NOTE DE CURS AN UNIVERSITAR 2012-2013

BIOLOGIE MOLECULAR anul II

Specializarea Biochimie

Titular curs Prof. Dr. Marieta Costache LP Asist. Dr. Andreea Toana

Bucuresti aprilie 2013

2

STRUCTURA NOTE DE CURS

STRUCTUR ACIZI NUCLEICI RAPEL I. NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULAR A

CROMOZOMILOR I GENELOR II. NOTE DE CURS BM2 - ORGANIZAREA MOLECULAR,

EXPRESIA I REGLAREA GENELOR EUCARIOTE III. NOTE DE CURS BM3 - REGLAREA INIIERII

TRANSCRIPIEI IV. NOTE DE CURS BM4 - PROCESAREA ARN,

TRANSPORT NUCLEAR I CONTROL POST-TRANSCRIPIONAL

V. NOTE DE CURS BM5 - TRADUCEREA

3

NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULAR A CROMOZOMILOR I GENELOR

SLIDE 2. Reprezentare clasic a unei celule procariote

Figura: Reprezentare clasic a unei celule procariote (dup Campbell, et al., Biology, 2002). Unul dintre criteriile care stau la baza clasificrii organismelor este absena sau

prezena nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un veritabil nucleu, includ eubacteriile i archeobacteriile. De cealalt parte se afl celulele eucariote care posed o membran nuclear care separ cromozomii de restul celulei. Cromozomul unic al celulelor procariote este format dintr-o molecul de ADN dublu catenar circular care conine cteva milioane de perechi de baze. n general, genoamele eucariotelor au o mrime i o complexitate variabil i conin mai muli cromozomi. Att celulele procariote ct i cele eucariote posed mecanisme, pe de o parte comune i pe de alt parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor i a fluxului de informaie de la ADN la proteine. Transcripia ADN realizat de ARN polimeraze constituie prima etap, comun la toate organismele. La celulele procariote, ribozomii se fixeaz pe molecula de ARNm, n curs de sintez, i realizeaz traducerea imediat a informaiei n proteine, n citoplasm. Din contr, la eucariote membrana celular separ locul n care se realizeaz transcripia de cel n care are loc traducerea. Transcriptul primar, ARNm imatur, conine o succesiune de secvene netraduse, numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor i sudare a exonilor (splicing), n procesul de maturare a ARNm. n urma acestei etape, localizat n nucleu, ARNm trece n citoplasm unde este tradus. Maturarea ARNm prin splicing confer celulei eucariote posibilitatea diversificrii informaiei prin combinarea alternativ a exonilor, o alt etap foarte important n dezvoltarea organismelor. Bacteriile, organismele procariote cele mai simple ntlnite n toate mediile naturale, prezint caracteristici comune. Adesea, un perete celular, format din peptidoglicani, nconjoar membrana plasmatic i confer celulei o form rigid. De asemenea, este prezent o membran extern care posed un numr de flageli i pili variabil. Bacteriile au un compartiment citoplasmatic unic care conine un nucleoid format dintr-o molecul simpl circular de ADN, ARN i proteine. Pe lng ADN prezent n nucleoid, citoplasma majoritii bacteriilor conine mici molecule circulare de ADN, numite plasmide. Cel mai adesea acestea confer celulei rezisten la antibiotice i la alte toxine. n condiii favorabile, bacteriile se multiplic rapid prin diviziune. Capacitatea lor de adaptare la condiiile de mediu i de diviziune rapid fac ca aceste celule s constituie suporturi excelente pentru numeroase analize biochimice i de biologie molecular, in vitro.

Dei cea mai mare parte a genoamelor procariote sunt mai mici de 5 Mpb lungime, exist i cteva mai mari. n prezentarea tradiional, genomul tipic procariotelor conine o singur molecul circular de ADN, localizat la nivelul nucleoidului. Aceast abordare este adevrat pentru E. coli i pentru multe alte bacterii foarte studiate, dar specificm c evoluia cunoaterii, n sfera genomului procariotelor, pune n discuie anumite concepte dezvoltate n era pre-genomic a microbiologiei. Aceste aspecte se refer att la structura fizic a genomului procariotelor ct i la organizarea genetic.

4

SLIDE 3. Punctul de vedere tradiional asupra cromozomului bacterian Tabel Mrimea i complexitatea genomului la cteva virusuri i celule Asemeni eucariotelor, genomul procariotelor trebuie s se ncadreze ntr-un spaiu foarte restrns. Cromozomul circular de la E. coli are o circumferin de 1,6 mm n timp ce dimensiunile celulei sunt de 1,0 x 2,0 m. Structurarea necesar este realizat, ca i la eucariote, cu ajutorul proteinelor de legare la ADN (DNA binding proteins) care compacteaz genomul ntr-o form organizat. Structura obinut nu prezint similitudini substaniale cu cromozomul de la eucariote cu toate c din punct de vedere didactic este folosit exprimarea de cromozom bacterian. Majoritatea cunotinelor pe care le avem despre organizarea ADN n nucleoid sunt rezultatul studiilor pe E. coli. Genomul circular al E. coli este suprarsucit. Suprarsucirile apar cnd ture suplimentare sunt introduse sau ndeprtate din structura dublei elice (suprarsucire pozitiv/negativ). Suprarsucirea este modalitatea ideal de mpachetare a unei molecule ntr-un spaiu redus. Primele dovezi c suprarsucirile sunt implicate n mpachetarea genomului circular de la E. coli au fost obinute n 1970 n urma examinrii unor nucleoizi izolai, fiind confirmate definitiv ca o trstur a celulelor vii n 1981. Se consider c, la E. coli supra-rsucirile sunt generate i controlate de dou enzime, ADN giraza i ADN topoizomeraza I. Cea mai plauzibil explicaie privind compactarea nucleoidului este aceea c ADN este ataat la proteine care restrng capacitatea de relaxare, astfel nct rotaia la nivelul unui situs de scindare are ca rezultat pierderea unei suprarsuciri dintr-un mic segment al moleculei. Modelul curent propune ataarea ADN de la E. coli pe structura unei proteine miez de la care radiaz 40-50 bucle n interiorul celulei. Fiecare bucl radiaz n interiorul celulei i conine aproximativ 100 kpb de ADN suprarsucit.

SLIDE 4. Compactarea cromozomului la E. coli

Figura Model pentru structura nucleoidului de E. coli Componentele proteice ale nucleoidului includ ADN giraza i ADN

topoizomeraza I, cele dou enzime care sunt principale responsabile pentru meninerea strii de suprarsucire, ca i un set de aproximativ patru proteine considerate a avea un rol mai specific n mpachetarea ADN bacterian. Cea mai abundent protein este HU, care este foarte diferit structural de histonele eucariote dar acioneaz similar, formnd un tetramer n jurul cruia se nfoar aproximativ 60 pb. n celula de E. coli sunt prezente aproximativ 60 000 copii ale HU care acoper aproximativ 1/50 din molecula de ADN, dar nu se cunoate dac tetramerii sunt distribuii de-a lungul ADN sau sunt poziionai numai n regiunea central a nucleoidului.

Discuii pe tema structurii nucleoidului procariot n ultimii 10 ani a devenit foarte clar c anatomia genomului procariot dezvoltat pe baza studiilor pe E. coli este foarte simplist. Dei marea majoritate a genoamelor bacteriene sau a cromozomilor de la archeobacterii sunt circulari, a fost descoperit un numr mare de forme lineare. Prima a fost descris pentru Borrelia burgdorferi, n 1989 de ctre Ferdows i Barbour, urmtorii ani fiind realizate descoperiri similare pentru genul Streptomyces i alte bacterii. Un alt aspect l reprezint prezena plasmidelor care reprezint mici molecule de ADN, adesea dar nu ntotdeauna circulare, care coexist cu cromozomul principal

5

n celula bacterian. Anumite tipuri de plasmide sunt capabile de integrare n genomul principal, n timp ce altele pot avea o existen independent. Plasmidele conin gene care, de obicei, nu se gsesc pe cromozomul principal, dar care sunt, n multe cazuri, neeseniale pentru bacterie, deoarece codific pentru fenotipuri cum sunt rezistena la antibiotice fr de care bacteriile pot tri n condiii de mediu normale. Multe plasmide sunt capabile de transfer de la o celul la alta, i aceleai plasmide sunt adesea regsite n bacterii care aparin la diferite specii. Trsturile diferite ale plasmidelor sugereaz c ele reprezint entiti independente care, n majoritatea cazurilor, nu sunt incluse n definiia genomului bacterian. Pentru o bacterie de tipul E. coli, care are un cromozom de 4,6 Mpb i care poate conine variate combinaii de plasmide, nici una mai mare de cteva kilobaze, toate dispensabile, putem defini cromozomul principal ca genom. n cazul altor procariote lucrurile nu stau la fel de simplu. De exemplu, cromozomul linear al Borrellia burgdoferi care are 910 kpb i conine 853 gene, este nsoit de cel puin 17 plasmide circulare i lineare care mpreun contribuie cu alte 533 kpb i cu cel puin 430 gene. Dei, majoritatea acestor gene sunt orfane (fr funcie identificat), au fost identificate i structuri indispensabile cum sunt genele pentru proteinele membranare i biosinteza purinelor. Se consider c mcar unele din cele 17 plasmide de la Borrelia sunt componente eseniale ale genomului. Astfel, este admis posibilitatea ca anumite procariote s posede genoame constituite din mai multe componente care includ un numr separat de molecule ADN. Aceast situaie este mult mai apropiat de ceea care exist la eucariote dect la procariotele tipice. De fapt, interpretarea informaiilor privind genomul de la Borrelia este nc controversat, i complicat datorit existenei unei bacterii nrudite, Treponema pallidum, al crei genom este format dintr-o singur molecul de ADN de 1138 kpb care conine 1041 gene, este lipsit de orice omologie cu genele prezente n plasmidele de la Borrelia.

Tabel Trsturile ctorva plasmide tipice Tip de plasmid Funciile genelor Exemple Rezisten Rezisten antibiotice Rbk la E. coli i alte bacterii Fertilitate Conjugare i transfer ADN ntre bacterii

F de la E. coli Uciga (killer) Sinteza de toxine care ucid alte bacterii

Col de la E. coli; produce colicin Degradativ Enzime pentru metabolismul moleculelor neobinuite

TOL pentru Pseudomonas putida; metabolism toluen Virulen Patogenitate Ti de la Agrobacterium tumefaciens; capacitatea de a determina formarea galelor la dicotiledonate

O alt complicaie privind structura fizic a genoamelor procariote este legat de diferenele dintre sistemele de mpachetare pentru moleculele de ADN de la bacterii i archeobacterii. Una dintre motivaiile pentru care archeobacteriile sunt privite ca un grup distinct de organisme, diferite de bacterii, este faptul c acestea nu posed proteine de compactare de tipul HU, dar posed proteine mult mai asemntoare cu histonele. Cu toate c, informaiile despre nucleoidul de la archeobacterii sunt destul de incomplete, se presupune c proteinele asemntoare histonelor au un rol important n mpachetare. Cunoatem deja c genomul bacterian are o structur genetic compact cu foarte puin spaiu ntre gene. Aceast organizare este foarte bine demonstrat i tipic

6

la genomul de la E. coli. La acest organism ADN care nu codific pentru diferite gene reprezint numai 11% din total i este distribuit pe toat lungimea sub forma unor segmente mici. O serie de teorii susin c organizarea compact este benefic pentru replicarea rapid a genomului cu toate c ipotezele nu pot fi susinute de dovezi experimentale.

SLIDE 5. Coninutul minim de gene i identitatea genelor specifice Tabel. Catalog comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M. genitalium Cu toate c numrul de genoame procariote secvenializate integral crete continuu, nu este nc posibil realizarea unui catalog complet cu coninutul genelor fiecrei specii, din simplul motiv c funciile anumitor gene rmn necunoscute. De exemplu, genomul de la E. coli conine 4 288 gene care codific pentru proteine dar peste 1 500 din acestea sunt orfane. Chiar dac informaia este adesea incomplet, este interesant s examinm rolul genelor ale cror funcii sunt cunoscute, i s apreciem numrul diferit al genelor implicate n diferite activiti biochimice la o bacterie de tipul E. coli. Cataloagele de gene sunt mult mai interesante cnd comparaiile se realizeaz ntre diferite specii. De exemplu, la E. coli 243 de gene sunt implicate n metabolismul energetic, la Haemophylus influenzae numai 112 i la Mycoplasma genitalium numai 31. Aceste comparaii pot duce la speculaii privind numrul minim de gene necesar pentru supravieuirea unei celule. Majoritatea demersurilor realizate n acest sens au demarat cu studiul celor mai mici genoame, cel al Mycoplasma genitalium i cel a Mycoplasma pneumoniae, care conin numai 470 i respectiv 679 gene. Consideraii teoretice au dus la sugestia c 256 gene reprezint minimul necesar, dar experimentele de inducere de mutaii sugereaz c pentru Mycoplasma sunt necesare minim 300. Studii similare interesante au fost realizate pentru genele specifice care determin distincia dintre o specie i alta. Din cele 470 gene ale genomului de la M. genitalium, 350 sunt prezente i la bacterii mai ndeprtate evolutiv, cum este Bacillus subtilis. Aceasta sugereaz c trsturile biochimice i structurale care disting Mycoplasma de Bacillus sunt codificate n aproximativ cele 120 gene care sunt unice la fiecare tip. Din nefericire, astfel de comparaii privind genele particulare nu dau rspunsuri cheie privind caracteristicile care individualizeaz fiecare tip de microorganism.

SLIDE 6. Operonii sunt caracteristici ale genoamelor procariote Figura. Diferite tipuri de operoni: a) operonul lactoz de la E. coli; b) operonul triptofan de la E. coli; c) operonul mixt de la Aquifex aeolicus

Cea de a doua caracteristic a genomului de la procariote, ilustrat la E. coli, este prezena operonilor. Operonii reprezint un grup de gene localizate una lng cealalt. Toate genele din structura unui operon sunt exprimate ca o singur unitate. Acest tip de aranjament este comun genoamelor procariote i poate fi ilustrat la E. coli cu operonul lactozei care a fost descoperit n 1961 de ctre Jacob i Monod. Acesta conine trei gene implicate n transformarea dizaharidului lactoz n unitile sale componente (glucoz i galactoz). Genele operonului lactoz sunt implicate n utilizarea lactozei ca surs de energie de ctre E. coli. Deoarece, lactoza nu este o component comun a mediul nconjurtor pentru E. coli, majoritatea timpului operonul nu este exprimat i enzimele pentru utilizarea lactozei nu sunt sintetizate de bacterie. Cnd lactoza devine disponibil se realizeaz activarea operonului i cele trei gene sunt exprimate mpreun. Operonul lactoz reprezint un exemplu clasic de reglare a expresiei genelor la bacterii (Figura a).

7

La E. coli i la Bacillus subtilis exist aproximativ 600 operoni. n majoritatea cazurilor, genele unui operon sunt corelate funcional i codific pentru un set de proteine implicate ntr-o anumit cale metabolic, cum ar fi utilizarea unui glucid ca surs de energie sau sinteza unui aminoacid (operon triptofan, Figura b). La alte bacterii sau archeobacterii exist posibilitatea ca operonii s conin gene implicate n diferite ci metabolice. Este cazul unuia dintre operonii de la Aquiflex aeolicus care conine ase gene linkate care codific pentru: i) dou proteine implicate n recombinare; ii) o enzim folosit n sinteza proteic; iii) o protein necesar pentru mobilitate; iv) o enzim utilizat n sinteza nucleotidic; v) o enzim pentru sinteza lipidic (Figura c). n concluzie, teoria c expresia unui operon conduce la sinteza coordonat a mai multor enzime necesare pentru o singur cale metabolic nu este valabil pentru toate speciile.

SLIDE 7. Structura materialului genetic la eucariote Nucleul celulei eucariote

Figura . Nucleul celular i caracteristicile sale (dup Campbell, et al., Biology, 2002). Structura materialului genetic la eucariote

n ciuda diferenelor evidente de form i de funcie, diferitele tipuri celulare care compun un organism multicelular, fie c este vorba de o ciuperc sau de un mamifer, conin un lot complet de gene. Vzut din exterior o celul din constituia unui cartilaj i un neuron nu se aseamn deloc. Cu toate acestea cele dou tipuri celulare conin acelai complement de gene.

Informaia genetic, prezent ntr-o celul eucariot specializat, se poate compara cu o carte care conine toate informaiile necesare construciei unei cldiri cu utiliti multiple. n cursul realizrii construciei, sunt probabil necesare toate planurile dar numai o mic parte a informaiei va trebui consultat n timpul activitii de construcie a unui etaj sau a unei singure camere. Aceast abordare este adevrat i pentru un ovul fecundat, care conine ansamblul instruciunilor genetice, i care este fidel replicat i informaia distribuit tuturor celulelor organismului n dezvoltare. n consecin, celulele poart mult mai mult informaie genetic dect pot utiliza vreodat. Acestea posed mecanisme care le permit s exprime informaia genetic, n mod selectiv, urmnd numai instruciunile care privesc numai o singur celul ntr-un moment particular al existenei acesteia. n acest subcapitol, o s analizm modalitile care le permit celulelor eucariote s structureze totalitatea materialului genetic pe care l conin, n condiiile controlului coordonat al expresiei genelor menite s asigure numai sinteza anumitor proteine. Mai nti vom descrie structura i proprietile nucleului celulei eucariote, care conine majoritatea informaiei genetice i mecanismele de reglare a acesteia. Nucleul celulei eucariote

n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice, nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun. Coninutul nuclear reprezint o mas vscoas amorf de materie, nchis ntr-un nveli nuclear complex. n nucleul unei celule tipice, n interfaz, se evideniaz: i) cromozomii, prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina; ii) matricea nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine proteine; iii) unul sau mai muli nucleoli, structuri amorfe, opace la microscopie electronic care sunt sediul sintezei ARN ribozomal i al asamblrii ribozomilor; iv) nucleoplasma, substan lichid care conine toate componentele i elementele nucleului eucariot. n figura sunt ilustrate schematic diferitele elemente ale nucleului eucariot. nveliul nuclear

8

n opoziie cu termenul de membran nuclear, nveliul nuclear desemneaz structura complex care se afl la frontiera dintre nucleul i citoplasma unei celule eucariote. ntr-o celul, separarea materialului genetic i a citoplasmei care l nconjoar este poate caracteristica cea mai important care distinge eucariotele de procariote. Apariia nveliului nuclear este cu siguran un punct de reper n evoluia biologic. nveliul nuclear const n mai multe elemente distincte. Continuitatea nveliului care delimiteaz nucleul este asigurat de dou membrane concentrice separate de un spaiu intermembranar de 10 la 50 nm. Cele dou membrane sunt fuzionate din loc n loc i formeaz pori circulari care sunt compui dintr-un ansamblu complex de proteine. Densitatea porilor nucleari variaz de la aproximativ 2 la 4 pe m2 n nveliul nuclear al eritrocitelor de pasre, relativ inactiv din punct de vedere metabolic, la mai mult de 60 m2 n cel al ovocitelor care se pregtesc s rspund nevoilor viitoare ale dezvoltrii embrionare.

O celul de mamifere, de mrime medie, posed aproximativ 3 000 de pori nucleari. Membrana extern este n general presrat cu ribozomi i adesea n continuitate cu membrana reticulului endoplasmatic.

Suprafaa intern a nveliului nuclear este bordat de o plas fibrilar dens, numit lamina nuclear. n anumite celule, cum este ovocitul de amfibian, aceast lamin formeaz un strat continuu, n timp ce n altele pare mult mai fragmentat. Considerm c lamina nuclear reprezint un suport structural pentru nveliul nuclear i servete la fixarea fibrelor de cromatin la periferia nucleului.

Fibrilele laminei nucleare au un diametru de aproximativ 10 nm i sunt compuse din polipeptide numite lamine, care aparin aceleiai superfamilii de polipeptide care compun filamentele intermediare ale citoscheletului. Ca i pentru componentele intermediare ale citoplasmei, integritatea laminei nucleare este controlat de ctre procesul de fosforilare/defosforilare. Dezasamblarea laminei nucleare, nainte de mitoz, este indus de ctre fosforilarea laminelor de ctre o kinaz specific.

SLIDE 8 -15. Ciclul Celular

- principalele stadii ale fazei M ntr-o celul animal Ciclul celular normal i mecanisme de control Ciclul celular

Ciclul celular reprezint totalitatea modificrilor i transformrilor suferite de celul n timpul procesului de replicare i difereniere.

ntr-o populaie de celule ce se divid, replicarea i diviziunea unei celule n dou celule fiice identice cuprinde 2 faze funcionale i 2 faze preparatorii.

Fazele funcionale sunt reprezentate de : copierea precis a ADN: faza S (de replicare a ADN); segregarea sau mprirea setului de cromosomi ntre cele dou celule fiice:

faza M (mitoza). Celula se pregatete biologic pentru faza S ntr-o faz preparatorie, numit G1

i pentru mitoz ntr-o faz mult mai puin neleas, G2. Celulele ce nu se mai divid pot fi permanent scoase din ciclul celular prin

difereniere terminal, sau pot fi oprite ntr-o stare intermediar, G0, (celular resting). Evenimentele ce presupun desfurarea unui ciclu celular intervin ntr-un mod organizat, astfel ncat anumite evenimente se termin nainte ca altele s nceap. Aceast ordine a evenimentelor este controlat de o serie de mecanisme de control intracelulare incomplet elucidate i este influenat de factori extracelulari: factori de

9

cretere, mitogeni i antimitogeni, inductori de difereniere, contact celul-celul sau factori de ancorare, nutrieni, etc. Fig. 1. Fazele ciclului celular

Notatii: Go=faza de repaus G1=faza de presintez ADN G2=faza de postsintez ADN S =faza de replicare a ADN M=faza de mitoz

Controlul ciclului celular Factorii ce influeneaz ciclul celular sunt:

Factori extracelulari: -factori de cretere; -factori mitogeni; -factori antimitogeni; -inductori ai diferenierii celulare;

Factori intracelulari: -cicline; -cdk - kinaze ciclin dependente; -proteine codate de gene supresoare ale tumorii:-p53, Rb-1; -PCNA - proliferating cell nuclear antigen; -gena myc. Abilitatea celulei de a produce o copie exact a ei nsi, prin diviziune, este o component esenial a vieii celulare. Acest proces trebuie realizat cu mare fidelitate, astfel nct organismele s fie capabile s se nmuleasc. Mecanismul molecular de control al ciclului celular utilizat de celul are un nivel nalt de organizare i este relativ bine conservat n cursul evoluiei speciilor.

Ne aflm de-abia la nceputul revelrii mecanismului implicat n acest proces complicat, n care sunt implicate numeroase semnale intra- i extracelulare. Dei n timpul procesului evoluiei i al diferenierii celulare pot interveni anumite schimbri subtile, genetice sau epigenetice, n orice faz a ciclului celular, aceste schimbri trebuie s se produc ntr-un mod controlat, pentru a preveni urmri dezastruoase.

Lipsa fidelitii n procesul de reproducere a celulelor creaz o situaie de instabilitate genetic care pare a fi un factor contributiv semnificativ n dezvoltarea celulelor maligne n organismele eucariote avansate.

Deci nu este surprinztor c boala canceroas este caracterizat printr-o reglare anormal a creterii i a reproducerii celulare. Pentru a ntelege cum debuteaz cancerul i pentru a dezvolta strategii optime pentru a elimina celulele canceroase, trebuie s fie identificate diferenele, chiar la nivel molecular, ntre celula normal i celula canceroas.

Fenomenul cheie al tranziiei de la o etap la alta a ciclului celular este reprezentat de aciunea enzimatic a unei anumite kinaze ciclin-dependente. Forma activ a acestor enzime se realizeaz prin formarea unui complex cu o anumit protein specific unui anumit stadiu al ciclului celular. Aceste proteine se numesc cicline.

10

Tabel - Kinazele ciclin dependente (cdk), ciclinele i substraturile kinazelor din diverse faze ale ciclului celular FAZA KINAZA CICLIN-DEPENDENT CICLINA SUBSTRATUL KINAZELOR G1 cdk2 Ciclina D Rb-1 G1/S cdk2 Ciclina E Rb-1 S cdk2 Ciclina A ? G2/M cdk2 Ciclina B/A ?

Dat fiind c progresia celulei n ciclul celular este condiionat de activitatea

cdk, controlul activitii acestor enzime i a complexelor pe care acestea le formeaz cu ciclinele, constituie un mecanism esenial de reglare a ciclului celular. Acest tip de control acioneaz la mai multe niveluri: 1. Sinteza ciclinelor

Condiionarea sintezei unui anumit tip de ciclin se face n funcie de etapa ciclului celular. Din punct de vedere cantitativ, sinteza de cicline depinde de: - amploarea semnalelor extracelulare ce favorizeaz proliferarea (hormoni, factori de crestere); - intensitatea degradrii proteolitice a ciclinelor.

Complexul cdk-ciclin activat fosforileaz substraturile necesare tranziiei celulei la urmatoarea faz a ciclului.

Controlul ciclului celular prin kinaze ciclin-dependente. 2. Blocarea activitii enzimatice a cdk se realizeaz prin fosforilarea cdk sau prin legarea lor de inhibitori ai kinazelor ciclin-dependente (CKI), proces ce mpiedic formarea complexului activ cu ciclinele.

Tabel- Complexele cdk-ciclin i inhibitorii acestora n funcie de etapele ciclului celular

COMPLEXUL CDK-CICLIN

KIP (inhibitori ai cdk) INK (proteine inhibitoare ale kinazelor)

FAZA cdk 4-Ciclina D

p21 p27 p15, p16 p18, p19 G1 cdk 2-Ciclina E

p21, p27 - G1/S cdk 2-Ciclina A

p 21 - S cdk 2-Ciclina B

p21 - G2/M Mai explicit, activitatea cdk este controlat la cel puin 6 nivele:

1. Fiecare ciclin este sintetizat ntr-un anumit stadiu al ciclului celular. Ciclinele D i E sunt sintetizate n faza G1, ciclina A n fazele S i G2, ciclina B n fazele G2 i M; 2. Degradarea ciclinelor este reglat n mod riguros; 3. Ciclina poate forma un complex cu o cdk (kinaz ciclin-dependent); 4. Acest complex devine activ prin aciunea unei CAK (cdk activating kinase);

11

5. Cdk sunt inactivate prin fosforilare n poziia Thr14 i Tyr15 i pot fi reactivate prin aciunea unei fosfataze n aceleai poziii, 6. Proteine inhibitoare de cdk pot fie preveni asamblarea complexelor cdk-ciclin, fie inactiva cdk din complexele formate.

Complexul cdk-ciclin activat fosforileaz substratele necesare tranziiei celulei la urmatoarea faz a ciclului. Anumite evenimente intracelulare sau extracelulare pot determina oprirea parcurgerii ciclului celular:

denutriia; schimbri drastice de temperatur; factori de stres; alterarea ADN, etc.

Afectarea ADN celular este cel mai studiat semnal de iniiere a sistemelor de control ale ciclului celular. Detectarea de erori de copiere a genomului celular determin sechestrarea celulelor n faza G1 sau, dac aceasta a fost depait, n faza S, inhibndu-se att iniierea replicrii, ct i elongaia. Blocarea ciclului celular se face prin intermediul inhibitorilor kinazelor ciclin-dependente. Exist mecanisme specifice de reglare a fiecrei etape ale ciclului celular:

Tranziia G1 - S n faza G1 a ciclului celular exist un punct de control cunoscut drept punctul

de restricie, R. El marcheaz fosforilarea proteinei Rb (a retinoblastomului) prin intervenia complexului holoenzimatic format de cdk 4 cu ciclina D. Consecina este anularea aciunii inhibitorii pe care o are proteina Rb n forma hipofosforilat i legarea acesteia la nivelul unor secvene specifice ale ADN prin intermediul unor factori de transcripie de tipul proteinei myc. Aciunea inhibitorie a proteinei Rb nainte de fosforilare se manifest prin legarea de un alt factor de transcripie, E2F. Complexul astfel format este capabil s lege ADN, dar nu poate iniia transcripia. E2F devine capabil s-i ndeplineasc rolul de factor de transcripie doar dup fosforilarea proteinei Rb, cnd factorul E2F redevine liber. Astfel se activeaz transcripia genelor ai cror produi sunt necesari pentru trecerea la faza S a ciclului celular i pentru desfaurarea corespunztoare a copierii ADN. Se consider c proteina Rb este factorul-cheie pentru trecerea n faza S a ciclului celular.

Alterarea ADN celulei aflate n faza G1 induce sinteza n cantiti mai mari a proteinei oligodimerice p53. Aceasta induce transcripia genei p21, sintetizndu-se astfel cantiti crescute de proteina p21, un inhibitor multipotent al kinazelor ciclin-dependente. Consecina final este inhibarea fosforilrii proteinei Rb i, deci, blocarea progresiei ciclului celular. Se consider c proteina p53 induce i transcripia unor compusi implicai n procesele de reparaie a ADN. n condiiile n care defectul este mult prea grav pentru a fi reparat, p53 contribuie la declanarea apoptozei. Faza S

Mecanismele de reglare a parcurgerii fazei S nu sunt suficient cunoscute. Se tie c, imediat dup iniierea replicrii ADN-ului, se formeaz complexul activator, cdk-ciclina A. Consecina este fosforilarea i, deci, activarea proteinelor care se leag la nivelul situsurilor de replicare autonom unde debuteaz acest proces. Odat ce ADN a fost copiat n ntregime, celula intr n faza G2.

Tranziia G2-M Primul factor reglator descris ca fiind implicat n tranziia de la faza G2 la faza

M a fost factorul de promovare a mitozei, MPF. MPF este de fapt complexul cdk2-ciclina B care, acionnd pe un substrat-cheie necunoscut, determin trecerea la faza M.

12

Faza M Faza debuteaz dup activarea complexului cdk2-ciclina B. Iesirea din faza

mitozei i intrarea n stadiul G1 este marcat de distrucia proteolitic a ciclinei B i de inactivarea cdk2. Reglarea extracelular a ciclului celular

Celula integreaz continuu semnale extracelulare cu rol n controlul mecanismelor de diviziune celular. Statutul nutriional, contactul celul-celul i peptidele extracelulare influeneaz evenimentele intracelulare.

SLIDE 16. Structura i funcia complexului porilor nucleari Figura. Complexul porului nuclear, model schematic (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) nveliul nuclear este o barier care separ dou din cele mai importante compartimente ale celulei, nucleul i citoplasma, porii fiind pori n aceast barier. Contrar membranei plasmatice, care mpiedic trecerea macromoleculelor ntre citoplasm i spaiul extracelular, anvelopa nuclear este un centru activ pentru ARN i proteinele care se deplaseaz n cele dou sensuri, ntre compartimentele pe care aceasta le separ. Replicarea i transcripia materialului genetic, care au loc n nucleu, necesit participarea unui mare numr de proteine care se sintetizeaz n citoplasm i sunt transportate prin nveliul nuclear. Invers, moleculele de ARNm, ARNt i subunitile ribozomilor care sunt fabricate n nucleu trebuie s fie transportate prin membrana nuclear. Anumite elemente, cum sunt moleculele ARNsn (ARN small nuclear), se deplaseaz n cele dou direcii. Acestea sunt sintetizate n nucleu, se asambleaz n particule ribonucleoproteice (RNP), n citoplasm, i sunt reimportate n nucleu unde intervin n maturarea ARNm. Acest trafic intens se realizeaz prin porii nucleari. innd seama c particule materiale, de talia subunitilor ribozomale, pot s treac prin porii nucleari, putem presupune c acetia sunt canale deschise dar, de fapt, este exact contrar. Porii nucleari conin un aparat complex, n form de co, numit Complexul Porului Nuclear (CPN) care obtureaz porul ca un dop i care se reliefeaz n afar n citoplasm i n nucleoplasm. Structura CPN este prezentat n modelul schematic din figura din Slide 16 i n micrografiile electronice din Slide 17.

SLIDE 17. Porul nuclear-imagini de microscopie electronic Figura Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin microscopie electronic: a) faa citoplasmatic a complexului porului nuclear (CPN); b) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare a CPN, evideniind structura sub form de co; c) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare prin tratament blnd cu detergent. Reeaua laminar, care se insereaz n inelul nuclear al NPC, este expus dup acest tratament (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

CPN este un enorm complex molecular cu simetrie octogonal care se estimeaz c are n structur 100 la 200 polipeptide. Masa CPN este de aproximativ 30 ori mai mare dect masa unui ribozom. Structura molecular a complexului CPN a fost determinat de-a lungul timpului graie tehnicilor de microscopie electronic i de analiz de imagini din ce n ce mai performante. Dac sunt injectate soluii, ale moleculelor cu mas molecular mic, n citoplasma unei celule acestea pot penetra rapid n porii nucleari prin simpl difuzie. Experimentul sugereaz c aceste substane sunt capabile s treac printre fantele existente ntre razele coului.

13

Capacitatea moleculelor mai mari (proteine i nucleoproteine) de a trece din citoplasm n nucleu depinde de sediul lor obinuit de reziden, n nucleu sau n afara acestuia. De exemplu, dac o protein citoplasmatic, cum este albumina seric bovin, este marcat radioactiv i injectat n citoplasm, ea are tendina de a rmne acolo. Din contr, dac injectarea este realizat cu o protein cu localizare nuclear, nucleoplasmina, proteina marcat va fi regsit imediat n nucleu.

SLIDE 18. Mecanisme de transport n 1982, Robert Laskey i colaboratorii si de la Medical Research Council,

Anglia, au descoperit c nucleoplasmina, una dintre cele mai abundente proteine nucleare din ovocitele de amfibieni, conine o secven de aminoacizi n apropierea extremitii C terminale care funcioneaz ca un Semnal de Localizare Nuclear (SLN), care i permite s treac prin porii nucleari i s intre n nucleu. De atunci au fost identificate o serie de alte SLN, cea mai mare parte a acestora fiind constituite din scurte secvene de aminoacizi cu sarcin pozitiv. n principiu, orientarea (adresarea) proteinelor ctre nucleu este asemntoare cu transportul altor proteine care sunt distribuite n anumite organite, de tipul mitocondriei sau peroxizomilor. n toate cazurile, proteinele posed o etichet specific care este recunoscut de ctre un receptor particular de la suprafaa organitului int. Importul proteinelor n nucleu trece prin mai multe etape: i) proteina care trebuie importat se cupleaz cu un receptor pentru SLN care pare a fi localizat la suprafaa filamentelor deprtate de inelul extern al porului ctre citoplasm; ii) interacia ntre proteina nuclear i receptorul pentru SLN permite acostarea proteinei pe faa citoplasmatic a complexului porului nuclear prin formarea unui complex de transport; iii) deplasarea complexului de transport prin por necesit energie eliberat din hidroliza ATP. Aceasta implic o modificare a conformaiei transportorului, structur mare n form de dop (inel intern) situat n centrul complexului porului nuclear. Modificarea de conformaie deschide un canal n centrul transportorului i permite moleculelor situate n proximitatea acestuia s ptrund n nucleoplasm. Dup acelai principiu, substanele care trec din nucleu n citoplasm declaneaz, probabil, deschiderea transportorului n sens invers. n figura este prezentat un model schematic de import nuclear al unei proteine (cargo) dup cuplarea acesteia cu semnalul de localizare nuclear (SLN). n citoplasm, importinele i interacioneaz cooperativ cu proteina cargo care urmeaz a fi transportat, prin legarea importinei la SLN. Subunitatea importinei , din complexul cargo trimeric rezultat, interacioneaz cu componentele CPN, translocnd complexul n nucleoplasm prin mecanisme destul de puin cunoscute. Aceast translocare necesit hidroliza ATP. n nucleoplasm, Ran-GTP interacioneaz cu importina , determinnd disocierea complexului cargo i elibernd proteina transportat n nucleoplasm. Pentru a susine un alt ciclu de import, importina monomer i complexul importin -Ran-GTP sunt transportate napoi n citoplasm. Proteina de activare RanGAP (Ran GTP activating protein), din citoplasm, stimuleaz transformarea Ran-GTP la Ran-GDP avnd drept rezultat o transformare conformaional la nivelul Ran care determin disocierea de importina . Importina liber interacioneaz apoi cu importina i se formeaz un nou complex cargo purttor al unui semnal bazic SLN, care iniiaz un alt ciclu de import nuclear. Se presupune c Ran-GDP este i el translocat prin porii nucleari din citoplasm n nucleoplasm, unde factorul nucleotidic de schimb, Ran (RCC1), determin eliberarea GDP i relegarea GTP.

14

SLIDE 19. Influena semnalului de localizare nuclear Un por nuclear individual este capabil s importe proteine i s exporte ARN

i ribonucleoproteine. Acest transport bidirecional poate fi vizualizat prin microscopie electronic. De asemenea, tendina de acumulare n unul dintre cele dou compartimente celulare a unor proteine purttoare de semnale de localizare n citoplasm sau n nucleu poate fi vizualizat prin microscopie de fluorescen sau confocal.

Semnalul de Localizare Nuclear (SLN) al antigenului T (SV40) poate direciona o protein citoplasmatic n nucleu:

a) piruvat kinaza normal, localizat n citoplasm, vizualizat prin imunofluorescen dup tratarea celulelor n cultur cu un anticorp specific;

b) piruvat kinaza himer, care conine un semnal SNL al SV40 la captul su N-terminal, este direcionat ctre nucleu. Proteina himer a fost exprimat n urma transfeciei unei gene modificate produs prin fuziunea unui fragment al unei gene virale care codific NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000).

SLIDE 20. Matricea nuclear Figura. Localizarea situsurilor de sintez i de maturare a pre-ARN cu sonde fluorescente: a) vizualizarea procesului de transcripie prin colorare cu DAPI pentru evidenierea genei i cu anticorpi fa de heterogen nuclear ribonucleoproteine, marcai cu fluorescein; b) evidenierea procesului de poliadenilare prin colorare cu poli-dT marcat cu rodamin i cu DAPI pentru evidenierea ADN; c) evidenierea splicingului prin utilizarea de anticorpi monoclonali, fa de proteina de splicing SC-35, marcai cu fluorescein Nucleul este un organit organizat

Specialitii n biologie celular se bazeaz mult pe studiile biochimice pentru a nelege activitile nucleului. Cu toate c acestea furnizeaz un numr mare de informaii, distrug toate structurile moleculare organizate care pot exista n nucleu i dau impresia c acesta nu este dect un sac de elemente repartizate la ntmplare. n acelai timp, o serie de studii de microscopie ne fac s realizm c nucleul este n realitate un compartiment foarte organizat. De exemplu, fibrele de cromatin, care compun un cromozom interfazic, nu sunt dispersate n tot nucleul, cum am putea crede, ci ele sunt concentrate ntr-un domeniu specific care nu se suprapune deloc cu domeniile altor cromozomi.

Interaciunile ntre extremitile cromozomilor i anvelopa nuclear reprezint un alt mod de organizare a cromozomilor n nucleu. Aceast asociere este evident mai ales n meioz, cnd cromozomii pot s se ndeprteze de anvelopa nuclear i s formeze un buchet.

De mai bine de treizeci de ani se tie c ARN ribozomal este sintetizat n nucleol, dar se consider c celelalte molecule de ARN, i mai ales ARNm se asamblau n tot nucleul. Cercetrile ultimilor zece ani au demonstrat clar c moleculele de ARNm sunt sintetizate ntr-un numr limitat de situsuri discrete situate n ntregul nucleu. Dac sunt identificate cu ajutorul unor sonde marcate fluorescent, situsurile de sintez i de maturare a moleculelor de pre-ARNm apar sub forma unor pete strlucitoare n nucleoplasma nemarcat. Fiecare din cele 20 la 50 de pete observate ntr-un anumit nucleu reprezint situsul sintezei mai multor molecule de ARNm diferite. Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate n acest compartiment printr-o reea interactiv complex de filamente care compun matricea nuclear.

15

Proba cea mai clar privind importana matricei nucleare a fost furnizat de o serie de cercetri efectuate n laboratorul lui Jeanne Lawrence de la Universitatea din Massachusetts. Utiliznd hibridizarea fluorescent, in situ, pentru a identifica localizarea secvenelor specifice de ADN sau ARN. Lawrence i colaboratorii si au constatat c moleculele de ARN transcrise, pornind de la o anumit gen, apar ca o tren ntr-o serie limitat de nuclee. Trena fluorescent apare datorit prezenei mai multor sute de molecule de pre-ARNm transcrise pornind de la o singur gen. Concentrarea transcripilor ntr-un loc limitat ne sugereaz c acetia nu sunt liberi s difuzeze plecnd de la ADN de pe care au fost transcrii. Se pare c acetia sunt meninui stabili de unele dintre elementele nucleului pe toat perioada maturrii lor. Dac nucleele sunt tratate cu detergeni i cu sruri concentrate, practic toate moleculele de pre-ARNm care au fost transcrise rmn asociate matricei nucleare reziduale. De fapt, urmele de ARNm fluorescente care au fost observate nainte de extracia dintr-un anumit nucleu i pstreaz exact poziia i dup extracie, deoarece moleculele de ARNm nou formate sunt asociate elementelor matricei celulare. De asemenea, orientarea trenelor sugereaz c moleculele de ARN prsesc locurile de sintez pentru a se localiza n situsuri mai apropiate de periferia nucleului. n cursul deplasrii moleculelor de ARNm fa de gena de la care sunt sintetizate, intronii sunt eliminai din structura transcripilor prin mecanismul de splicing. Orientarea trenei, dinspre interiorul nucleului ctre periferia sa, este compatibil cu un model n care matria nuclear ghideaz moleculele de ARN, n curs de maturare, de la locul n care sunt transcrise ctre porii nucleari pentru a iei din nucleu.

SLIDE 21. Matricea nuclear

Figura. Matricea nuclear: a) micrografie electronic a unui nucleu izolat n prezen de detergeni i sruri 2M; b) micrografie electronic a unei regiuni de fibroblast de oarece n urma tratamentului cu detergent i nlturare a cromatinei i ADN

Cnd nucleele izolate sunt tratate cu detergeni anionici i o concentraie crescut de sruri (NaCl 2M), pentru a extrage lipidele i aproape toate proteinele histonice i nehistonice ale cromatinei, ADN apare ca un halou care nconjoar un centru nuclear rezidual. Dac fibrele de ADN sunt apoi digerate cu nucleaz, rmne o structur care pstreaz forma nucleului de origine, dar ea este compus din fibrile proteice subiri care se ncrucieaz pe suprafaa spaiului nuclear. Aceast reea fibrilar insolubil este matricea nuclear

Matricea nuclear nu este numai un schelet care menine forma nucleului sau un eafodaj pe care se organizeaz buclele de cromatin; ea servete i n vederea fixrii pentru mecanismele care intervin n diferite activiti ale nucleului, cum sunt transcripia, maturarea ARN i replicarea. De exemplu, dac celulele sunt incubate n prezen de precursori radioactivi ai ARN sau ADN n timpul unei scurte perioade, gsim c aproape toi acizii nucleici sintetizai sunt asociai fibrilelor matricei nucleare.

SLIDE 22. Cromozomii. Structura cromozomului mitotic

16

Figura. Comparaie ntre starea cromatinei n interfaz i a cromatinei compactate n mitoz: a) micrografie electronic prezentnd starea dispersat a cromatinei n interfaz; b) micrografie electronic a unui cromozom mitotic (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Cromozomii se individualizeaz structural la nceputul mitozei i par s dispar din nou la sfritul acesteia. Acetia sunt constituii dintr-un complex de ADN i proteine numit cromatin. Cromatina exist n diverse stri n diferite faze ale ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai scuri dect lungimea moleculelor de ADN pe care le conin. n medie, un cromozom uman conine o molecul de ADN de aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, n structura cromozomului, presupune existena unui sistem organizat de mpachetare care s permit totui funcionarea genomului i exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a organitelor intracelulare prezint o structur care ne ofer informaii interesante despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului ofer destul de puine informaii privind natura cromozomilor n interfaz. n aceast etap, cromozomii sunt mult mai puin vizibili deoarece cromatina se afl ntr-o stare mai relaxat.

SLIDE 23. Imagine electrono-microscopic a unui cromozom uman n

metafaz Cromozomii eucariotelor, care constau ntr-un complex de ADN, ARN i

proteine numit cromatin, sunt entiti dinamice a cror aparen variaz considerabil i dramatic cu stagiul ciclului celular. Cromozomii individuali se pot evidenia sub form condensat numai n timpul diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). n timpul interfazei, care formeaz restul ciclului celular, cnd cromozomii sunt transcrii i replicai, cromozomii majoritii celulelor devin foarte dispersai. Nucleul Celular

n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice, nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun: coninutul nuclear reprezint o mas vscoas amorf de materie nchis ntr-un nveli nuclear complex. n nucleul unei celule tipice, n interfaz (nemitotic), se evideniaz:

i) cromozomii, prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatin;

ii) matricea nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine proteine;

iii) unul sau mai muli nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii i care intervin n sinteza ARN ribozomal i n asamblarea ribozomilor;

iv) nucleoplasma, substan lichid care conine toate componentele i elementele nucleului eucariot . Cromozomii Cromozomii par s apar la nceputul mitozei i s dispar din nou dup mitoz, punnd astfel citologilor una dintre nntrebrile cele mai importante dar n acelai timp i una dintre cele mai stimulante; care este natura cromozomilor n celulele ne-mitotice. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a organitelor infracelulare demonstreaz o structur care ne ofer informaii interesante despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului evideniaz puine informaii privind natura cromozomului n interfaz. mpachetarea genomului

17

O celul uman normal conine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent n numrul diploid de cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur molecul de continu de ADN; cu ct cromozomul este mai mare cu att mai lung este ADN pe care l conine. Dat fiind c fiecare pereche de baze ocup aproximativ 0,34 nm dea lungul moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2 metri. Pe de alt parte, n celul, ADN este unit prin cantiti mari de ap (aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la creterea volumului. ntrebarea care se ridic este: cum este posibil intrarea a 2 m de ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu depete 10 m, asigurnd i accesul proteinelor i enzimelor implicate n reglare. O alt problem la fel de important este modul n care molecula de ADN dintr-un cromozom este organizat pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. Rspunsul la toate aceste probleme l gsim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. De mult timp se tie c cromozomii sunt compui din fibre, numite cromatin, formate din ADN i din proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt n general mprite n dou grupe principale: histonele i proteinele cromozomale nehistonice. Histonele reprezint o colecie de mici proteine bazice bine definite n timp ce nonhistonele conin un numr mare de proteine diferite: structurale, enzimatice i reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost nc caracterizate. Cromatina mai conine i un procentaj sczut de ARN compus n principal din catene de ARN n formare in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n procesul de splicing al ARNm.

SLIDE 24. Centromeri/Telomeri Figura. Hibridizarea fluorescent n situ (FISH) i aplicaiile ei: a) utilizarea de sonde fluorescente pentru marcarea regiunii centromerice a cromozomului 16; b) exemplu de cariotip spectral; c) evidenierea prezenei telomerilor la cromozomi de oarece (adaptat dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) Centromerii. Se poate remarca cci toi cromozomii reprezentai n figur posed un situs unde suprafaa lor exterioar este net rscroit (scobit). Aceast scobitur reprezint centromerul cromozomului. Mai sus am artat c centromerii conin heterocromatin constitutiv. Centrometrii cromozomilor umani conin o secven lung de aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit ) dispuse n tandem i repetate de 2 000 la 30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixeaz proteine specifice, ntre altele cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separ cromozomii n timpul diviziunii mitotice.

SLIDE 25. Telomerii Figura. Completarea capetelor ADN de ctre telomeraz: a) procesul de replicare i evidenierea formrii capetelor incomplete ale cromozomilor pentru catena ntrziat; b) mecanismul de aciune al telomerazei cu evidenierea motivelor repetitive de la capetele cromozomilor Telomerii Cele dou extremiti ale moleculei de ADN a fiecrui cromozom posed un segment particular de secvene repetitive numite telomeri, care formeaz un coif la fiecare capt al cromozomilor. La om telomerii posed secvene TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de secvene repetitive, care

18

variaz mult ntre specii, chiar dac ele sunt nrudite i apropiate, n cazul telomerilor de la om i de la toate vertebratele studiate pn n prezent gsim aceeai secven telomeric. La alte organisme cum sunt protozoarele i drojdiile, telomerii au secvene diferite dar, ca i pentru vertebrate, o caten este ntotdeauna bogat n resturi de guanozin iar complementara sa n resturi de citozin. Catena bogat n G este orientat n sensul 5-3 ctre extremitatea cromozomului i depete cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat n C. Datorit existenei acestui dezechilibru catena bogat n G formeaz o scurt coad monocatenar la cele dou extremiti ale cromozomului. Aceast dispoziie persist de la o generaie celular la alta datorit unei enzime speciale, telomeraza, care poate aduga noi uniti repetitive la extremitatea 3 a catenei bogate n G.

Telomeraza, ale crei proprieti au fost bine studiate de ctre Elisabeth Blackburn i colegii si de la Universitatea din California, San Francisco, este o transcriptaz invers care asambleaz fragmente de ADN folosind o caten (matri) de ARN. Telomeraza este o enzim foarte neobinuit n sensul n care ARN care servete drept model, face n realitate parte din enzim. Secvenele telomerice sunt i situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.

Telomerii au roluri importante: i) sunt necesari replicrii complete a cromozomului; ii) protejeaz cromozomii de nucleaze i de alte influene destabilizatoare; iii) mpiedic fuziunea dintre extremitile cromozomilor n procesele de

recombinare; iv) faciliteaz interaciile dintre extremitile cromozomilor i anvelopa

nuclear n anumite tipuri celulare. De asemenea, telomerii i activitatea telomerazei par s fie unii dintre

principalii actori implicai n procesul de mbtrnire. Celulele normale, n cultur, nu sunt capabile s se divid dect de un numr limitat de ori nainte de a da semne de mbtrnire i de a muri n final. Dintre ipotezele propuse pentru a explica aceast observaie este i scurtarea progresiv a telomerilor. Experiene recente sugereaz alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile s se divid n cultur dect de un numr limitat de ori nainte de a da semne de mbtrnire i n final de a muri.

Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica aceast observaie: cea mai recent este scurtarea progresiv a telomerilor. Telomerii se scurteaz deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu nceteaz s creasc n cultur; spunem c acestea devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conserv lungimea telomerilor de-a lungul generaiilor. De fapt, o seri de cercetri au demonstrat c un anumit numr de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi evideniat n celulele normale. Aceast descoperire a declanat cercetarea inhibitorilor specifici ai acestei enzime spernd c acetia ar putea opri creterea anumitor tumori.

SLIDE 26. Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului Figura. Schema general a organizrii cromatinei cu evidenierea principalelor nivele cunoscute de organizare (Campbell, et al., Biology 2002). Imagine electrono-microscopic a unui cromozom uman n metafaz

Cromozomii eucariotelor, care constau ntr-un complex de ADN, ARN i proteine numit cromatin, sunt entiti dinamice a cror aparen variaz considerabil i dramatic cu stagiul ciclului celular. Cromozomii individuali se pot evidenia sub form condensat numai n timpul diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). n

19

timpul interfazei, care formeaz restul ciclului celular, cnd cromozomii sunt transcrii i replicai, cromozomii majoritii celulelor devin foarte dispersai. Nucleul Celular

n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice, nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun: coninutul nuclear reprezint o mas vscoas amorf de materie nchis ntr-un nveli nuclear complex.

n nucleul unei celule tipice, n interfaz (nemitotic), se evideniaz: i) cromozomii, prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite,

cromatina; ii) matricea nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine

proteine; iii) unul sau mai muli nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii

i care intervin n sinteza ARN ribozomal i n asamblarea ribozomilor; iv) nucleoplasma, substan lichid care conine toate componentele i

elementele nucleului eucariot . Cromozomii Cromozomii par s apar la nceputul mitozei i s dispar din nou dup mitoz, punnd astfel citologilor una dintre nntrebrile cele mai importante dar n acelai timp i una dintre cele mai stimulante; care este natura cromozomilor n celulele ne-mitotice. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a organitelor infracelulare demonstreaz o structur care ne ofer informaii interesante despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului evideniaz puine informaii privind natura cromozomului n interfaz (fig 12.1a). mpachetarea genomului O celul uman normal conine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent n numrul diploid de cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur molecul de continu de ADN; cu ct cromozomul este mai mare cu att mai lung este ADN pe care l conine. Dat fiind c fiecare pereche de baze ocup aproximativ 0,34 nm dea lungul moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2 metri. Pe de alt parte, n celul, ADN este unit prin cantiti mari de ap (aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la creterea volumului. ntrebarea care se ridic este: cum este posibil intrarea a 2 m de ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu depete 10 m, asigurnd i accesul proteinelor i enzimelor implicate n reglare. O alt problem la fel de important este modul n care molecula de ADN dintr-un cromozom este organizat pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. Rspunsul la toate aceste probleme l gsim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. De mult timp se tie c cromozomii sunt compui din fibre, numite cromatin, formate din ADN i din proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt n general mprite n dou grupe principale: histonele i proteinele cromozomale nehistonice. Histonele reprezint o colecie de mici proteine bazice bine definite n timp ce nonhistonele conin un numr mare de proteine diferite: structurale, enzimatice i reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost nc caracterizate. Cromatina mai conine i un procentaj sczut de ARN compus n principal din catene de ARN n formare in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n procesul de splicing al ARNm.

20

In interfaz cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre de 30 nm sub forma unui eafod extins. In metafaz, eafodul este pliat intr-un helix i apoi ntr-o structur mult mai compactat a crei geometrie precis nu a fost determinat.

SLIDE 27. Un model de mpachetare a cromozomilor metafazici Comentariu figura - in interfaz cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre de 30 nm sub forma unui eafod extins In metafaz, eafodul este pliat intr-un helix i apoi ntr-o structur mult mai compactat a crei geometrie precis nu a fost determinat

O alt problem este modul n care un nucleu cu un diametru de 10 m poate conine o cantitate de ADN a crei lungime este de 200 000 de ori mai mare dect aceast valoare. Formarea nucleozomilor reprezint prima etap important a procesului de condensare. Dac ntinderea ar fi complet, cele 200 perechi de baze ale unui nucleozom individual de 10 nm diametru ar ocupa aproximativ de 70 nm, pentru o valoare a planului nucleotidelor de 0,34 nm. n consecin, raportul c de condensare a ADN, din structura nucleozomilor este de aproximativ 7:1. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei. Deci, cel mai redus nivel de organizare al cromatinei este rsucirea moleculei de ADN n jurul inimii nucleozomului i are un de diametru 10 nm. Totui, cromatina nu se gsete n celul sub aceast form relativ rsucit de irag de mtnii. Micrografiile electronice ale seciunilor de nucleu relev un umr de pete minuscule cu un diametru de aproximativ 30 nm care reprezint seciuni transversale la nivelul fibrelor de cromatin. Dac se separ cromatina din nucleu, n prezena ionilor divaleni, se observ prezena unor filamente de aceeai grosime. Structura acestui filament de 30 nm rmne nc un subiect discutabil. n figur este prezentat modelul solenoid de suprarsucire a filamentului subire al nucleozomilor (10 nm) pentru a forma un filament de ordin superior, mai gros. Se presupune c, fibrele condensate se formeaz prin mpachetarea nucleozomilor ntr-o structur spiralat (aranjament solenoid) care conine ase nucleozomi pentru fiecare tur de rsucire. Acest nivel suplimentar de organizare al cromatinei crete de ase ori raportul de condensare. Filamentul de 30 nm este conservat prin interaciunea ntre moleculele de histon H1 ale nucleozomilor vecini. Dac sunt extrase selectiv moleculele H1, filamentele groase de cromatin se deruleaz i se transform n mrgele (mtnii) mai subiri i mai nguste. Readugarea histonei H1 restabilete structura de ordin superior. Studii recente de microscopie electronic sugereaz c fibrele de 30 nm sunt mai puin uniforme dect modelul solenoid imaginat. Cromatina condensat poate fi de fapt foarte dinamic fiind format din structuri parial depliate care se pot replia rapid n structuri solenoide ocazionale. Cromatina din regiunile cromozomiale care nu sunt transcrise frecvent este predominant n forma condensat de 30 nm, n timp ce regiunile transcrise activ se consider c adopt forma relaxat de irag de mtnii. Urmtoarea etap de condensare a ADN, n nucleu, o reprezint organizarea filamentelor de 30 nm ntr-o serie de bucle mari suprarsucite. Se estimeaz c fiecare bucl conine ntre 10 i 150 kilobaze ADN. Se pare c acestea sunt fixate la baz cu proteine specifice printre care i o topoizomeraz de tip II care intervine pentru a controla gradul de spiralizare al ADN la nivelul buclei. Topoizomeraza elibereaz moleculele de ADN dac o bucl se ncurc. Buclele de ADN ar putea mpri genomul n domenii, fiecare coninnd un lot mic de gene care sunt exprimate

21

printr-un mecanism comun de reglare. Normal, buclele de cromatin sunt etalate la interiorul nucleului i nu sunt vizibile, dar prezena lor poate fi evideniat n anumite circumstane. De exemplu, dac tratm cromozomii mitotici izolai cu reactivi care extrag histonele, putem observa c ADN eliberat de histone se pliaz sub form de bucle plecnd de la eafodaj proteic, format din proteine nehistonice.

SLIDE 28. Cteva caracteristici ale histonelor

Figura: Secvena aminoacizilor histonei H4 din timus de viel. Aceast protein de 102 aminoacizi posed 25 de resturi de arginin i lizin. Histona H4 de la mazre difer de aceasta numai prin dou resturi: Val 60 i Lys 77. Aminoacizii subliniai sunt subiectul unor modificri post-translaionale

Capul spermatozoidului este bogat n spermin i n spermidin (de unde i numele acestor poliamine), i n particular, pentru peti, n protamine. Acestea sunt polipeptide care nu depesc 5 kDa (30-40 aminoacizi), foarte bazice datorit coninutului ridicat de arginin: 21 din cei 31 de aminoacizi ai clupeinei de hering sunt reprezentai de arginin. O parte (proporie) din aceste molecule este fixat pe ADN. (Se consider c protaminele se fixeaz probabil la nivelul fosei mari determinnd o conformaie cu o mare proporie de elice alfa. ADN plasat n capul spermatozoizilor este cel mai condensat).

n celulele somatice, ADN este asociat n proporii egale cu proteine: histonele (H) majoritare i proteinele ne-histonice. Complexul nucleoproteic care rezult i datoreaz numele reaciei sale cu colorani bazici. Cromatina este un irag de mtnii unde fiecare mrgea, nucleozomul, reprezint asocierea spaial precis a dou componente. Nucleozomii Uniformi i repetitivi, se formeaz prin rsucirea sub form de serpentin a ADN pe corpi sau nuclee de histone (figura 3.2). 1. Nucleul (inima) este o asociere cuaternar, prin intermediul domeniului lor hidrofob, format din 2 copii de histone H2a, H2b, H3 i H4. Octamerul are aspectul unui cilindru plat. 2. Prin formarea de legturi de hidrogen ntre resturile lor i sarcinile negative ale gruprilor fosfat (din structura moleculei ADN), helixurile terminale ale histonelor H3 i H4, se ajusteaz strns la nivelul fosei mici a ADN. Ca rezultat, pe o lungime de aproximativ 200 pb, dubla elice se contorsioneaz la suprafaa cilindrului sub forma unei elice de stnga cu dou suprarsuciri. Astfel mpachetat, ADN prezint fosa mare ctre exterior, secvenele bazelor fiind accesibile. Regiunea format din ADN de legtur ntre fiecare nucleozom are lungime foarte variabil n funcie de tipul celular (o la o sut de perechi de baze). 3. Histona H1 intervine n determinarea gradului superior de organizare. Prin conformaia sa teriar cu trei domenii prinde nucleozomii ntre ei prin trei tipuri de contacte prezentate n figur: H1/ADN la intrare i la ieire; H1/suprafaa nucleului (mai ales prin intermediul H2a); H1/H1 urmtoare.

ADN supra-rsucit din nucleozom este protejat de aciunea hidrolitic a nucleazelor, n timp ce regiunile de legtur dintre nucleozomi sunt foarte sensibile.

Cu toate c supra-rsucirea este foarte eficient aceasta nu reprezint dect primul grad (nivel) de compactare necesar pentru ADN. Sunt necesare stivuiri n coloane ale nucleozomilor i formarea unor tururi (ture) complexe de ordin superior ale cromatinei, pentru a obine arhitectura final a cromozomului.

Modificrile post-traducionale reversibile ale histonelor, pe de o parte, i cele ale bazelor, pe de alt parte (metilarea), confer suplee moleculei. Acestea modific

22

densitatea i repartiia sarcinilor i gruprilor hidrofobe, moduleaz interaciile ADN-histone i histone-histone necesare adaptrii cromozomului la funciile sale. Citologii au denumit heterocromatin, regiunile foarte condensate i eucromatin, regiunile mai difuze. Prima este inert, iar n cea de a doua genele au capacitate de exprimare.

SLIDE 29. Structura nucleozomal core a octamerului histonic Figura. Structura a fost modelat ca urmare a studiilor cu raze X. Acelai model al structurii centrale a nucleozomului (core) fiind identificat poziia histonelor

n 1974, Roger Kornberg, de la Universitatea Harvard, a propus un nou tip de structur secundar pentru cromatin bazndu-se pe rezultatele digestiei cu nucleaze asupra cromatinei din diferite surse. Astzi, se cunoate c nucleozomii conin o particul care constituie nucleul nucleozomului, compus din 146 perechi de baze de ADN suprarsucit, care face aproape dou spire n jurul unui miez proteic central care conine 8 molecule din patru histone: H2A, H2B, H3 i H4. Particulele de nucleozomi sunt unite unele de altele printr-un segment de ADN de legtur, de lungime variabil, dar care are n general 60 de perechi de baze. ADN din structura unui nucleozom i din braul de legtur reprezint aproximativ 200 de perechi de baze, ceea ce corespunde valorii fragmentelor gsite n cursul primelor experiene cu nucleaze. Nucleele nucleozomilor, care au un diametru de aproximativ 10 nm, i ADN de legtur, cu un diametru de 2 nm, apar pe micrografiile electronice asemeni unui irag de mtnii. Pentru fiecare nucleozom, o molecul de histon H1 este poziionat n exteriorul nucleului fiind asociat la cele dou extremiti ale ADN care intr i ies de pe suprafaa complexului proteic. Dac se realizeaz eliminarea selectiv a moleculelor de histone H1, printr-un tratament al fibrelor cu soluii saline de concentraie sczut, cromatina capt un aspect mult mai dezorganizat. In general, resturile de aminoacizi bazici ale histonelor nucleului sunt grupate la extremitile moleculei, restul structurii pstrnd un caracter relativ hidrofob. Aceast separare convine perfect organizrii nucleozomului. Regiunile nencrcate i hidrofobe ale histonelor ocup centrul particulei i favorizeaz agregarea ntr-un nucleu strns. Poriunile polare, bazice, ale moleculelor din nucleu formeaz cozi flexibile orientate ctre exteriorul particulei, unde resturile ncrcate pozitiv pot stabili interacii ionice cu gruprile fosfat negative din structura scheletului ADN. Cu toate c, molecula de ADN este strns asociat nucleului format din histone prin suprafaa intern a fibrei elicoidale, suprafaa sa extern rmne expus i poate interaciona cu moleculele de reglare. Studii de cristalografie cu raze X au demonstrat c resturile ncrcate pozitiv sunt reunite sub form de perechi la suprafaa octamerului histonic. Situsurile pereche formeaz un fel de spiral pe drumul pe care se presupune c l urmeaz elicea ADN care nconjoar nucleul nucleozomului. Acestea servesc drept puncte de fixare pentru cele dou catene ale helixului. Deoarece toate moleculele ADN, indiferent de origine i secvena nucleotidic, posed un schelet riboz-fosfat identic cu cel cu care interacioneaz histonele, nu trebuie s ne surprind extrema conservare a moleculelor aminoacizilor din structura histonelor. Dac pentru spiralizarea a 200 de perechi de baze de ADN sunt necesare aproximativ nou molecule de histone, o celul uman care conine 6 miliarde de perechi de baze de ADN, poate conine aproximativ 300 milioane de histone necesare mpachetrii primare a materialului genetic. Astfel se explic, necesitatea unui numr mare de exemplare de gene care codific pentru histone n celulele care se divid rapid. Interacia dintre histone i ADN este, n principal, de natur structural i relativ independent de secvena nucleotidic. In vitro, un fragment de ADN care n

23

mod normal nu este asociat cu histone, cum este cazul bacteriofagilor sau a polinucleotidelor bicatenare sintetice, formeaz subuniti nucleozomale dac este incubat cu histone purificate care provin de la plante i animale. Experienele de acest tip ilustreaz clar capacitatea de autoasamblare a nucleozomilor. Chiar dac asamblarea histonelor cu ADN nu depinde de secven, aceasta nu semnific neaprat c pentru o anumit gen, nucleele nucleozomilor sunt localizate la situsuri aleatoare. De fapt, s-a demonstrat c anumite pri ale genelor manifest interaciuni constante cu regiunile vecine. Exemplul prezentat n micrografia electronic din figur demonstreaz c pe cromozomul virusului SV40 particulele nucleozomale sunt distribuite periodic, cu excepia unei regiuni care este lipsit de asocierea cu histonele.

SLIDE 30. Structura n aminoacizi a histonei H4 Histonele

Valorile de pH acide sau srurile determin dezorganizarea legturilor ionice i separ cromatina n ADN i fraciune proteic. Prin cromatografie de excluziune, de schimb ionic sau prin electroforez (tehnica SDS-PAGE n geluri cu porozitate redus), au fost identificate la nivelul fraciilor proteice 5 specii de histone.

Punctele comune ale acestora sunt: - mrime mic (au numai 100 la 200 de resturi de aminoacizi); - coninut bogat n aminoacizi bazici: arginina i lizina reprezint aproximativ 1/4 din totalul de resturi. La valorile pH celular aceste proteine sunt ncrcate pozitiv, policationi; - modificrile post-traducionale ale anumitor resturi, deci a aminoacizilor bazici, sunt reversibile enzimatic: acetilare, metilare, fosforilare...; - o structur teriar cu un grad nalt de helix . **: perioad unitar de evoluie: durata necesar pentru o schimbare de 1% din secven dup divergena a dou specii.

Studiile comparative de secvene i de structur tridimensional conduc la divizarea familiei histonelor n dou grupuri, heterogenitate care este subliniat i de poziia lor n nucleozom: H2, 3 i 4 pe de o parte i H1 pe de alt parte.

De fapt, histonele H4 i H3, i ntr-un grad mai mic H2a i H2b, sunt proteine foarte conservate evolutiv. Se d ntotdeauna exemplul frapant al histonei H4 de la bovine i de mazre, ale cror secvene nu difer dect prin dou resturi, aceste diferene avnd influene puin perturbatoare: o Lys n locul unei arginine i o Leu n locul unei Val (doi aminoacizi hidrofobi). Exist aceste diferene minore n condiiile n care acest animal i aceast plant au suferit divergen acum un miliard de ani. Structura histonei H1 este mult mai variabil de la o specie la alta.

Structura teriar a celor patru histone din primul grup demonstreaz existena a dou domenii: un domeniu central globular, hidrofob; un domeniu N-terminal, hidrofil, ncrcat pozitiv i flexibil.

Histona H1, mai lung, posed un al treilea domeniu la nivelul captului C-terminal, hidrofil i flexibil.

Se consider c histona H1 se leag la unuitate nucleozomal de 166 pb. ADN face dou ture complete i poate lega H1 la intrare i la ieire de pe structura nucleozomului. H1 se comport ca o agrafa care reunete cele dou treceri.

24

SLIDE 31. Gel electroforeza SDS a unui amestec de histone H3 i H4 Figura. Electroforeza n SDS a unui amestec de histome H3 i H4 de la viel. Histonele H3 i H4 din timus de viel conin toate benzile anticipate pentru tetramerul (H3)2(H4)2

SLIDE 32. Nucleosomii sunt complexe ADN-histone Figura. Modelarea structurii nucleozomului. mpachetarea genomului eucariot

Dup cum am evideniat mai sus, o celul uman normal conine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent n numrul diploid de cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur molecul continu de ADN. Cu ct cromozomul este mai mare cu att este mai lung molecula de ADN pe care o conine. Deoarece fiecare pereche de baze ocup aproximativ 0,34 nm, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2 metri. De asemenea, n celul, ADN este hidratat cu cantiti importante de ap (aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la creterea volumului. Problema cheie a fost identificarea modalitilor prin care este posibil localizarea a 2m de ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu depete 10 m, asigurnd n acelai timp, accesul proteinelor i enzimelor implicate n procesele de reglare. O alt problem, la fel de important, se refer la modul n care molecula de ADN, dintr-un cromozom, este organizat pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. Rspunsurile la toate aceste probleme l gsim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. Se cunoate de mult timp c fibrele care formeaz cromatina, i intr n structura cromozomilor, sunt formate din ADN n asociere cu proteine. Proteinele din structura cromatinei sunt mprite n dou grupe principale: histonele i proteinele cromozomiale nehistonice. Histonele reprezint o colecie de mici proteine bazice bine definite, n timp ce proteinele nehistonice sunt compuse dintr-un numr mare de proteine diferite cu rol structural, enzimatic i reglator. Cromatina mai conine i un procentaj sczut de ARN compus, n principal, din catene de ARNhn in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n procesul de splicing al ARNm. n celulele eucariote, unitatea de baz a organizrii cromatinei este nucleozomul. Acesta reprezint o entitate n care 146 pb sunt rsucite n dou ture de super-elice stng n jurul unui octamer de histone care conine cte dou exemplare din moleculele H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii sunt organizai n filamente de 10 nm n diametru prin interaciuni cu histona H1, care se leg la ADN care intr i iese din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este obinut prin rsucirea unui filament de 10 nm ntr-o elice care conine 6 nucleotide pe tur, cu formarea unui solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai puin cunoscute. Microscopia electronic a furnizat dovezi decisive privind organizarea cromatinei n regiuni, bucle i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o matrice bogat n proteine. Fiecare bucl pare s aib doar o singur origine de replicare i s se comporte ca o unitate de replicare. Buclele, sunt uniti de supra-rsucire independente, structura topologic a fiecreia fiind independent de starea celorlalte. Se pare c acest lucru este posibil datorit fixrii extremitilor buclelor n matrice. Cu toate c fiecare bucl conine mai multe uniti de transcripie, activitatea ntregii regiuni poate fi coordonat pentru a fi reprimat sau potenial activat.

25

Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului mpachetarea precis a ADN de la eucariote depinde de histone, grup remarcabil de proteine bazice care se mparte n cinci subgrupe, n principal n funcie de coninutul lor n lizin i arginin care reprezint aproximativ din totalul aminoacizilor. La pH fiziologic, aceste proteine sunt ncrcate pozitiv i posed o structur teriar cu un grad mare de elice alfa. Aminoacizii bazici din structur sufer modificri post-traducionale (acetilare, metilare, fosforilare) reversibile enzimatic. Studiile comparative de secven i de structur tridimensional au condus la divizarea familiei histonelor n dou grupuri: H2A, H2B, H3 i H4 pe de o parte i H1 pe de alt parte. Aceast eterogenitate este subliniat i de poziia lor n nucleozom. De fapt, histonele H4 i H3, i ntr-un grad mai mic H2A i H2B, sunt proteine foarte conservate evolutiv. Exemplul cel mai frapant este al histonei H4 de la bovine i de la mazre, care au acelai numr de aminoacizi (102) i ale cror secvene primare nu difer dect prin doi aminoacizi: o lizin n locul unei arginine i o leucin n locul unei valine. Aceste diferene minore sunt prezente n condiiile n care divergena dintre animal i plant s-a produs acum un miliard de ani. Structura histonei H1 este mult mai variabil de la o specie la alta. Aceast conservare extrem sugereaz c toi aminoacizii au un rol bine definit n funcionarea proteinei. Structura teriar a histonelor din primul grup demonstreaz existena a dou domenii: un domeniu central globular, hidrofob i un domeniu N-terminal, hidrofil, ncrcat pozitiv i flexibil. Histona H1, mai lung, posed un al treilea domeniu la nivelul captului C-terminal, hidrofil i flexibil. La nceputul anilor 1970, s-a putut observa c n urma tratamentului cromatinei, cu nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformat n fragmente de aproximativ 200 perechi de baze sau n multipli ai acestora. Din contr, acelai tratament aplicat moleculelor de ADN nud determin obinerea unei populaii de fragmente de mrimi aleatoare. Aceast descoperire i-a fcut pe cercettori s considere c fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau protejate de atac enzimatic probabil prin asocierea lor periodic cu o protein.

SLIDE 33. Structura i dimensiunile nucleozomilor

Figura. Structura i dimensiunile nucleozomilor: a) sedimentarea nucleozomilor n gradient de sucroz duce la obinerea unei serii de picuri care corespund formelor monomere, dimere, trimere, etc., ale nucleozomilor; b) ADN extras din fraciile individuale este supus electroforezei mpreun cu un martor ADN digerat cu nucleaze; c) micrografie electronic a cromatinei eliberat dintr-un nucleu al unei celule de Drosophila. Se observ c fibrele de cromatin sunt formate din nucleozomi conectai ntre ei prin segmente scurte de ADN; d) schem care demonstreaz structura unei particule nucleozomale cu o molecul de histon H1 asociat; e) electroforez n SDS a unui amestec de histone H3 i H4 din timus de viel. Se observ toate benzile corespunztoare componentelor tetramerului (H3)2(H4)2 SLIDE 34. Modul de legare al histonei H1 n structura nucleosomului

Figura. Dou ture complete ale moleculei de ADN sunt conectate prin legarea histonei H1 care vine n contact cu molecula la capete i n mijloc. Octamerul histonic este reprezentat printr-o sfer. Se consider c histona H1 se leag la unuitate nucleozomal de 166 pb. ADN face dou ture complete i poate lega H1 la intrare i la ieire de pe structura nucleozomului. H1 se comport ca o agrafa care reunete cele dou treceri

26

SLIDE 35. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin

condensat de 30 nm Figura. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat de 30 nm: a) micrografia i modul de organizare a nucleozomilor din structur; b) micrografie prezentnd fibrele de 30 nm i modelul de mpachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

SLIDE 36. Cromatina exist n forme condensate i relaxate Figura. Cromatina n form condensat i relaxat

a) Cromatina izolat la putere ionic sczut apare sub forma unor lanuri de mrgele. Mrgelele sunt nucleosomii cu un diametru de 10nm diametru Cromatina izolat in tampon cu putere inic fiziologic (o,15 M KCl) apare ca o fibr condensat de 30nm diametru Influene globale asupra expresiei genelor Pn n prezent atenia ne-a fost ndreptat ctre reglarea transcripiei genelor i asupra maturrii transcripilor primari. Viteza, momentul i localizarea acestor procese sunt determinate de ctre proteinele care nu recunosc dect secvene scurte de ADN i/sau suprafeele altor proteine. Aceste interacii influeneaz iniierea sau terminarea transcripiei sau chiar maturarea transcripilor. Prezena sau starea funcional a acestor proteine sunt adesea determinantul principal al expresiei genelor. Totui, este de asemenea evident c modificrile reversibile ale strii ADN pot influena expresia genelor, i n particular competena acestora n realizarea transcripiei. De exemplu, modificarea gradului de superhelicitate a ADN, adic a strii sale topologice, i modificrile conformaionale care decurg din aceasta (de ex. trecerea de la topologie B la Z sau la alte forme de ADN) pot influena puternic activitatea de transcripie. Starea cromatinei n care se gsete gena, n particular gradul de compactare a nucleozomilor, adaug un grad de complexitate suplimentar n exprimarea genelor. n general, activarea din timpul transcripiei este n raport cu trecerea cromatinei de la o structur foarte condensat ctre o form derulat, sau form deschis. Activitatea de transcripie este de asemenea influenat de ctre gradul de metilare a citozinei din structura dinucleotidului 5-CG-3. Reprimarea transcripiei este adesea asociat cu o hipermetilare la nivelul genei sau n apropierea acesteia, activarea fiind nsoit de demetilare. Compactarea ADN Unitatea de baz a organizrii cromatinei n celulele eucariote este nucleosomul, o entitate n care 145 pb sunt rsucite n dou ture de super-helix stng n jurul unui octamer de histone care conine dou exemplare din moleculele H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii sunt organizai n filamente de 10 nm n diametru prin interaciuni cu hostona H1, legat de ADN care intr i iese din nucleosom. Un al treilea nivel de organizare este obinut prin rsucirea unui filament de 10 nm ntr-o elice care conine 6 nucleotide pe tur: este vorba de formarea unui solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai puin cunoscute. Microscopia electronic a furnizat dovezi decisive privind faptul c cromatina este organizat n regiuni, bucle i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o matrice bogat n proteine. Fiecare bucl pare s aib doar o singur origine de

27

replicare i s se comporte ca o unitate de replicare. Buclele sunt uniti de supra-rsucire independente, structura lor topologic fiind independent de starea buclelor vecine. Acest lucru este probabil posibil datorit fixrii extremitilor buclelor n matrice. Cu toate c fiecare bucl conine mai multe uniti de transcripie, activitatea ntregii regiuni poate fi coordonat pentru a fi reprimat sau potenial activ. Cromatina reprimat. Numeroase gene de la organismele eucariote multicelulare nu sunt exprimate dect n anumite momente ale dezvoltrii i/sau n anumite esuturi. Aceasta semnific c celulele trebuie s posede modaliti eficace pentru a reprima expresia tuturor acestor gene care nu sunt caracteristice unui anumit tip de celule. Represarea unor regiuni (blocuri) mari de gene prin limitarea disponobilitii factorilor de transcripie este un mecanism destul de puin probabil pentru o astfel de reglare. Ideea este susinut de faptul c genele care nu sunt exprimate n mod normal ntr-o celul, pot fi produse dac sunt introduse n aceasta prin transfecie. De exemplu, genele globinei, induse prin transfecie n fibroblaste, sunt exprimate de o mie de ori mai puternic dect genele rezidente ale globinei; n plus aceast diferen persist n cursul diviziunilor succesive dac genele transfectate sunt integrate la nivelul unor situsuri cromozomice. De fapt, acesta este un efect destul de obinuit dar nu universal, ca genele transfectate s aib o activitate mai mare dect genele endogene. Este general admis c acest represie este rezultatul sechestrrii genelor silenioase n structuri de cromatin superior structurate care le fac inaccesibile mainriei de transcripie. n absena informaiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este imposbil de descris starea de tranziie care separ cromatinele reprimate i exprimate. O indicaie este furnizat prin corelaia care exist ntre momentul n care gena este replicat i cel n care ea poate fi transcris. Genele de meninere, exprimate n permanen n toate celulele, cum este cea pentru dihidrofolat-reductaz, actin citoplasmatic sau glucozo-6-fosfat dehidrogenaz, sunt replicate n prima jumtate a fazei S; genele ne-exprimate tind s fie replicate mai trziu. n plus, replicarea genelor este precoce n esuturile n care ele sunt exprimate i trzie n esuturile n care acestea sunt silenioase. La fel, la mamifere, cromozomul X inactiv este replicat dup cromozomul X activ. Aceste corelaii sugereaz c replicarea precoce creeaz o stare mai accesibil mainriei de transcripie sau mai eficace pentru fixarea factorilor de transcripie.

SLIDE 37. Modelul solenoid al cromatinei condensate Figura. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat de 30 nm: a) micrografia i modul de organizare a nucleozomilor din structur; b) micrografie prezentnd fibrele de 30 nm i modelul de mpachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

SLIDE 38. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei Figura. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei: a) micrografie electronic prezentnd domenii de cromatin, n bucle la cromozomii n perie izolai dintr-un ovocit de amfibian; b) model de structurare a buclelor fibrelor de cromatin de 30 nm imaginat n urma experienelor de hibridare in situ cu sonde (A la H) situate la distane variabile pe ADN liniar; c) micrografie electronic a unui cromozom metafazic din celule HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu detergeni

28

Micrografia electronic din figur evideniaz buclele lungi de ADN ancorate la un schelet cromozomial compus din proteine nehistonice obinut prin ndeprtarea histonelor din structura cromozomilor din celule HeLa, n metafaz. Acest eafodaj flexibil are forma cromozomului metafazic i persist chiar i atunci cnd ADN este digerat cu nucleaze. Acelai tip de bucle se pot evidenia n cromozomii politeni interfazici din celulele insectelor i n cromozomii meiotici n perie (lamp-brush) din ovocitele de amfibieni, ceea ce demonstreaz c acestea nu sunt proprii cromozomilor mitotici. O serie de experimente de hibridizare in situ, realizate pe celule umane n interfaz, utiliznd diferite sonde fluorescente, au dus la imaginarea modelului prezentat. Astfel, s-a evideniat c o serie de sonde (A la H) care recunoteau secvene situate la milioane de perechi de baze distan, n structura ADN linear, erau poziionate foarte aproape unele de altele n structura cromozomului interfazic. Se consider c apropierea dintre aceste situsuri, numite i regiuni asociate scheletului (denumite SARs de la scaffold-associated regions sau MARs de la matrix-attachment regions) este posibil datorit asocierii lor la scheletul cromozomului. n general, regiunile asociate scheletului se gsesc ntre unitile de transcripie. Deci, genele sunt localizate prioritar la nivelul buclelor de cromatin ale cror baze sunt ataate scheletului cromozomului. Cromozomul mitotic reprezint etap ultim de condensarea a cromatinei. De obicei, un m de cromozom mitotic conine un cm de ADN. Aceast condensare, realizat ca urmare a unui proces nc puin cunoscut, este nsoit de fosforilarea practic a tuturor moleculelor de histone H1 la nivelul celor cinci resturi de serin din molecul.

SLIDE 39. Demonstraie experimental a formrii buclelor de cromatin la cromozomii interfazici

Figura. Hibridizarea in situ a celulelor n interfaz a fost realizat cu diferii markeri fluoresceni (sonde) specifici pentru secvene separate prin distane cunoscute pe cromozomul linear. Literele din figur reprezint sondele care pot fi identificate prin culoarea lor diferit. Acestea arat c secvenele A i B care sunt separate ntre ele printr-un milion de baze sunt evideniate n nucleu ca fiind foarte apropiate. Siturile A-F sunt separate de milioane de perechi de baze de secvene lineare dar sunt fizic apropiate unele de altele n nucleul n interfaz

SLIDE 40. Prezentare generala a structurii cromozomilor si genelor. ADN de la eucariotele superioare consta in secvente unice si repetitive

SLIDE 41. Micrografie electronic a cromatinei la Drosofila melanogaster

Fibrele de 100 A sunt separate de nururi ntre nucleosomi Cromatina n form condensat i relaxat O imagine electronomicroscopic a cromatinei de la Drophila melanogaster evideniind fibrele de 100A care leag nucleosomii ntre ei. Topologia i conformaia ADN

29

Influena super-helicitii asupra reglrii transcripiei Numeroase observaii indic c expresia genelor eucariote este modulat de starea de super-helicitate a ADN. Mutaii care afecteaz topoizomerazele sau inhibitorii acestora, care la rndul lor influeneaz starea de super-helicitate a ADN, activeaz transcripia anumitor gene nhibnd expresia altora. Deoarece legtura proteinelor cu ADN supra-rsucit negativ este facilitat printr-o modificare favorabil a energiei libere, i este posibil ca variaiile super-helicitii ADN s influeneze accesul ARN polimerazei sau a proteinelor activatoare sau represoare la secvenele reglatoare. Alterrile strii de super-helicitate sau gradul de supra-rsucire pot i ele s afecteze replierea ADN i astfel capacitatea sa de a interaciona cu proteinele implicate n transcripie. Am vzut c cromatina de la eucariote este organizat ntr-o serie de bucle de lungimi variabile, ale cror extremiti sunt ancorate n matricea proteic. Aceast organizare confer fiecrei bucle o super-helicitate proprie i independent de cea a buclelor vecine. Este interesant de reinut c topoizomeraza II, responsabil de relaxarea ADN supra-rsucit este o protein major a structurii cromozomiale la care sunt acroate buclele. Efectele negative sau pozitive asupra transcripiei structurilor care se intercaleaz n ADN sau inhib topoizomerazele i altereaz astfel ntreaga superhelicitate a ADN, au contribuit i ele la noiunea c topologia ADN este un parametru important, care guverneaz reglarea transcripiei. Totui, absena fenotipului care s afecteze transcripia la mutani de drojdii deficieni n topoizomeraza I sau II sugereaz c, dac o activitate topoizomerazic este necesar transcripiei ADN de la eucariote, una dintre aceste activiti poate fi suficient. Cea mai mare parte a indicaiilor care implic topoizomeraze i efectele lor asupra topologiei ADN n reglarea transcripiei, sunt indirecte i puin concludente. De fapt, nu exist nici o prob pentru sau contra ideii c modificarea super-helicitii unei bucle a cromozomului influeneaz activitatea de transcripie a ntregii regiuni sau a genelor care sunt localizate la acest nivel. Conformaiile B i Z ale ADN i transcripia ADN poate prezenta o conformaie de dreapta (B) sau de stnga (Z). La echilibru proporiile relative ale celor dou forme sunt influenate de secvenele de ADN, superhelicitatea sa i diversele condiii de mediu, cum sunt fora ionic, temperatura i prezena metalelor.