o d e m o n s t r a t e s t h e h i g h s e n s i t i v i t y o fo n - c o l u m n U V d e t e c t i o n , w h i c h p e r m i t t e d t h e d e t e r m i n a t i o n o fa PCR a m p l i f i e d 4 0 4 - b p g e n e f r a g m e n t w i t h a l o w e r m a s sd e t e c t i o n l i m i t o f 0 . 0 0 6 p i g . T h i s i s e q u a l t o a m i n i m u m d e t e c t a b l ec o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 n g / m l u s i n g a 2 0 - / i l s a m p l e l o o p . T h i s v a l u ec o m p a r e s f a v o u r a b l y t o t h e c o n c e n t r a t i o n s e n s i t i v i t y r e p o r t e d f o ro n - c o l u m n UV a b s o r b a n c e d e t e c t i o n i n c a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( 8 ) . M o r e o v e r , t h e c a l i b r a t i o n c u r v e ( F i g . 8 ) ,w h i c h h a d b e e n o b t a i n e d f o r t h e 4 0 4 - b p PCR p r o d u c t , s h o w e de x c e l l e n t l i n e a r i t y ( r = 0 . 9 5 7 ) o v e r a r a n g e o f m o r e t h a n 2m a g n i t u d e s ( 0 . 0 0 6 - 1 . 8 A t g ) , a s a s s e s s e d b y t h e e v a l u a t i o n o f al o g ( s i g n a l ) v e r s u s l o g ( c o n c e n t r a t i o n ) p l o t ( 2 7 ) . T h e r e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n i n p e a k a r e a m e a s u r e m e n t s w a s l e s s t h a n 5 %a s d e t e r m i n e d w i t h t e n r e p e a t e d i n j e c t i o n s o f t h e 4 0 4 - b p PCRp r o d u c t .T h e l o a d i n g c a p a c i t y w a s e v a l u a t e d b y i n j e c t i n g i n c r e a s i n ga m o u n t s o f a 4 0 4 - b p PCR p r o d u c t p u r i f i e d c h r o m a t o g r a p h i c a l l yb y m e a n s o f a p o l y a c r y l a m i d e s i z e e x c l u s i o n g e l . S u b s e q u e n t l y ,t h e p e a k h a l f - w i d t h w a s p l o t t e d a g a i n s t t h e s a m p l e l o a d ( F i g . 9 ) .I t r e m a i n e d c o n s t a n t a t s a m p l e l o a d s u p t o a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 i t g ,a n d t h e n i n c r e a s e d w i t h f u r t h e r i n c r e a s e i n t h e s a m p l e l o a d .H o w e v e r , f o r s e m i p r e p a r a t i v e p u r p o s e s a t l e a s t 5 j i g o f DNAc a n b e a p p l i e d w i t h l i t t l e d e c r e a s e i n r e s o l u t i o n .T h e r e c o v e r y o f t h e 4 0 4 - b p PCR p r o d u c t f r o m t h e P S - D V B -C 1 8 c o l u m n w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g i t s p e a k a r e a b o t hw i t h t h e c o l u m n i n p l a c e a s w e l l a s a f t e r i t s r e p l a c e m e n t w i t ha n i n t e r n a l u n i o n . T h e r e c o v e r y r a t e w a s 9 7 . 5 % . F u r t h e r m o r e ,n o c r o s s - c o n t a m i n a t i o n w a s d e t e c t e d . T h e r e f o r e , I P - R P - H P L Co n n o n - p o r o u s P S - D V B - C 1 8 b e a d s c a n b e c o n s i d e r e d a ne x c e l l e n t t o o l f o r t h e r a p i d a n a l y s i s a n d m i c r o p u r i f i c a t i o n o fd o u b l e - s t r a n d e d p o l y n u c l e o t i d e s w i t h o u t a n y p r i o r s a m p l ep r e t r e a t m e n t , a s c o n f i r m e d b y t h e e v a l u a t i o n o f t h e e x p r e s s i o no f 3 - m i c r o g l o b u l i n a n d t h e m u l t i d r u g r e s i s t a n c e g e n e s I a n d I I Ii n m o n o n u c l e a r w h i t e b l o o d c e l l s o b t a i n e d f r o m a c o n t r o l( F i g . l O a ) a s w e l l a s f r o m a p a t i e n t s u f f e r i n g f r o m c h r o n i cl y m p h a t i c l e u k e m i a ( F i g . l O b ) . F u r t h e r m o r e , a n a l y s e s c a n b ec a r r i e d o u t w i t h a h i g h d e g r e e o f r e p r o d u c i b i l i t y , t h e m e a n r e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e r e t e n t i o n t i m e s h a s b e e n 3 . 4 % f o r 4 2m e a s u r e m e n t s .

CONCLUSIONSI t i s c o n c l u d e d t h a t I P - R P - H P L C o n a l k y l a t e d n o n - p o r o u s s t y r e n e -d i v i n y l b e n z e n e c o p o l y m e r s r e p r e s e n t s t h e f i r s t r e a l a l t e r n a t i v et o g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A l l o w i n g a n e q u a l s a m p l e t h r o u g h p u t ,n o t i m e - c o n s u m i n g a n d l a b o r i o u s p o u r i n g o f g e l s a s w e l l a s n os t a i n i n g w i t h t h e m u t a g e n i c e t h i d i u m b r o m i d e a r e r e q u i r e d .M o r e o v e r , q u a n t i t a t i o n c a n b e a c h i e v e d d i r e c t l y b y m e a n s o f U Va b s o r b a n c e a t 2 5 4 n m w i t h o u t t h e n e e d f o r a n e x p e n s i v e t w o -d i m e n s i o n a l g e l s c a n n e r . A n d i n c o m p a r i s o n w i t h c a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i s , n o t o n l y f a s t e r s e p a r a t i o n s a r e a c h i e v e d , b u t PCRp r o d u c t s m a y b e a l s o a n a l y z e d w i t h o u t p r i o r p u r i f i c a t i o n .REFERENCES

1 . S t e l l w a g e n , N . C . ( 1 9 8 7 ) A d v . E l e c t r o p h o r e s i s 1 , 1 7 7 - 2 2 8 .2 . G o r d o n , M . J . , H u a n g , X . , P e n t o n e y , S . L . a n d Z a r e R . N . ( 1 9 8 8 ) S c i e n c e2 4 2 , 2 2 4 - 2 2 8 .3 . K u h r , W . G . ( 1 9 9 0 ) A n a l . C h e m . 6 2 , 4 0 3 R - 4 1 4 R .4 . G u t t m a n , A . , C o h e n , A . S . , H e i g e r , D . N . a n d K a r g e r , B . L . ( 1 9 9 0 ) A n a l .C h e m . 6 2 , 1 3 7 - 1 4 1 .5 . H e i g e r , D . N . , C o h e n , A . S . a n d K a r g e r , B . L . ( 1 9 9 0 ) J . C h r o m a t o g r . 5 1 6 ,3 3 - 4 8 .6 . K a s p e r , T . J . , M e l e r a , M . , G o z e l , P . a n d B r o w n l e e , R . G . ( 1 9 8 8 ) J .C h r o m a t o g r . 4 5 8 , 3 0 3 - 3 1 2 .7 . C o h e n , A . S . , N a j a r i a n , D . , S m i t h , J . A . a n d K a r g e r , B . L . ( 1 9 8 8 ) J .C h r o m a t o g r . 4 5 8 , 3 2 3 - 3 3 3 .8 . N a t h a k a m k i t k o o l , S . , O e f n e r , P . J . , B a r t s c h , G . , C h i n , M . A . a n d B o n n , G . K .( 1 9 9 2 ) E l e c t r o p h o r e s i s 1 3 , 1 8 - 3 1 .9 . H a r d i e s , S . C . a n d W e l l s , R . D . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 3 ,3 1 1 7 - 3 1 2 1 .1 0 . L a n d y , A . , F o e l l e r , C . , R e s z e l b a c h , R . a n d D u d o c k , B . ( 1 9 7 6 ) N u c l . A c i d sR e s . 3 , 2 5 7 5 - 2 5 9 2 .1 1 . E s h a g h p o u r , H . a n d C r o t h e r s , D . M . ( 1 9 7 8 ) N u c l . A c i d s R e s . 5 , 1 3 - 2 1 .1 2 . W e s t m a n , E . , E r i k s s o n , S . , L a a s , T . , P e r n e m a l m , P . - A . a n d S k o l d S . - E .( 1 9 8 7 ) A n a l . B i o c h e m . 1 6 6 , 1 5 8 - 1 7 1 .1 3 . K a t o , Y . , Y a m a s a k i , Y . , O n a k a , A . , K i t a m u r a , T . , H a s h i m o t o , T . , M u r o t s u ,T . , F u k u s h i g e , S . a n d M a t s u b a r a , K . ( 1 9 8 9 ) J . C h r o m a t o g r . 4 7 8 , 2 6 4 - 2 6 8 .1 4 . K a t z , E . D . , H a f f , L . A . a n d E k s t e e n , R . ( 1 9 9 0 ) J . C h r o m a t o g r . 5 1 2 ,4 3 3 - 4 4 4 .1 5 . J o s t , W . , U n g e r , K . a n d S c h i l l , G . ( 1 9 8 2 ) A n a l . B i o c h e m . 1 1 9 , 2 1 4 - 2 2 3 .1 6 . K w i a t k o w s k i , M . , S a n d s t r o m , A . , B a l g o b i n , N . a n d C h a t t o p a d h y a y a , J .( 1 9 8 4 ) A c t a C h e m . S c a n d . B 3 8 , 7 2 1 - 7 3 3 .1 7 . H u b e r , C . G . , O e f n e r , P . J . a n d B o n n , G . K . ( 1 9 9 2 ) J . C h r o m a t o g r . 5 9 9 ,1 1 3 - 1 1 8 .1 8 . H u b e r , C . G . , O e f n e r , P . J . a n d B o n n , G . K . ( 1 9 9 2 ) A n a l . B i o c h e m . , i n p r e s s .1 9 . U s h e r , D . A . ( 1 9 7 9 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 6 , 2 2 8 9 - 2 3 0 6 .2 0 . E r i k s s o n , S . , G l a d , G . , P e r n e m a l m , P . - A . a n d W e s t m a n , E . ( 1 9 8 6 ) J .C h r o m a t o g r . 3 5 9 , 2 6 5 - 2 7 4 .2 1 . M a a , Y . a n d H o r v d t h , C . ( 1 9 8 8 ) J . C h r o m a t o g r . 4 4 5 , 7 1 - 8 6 .2 2 . C h i r g w i n , J . M . , P r z y b y l a , A . E . , M a c D o n a l d , R . J . a n d R u t t e r , W . J . ( 1 9 7 9 )B i o c h e m i s t r y 1 8 : 5 2 9 4 - 5 2 9 9 .2 3 . N o o n a n , K . E . , B e c k , C . , H o l z m a y e r , T . A . , C h i n , J . E . , W u n d e r , J . S . ,A n d r u l i s , I . L . , G a z d a r , A . F . , W i l l m a n , C . L . , G r i f f i t h , B . , V o n H o f f , D . D .a n d R o n i n s o n , I . B . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 7 : 7 1 6 0 - 7 1 6 4 .2 4 . W o n g y a i , S . , V a r g a , J . M . a n d B o n n , G . K . ( 1 9 9 1 ) J . C h r o m a t o g r . 5 3 6 ,1 5 5 - 1 6 4 .2 5 . H a u p t , W. a n d P i n g o u d , A . ( 1 9 8 3 ) J . C h r o m a t o g r . 2 6 0 , 4 1 9 - 4 2 7 .2 6 . M i c h e l s o n , A . M . ( 1 9 6 3 ) T h e C h e m i s t r y o f N u c l e o s i d e s a n d N u c l e o t i d e s ,A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n , p p . 5 0 9 - 5 1 2 .2 7 . S c o t t , R . P . W . ( 1 9 8 6 ) L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y D e t e c t o r s , J o u r n a l o fC h r o m a t o g r a p h y L i b r a r y , V o l . 3 3 , E l s e v i e r , A m s t e r d a m , p p . 1 2 - 1 4 .