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Botanica Complulensis ISSN; 0214-4565 200!, 25, 2JJ-2.N

Notas preliminares sobre las técnicas de amplificación y variación de la región ITS (Internal Transcrihed Spacer) en el género

Encalypta (Encalyptaceae, Bryophyta)

María Paz MARTÍN* & Isabel ALVARO**

* Real Jardín Bot¡ínico, C.S.J.c., Plaza de Murillo 2, 28014 Madrid, España. E-mail: maripaz(dJma-rjb.csic.es

** Departamento Biología Vegetal (Botánica) Facultad de Biología. Universidad de Barcelona. Av. Diagonal 64.'1.08021\ Barcelona. España. E-mail: malvaro@bio.ub.t's

Resumen

MARTÍN M, P. & ÁI.VARO L 2001. Notas preliminares sobre las técnicas de amplificaci6n y varim.:ión de la región lTS (Jntema! Transcrihed Spacer) en el género Enca!ypta (En­calyptaceae, Bryophyta). Bot. COIII!J!utensis 25: 233-239.

Se presentan las primeras aportaciones sobre el estudio molecular de la región ITS ({mema! Tmnscrihed S!)(lCl'r), basado en la técnica de la PCR, para las especies del género Enea!YIJla presentes en la Península Ibérica, El aislamiento del ADN se realizó a partir de fragmentos del gamet6fito y del espor6fito procedentes tanto de material fresco como de her­bario. También se ha utili/.ado protonema obtenido en cultivo in vilro, a partir de esporas. Los amplímeros obtenidos corresponden a las dos regiones espaciadoras (lTS-1 e ITS-2), además de la subunidad 5.8S, del ADNr nuelear. Se utilizaron dos protocolos de amplifica­l:i6n y las parejas de iniciadores ITS5/1TS4, ITS I/lTS4. ITS I/1TS2 e ITS3/1TS4. Con l1'S5/I1'S4 e l1'S 1/I1'S4 se ubtuvierun amplifil:al:iunes de la región l1'S pur cumpletu, a par­lir del ADN extraido de material frescu. Sin embargu, a partir del material de herbariu sólo se pudierun amplificar las regiones I1'S-1 e I1'S-2 por separado, utilizando los inicia­dores I1'S 1/I1'S2 e I1'S3/I1'S4.

Palabras clave: Enl:alyptaceae, Musgus, Península lbéril:a. Amplificación ADN, lTS

Abstraet

MARTíN M. P. & ÁLVARO L 2001. Preliminar nutes abuut the amplíficatiun tedmiques and the variation of the I1'S region in the genus El/ca!YIJla (Encalyptaceae, Bryophyta), Bot. COnJp!ulcl1si.\· 25: 233-239,

Results on DNA amplifications are presenled for Ihe Ew(/!ypta species presenl in lht: Iberian Peninsula. DNA was isolated from the gamelophyle anel sporophytt:, frum buth fresh and herbarium materials. DNA was alsu isulakd frum prutunema ublained frum cul­tures in vitro of spores. 1'he internal transcribed spacers 1 and 2, including the 5.RS nrDNA

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have been amplified. Pair pril11crs lTSSflTS4, ITS J/ITS4, ITS l/lTS2 and lTS3/lTS4 were lested by using two different amplification prolocols. ITS5/ITS4 ¡Uld JTS I/ITS4 yiclded arn­plíl11er only from fresh samplcs, nol frum herbarium collections, from which only pril11ers lTSl/lTS2 and ITS3/ITS4 amplificd succcssfully each of lhe ITS regions scparalcly.

Keywords: EncaJyptaceae. Musci, lbcrian Peninsula, DNA Amplification. JTS

INTRODUCCiÓN

Los musgos de la familia Ewatyptaceae, incluida dentro del orden Encalypta­les, se encuentran mayoritariamente representados en el Hemisferio Norte, y están caracterizados por la presencia de una larga y cilíndrica caliptra que cubre por com­pleto la cápsula. La familia incluye dos géneros: Bryohrittonia Williams y 1:-"11­catypta Hedw., el primero monoespecífico y el segundo con 19 especies repartidas en 5 secciones (Honon, 1983).

En la Península Ibérica únicamente está presente el género Enealypta, con 8 es­pecies: E. affil1is Hedw. f., E. alpina Sm., E. ci/iata Hedw., E. microstoma Bals. & De Not., E. rhaptocarpa Schwaegr., E. :>pathulata C. MüJl., E. streptocarpa Hedw. y E. vulRaris Hedw. En nuestro estudio sobre la distribución del género Enealypta en España se han analizado algunos de los caracteres tradicionales que han utili­zado diversos autores (Horton, 19l:'13; Nyholm, 19R 1) para reconocer los diferentes taxones: presencia-ausencia de peristoma, morfología del petistoma, morfología es­poral, base de la caliptra, ápice del filidio, lámina basal, etc. Pero éstos, no siempre proporcionan un criterio claro para delimitar las especies y las categorías infracs­pecílkas. Además, en el estudio de las numerosas poblaciones peninsulares de E. vulf(aris se ha observado una importante variabilidad infraespecífica y, para ciel10s caracteres, una ausencia de discontinuidad con poblaciones de otros taxones de la misma sección: E. spathulata y E. rhaptocarpa. El hecho de que muchas pobla­ciones presentan una mezcla de caracteres cuestiona la validez de algunos de ellos. ¿Cuándo la variabilidad morfológica es una respuesta a condiciones am­bientales y cuándo se trata de caracleres discriminatorios fijados genéticamente?

Con el objeto de aportar nuevos datos que nos ayuden a delimitar mejor la po­sición de los diferentes taxones y clarificar la filogenia del género, iniciamos el es­tudio molecular. basado en la técnica de la PCR (Polimerasa Chain Re(Jetion), de las especies de Encalypta presentes en la Península. En esta primera aportación da­mos a conocer la metodología utilizada y los primeros resultados obtenidos.

MATERIAL Y MÉTODOS

inicialmente hemos analizado las 6 especies de El1calypta más representadas: t,'. alpina. E. ciliata, E. rhaptocarpa, E. spathulata, E. strcptocarpu y E. vulgaris; ade­más hemos incluido en el estudio. a la potiácea Tortula muralis Hedw. para consi­derarla como grupo externo en los posteriores análisis filogenéticos (ver tabla 1).

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Tabla t Taxones estudiados. Material y fecha de aislamiento del ADN

Fecha Fecha AislamiclllO ADNTaxo/lcs/N" Herhario

reculección ADN Ui-({![mellto utilizadu)*

Encalypta alpina BCC 1756 09/07/83 24/04/98 G+E E. ci¡¡ata BCC 1228 22/07/87 24/04/IJX G+E E. rhaplo("(/rl>ll BCC 1195 07/07/84 24/04/IJX G+E E. spathulata lMF 1488 04/02/90 24/04/98 G+E E. strepto('(Jrpa BCC 1250 06/10/98 07/12/9R G+ propágulos H. \'ul![aris RCC 1242 28/04/IJ7 24/04/98 G+E R. vulxaris (<.:ultivo in vitl'O) 05/04/IJX 08/06/98 Protoncma Tortula muralis BCC 1300 IO/06/IJX 07/12/98 G+E

* (1: gametófito. E: espurófito.

Cada extracción del ADN se realizó a panir de 2-2,5 mg de material deshidra­tado, secado al aire y procedente de una única población. Todas las muestras utili­;,adas en las extracciones proceden de localidades de la Península Ibérica, y en el caso de E. l'lIlgaris también se realizaron extracciones a partir de pequeños frag­mentos de protonema obtenidos de cultivo in vitro. a partir de esporas.

El ADN se aisló utilizando los dos protocolos mencionados en Martín & Gar­cía -Figueres (1999): 1) método estándar, basado en Whiting et al. (1997), Y 2) kit comercial (EZNA Plant ADN miniprep kit, Omega Biotek). El método estándar presenta tres fases: a) extracción con tampón de lisis que contiene 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI y 3% SDS, durante una incubación de toda la noche a 55°C, b) purificación con fenal: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24: 1) un mínimo de 3 veces, c) precipitación con etanol absoluto frío durante 2h 30 min a -20°C.

Para las amplificaciones de la región ITS (ITS-I + 5.8S + lTS-2), completa o parcial, se ensayaron distintas parejas de iniciadores: ITS5/ITS4, ITS I/ITS4, ITS I/ITS2 e ITS3/ITS4 (White et al., 1990) y dos métodos de amplificación dis­tintos: 1) amplificaciones estándar mediante un cóctel según se indica más abajo y 2) amplificaciones individuales con Ready-To-Go ®PCR Beads (Amershan-Phar­macia Biotech).

En las amplificaciones estándar, las reacciones se llevaron a cabo en un volu­men final de 20 !JI conteniendo 1.5 !JI de agua Milli-Q. 2 !JI 10 x PCR Buffer II (Perkin Elmer), 200 mM deoxinucleótidos (dNTP) (Pcrkin Elmer), 1.5 mM MgCIO' 10 pmol de cada iniciador, 0.5 unidades de AmpliTa4® Gold ADN Polymerase (Perkin Elmer) y 10 !JI de ADN. En las amplificaciones con PCR Beads, a un vo­lumen final de 25 IlL se realizaron dos ensayos con distintas cantidades de inicia­dores: 1) 1,0 !JI de ADN, 0,5 !JI de cada iniciador (10 IlM) Y 23,0 !JI de agua Milli­Q y 2) 1,0 !JI de ADN, 1,0 !JI de cada iniciador (10 !JM) Y 22,0 !JI de agua Mi1li-Q.

Los amplímeros obtenidos se visualizaron con un transiluminador de eleetro­I'oresis con luz lLV. y tinción con bromuro de etidio incluido en el gel de agarosa.

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RESULTADOS

A partir de las extracciones con material fresco o recolectado en un plazo de tiempo inferior al año, sólo se visualizaron las amplificaciones realizadas con PCR Beads (Fig.I.I). Con las mismas condiciones de extracción y amplificación, los amplímeros obtenidos con el par de iniciadores ITS l/ITS4 fueron de mejor calidad, es decir se visualizaron bandas únicas y nítidas, que los obtenidos con el par ITS5/ITS4 (Fig. 1.4). Las longitudes en pares de bases (bp) de los segmentos all1~

plificados con ITSI/ITS4, que incluye un fragmento final 18S ADNr + ITS-I + 5.SS ADNr + ITS-2 + fragmento inicial 28S ADNr. se indican en la Tabla 2.

Tabla 2 Longitudes en pares de bases (bp) de los segmentos ampliticados con las diferentes

parejas de iniciadores. Las amplificaciones que han dado más de una banda se indican entre paréntesis

RF:GIÓN DIANA

Taxones ITS (frS1/IT.':;4)

ITS-I (fI'Sl/ITS2)

ITS-2 (I'IS3/ITS4)

Encalypla alpina nd nd F:. eiliata (550,298, 220) (510, 344) E. rhaptocarpa (396,220) (550,344) E. spalhulata (3lJ6,220) (550,344) E. slrcptocarpa 1018 I1d nd t'. v¡¡/~aris 900 *(396,220) (450,314) Tortula muralis 800 nd nd

nd: no hay dalos; ---: nu ~e ha visuali/udo banda; *: bandas dt'biles en lus geles.

No se visualizaron amplímeros tras la reacción en cadena de la polimerasa con PCR Beads y los iniciadores ITS 1/ITS4, a partir de las extracciones con material de herbario de 8 a 10 años de antigüedad (Fig. 1.3). Sin embargo, para algunas de las muestras de herbario analizadas CE, ciliata, E. spathulata, E. rhaptocarpa), se ob­tuvieron amplímeros con las parejas de iniciadores ITS 1/1TS2 (final I SS ADNr + región lTS-I + inicio 5.8S AONr) e ITS3/ITS4 (finaI5.8S ADNr + región ITS-2 + inicio 28S ADNr) por separado. En ambos casos se visualizaron bandas dobles en los geles (Fig. 1.5). Las longitudes en pares de bases de estos amplímeros se muestra en la Tabla 2.

Las extracciones de fragmentos de protonema de t:. vuft.:aris, amplificadas con PCR_Beads. no dieron en ningún caso bandas únicas y definidas. La muestra amplificada con los iniciadores ITS I/ITS4 originó dos bandas (Fig. 1.3, columna 5, PCR Beads) y la banda superior estaba situada por debajo de las 900 bp obtenidas en las amplificaciones de E. l'ulgaris realizadas a partir de gametól'ito más espo-

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Finura 1.-1: AmplificaciÓn estándar frente a P 'R Beads wn los iniciadores rrs 1/1'1'$4 para ma­terial f . co ti· '. \'/II¡; /ri·. olumnas 1- : B. I'1I1)i/lris, prolOcolo de amplificación esl. miar; 6: cOLlIrol negativo: 7-10: 1,'. \'/I/lIt/ris, PCR Be;Jds; M,: marcador de peso mole ul<lr X 174 R.P DNA/ Hac ru ha ­npnlS ( ibc.o BRL, A),2: mpli Icación un P R Bcads 'iniciadorc, rrs 1/ITS4 de mal rial fr's­co d> E, s/rl'{JW iIIpt/ (columnas: l. gametólilO; 2, propá ulas) y Torlttla II/I/I"tllis (colulllna: J. M: Mar­cador d' P so molecular IKh Laddcr. : Amplificación e ·tánuar (parte. uperiorJ frenl' a r R B ads (par! >inrerior). con ini iad 'S ITS 1/1'1'$4 par'l material con 8-11 año. de antigüedad (columnas 1 y malerial fres () olumnas - ). Las mue. l~ 'n la pan' superior e inferior corre. pondcn a: 1, F. cilio­lO: 2, '. alpilla; 3. '. sI'OII1I1Itt/<I; 4, E. r/wplocarlm; 5, E. \'III)iurls (protoncma); 6. Torllllo IllIlralis' 7.

ontrol n' alivo; M, mar ador de o molecular IKb I add r. 4: Amplificacion s con iniciado s ITS I/lTS4 fn;nV a I 5/ITS4. P R Beads y malerial fr o d t:. wdgaris. Colulllna. 1- 5-6: 'on­ct:nt ción el iniciadores 5 pm()l!~l: columnas .-4.7-8: wncentra..:i6n el' iniciadore~ 10 plllol/~I; M: mal'CadlJl" dt: pes m ,1 cular IKR 'Iuder; M,: X 174 RF DNi\/ Jlac III FraglTl n". 5: Amplifi..:acione~

iniciadores 1 1/ITS2 frent' u rrs. /1 4. con P R Bead;; de matcrial dc herbario (columnas: 1·3,5·7) Yprolon fila ( nlumna -: 4-8). 1.5: C. d!i(¡/u; ,6: F:'. ,1'fl1l1/1lI/<I{(¡: 3,7: L;;. r/tapIO(Orpo; 4,8: h. vlI/gari,;, M: marcador el" p..:sn molecular IKb Ladeler; M,: X 174 R ' DNA/ Ha' III Fr l'mC\lls.

rófito. Las amplificaciones que se obtuvieron a partir (k fragmentos de protonema de E. ¡'u/gori.\', con los iniciadores I1'S 1/I1'S2 e ITS3/ITS4 también dieron dobks bandas pero, en este caso, la suma ele las bandas ele nl<iyor longilUcI (en general, más inten~as) era elel orden de las (00 bp.

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DISCUSIÓN

Los métodos (h: extracción uüli/ados en este estudio, no parecen ser limitantcs para la postenior amplil"ieación, pero sí el método utiliz.ado para la peR, ya que en las muestras analizadas sólo se visualizaron bandas en los geles tras su amplifica­ción con PCR Beads. Aunque el método de extracción estándar dio tlll ADN de concentraciÓn y calidad suficiente para su posterior afllp)irieaci<Ín, aconsejamos el kit comercial (el aquí ensayado u otros) para evitar el nso de substancias nociva::; como I fenol yel clororormo y rl~ntabili7.ar e1ticrnpo de extracción (12 horas con el m todo est,índar, frente a 30 minutos con el kit).

Los aislamientos de ADN a partir dc material rccoh:ctado recientemente (en los doc' mcscs antniorcs a la extracción) han amplifieauo bien con los iniciadores ITS IjlTS4, no así el material conservado varios aIlos en herbario. Sin embargo, las extracciones de este material antiguo se ampliricaron al utilizar las parejas de iniciadores que permiten obtener los dos espaciadores (lTS-I e ITS- 2) por sepa­rado. El deterioro y fraccionamiento que puede haber sufrido el ADN de estos ejemplares de herbario podría estar relacionado con la mayor eficacia de los ini­ciadores /"fS IjJrTS2 e ITS3jITS4. Estos primeros resul1tados sugieren que es acon­sejable el uso de material recién recolectado en estudios prelirninares corno el aquí propuesto.

La aparición de dobles bandas en las amplificaciones siempre que se han utilli­lado las parejas de iniciador's ITS5jJTS4, ITS ljlTS2 e ITS3/nS4, puede deberse a dos razones principales. A) Que alguno de los iniciadores utilizados tenga más de una re~ión de hibridación en el ADN genórnjco de las muestras estudiadas. Así pues, tillO de los objetivos a conseguir a corto phl/.o es, a partir de las secuencias obtenidas (datos no incluidos), diseiiar iniciadores específicos para musgos y en particular para el "énero t;l/ca/yp/a. Esto nos pennitirá ser más eficaces en las am­plificaciones con I material de herbario. B) La existencia de intron . en las subu­nidades del ADNr.

La duble lXUlda que se ubserva en las amplificaciones obtenidas a partir de pro­tonel na, COII los injciadores lTSl/ITS4, pueden ser debidas a la amplificación de ADN procedente de alguna contaminación.

Las bandas obtenidas en las amplificaciones de cada una de las regiones ITS-I e ITS- correspondientes a las especies E..\po/hu/a/a 'E. r/1ap/o('([rpa muestran un núm -ro d pares de bases similar para ambas, mientras que para E. ci/ia/a las bandas fueron distintas.

Los primeros resultados obtenidos en 'stc trabajo, b{¡sicamente técnico, apun­tan una I rometedora variabilidad molecular del ADN ribosómico nuclear para es­tudios sist 'máticos en briólitos, aunque su valor desde el punto ele vista filogenético debe ser confirmado. Sin embargo, es necesaria una mayor adecuación de las tec­nicas y d los iniciadores para optimizar los resultados con material antiguo y de­teriorado. 'ste es un reto importante, ya 4ue el material de 'herbario siernpre es una referencia importante cn los trabajos dc rcvisión.

fhll;'lnicu CornpIUIt'Il",iS ~oo l. 5. 33·2. ~

MO Pa: Mar/ín & 1. Álv(/ro No/as prelimillares .\'oln·(' las /';/"l1ic(/.\' de amplificación ...

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Originul recihii!o:29 de Marzo de 200/ Vcrsiól/ j/l/ol recihido: 26 de ./ulio de 200/

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