Normalización Validacion-M

Normalización y validación

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2

Qué es una norma??

Standard(palabra inglesa)

Documento normativo

Patrón de

medida

En cienciay tecnología

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3

Qué es una norma??

• Un documento, establecido por consenso y aprobado por un organismo reconocido, que establece, para uso común y repetido, reglas, directrices o características para ciertas actividades o sus resultados, con el fin de conseguir un grado óptimo de orden en un contexto dado.

» EN 45020:1993 Glosario de términos sobre Normalización ..

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Términos equivalentes

• Norma– Un modelo aceptado o aprobado de alguna cosa frente a

la cual otros son juzgados– Un nivel de excelencia o calidad

• Guía– Un principio propuesto para asignar estándares o

determinar una línea de acción

• Criterio– Un estándar por el que alguna cosa puede ser juzgada o

decidida

• Principio– Un estándar o regla de conducta

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Normalización

• La normalización o estandarización es la redacción y aprobación de normas que se establecen para garantizar el acoplamiento de elementos construidos independientemente, así como garantizar el repuesto en caso de ser necesario, garantizar la calidad de los elementos fabricados y la seguridad de funcionamiento

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Normalización

• Es la actividad que tiene por objeto establecer, ante problemas reales o potenciales, disposiciones destinadas a usos comunes y repetidos, con el fin de obtener un nivel de ordenamiento óptimo en un contexto dado, que puede ser tecnológico, político o económico.

ISO (International Organization for Standarization)

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Normalización

• Objetivos

– Simplificación: Se trata de reducir los modelos quedándose únicamente con los más necesarios.

– Unificación: Para permitir la intercambiabilidad a nivel internacional.

– Especificación: Se persigue evitar errores de identificación creando un lenguaje claro y preciso

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Clasificación de las normas1. Por el ámbito de aplicación

1. Nacional1. Normas para el sector industrial. 2. Normas para la empresa. 3. Normas para organismos nacionales.

2. Internacional

2. Por el contenido 1. Científico

1. Definiciones de magnitudes, unidades y símbolos. 2. Designaciones de la simbología matemática. 3. Designaciones de notaciones científicas.

2. Industrial 1. Normas de calidad: Definen las características de un producto o proceso. 2. Normas dimensionales: Definen las dimensiones, tolerancias, formas, etc. de un producto. 3. Normas orgánicas: Aspectos generales (color de las pinturas, dibujos, etc.). 4. Normas de trabajo: Ordenan los procesos productivos.

3. Por la forma de aplicación 1. Obligatorias 2. Voluntarias

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Origen de las normas

• Internacional– WHO– ISO– IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)– OCDE (Organisation of Economic Co-operation & Development– The joint European Standards Organisation (CEN/CENLAC)

• Nacional– National Council for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (USA)– Programas nacionales de acreditación– Sociedades profesionales– Grupos de pacientes

• Local– Grupos locales de organizaciones profesionales y hospitales

locales, particularmente en auditorías clínicas– Contratos proveedor /comprador

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Normas de interés para laboratorios

Organización Título Abreviación

ISO Sistemas de Gestión de la Calidad: Requisitos

ISO 9001:2001

ISO Laboratorios clínicos – Requisitos particulares para la calidad y la competencia

ISO 15189

OECD Principios de Buenas Prácticas de Laboratorio

OECD-GLP

CAP (College American Pathologists)

Estandares para la acreditación de laboratorios

CAP-LAP

CPA (Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd

Manual de normas y guías para la acreditación

CPA(UK)Ltd

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Estandarización

• Observar la situación inicial es el punto de partida de cualquier iniciativa de mejora.

• La mejora del trabajo estandarizado es un proceso interminable.

PROCESO(“Conjunto de actividades

interrelacionadas o interactuantes”)

Eficiencia del ProcesoCapacidad de alcanzar los resultados deseados

Eficacia del ProcesoResultados alcanzados vs Recursos usados

PRODUCTO(“Resultado deun proceso”)

SalidasEntradas

(Incluidos los recursos)

Monitoreo y Oportunidadesde Medición

(Antes, durante y después del proceso)

Procedimiento(“Forma especificada de llevar a cabo una

actividad o proceso” - Puede serdocumentado o no )

Qué es un proceso??

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Planificar

Hacer

Actuar

Verificar

Uso del Ciclo Deming en el proceso de estandarización

Edwards Deming

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Planificar

Hacer

Actuar

Verificar

Los 6 Pasos del ciclo PHVA según Ishikawa

Definir objetivosy metas

Definir losmétodos para

lograr los objetivos

Llevar a cabo la capacitación y el entrenamien- to

Realizareltrabajo

Verificar los resultadosdel trabajo

Tomar accionescorrectivas

Qué es el control total de la calidad? – La modalidad japonesa

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Output B

Input A

Output C

Ouput DInput C

Output A

Input D

Ouput EInput E

Feedback

PROCESS A

PROCESS B

PROCESS C

PROCESS E

PROCESS D

Output FInput FInternal

CustomerInternal

CustomerPROCESS F

Input B

PDC

A PDC

A

PDC

A PDC

A

PDC

A PDC

A

PDC

A PDC

A

PDC

A PDC

A

PDC

A PDC

A PDC

A PDC

A

Resultado B

Entrada A

Resultado C

Resultado DEntrada C

Resultado A

Entrada D

Resultado EEntrada E

Retroalimentación

PROCESO A

PROCESO B

PROCESO C

PROCESO E

PROCESO D

Resultado FEntrada FCliente

Interno

ClienteInterno

PROCESO F

Entrada B

PDC

A PHV

A

PDC

A PHV

A

PDC

A PHV

A

PDC

A PHV

A

PDC

A PHV

A

PDC

A PHV

A PDC

A PHV

A

Mapa de procesos en el laboratorio

Cliente

Externo

Cliente

Externo

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Estandarización

• El proceso de estandarización se basa en cuatro elementos básicos:

– Detección de los desperdicios a partir de la observación de los procesos, para su posterior eliminación.

– Identificación de los elementos de trabajo, obtenidos del proceso de observación.

– Análisis del Takt Time o ritmo al que se deben hacer los distintos productos o servicios en un proceso para satisfacer la demanda del cliente.

– Las herramientas de trabajo estandarizado para cada proceso, operario y situación del Takt Time.

En la estandarización de los procesos del laboratorio se deben tener en cuenta las siguientes fases

Fases en actividades del proceso operativo

Actividades Pasos en las actividades del proceso operativo

Pre-analítica 1. Consulta2. Selección de

pruebas3. Petición

1. Consulta Doctor/paciente2. Rellenado de formulario de

petición3. Obtención de especímenes4. Transporte del especímen y la

petición5. Recepción 6. Adquisión

4. Identificación5. Obtención6. Transporte

7. Preparación

Analítica 7. Preparación 7. Preparación de la muestra8. Análisis de la muestra8. Análisis

Post-analítica 9. Informe10. Interpretación

9. Informar de los resultados incluyendo interpretación y recomendaciones

10. Emisión del informe11. Recepción del informe por el

médico, y consulta si es necesario

11. Conclusión del médico

12. Acción

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Pre-analítica: Consulta, selección y petición

• Asesor especialista como parte del servicio• Manual de los usuarios

– Estándar D1 del CPA (UK) Ltd– Revisión anual por lo menos

• Establecer sistemas de comunicación entre clínicos y el laboratorio– Formularios de petición– Informes emitidos por el laboratorio– Sesiones clínico patológicas– Reuniones de auditorías

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Contenido de un manual del usuario

1. Contenido2. Información General3. Utilización del laboratorio

1. Peticiones y recogida de especímenes2. Transporte al laboratorio

4. Información de las áreas1. Bioquímica2. Hematología y transfusión de sangre3. Histopatología4. Citopatología5. Microbiología, etc

5. Tablas alfabéticas de pruebas/procedimientos1. Nombre de la prueba2. Especímen y recipiente necesario3. Intervalos de referencia (cuando sea necesario)4. Comentarios especiales5. Plazos de entrega

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Ejemplo de petitorio

St Elsewhere´s Hospital Trust - Laboratorio Clínico Teléfono (0800) 100200

Número de Historia del pacienteApellidosNombreDirecciónFecha de nacimiento Sexo (M/F)

Número del laboratorio

Medico solicitanteFirma:

Hospital Sala/Clínica

Fecha y hora de la toma de muestra

Especialista (nombre y apellido) Detalles clínicos/diagnóstico/tratamiento

Bioquímica Hematología MicrobiologíaPerfil renal Perfil lipídicoPerfil hepático Perfil diabéticoPerfil óseo Glucosa en ayunasPerfil cardíaco Glucosa aleatoriaPerfil tiroideo Test de embarazoPor favor, especifique otros:

Recuento sangre total RA latexVSG factor antinuclearFolato y B12Control de warfarinaFerritinaEstudio de coagulaciónIM estudio

Orina MSU Torunda Cervical

CSU HVS UretralHeces Cultivo Parásitos Otras determinaciones en sangre para ....................................................Esputo Rutina Otros especímenes AFB para .....................................................

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• Identificación– Mínimo de información: Nombre, fecha de

nacimiento, fecha de recogida y código relacionado con la admisión hospitalaria

• Obtención y transporte– Genera fuentes de interferencia en el análisis– Estandarizar la preparación del paciente– Aprobación de comité de ética para

procedimientos nuevos o experimentales

Pre-analítica: Identificación, obtención y transporte

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Analítica: Preparación del espécimen

• En cada laboratorio hay diferencias en los procedimientos de preparación de especímenes.

• Es importante implementar un sistema que relacione cualquier determinación posterior con el especimen original, es decir, debe haber trazabilidad.

• Es sistema debe estar documentado y seguirá la normativa para la elaboración de los documentos del sistema de calidad

Analítica: Preparación del espécimenPaso Actividades Etiquetado Numeración

1 Formulario de petición recibido con dos especímenes para biopsiaEspécimen 1Especímen 2

# de acceso para el formulario

El nombre del paciente, etc, debería constar en la etiqueta del contenedor del espécimen, pero se pueden adjuntar # de acceso

07-03066

07-03066-107-03066-2

2 Dos bloques de tejido preparado del espécimen 1 se colocan en cestillas separadas para su inclusión:Bloque de parafina ABloque de parafina B

Etiqueta del bloque de parafinaEtiqueta del bloque de parafina

07-03066-1-A07-03066-1-B

3 Secciones del corte del nivel 1 en el bloque de parafina A y montadas en corteSecciones de corte del nivel 2 en el bloque de parafina A y montadas en corte

Número de corte

Número de corte

07-03066-1-A-1 mas el nombre del paciente

07-03066-1-B-1 mas el nombre del paciente

Índice al número de código, por ejemplo 07-03066-2-A-1 07 = Año 03066 = némero de acceso 2 = número del espécimen A = letra del bloque de inclusión 1 = Posición del nivel en el bloque

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• En esta fase los procedimientos cumplen una amplia variedad de funciones que van desde la identificación hasta la medición de los analitos.

• Por tanto, tras la estandarización de los pasos de una técnica o análisis se deberá crear un procedimiento con una estructura preestablecida por el sistema de documentación de la calidad del usuario

Analítica: Análisis

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Estructura de un procedimiento estandarizado

1. Objetivo2. Alcance3. Referencias4. Definiciones5. Documentación6. Actividades y métodos6.1 Fundamentos del método6.2 Requisitos del especímen6.3 Obtención de los datos6.4 Reactivos, patrones para el control de calidad, accesorios y equipos6.5 Calibración6.6 Descripción detallada del procedimiento6.7 Control y evaluación de la calidad6.8 Limitaciones del procedimiento6.9 Informe de resultados e interpretación clínica6.10 Anotaciones del procedimiento y otra información pertinente

Actividades relacionadas a un procedimiento analítico que pueden ser sometidas a estandarización

Manual para los usuariosDel laboratorio

4.1 BioquímicaPrueba funcional

5.0 Tablas de determinación Por orden alfabético

Instrucciones de trabajo para el analizador BHM

Manual de utilización del instrumento

Manual de mantenimiento del instrumento

•Acciones del usuario diarias•Calibraciones del instrumento

•Mantenimiento programado (externo)•Mantenimiento no programado (externo)

Procedimiento para la obtención delEspécimen

Procedimiento para la prueba deSupresión de TRH

Procedimiento para la recepción delEspécimen

Procedimiento para la obtención de datosY preparación del espécimen en bioquímica

Procedimiento para la determinación de TSH en suero

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Post-analítica: Elaboración e interpretación de informes

• Incluye el contenido y la validación de los datos• El valor de la información producida depende de la

forma en que esté presentado el informe.• La validación de los datos y de la información es

una parte importante y signica ¨la comprobación de la corrección de los datos¨:– Validación técnica: uso de correctores de texto, señalar

valores críticos, uso de computadoras, etc– Validación clínica, realizado por el facultativo

experimentado

• Algunas normas de los sistemas de calidad y de acreditación dan gran importancia a la calidad del informe y a la interpretación de resultados

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Post-analítica: Estandarización del contenido del informe

1. Nombre y dirección del laboratorio de ensayo y el lugar de realización del ensayo cuando sea diferente de la dirección del laboratorio

2. Identificación única del informe (# serie) y de cada una de sus páginas y el número total

3. Nombre y dirección del cliente4. Descripción e identificación del objeto ensayado5. Fecha de recepción del objeto a ensayar y fecha de

realización del ensayo6. Identificación de la especificación del ensayo o descripción

del método o procedimiento7. Descripción del procedimiento de muestreo (opcional)8. Cualquier desviación, adición o exclusión de la

especificación del ensayo, y cualquier otra información relativa a un ensayo específico.

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Post-analítica: Estandarización del contenido del informe

9. Identificación de cualquier método o procedimiento de ensayo no normalizado que se haya utilizado

10. Medidas, examenes y resultados derivados, apoyados, cuando proceda por tablas, gráficos, dibujos, fotografias, asi como los posibles fallos detectados

11. Indicación de la incertidumbre de las mediciones 12. Firma y cargo o marca equivalente , de o las

persona(s) que aceptan la responsabilidad técnica del informe y la fecha de emisión

13. Declaración de que el informe de ensayo solo afecta a los objetos sometidos al ensayo

14. Indicación de que el informeno deberá reproducirse parcialmente sin la aprobación por escrito del laboratorio.

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Validación

• Comprende la comparación sistemática de todas las operaciones importantes y del equipo para un proceso o procedimiento

• Objetivo: Garantizar la calidad del proceso cuando se siguen procedimientos y controles establecidos.

• Es la demostración documentada de que un proceso, procedimiento o método es apropiado con alta seguridad para desempeñar una labor específica

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Validación de métodos

• Demostrar que un método analítico es adecuado para la aplicación prevista.

• Se demuestra que los resultados de una aplicación especial caen dentro de una desviación de medida definida

• La validación de un procedimiento incluye el método utilizado y la manipulación de las sustancias utilizadas.

• Es necesario incluir cada operación y comprobarla por separado.

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Validación: ISO 15189

• Item 5.5.2 El laboratorio sólo debe utilizar procedimientos validados para confirmar que los procedimientos de análisis son adecuados para el uso previsto. Las validaciones deben ser tan amplias como sea necesario para satisfacer las necesidades en una determinada aplicación o campo de aplicación. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos y el procedimiento utilizado para la validación.

• Los métodos y procedimientos seleccionados para uso deben ser evaluados y se debe demostrar que dan resultados satisfactorios antes de ser utilizados para análisis médicos. Una revisión de procedimientos por el gerente del laboratorio o la persona designada debe llevarse a cabo inicialmente y a intervalos definidos. Por lo general, dicha revisión se realiza anualmente. Estas revisiones deben ser documentadas.

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Parámetros para la validación de procedimientos analíticos

• Precisión• Exactitud• Límite de detección• Límite de cuantificación• Especificidad• Linearidad • Dureza o resistencia• Robustez

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Diferenciación entre exactitud y precisión

x xx x

x xx x

x xx x

x xx x

Bien Mal

Mal

ExactitudPre

cisi

ón

Precisión: Grado de coincidencia mutua de varios valores medidos;Es independiente del valor convencionalmente verdadero.Exactitud: Grado de desviación del valor convencionalmente verdadero

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Precisión

• Es el grado de repetibilidad de un grupo de resultados.

• Usualmente se expresa como D.S. o D.S. relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones.

• Las medidas de precisión son calificadas o explicadas en términos de : replicabilidad, repetibilidad o precisión intermedia y reproducibilidad.

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Replicabilidad

Es la precisión en condiciones de Repetibilidad e involucra:

Mismo laboratorio Mismo equipamiento Un único analista Mismo método Misma muestra Intervalos cortos de tiempo

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Replicabilidad

• Realizar un mínimo de 10 mediciones independientes de un material de referencia a varias concentraciones dentro del rango de trabajo.

• Repetir tres veces (como mínimo) en un intervalo de tiempo corto.

• Determinar la desviación estándar de los resultados.

• Informar la repetibilidad (como DS) para cada concentración.

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Precisión intermedia

Expresa la variación intra-laboratorio:Mismo laboratorioEl equipamiento puede ser el mismo o

pueden emplearse otros equipos.Distintos analistas Mismo métodoMisma muestraDías distintos

ILR

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Ejemplo:Se analizó con cinco sueros de altos, medios y bajos niveles de antitoxina tetánica.El (CV) se usó para expresar las variaciones.

ILR

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Reproducibilidad

Es la precisión en condiciones de reproducibilidad e involucra:

Distinto laboratorio Diferente equipamiento Distintos analistas Mismo método Misma muestra Intervalos en tiempos largos

Reproducibilidad Ensayos interlaboratorios

ILR

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EjemploSe analizó con cinco sueros de altos, medios y bajos niveles de antitoxina tetánica.El (CV) se usó para expresar las variaciones.

ILR

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Exactitud

La exactitud de un procedimiento analítico es la cercanía de sus resultados al valor verdadero.

Debe ser establecida a lo largo de un rango.

USP 30-NF25 - 2007

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Exactitud

• Emplea materiales de referencia• Detecta errores sistemáticos • Hay dos formas de determinarla:

– Realizar el procedimiento a un material de referencia conteniendo un analito de pureza conocida

– Comparar los resultados con los de otro procedimiento de exactitud conocida

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Exactitud

• Se calcula como el porcentaje de recobramiento del analito en el material de referencia o como la diferencia entre el promedio y el valor convencionalmente verdadero, junto con intervalos de confianza

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Límite de detección

Es la cantidad más baja del analito en una muestra que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada.Expresada como concentración del analito en la muestra, ej porcentaje, partes por millon, etc. Específica si un analito esta o no por debajo de un cierto valor

ILR

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• Puede determinarse por una relación visual para métodos no instrumentales (Formación de la banda de precipitación).

• Se puede definir métodos cualitativos, como la concentración por debajo de la cual la

identificación positiva se torna poco confiable.

ILR

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• El limite de detección se puede estimar a partir de: La desviación estándar del blanco. La desviación estándar de una solución de concentración

cercana al LD (informado por el fabricante, blanco fortificado).

LD = Xb + 3 s Usando blanco

LD = 3 s Usando blanco fortificado

S: desviación estándar de los resultados obtenidos.

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• Realizar un mínimo de 10 mediciones independientes del blanco (matriz sin agregado de analito)

• Realizar como mínimo 10 lecturas independientes del blanco fortificado a baja concentración (2.5 a 5 veces el LD informado por el fabricante, para espectroscopia).

• Determinar finalmente la desviación estándar de los resultados.

• Para métodos cualitativos se analizan 10 replicados independientes del blanco y varios niveles de concentración.

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Límite de Cuantificación

Se refiere a la concentración mas baja de un analito en una muestra, que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las condiciones de operaciónEs expresado como la concentración del analito en la muestra.

ILR

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Límite de Cuantificacion

• Limite de cuantificación es la menor concentración de una muestra que puede ser cuantificada con un nivel de incertidumbre aceptable.LQ = Xb + 10 s Usando blanco

LQ = 10 s Usando blanco fortificadoXb = Valor del blanco

• Comparar las señales medidas en muestras con concentraciones bajas del analito con la muestra blanco.

• La mínima concentración a la cual el analito pueda ser confiablemente medido se establece como límite de cuantificación.

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Especificidad

Es la capacidad de medir inequivocamente el analito en presencia de otros componentes como impurezas, productos de degradación, etc.

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Especificidad

• En el caso de análisis cualitativos (Pruebas de identificación), se debe demostrar la capacidad para seleccionar entre compuestos de estructura similar.

• Se debe confirmar por comparación con material de referencia conocido y con muestras que no contengan el analito.

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Sensibilidad

• Junto con la especificidad son dos parámetros que se utilizan a menudo para validar las pruebas usadas en el laboratorio.

• Sensibilidad: Capacidad de una prueba para detectar casos positivos (ausencia de falsos negativos)

• Especificidad: Capacidad de una prueba para identificar correctamente a todos los casos negativos (ausencia de falsos positivos).

• S y E tienen la ventaja adicional de que son propiedades intrínsecas a la prueba diagnóstica, y definen su validez independientemente de cuál sea la prevalencia de la enfermedad en la población a la cual se aplica.

ILR

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Cálculo de Sensibilidad y especificidad

Prueba de referencia o Gold Estándar

Total

Positivo Negativo

Prueba a evaluar

Positivo VP FP

Negativo

FN VN

Total

Sensibilidad = VP x 100 VP + FN

Especificidad = VN x 100 VN + FP

ILR

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Cálculo de Sensibilidad y especificidad

Prueba de referencia o Gold Estándar

Total

Positivo Negativo

Prueba a evaluar

Positivo 50 2 52

Negativo

0 48 48

Total 50 50 100

Sensibilidad = 50 x 100 = 100% 50 + 0

Especificidad = 48 x 100 = 96% 48 + 2

ILR

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Otro ejemploExploración y biopsia prostática de una muestra de pacientes con sospecha de cáncer de próstata.

Resultado del tacto rectal

Resultado de la biopsia prostática

CáncerPatología benigna Total

Anormal 634 269 903Normal 487 1251 1738

Total 1121 1520 2641

100-56,56=43,44% de los pacientes que efectivamente tenían cáncer presentaban tactos normales. Claramente ello indica la necesidad de utilizar otros marcadores más sensibles, como el PSA o sus derivados, para poder establecer el diagnóstico de forma más precisa.

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La seguridad de una prueba diagnóstica. Valores predictivos

• Cuando a un paciente se le realiza alguna prueba, el médico carece de información a priori acerca de su verdadero diagnóstico

• Más bien la pregunta se plantea en sentido contrario: ante un resultado positivo (negativo) en la prueba, ¿cuál es la probabilidad de que el paciente esté realmente enfermo (sano)?.

• Los valores predictivos darán mayor información5

Valor predictivo positivo:Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en la prueba. El valor predictivo positivo puede estimarse, por tanto, a partir de la proporción de pacientes con un resultado positivo en la prueba que finalmente resultaron estar enfermos:

Valor predictivo negativo:Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté realmente sano. Se estima dividiendo el número de verdaderos negativos entre el total de pacientes con un resultado negativo en la prueba:

ILR

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Valores predictivos - interpretación

El valor predictivo positivo en el ejemplo es del 70,21% (634/903) y el valor predictivo negativo del 71,98% (1251/1738).Ello significa que en un 70,21% de los pacientes con un tacto anormal finalmente se confirmó la presencia de cáncer, mientras que de los que no se detectaron anomalías en el tacto un 71,98% estaban efectivamente sanos.

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Influencia de la prevalencia

Para el diagnóstico del VIH se emplean tests que han confirmado tener una alta validez, con valores aproximados de sensibilidad y especificidad de un 99,5%. Supongamos que se aplicase esta prueba a la totalidad de la población Arequipeña, que se cifra en 2.800.000 habitantes. Si asumimos que en Arequipa existen 6.000 pacientes VIH positivos (lo cual implicaría una prevalencia de 6000/ 2.800.000 =0,21%), el test resultaría positivo en un total de 19.940 sujetos, obteniéndose un valor predictivo positivo del 29,9% (ver tabla).

Así pues, sólo un 29,9% de los sujetos con un resultado positivo en el test resultarían estar realmente afectados, mientras que un 70,1% de los mismos no presentarían la enfermedad. Resulta obvio que en una comunidad como la arequipeña la utilización de esta prueba no resultaría útil, debido a la alta proporción de falsos positivos que conllevaría.

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Resultados de la aplicación del test de VIH en una población de baja prevalencia.

Resultado del testVerdadero diagnóstico

VIH+ VIH- Total

Positivo 5.970 13.970 19.940

Negativo 30 2.780.030 2.780.060

Total 6.000 2.794.000 2.800.000

0,995 = 2 780 030

ILR

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Resultados de la aplicación del test de VIH en una población de alta prevalencia.

Resultado del testVerdadero diagnóstico

VIH+ VIH- Total

Positivo 796.000 10.000 806.000

Negativo 4.000 1.990.000 1.994.000

Total 800.000 2.000.000 2.800.000

ILR

63


• Por lo tanto, si la prevalencia es alta, un resultado positivo tiende a confirmar la presencia de la enfermedad, mientras que si la prevalencia es baja, un resultado positivo no permitirá afirmar su existencia.

ILR

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Linearidad y Rango

•Capacidad de producir resultados que sean directamente o por una transformación matemática proporcionales a la concentración del analito en la muestra en un rango determinado.•Se refiere a la linearidad de la relación de concentración y medición del ensayo. En algunos, para obtener una linearidad la concentración y/o la medición pueden ser transformadas. •Las transformaciones pueden ser a logaritmos, raíz cuadrada. •Si no se obtiene linearidad se puede usar un modelo no linear.•El objetivo es tener un modelo que describa la relación concentración-respuesta.

ILR

65

Linearidad y Rango

• Rango es el intervalo ente los niveles superior e inferior de un analito que han demostrado ser determinados con un nivel confiable de precisión, exactitud y linearidad.• El rango normalmente se expresa en las mismas unidades del resultado del ensato (ej., porcentaje, partes por millon, etc).

ILR

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Linearidad y Rango

•La linearidad se debe establecer a lo largo del rango del procedimiento analítico•Inicialmente se debe establecer por examen visual de la gráfica de la señal como una función de la concentración del contenido del analito.•Se recomienda como mínimo unas 5 concentraciones.•Si hubiera una relación linear se debe establecer apropiados métodos estadísticos como la regresión linear.•El coeficiente de correlación, el intercepto-y, la pendiente de la regresión linear deben ser calculados y evaluados.

ILR

67

ILR

68

Linearidad y Rango

• El rango es validado verificando que el procedimeinto otorge una precisión, exactitud y linearidad aceptables cuando se aplique a muestras que contiene analitos en los extremos del rango asi como también dentro.

ILR

69

Robustez

• Es la capacidad de un método para permanecer inafecto por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee una indicación de su confiabilidad durante el uso normal.

• Puede ser determinada durante el desarrollo del método.

ILR

70

Pasos para la Validación

• Selección de una técnica • Evaluar la factibilidad de la técnica• Optimización de la técnica • Evaluar los parámetros de validación • Comparar con otras técnicas

ILR

71

Categorias de procedimientos analíticos según USP 30

• Category I — Para cuantificación de componentes principales.

• Category II — Para determinación de impuresas o compuestos degradados. Incluyen pruebas cuantitativas y ensayos de límites.

• Category III — Para la determinación de características de performance.

• Category IV—Ensayos de identificación

ILR

72

Parámetros requeridos para la validación

ParámetrosCategoría

I

Categoría II

Categoría III

Categoría IVCuantitativo

Ensayo de

límite

Exactitud SI SI * * No

Precisión SI SI No SI No

Especificidad SI SI SI * SI

Límite detección No No SI * No

Límite Cuantificación

No SI No * No

Linearidad SI SI No * No

Rango SI SI * * No

* Podría requerirse dependiendo de la naturaleza del ensayo específico.

Estandarización de la técnica de inmunofluorescencia indirecta aplicada

a la Enfermedad de Chagas

Analista 1 Analista 2 Analista 3

Día # celx106 # celx106 # celx106 Prom DS N SEM

0 0,5 0,5 0,5 0,500 0,000 3 0,00

2 2,48 3,06 1,61 2,383 0,730 3 0,28

4 2,87 3,295 3,75 3,305 0,440 3 0,22

6 2,94 3,375 6,05 4,122 1,684 3 0,43

8 3,428 3,25 3,3 3,326 0,092 3 0,10

10 2,57 2,75 2,7 2,673 0,093 3 0,10

12 0,565 0,455 1,47 0,830 0,557 3 0,25

14 0,29 0,01 1,08 0,460 0,555 3 0,25

Curva de crecimiento para obtención de antígeno de T. cruzi

ILR

75

Obtención de mayor volumen de parásitos en cultivo

Curva de crecimiento de T. cruzi cepa Tulahuen en tubos de polipropileno - gráfica promedio

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 2 4 6 8 10 12 14

Días

# e

pi

x 1

0e6 /

mL

ILR

76

Fijación del antígeno

Preparación antígeno a Temperatura ambiente

Preparación antígeno a Temperatura de 4ºC

PBS formolado al 2%

Al 1% Al 0.25% Al 0.25%PBS formolado al 0.1%

Formalizar a 4ºC por 1 hora

Formalizar toda la noche a Tº Ambiente

5 – 20 parásitos x campo



Secar láminas por toda la noche a TºAmb

Guardar a -20ºC

ILR

77

Objetivo de la estandarización

• Preparar antígeno a temperatura ambiente.• Probar diversas concentraciones de PBS

formolado necesario para la muerte del parásito con la conservación de su estructura.

• Evaluar la proporción adecuada de parásitos fijados por campo.

ILR

78

Fijación del antígeno

ILR

79

Conclusiones

• El mejor procedimiento para la fijación de antígeno epimastigote de Trypanosoma cruzi para la técnica de inmunofluorescencia indirecta, es aquel que procesa el antígeno de la siguiente manera:

• Usar láminas para inmunofluorescencia, lavadas con Alconox (detergente para laboratorio) durante 24 horas, enjuagadas con agua destilada

• Limpiar antes de usar con alcohol al 96% y papel tissue, evitando dejar pelusas

• Todo el procedimiento de preparación de antígeno debe ser realizado a temperatura refrigerada (4ºC).

• PBS pH 7.2 a 4°C para los lavados• PBS formolado al 2% a 4ºC• Proporción de parásitos fijados: de 40 a 50 por

campo, observados a 40X, vistos con forma definida, sin restos de basura y en una adecuada repartición en el campo observado.

• La concentración de parásitos necesaria para la proporción anteriormente descrita es: 3 x 106 parásitos/ml.

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80

Sueros Controles de Prueba / No inactivados

Diluir sueros en PBS pH 7.2

Agregar 15ul suero diluido a cada pocito

Temperatura incubación: 37ºC

30 minutos 1 hora45 minutos

Lavado con PBS (2 veces) y Agua destilada (1 vez )

5 minutos 10 minutos 15 minutos

Dejar secar completamente a Temperatura ambiente

Usar Conjugado diluido en PBS pH 7.2 y azul de evans

1/50 1/100 1/200 1/400 1/800

Tiempos de lavado

Títulos a probar del conjugado

Concentraciones a probar del azul

de evans

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81

Estandarización del conjugado para IFI

Titulación del conjugado Anti-inmunoglobulina humana asociada a Isotiocianato de Fluoresceína: CONJUGADO USADO.- Fluorescein-conjugated rabbit IgG fraction to human IgG (Whole molecule) – 2mL. Marca: Cappel. ICN Pharmaceuticals, Inc.Catálogo: 55145Lote: 02923 Diluciones sugeridas: 1:100 – 1:800 para IFI

ILR

82

Se evaluaron hasta 27 posibles combinaciones de las condiciones indicadas en la tabla

Láminas + / - Prueba 01 Condiciones

Suero No inactivado

Dilución Suero PBS pH 7.2

Temperatura de Incubación 37°C

Tiempo de incubación 30 minutos

Lavados Agitación 5 min con AD

Azul de Evans 0.01%

Glicerina Preparada con PBS.

Lectura 20X

ILR

83

Esquema representativo de la dilución del conjugado vs diluciones de sueros referenciales

ILR

84

Conclusiones

a. El conjugado a la dilución 1/50 permite diferenciar perfectamente un resultado positivo de un negativo

b. El Suero Referencial Positivo se visualiza mejor a la diluación 1/16, 1/32 y 1/64 con el lavado de 10 minutos.

c. El Suero Referencial Negativo se visualiza mejor a 1/16, para las tres condiciones probadas.

d. El mejor tiempo de lavado es el de 10 minutos.

e. El lavado de 15 minutos lisa la mayoría de parásitos y se observa baja fluorescencia y bajo contraste.

ILR

85

Dilución 1/50 Dilución 1/100 Dilución 1/200

Estandarización del conjugadoD

iluci

ón

del su

ero

refe

ren

cial 1/1

6

Validación de la prueba de HAI para el inmunodiagnóstico de Chagas

ILR

87

Evaluación de la sensibilidad y especificidad

Gold Estándar –HAI Polichaco

Total

Positivo Negativo

HAI -UPCH

Positivo 51 3 54

Negativo

1 49 50

Total 56 52 104

Sensibilidad = 51 x 100 = 94,4 % 51 + 3

Especificidad = 49 x 100 = 98% 49 + 1

Documents

Normalización Validacion-M