UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI

FACULTATEA DE ÎMBUNĂTĂŢIRI FUNCIARE ŞI INGINERIA MEDIULUI

SPECIALIZAREA PROTECŢIA MEDIULUI

MICROBIOLOGIE - NOTE DE CURS

Conf. Dr. Irina Grebenişan

MORFOLOGIA BACTERIILOR

1. Bacteriile sferice (cocii) au formă sferică, ovoidă, elipsoidală, reniformă, diametrele celulei fiind aproximativ

egale. Cocii se pot grupa în şase subtipuri morfologice în funcţie de poziţia celulelor fiice după diviziune:

-coci simpli sau izolaţi;

-diplococi celulele sunt grupate câte două – Streptococcus pneumoniae;

-streptococi celulele formează lanţuri Streptococcus thermophilus;

-tetracoci celulele sunt grupate câte patru – Micrococcus tetragenes;

-sarcina celulele sunt grupate în cuburi – Sarcina lutea;

-stafilococi celulele sunt grupate sub formă de ciorchine – Staphylococcus aureus

2. Bacterii cilindrice (bacili) au formă de bastonaşe care pot fi filamentoase sau sferic-ovale – cocobacili – Bacillus

subtilis, Clostridium sp., Lactobacillus plantarum, Pseudomonas sp. Bacilii pot fi drepţi sau uşor curbaţi cu capete drepte sau

rotunjite, pot fi izolaţi sau grupaţi câte doi – diplobacili, în lanţuri – streptobacili, palisadă (ca un gard), rozetă sau stea.

3. Bacterii spiralate sau elicoidale cuprind trei subtipuri morfologice:

-vibrionul în formă de virgulă – Vibrio cholerae;

-spirilul în formă de spirală cu spire rigide – Spirillum volantus;

-spirocheta în formă de spirală cu spire flexibile – Treponema, Leptospira

4. Bacterii filamentoase sunt reprezentate de actinomicete şi prezintă asemănări morfologice cu fungii, formează hife

cu tendinţă de ramificare şi spori. Bacteriile din genul Streptomyces sunt cunoscute ca fiind producătoare de antibiotice:

streptomicina, cloramfenicolul, kanamicina, tetraciclina; enzime şi compuşi antitumorali.

5. Bacterii pătrate au fost izolate din ape hipersaline din Peninsula Sinai; prezintă vacuole cu gaz care dispar la

presiune; formează grupuri de 8-16 pătrate. În funcţie de condiţiile de mediu, bacteriile îşi pot modifica forma acest proces

numindu-se pleomorfism – la Ptoteus mirabilis celulele pot fi de formă bacilară (de obicei) sau filamente lungi (mai rar) şi la

Haemophilus celulele pot fi sub formă filamente sau cocobacili.

1.2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

1.2.1. PERETELE CELULAR

Este un înveliş rigid care asigură celulei protecţie faţă de şocurile osmotice, susţinere mecanică şi determină forma

celulei bacteriene. Celulele lipsite de perete celular se numesc protoplaşti. Participă la procesul de creştere şi diviziunea

celulară. Conţine constituenţi cu rol de factori antigenici, de receptori pentru bacteriofagi, de recunoaştere a celulelor capabile

de conjugare. Conţine enzime autolitice care degradează peptiglicanul în cursul sporulării sau biosintezei peretelui celular. La

eubacterii peretele celular este constituit din peptidoglican – mureină. La arhebacterii peretele celular este constituit din

pseudomureină. Peptidoglicanul este un polimer alcătuit din:

-acidul N-acetilmuramic şi N-acetil glucozamina unite între ele prin legături β-1,4 glicozidice, formând lanţuri

liniare (componenta glicanică);

-tetrapeptid (componenta proteică) constituit din:

*aminoacizi cu două grupări amino (lizina) între care se stabilesc legături încrucişate între lanţurile glicanice;

*aminoacidul acid diaminopimelic

În funcţie de structura şi de compoziţia chimică, peretele celular bacterian poate fi colorat specific, bacteriile fiind

încadrate din acest punct de vedere în trei tipuri:

1. Gram pozitive;

2. Gram negative;

3. acidorezistente.

1.Bacteriile Gram pozitive

• 80-90% din greutatea uscată a peretelui celular este reprezentat de peptidoglican;

• Peretele celular conţine acizi teichoici şi acizi teichuronici legaţi covalent de peptidoglican;

• Peretele celular poate fi degradat de lizozim care hidrolizează legăturile dintre acidul N-acetil muramic şi N-acetil

glucozamina, sau endopeptidaze care rup legăturile dintre tetrapeptidele din peptidoglican;

2. Bacteriile Gram negative

• Peretele celular nu conţine acizi teichoici şi teichuronici;

• Prezintă membrană externă care este constituită din (fig. 1):

-fosfolipide (35%);

-lipopolizaharide (50%);

-proteine membranare globulare;

-lipoproteine;

-proteine cu rol în transportul membranar (porine).

1.2.2. SPAŢIUL PERIPLASMIC

Compartiment prezent doar la bacteriile Gram negative, este delimitat la exterior de membrana externă, iar la interior

de membrana citoplasmatică. La nivelul său sunt eliminate enzime precum: fosfataza alcalină, fosfodiesteraza ciclică, DN-aze,

RN-aze sau alte proteine neenzimatice cu rol de legare şi transport a diferitelor substanţe (glucide, aminoacizi, ioni anorganici).

Chemoreceptorii ce sunt implicaţi în răspunsul chemotactic sunt localizaţi la nivelul spaţiului periplasmic.

1.2.3. MEMBRANA PLASMATICĂ

Separă citoplasma de suprafaţa internă a peretelui celular, de care este lipită datorită diferenţei de presiune osmotică

între conţinutul celular şi mediul extern. Reprezintă singura structură citoplasmatică permanentă a celulei bacteriene cu rol de

delimitare a spaţiului intracelular. Este constituită din două straturi de fosfolipide în care sunt incluse proteine membranare.

Bistratul fosfolipidic prezintă o extremitate hidrofobă orientată spre interiorul membranei şi una hidrofobă orientată spre

exteriorul membranei. Proteinele membranare sunt inclavate în bistratul fosfolipidic, fiind asociate cu regiunea hidrofobă a

lipidelor şi având rol în transportul unor substanţe în interiorul celulei. Poate forma sisteme de membrane (mezosomii) care se

ramifică în citoplasmă sau care se pot separa devenind entităţi aparent independente. Funcţionează ca o barieră osmotică, fiind

impermeabilă pentru anumite tipuri de molecule şi permeabilă pentru altele.

1.2.4. CITOPLASMA

Este considerată ca fiind un sistem coloidal complex format din proteine, glucide, lipide, apă, substanţe minerale.

Aspectul variază în funcţie de vârsta microorganismului şi de condiţiile de mediu:

-la celulele tinere apare ca o masă densă, omogenă, intens colorată;

-la celulele îmbătrânite capătă o structură granulară, cu vacuole evidente şi o coloraţie slabă.

Conţine cantităţi mari de ARN (ceea ce explică bazofilia intensă în celulele tinere). În interiorul citoplasmei se găsesc:

nucleoidul, ribosomii, incluziunile, vacuolele şi ceilalţi constituenţi ai protoplastului.

1.2.5. NUCLEOIDUL

Constituie echivalentul bacterian al nucleului de la celulele eucariote, fiind lipsit de membrană nucleară şi inclavat

direct în citoplasmă. Este constituit dintr-o macromoleculă de ADN cu dimensiuni foarte mari (1400 µm lungime şi 2,5 nm

diametru) în raport cu dimensiunea celulei bacteriene (0,5-1 µm x 3-6 µm) ceea ce presupune o împachetare a ADN. Greutatea

moleculară a ADN cromosomal bacterian variază între 109 şi 1010, conţinând 4x106 perechi de nucleotide. Bacteriile sunt

haploide având un singur cromosom, însă în celulele tinere aflate în faza exponenţială de creştere pot fi 2-4 copii cromosomale

provenite din replicarea rapidă a cromosomului parental.

1.2.6. RIBOSOMII

Sunt particule nucleoproteice intracitoplasmatice, formate din ARNr şi proteine ribosomale, fiind implicate în procesul

de sinteză a proteinelor. Celulele aflate în faza de creştere logaritmică au în citoplasmă 1.500 pâna la 100.000 de ribosomi.

Ribosomii prezenţi în celulele procariote au constanta de sedimentare 70 S şi sunt alcătuiţi din două subunităţi:

-subunitatea mare de 50 S formată din molecule de ARNr 23 S şi ARNr 5 S asociate cu 34 proteine ribosomale

diferite;

-subunitatea mică 30 S formată din ARNr 16 S şi 21 proteine ribosomale diferite.

Sunt componente importante ale sistemului de traducere a informaţiei genetice, la nivelul lor realizându-se reacţii ce

determină iniţierea, alungirea şi terminarea sintezei lanţului peptidic. Prezintă situsuri prin care interacţionează cu ARNm şi

ARNt legând specific între ele moleculele de aminoacizi şi determinând formarea proteinelor. În timpul biosintezei proteice

ribosomii se grupează şi formează poliribosomi ceea ce asigură eficienţă mai mare acestui proces.

1.2.7. SPORUL

Reprezintă o formă primitivă de diferenţiere celulară ce constă în formarea, în celula vegetativă a bacteriilor Gram

pozitive, a unui nou tip de celulă cu o ultrastructură, compoziţie chimică şi enzimatică diferită, ceea ce-i conferă rezistenţă

mare la condiţii nefavorabile de mediu.

Tipuri de spori:

-endosporul – se formează în interiorul unei celule vegetative, prezintă rezistenţă mare la condiţiile de mediu;

-sporii de origine hifală de la actinomicete (Streptomyces, Nocardia);

-chiştii – descrişi la Azotobacter provin din transformarea celulelor vegetative;

-gonidiile;

-mixosporii, heterocistii şi akineţii.

În funcţie de poziţia unde se formează endosporii pot fi diferenţiate taxonomic bacteriile: ecuatorial (Bacillus

anthracis), subterminal (B. cereus), terminal (Clostridium tetani).

Sporul este format din:

-înveliş sporal (structură lamelară complexă);

-cortex (format din peptidoglican modificat);

-sporoplasmă;

-nucleoplasmă.

1.2.8. INCLUZIUNI INTRACELULARE

Sunt formaţiuni structurale inerte care apar în citoplasma bacteriilor la sfârşitul perioadei de creştere activă. Sunt

structuri legate de activitatea metabolică a celulei, fiind materiale de rezervă care se acumulează în diferite regiuni ale celulei

atunci când cultura se dezvoltă lent sau nu se mai dezvoltă. În funcţie de compoziţia chimică, incluziunile pot fi clasificate

astfel:

-polimeri organici – incluziuni de glicogen, amidon, poli-β-hidroxibutirat, cianoficină (în cazul cianobacteriilor)

polimer format din acid aspartic şi arginină;

-polimeri anorganici – incluziuni de polimetafosfat;

-incluziuni anorganice simple – granule de CaCO3, sulf coloidal (în cazul bacteriilor sulfuroase.

În cazul bacteriei Bacillus thuringiensis s-au evidenţiat incluziuni (care nu au rol de depozit) proteice parasporale, cu

structură cristalină, de tipul endotoxinei.

Vacuolele sunt structuri intracitoplasmatice sferice cu diametru de 0,3-0,5 μm, totalitatea lor formând vacuomul.

Vacuolele prezintă o membrană lipoproteică monostratificată, conţin apă şi susbtanţe dizolvate, iar numărul / celulă variază ele

având rol în reglarea presiunii osmotice şi în etapa premergătoare a formării incluziunilor, de depozit a substanţelor de rezervă.

Bacteriile acvatice au vacuole cu gaze numite aerosomi cu rol în flotaţei.

1.2.8. APARATUL FOTOSINTETIC

Pigmenţii fotosintetizanţi (clorofila a, carotenoizi, ficocianină – pigment albastru, ficoeritrină – pigment roşu) ai

cianobacteriilor sunt localizaţi la nivelul tilacoizilor – structuri membranare particulate. Membranele intracelulare tilacoidale

au forme variate – tubulare, veziculare, lamelare, fiind acoperite cu corpusculi mici numiţi ficobilisomi care conţin

ficobiliproteine. Tilacoidele servesc ca centru al reacţiilor biochimice în urma cărora are loc conversia energiei luminoase în

energie chimică şi transportul electronilor. În cazul bacteriilor genului Chlorobium aparatul fotosintetic este format din vezicule

delimitate de o membrană monostrat, care nu au legătură cu membrana plasmatică.

1.2.9. STRUCTURI EXTRAPARIETALE

Constituie o barieră ce protejează celula faţă de condiţiile nefavorabile de mediu (prevenirea ataşării virusurilor sau

procesul de desicare). Este o structură accesorie cu o consistenţă viscoasă, gelatinoasă, care acoperă complet celula şi dau un

aspect mucoid, fiind constituită din polizaharide;

Capsula se întâlneşte la bacteriile Gram pozitive şi negative. Pe mediu solid bacteriile capsulate produc colonii

netede (de tip S=smooth), iar cele necapsulate colonii rugoase (de tip R=rough). Capsula îndeplineşte roluri multiple precum:

-de protecţie faţă de uscăciune;

-conferă virulenţă bacteriilor patogene, deoarece capsula este chemotactic negativă pentru fagocite;

-depozitează unele substanţe nutritive;

-conferă caracterul de antigenitate;

Glicocalixul este o structruă extraparietală cu ajutorul căreia se ancorează fie de alte celule, fie de diverse suporturi.

Glicocalixul este format din filamente polizaharidice şi glicoproteice care se leagă de lipopolizaharidele membranei externe la

bacteriile Gram negative şi de mureina (peptidoglicanul) bacteriilor Gram pozitive.

1.2.10. APENDICI LOCOMOTORI

Sunt reprezentaţi de flageli – organite extracelulare care conferă mobilitate celulelor purtătoare. Flagelii sunt apendici

de natură proteică (cea mai importantă este flgelina) cu diametru de 20 μm şi lungime de 4-70 μm. Flagelul se formează din

structurile de înveliş ale celulei şi are o structură complexă fiind format din:

-corpuscul bazal (ancorează flagelul la peretele celular prin intermediul unor structuri discoidale;

-cârligul (conectează filamentul la suprafaţa celulară);

-filamentul extern (flagelul propriu zis);

În funcţie de numărul flagelilor bacteriile sunt clasificate astfel:

-monotrihe (un singur flagel);

-amfitrihe (cu doi flageli poziţionaţi diametral opus);

-lofotrihe (cu numeroşi flageli grupaţi);

-peritrihe (cu numeroşi flagelidistribuiţi pe toată suprafaţa celulei).

1.2.12. APENDICI NELOCOMOTORI

Sunt reprezentaţi de pili şi fimbrii. Pilii sunt structuri filamentoase drepte cu număr variat /celulă (1-10) a căror

sinteză este codificată de gene situate pe plasmide (elemente genetice extracromosomale). Pilii sunt de natură proteică, fiind

constituiţi din pilină şi au rol în procesul de conjugare bacteriană şi receptori pentru fagii filamentoşi.

Fimbriile sunt structuri filamentoase drepte şi rigide, constituite din proteine numite fimbriline, sunt codificate de

gene cromosomale. Fimbriile se consideră că au rol în mărirea suprafeţei de absorbţie a substanţelor nutritive sau determină

ataşarea intercelulară sau de substrat. Bacteriile patogene care prezintă fimbrii manifestă o virulenţă mai mare faţă de cele fără

fimbrii datorită ataşării mai eficiente de celulele gazdei.

2. CARACTERE GENERALE ALE FUNGILOR

Studiile realizate pe fungi au relevat o mare diversitate a acestor organisme, care se datorează formei, structurii şi

particularităţilor biologice. Fungii formează cea mai mare grupare sistematică dintre organismele eucariote inferioare. Fungii

sunt eucariote heterotrofe, incapabile de fotosinteză, care îşi obţin energia prin oxidarea compuşilor organici. Ei se găsesc în

special în sol unde participă la degradarea unor substraturi foarte variate. Fungii pot prezenta un mod de viaţă saprofit sau

parazit (parazitează plantele şi animalele). Celulele fungilor au o organizare tipic eucariotă, corpul vegetativ fiind alcătuit din

hife care formează miceliul numit tal.

Miceliul variază în complexitate şi dimensiune: de la formele unicelulare (levuri), la cele pluricelulare (mucegaiurile)

şi până la ciupercile macroscopice. Celulele prezintă un perete celular gros, al cărui principal component este chitina

(poliglucid rezistent şi flexibil, alcătuit din resturi de N-acetilglucozamină). Celulele fungice au, de obicei, mai mulţi nuclei dar

nu conţin plastide. Organizarea hifelor este coenocitică: în interiorul structurii filamentoase ramificate, protejată de peretele

celular rigid, se găseşte o masă citoplasmatică multinucleată. Hifele pot fi neseptate, de exemplu la Phycomycetes sau pot avea

septe la Ascomycetes şi Basidiomycetes ce sunt străbătute de pori.

2.1. STRUCTRURA CELULARĂ A FUNGILOR

Nucleul - a fost pus în evidenţă prima dată de către De Bary (1866). Nucleul fungilor este mic având dimensiuni

cuprinse între 0,75 - 20 μm. Forma nucleului este sferică sau ovală. Nucleul este înconjurat de o membrană dublă cu numeroşi

pori, caracteristică organismelor eucariote. În interior se află nucleoplasma şi unul sau mai mulţi nucleoli. Substanţa

caracteristică nucleului este cromatina, alcătuită din acidul dezoxiribonucleic, acidul ribonucliec şi proteine. Numărul

cromosomilor variază în funcţie de specie, fiind în general mic, de exemplu Penicillium notatum are cinci, Neurospora crassa

are şapte, iar Aspergillus nidulans are opt cromosomi.

Reticulul endoplasmatic - din celulele fungice este constituit din două membrane unitare separate printr-un lumen.

RE poate avea formă tubulară sau lamelară şi este mai evident în celulele tinere.

Ribosomii sunt distribuiţi în mod neuniform în citoplasmă sau sunt ataşaţi de RE. Mitocondriile sunt asemănătoare cu

cele de la alte organisme, îndeplinind aceleaşi funcţii. Complexul Golgi este şi el prezent în celulele fungice. Vacuolele sunt

prezente în număr mare în celulele mature, fiind prevăzute cu o membrană simplă.

Citoplasma prezintă la exterior o membrană fină lipoproteică - plasmalema, urmată de hialoplasmă (la periferia

celulei), iar în interior este prezentă granuloplasma. Continuitatea citoplasmei este asigurată de plasmodesme între celule şi

anastomoze între hife. În componenţa citoplasmei intră: glucide (glicogen), proteine, lipide, acid ribonucleic, acizi organici,

enzime, fosfaţi de fitosterine. Citoplasma celuleor fungice este hialină, omogenă şi refringentă.

Peretele celular este constituit din chitină, micoceluloză, caloză, hemiceluloză poliglucide complexe, acizi organici,

etc. În funcţie de absenţa sau prezenţa peretelui celular, celulele fungice pot fi gimnoplaste - fără perete celular (la grupe

inferioare de fungi) şi dermatoplaste - cu perete celular (grupele evoluate).

2.2. STRUCTURA MICELIULUI

Aparatul vegetativ al fungilor este numit miceliu. Miceliul este divers constituit în funcţie de gradul de evoluţie al

fungilor. La ciupercile superioare, miceliul este alcătuit din hife septate transversal, care formează un miceliu pluricelular.

Celulele pot fi uninucleate, binucleate sau plurinucleate. La foarte multe ciuperci hifele sunt incolore, dar odată cu diferenţierea

sporilor miceliul se colorează. La unele specii de fungi, miceliul care formează corpii sporiferi se colorează în roşu, galben,

albastru, ca urmare a faptului că celulele sintetizează o serie de pigmenţi care colorează peretele. În funcţie de dezvoltarea în

interiorul sau la suprafaţa diferitelor substraturi, miceliul poate fi intern sau extern.

3. NOŢIUNI DE VIRUSOLOGIE GENERALĂ

Virusologia este ştiinţa care studiază virusurile şi afecţiunile provocate de aceste entităţi. Apariţia şi dezvoltarea

acestei ştiinţe a început odată cu descoperirea în anul 1892 de către Ivanovski a faptului că boala mozaicului tutunului este

provocată de un agent infecţios.

Câţiva ani mai târziu, experimentele realizate de Beijerinck cu extracte din frunze de tutun infectate cu virusul

mozaicului tutunului, au adus dovada că acest agent infecţios este filtrabil, rezistent în timp şi poate prin inoculare la plante

sănătoase să provoace boala.

În următoarele decenii au fost descoperite numeroase virusuri care parazitează oamenii, animalele, plantele şi

microorganismele (bacteriile şi fungii). În 1911 Rous a evidenţiat virusul sarcomului aviar, în 1915 Twort a izolat virusuri

specifice bacteriilor, iar în 1917 D’Herelle a evidenţiat apariţia plajelor de liză dovedind astfel posibilitatea infectării şi

parazitării bacteriilor de către virusuri.

3.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR

Virusurile se deosebesc fundamental de organismele procariote sau eucariote, fiind încadrate într-un regn aparte numit

VIRA. Virusurile sunt entităţi biologice infecţioase cu organizare acelulară.

Particula virală completă se numeşte virion sau virus infecţios matur şi rezultă în urma autoasamblării

componentelor sale sintetizate de celula gazdă, pe baza informaţiei genetice conţinută de acidul nucleic viral.

Particula virală lipsită de capsidă se numeşte virus vegetativ când se află liber în citoplasma celulei gazdă în timpul

replicării sale sau provirus când este integrat în cromosomul gazdei.

Virusurile nu au echipament enzimatic de biosinteză şi catabolism propriu, ci doar unele enzime cu rol în pătrunderea,

replicarea şi eliberarea din celula gazdă. Virusurile sunt paraziţi absoluţi, constanţi şi obligaţi deoarece nu cresc, nu se divid şi

nu se pot reproduce în afara unei celule gazdă vie.

Pe baza informaţiei genetice conţinută în acidul nucleic şi cu ajutorul sistemelor biochimice ale celulei gazdă –

sistemele enzimatice Lipmann ce asigură acumularea energiei, sistemelor de transport de electroni, ribozomilor şi ARNt

virusurile îşi pot sintetiza componentele structurale. Deoarece nu conţin acid muramic în structura învelişurilor externe virionii

nu sunt sensibili la multe antibiotice.

3.2. PARTICULARITĂŢILE MORFOLOGICE ŞI STRUCTURALE

ALE VIRUSURILOR VERTEBRATELOR

Morfologia şi structura virusurilor a putut fi elucidată prin studiile de microscopie electronică, prin analize de difracţie

cu raze X, analize biochimice sau imunologice. Astfel, a fost relevată o diversitate mare a tipurilor morfologice şi a

dimensiunilor virusurilor.

Dimensiunile virusurilor variază în limite mari, fiind cuprinse între 10-400 nm diametru.

Virionul este constituit din:

• genom viral (acid nucleic ADN sau ARN niciodată ambele);

• capsidă;

• peplos.

Genomul viral este constituit fie dintr-o moleculă de ADN, fie din ARN dispusă helical, lineară sau circulară,

monocatenară sau bicatenară (tabelul 1).

Tabelul 1

Tipuri de acizi nucleici virali

ARN monocatenar

Virusul gripal Virusul poliomielitic

Bacteriofagul Qβ HIV

ARN dublucatenar Virusul guturaiului Virusurile plantelor

ADN monocatenar Bacteriofagul φX174

ADN dublucatenar Bacteriofagul λ SV 40

Informaţia genetică deţinută de genomul viral poate determina propria replicare şi „deturnarea” metabolismului celulei

gazdă în scopul sintetizării componentelor structurale virale.

Capsida virală este constituită din unităţi structurale de natură proteică numite capsomere. Capsomerele se asociază şi

formează structuri cu simetrie helicală sau icozaedrică.

Invelişul extern (peplos) se formează în momentul când virionul părăseşte celula gazdă. Peplosul este constituit din:

- un strat dublu lipidic (ce conţine sfingolipide şi colesterol) provenit din membrana celulară a gazdei;

- pe suprafaţă internă prezintă o foiţă proteică (proteine de membrană);

- pe suprafaţa externă prezintă spicule (spikes) proeminenţe de natură glicoproteică, care au extremităţile ascuţite, drepte

sau în formă de butoni.

Cele mai cunoscute spicule sunt cele de la Orthomyxovirus numite hemaglutinine şi neuraminidaze. Hemaglutininele

au aspect de bastonaşe cu formă de prismă cu baza triunghiulară fiind de natură glicoproteică şi funcţionează ca antigen ducând

la apariţia de anticorpi.

Neuraminidaza se prezintă sub forma unor butoni, este tot de natură glicoproteică şi are următoarele roluri:

1. distrugerea mucoproteinelor care protejează căile respiratorii permiţând fixarea virionilor de celule;

2. degradarea receptorilor celulari favorizează pătrunderea virionului în celulă sau eliberarea virusului din celulă şi

infectarea altor celule;

3. participă la procesul de asamblare a virionilor.

Proteinele de membrană sunt localizate în stratul dublu lipidic şi formează un strat intern complet cu rol în

memţinerea integrităţii virionului

3.3. BACTERIOFAGII

Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile şi din punct de vedere al ciclului de viaţă pot fi: litici (virulenţi) –

T4 şi/sau lizogeni (temperaţi) – λ. Bacteriofagii au fie genom constituit dintr-o moleculă de ADN dublucatenar sau

monocatenar linear, fie genom ARN.

Din punct de vedere al ciclului de viaţă bacteriofagii pot fi litici şi/ sau lizogeni (temperaţi). Din punct de vedere structural fagii

au fost clasificaţi în trei tipuri: icosaedrici (φX174), icosaedrici cu coadă (T4) şi filamentoşi (φ29, M13). Bacteriofagii pot fi

virulenţi (litici) (T4) sau temperaţi (lizogeni) (φ80, λ). Structura bacteriofagului T4 este următoarea: cap, coadă, placă bazală,

fibrele cozii.

Bacteriofagii virulenţi îşi "injectează" materialul genetic (genomul, cromosomul viral) în citoplasma celulei gazdă,

care este replicat independent de cromosomul bacterian, are loc transcrierea, se sintetizează proteinele virale şi componentele

structurale ale bacteriofagului, se asamblează particulele virale şi în final celulele bacteriene sunt lizate.

Bacteriofagii temperaţi după ce-şi introduc genomul în celula gazdă, acesta se integrează în cromosomul bacterian

devenind profag şi se replică odată cu cromosomul celulei gazdă, iar genele virale în marea lor majoritate nu se exprimă.

Integrarea se realizează la nivelul unor situsuri specifice (genomul fagului λ se integrează între operonii gal şi bio) sau la

întâmplare în diferite regiuni ale cromosomului bacterian. Starea de lizogenie poate fi perpetuată de-a lungul mai multor

generaţii bacteriene, dar în anumite condiţii genomul viral poate fi excizat din cromosomul celulei gazdă şi eliberat în

citoplasmă, evoluând spre ciclul litic. Acesta este fenomenul inducţiei fagice (inducţiei litice).

Integrarea genomului fagilor lizogeni în cromosomul bacterian se realizează cu ajutorul unei enzime numite integrază

codificată de gena int. Excizia profagului care apare în cazul inducţiei fagice a unei tulpini lizogene este determinată de enzima

excizionaza codificată de gena xis.

Starea de lizogenie determină unele modificări la nivelul membranei externe a celulelor bacteriene, care duc la

alterarea situsurilor de legare, astfel că bacteria este protejată de atacul altor bacteriofagi virulenţi înrudiţi cu fagul temperat.

Inducţia litică se datorează faptului că proteinele virale represoare, care determină inhibarea exprimării genelor virale

sunt inactivate. Inducerea ciclului litic depinde de cantitatea relativă a proteinelor represoare Cro (care inhibă sinteza

represorului cI şi permite transcrierea genelor virale implicate în multiplicarea şi morfogeneza fagului, determinând excizia

profagului din cromosomul bacterian şi deci evoluţia litică) şi cI (care inhibă exprimarea majorităţii genelor virale, determinând

starea de lizogenie). Inducţia fagică poate fi declanşată spontan sau poate fi stimulată de factori fizici (radiaţii ionizante (X),

neionizante (UV), temperatură) sau chimici (antibiotice - mitomicina C în cazul tulpinilor de Streptomyces producătoare de

streptomicină).

4. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA PROCARIOTE ŞI EUCARIOTE.

CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE

Acizii nucleici sunt substanţe macromoleculare alcătuite din nucleotide. Nucleotidele sunt formate dintr-o bază

azotată, o pentoză şi un radical fosfat. Bazele azotate sunt de două tipuri: purinice (adenina şi guanina) şi pirimidinice (citozina,

timina şi uracilul). Pentozele sunt reprezentate de dezoxiriboză în structura ADN şi riboză în ARN. O bază azotată şi o pentoză

sunt legate prin legături β-N-glicozidice şi formează o nucleozidă. Nucleotidele sunt formate prin adăugarea radicalului fosfat

la nucleozidă. În structura ADN intră dezoxiriboza, adenina, guanina, citozina, timina şi radicalul fosfat. În structura ARN intră

riboza, adenina, guanina, citozina, uracilul şi radicalul fosfat. Nucleotidele sunt legate între ele prin legături fosfodiesterice.

Sistemele biologice cuprind două tipuri fundamentale de organizare: acelulară sau moleculară, în această categorie

încadrându-se virusurile şi viroizii şi celulară care cuprinde două categorii divergente de organizare, procariotă şi eucariotă.

Organizarea celulară procariotă cuprinde bacterii, actinomicete şi cianobacterii, iar cea eucariotă drojdii, fungi, plante şi

animale. Se consideră că există şi o a treia categorie intermediară – organizarea mezocariotă la un singur grup de

microorganisme Dinoflagelate (alge).

Virusurile sunt entităţi biologice cu organizare acelulară. Un virus este alcătuit dintr-un înveliş proteic numit capsidă şi

un miez de acid nucleic. Miezul de acid nucleic este constituit din ADN sau ARN, niciodată ambele (ADN la

dezoxiribovirusuri şi ARN la ribovirusuri). ADN poate fi dublu catenar, linear sau circular sau dublucatenar linear.

Unele ribovirusuri animale au genomul segmentat ARN este alcătuit din mai multe segmente de ARN “minus”, care

generează catene de ARN “plus”, acestea funcţionând ca ARNm. De exemplu virusul gripal are genomul constituit din opt

fragmente de ARN monocatenar. Acest virus se numeşte virus cu catenă negativă pentru că ARN conţinut în capsida virală nu

are funcţie de mesager.

Viroizii sunt alcătuiţi dintr-o moleculă de ARN, neasociat cu proteine. De exemplu viroidul care determină infecţii la

cocotier.

4.1. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA PROCARIOTE

Bacteriile, inclusiv actinomicetele şi cianobacteriile prezintă organizare celulară procariotă, deci se autoreproduc şi au

morfogeneză autonomă.

Genomul procariot este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:

a) gene esenţiale localizate în structura cromosomului;

b) gene accesorii localizate în structura plasmidelor, a transpozonilor, secvenţelor de inserţie, bacteriofagilor.

Cromosomul bacterian este alcătuit dintr-o moleculă de ADN dublucatenar circular închis covalent. Acesta este situat

în regiunea centrală a celulei bacteriene, este inclavat direct în citoplasmă fiind prins prin mezosom de membrana plasmatică şi

formează nucleoidul (nucleosom, nucleoplasmă) sau nucleul de tip procariot lipsit de membrană nucleară.

ADN bacterian nu este complexat cu proteine histonice, dar la unele grupe bacteriene ADN este asociat cu proteine

bazice asemănătoare histonelor. Se presupune că aceste proteine au rol în neutralizarea încărcăturii negative a grupărilor fosfat

ale ADN, asigurându-i stabilitatea. Din punct de vedere chimic nucleoidul este un complex ADN-ARN-proteine (80% ADN,

10% ARN – ARNr şi ARNm şi 10%proteine – ARN polimerază).

Elementele genetice accesorii au următoarele proprietăţi :

a) conţin informaţie genetică neesenţială pentru reproducerea organismului purtător, unele nu conferă nici o proprietate

detectabilă;

b) sunt capabile de replicare independentă faţă de cromosomul bacteriei purtătoare.

Cele mai importante elemente genetice accesorii la procariote sunt plasmidele. Plasmidele sunt reprezentate de molecule de

ADN dublucatenar circular covalent închis sau linear. Ele sunt delimitate spaţial de cromosomul bacterian, se pot replica

autonom faţă de acesta. Moleculele de ADN plasmidial pot prezenta trei conformaţii moleculare: circulare covalent închise

(CIC), circulare deschise (CD) şi lineare (L).

4.2. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC EUCARIOT

Caracteristicile organizării genetice eucariote sunt:

a) existenţa membranei nucleare duble care închide materialul genetic;

b) repartizarea informaţiei genetice pe mai mulţi cromosomi.

Datorită localizării materialului genetic pe mai mulţi cromosomi transcrierea şi traducerea informaţiei genetice se realizează

separat, prima în nucleu, cea de-a doua în citoplasmă la nivelul ribosomilor.

Complexarea permanentă a ADN cromosomal cu histone (proteine bazice ce conţin resturi de arginină şi lizină) face ca la

eucariote substanţa nucleară – cromatina să prezinte un aspect fibros la microscopul electronic. Complexarea cu proteine

histonice a ADN cromosomal are drept consecinţă prezenţa unui ciclu celular cu două faze distincte: replicativă şi

distributivă.

4.2.1. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE

În celulele somatice, cromosomii suferă procese ciclice de spiralizare, despiralizare şi sinteză replicativă, procese care

asigură transmiterea informaţiei genetice de la o generaţie la alta, în cadrul ciclului celular.

Ciclul celular reprezintă perioada dintre două diviziuni mitotice succesive. Ciclul celular este divizat în două etape:

interfaza (I) şi diviziunea celulară - mitoza (M). Interfaza este perioada cea mai activă din punct de vedere metabolic - are

loc sinteza ADN, a proteinelor histonice. Interfaza este subdivizată în trei faze:

a) faza presintetică G1 - (G = gol sintetic)

- nu se sintetizează ADN, dar are loc acumularea compuşilor necesari replicării cromosomilor monocromatidici,

dublării centriolilor şi formării aparatului mitotic. Au loc sinteze de ARN, proteine enzimatice şi neenzimatice.

- există celule care nu se divid continuu, nefiind implicate permanent în cicluri proliferative repetate, deşi ele rămân

viabile şi active metabolic îndeplinind funcţii specifice tisulare pentru perioade lungi de timp. Ele pot reveni la ciclul

celular proliferativ, sub acţiunea unor factori extracelulari, aşa cum se întâmplă în cazul vindecării unei leziuni -

procesul cicatrizării. Acest tip de celule se spune că se află în faza G0. Decizia unei celule G0 de a reintra în ciclul

celular sau a celulelor ciclice de-a ieşi din circuit se produce în ultima parte a fazei G1.

b) faza S - (S = sinteză)

- se dublează cantitatea de ADN, cromosomii devenind bicromatidici. La sfârşitul mitozei şi în G1 cromosomii sunt

monocromatidici.

c) faza postsintetică G2

- nu se sintetizează ADN, dar se asigură condiţiile pentru formarea aparatului de diviziune a celulei şi se acumulează

substanţe cu rol energetic necesare pentru realizarea mitozei.

Durata ciclului celular variază la diferite tipuri de celule eucariote. Astfel drojdiile se pot divide la aproximativ 120

min. Cele mai multe celule vegetale şi animale se divid la 10-12 ore. La mamifere, dacă se atribuie 24 ore unui ciclu celular,

atunci mitoza durează 1 oră, faza G1 circa 10 ore, faza S până la 9 ore, iar faza G2 aproximativ 4 ore.

5.1. TIPURILE DE NUTRIŢIE A MICROORGANISMELOR

Microorganismele au fost grupate în două categorii în funcţie de sursa de carbon pe care o folosesc:

Autotrofe – folosesc CO2 ca unică sau principală sursă de carbon anorganic;

Heterotrofe – folosesc substanţe organice ca sursă de carbon pentru biosinteze şi producere de energie.

În funcţie de modul de obţienere a energiei microorganismele au fost grupate în două categorii (tabelul 5.1.):

Fototrofe – folosesc energia radiantă luminoasă (fig. 5.1, 5.2);

Chemosintetizante – obţin energia din reacţii chimice (fig. 5.3).

Microorganismele chemoheterotrofe sunt dependente de compuşii organici ca sursă de carbon şi energie şi pot fi clasificate

astfel:

Saprotrofe – obţin compuşii organici din mediul înconjurător;

Simbiotrofe – preiau compuşii organici de la alt organism cu care trăiesc permanent în contact direct;

Biotrofe – obţin substanţele organice din celulele vii ale gazdei simbiotice;

Necrotrofe – obţin compuşii organici din celulele moarte ale gazdei simbiotice.

Microorganismele chemoheterotrofe pot fi clasificate în două categorii în funcţie de modul în care obţin substanţele

necesare biosintezelor:

Microorgansime osmotrofe – preiau substanţele dizolvate în mediu prin transfer prin membranele celulare;

Microorganisme fagotrofe – înglobează substanţele pe care le digeră înainte de a utiliza produşii de digestie.

În funcţie de modul de nutriţie şi gradul de dependenţă de alte microorganisme, microorganismele chemoheterotrofe

pot fi clasificate astfel:

Saprofite obligate libere – microorganisme heterotrofe libere, care nu au capacitatea de simbioză mutualistă sau

parazitară;

Facultativ necrotrofe – microorganisme cu potenţial simbiotic, normal libere, cu nutriţie saprotrofă, care pot deveni

parazite având nutriţie necrotrofă;

Necrotrofe obligate – include paraziţi specializaţi a căror existenţă liberă se limitează la supravieţuirea în ţesutul mort al

gazdei infectate;

Facultativ biotrofe – microorganisme facultativ simbiotice, sunt biotrofe în stadiul simbiotic şi saprotrofe în stadiul liber;

Obligate biotrofe – microorganisme simbiotice mutualiste sau parazitare, incapabile de existenţă liberă (doar ca spori sau

chişti).

5.2. METABOLISMUL

Metabolismul reprezintă totalitatea proceselor chimice care au loc în celulele orgnismelor vii (fig. 5.4). Metabolismul

include:

anabolismul care reprezintă totalitatea reacţiilor de sinteză a constituenţilor celulari (metaboliţi primari şi secundari) ce

necesită energie;

catabolismul care reprezintă totalitatea reacţiilor de degradare ce asigură eliberarea elementelor compuşilor moleculari

sau macromoleculari ai unei celule şi producerea de energie.

Reacţiile anabolice sunt necesare pentru creşterea, reproducerea şi repararea structurilor celulare. Reacţiile catabolice

furnizează organismului energia necesară proceselor vitale, inclusiv deplasarea, transportul şi sinteza moleculelor complexe.

În toate reacţiile catabolice are loc transferul de electroni, care permite captarea energiei în legăturile macroergice ale

moleculelor de ATP sau alte molecule asemănătoare. Transferul de electroni este în strânsă legătură cu procesele de oxidare şi

reducere (tabelul 5.2.).

Oxidarea poate fi definită ca reacţia în care se pierd sau se îndepărtează electroni. Deşi multe substanţe se combină cu

oxigenul şi transferă electroni acestuia, în cazul în care în mediu sunt prezente alte substanţe acceptoare de electroni oxigenul

poate lipsi. Reducerea poate fi definită ca reacţia în care se câştigă electroni.

Atunci când o substanţă pierde electroni sau este oxidată se eliberează energie, dar trebuie să existe o altă substanţă care să

primească electronii sau să se reducă în acelaşi timp.

6.1. CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA MICROORGANISMELOR

Microorganismele cresc şi se multiplică dacă în mediu sunt suficiente substanţe nutritive pentru sinteza tuturor

compuşilor necesari formării constituenţilor celulari. Multiplicarea microorganismelor se realizează prin mecanisme diferite de

diviziune:

diviziune directă (fisiune binară);

înmugurire;

diviziune mitotică,

formarea sporilor de propagare.

Fisiunea binară – celulele bacteriene se alungesc până ating o anumită lungime, apoi în zona ecuatorială se formează

un sept transversal care separă celula în două celule fiice identice (fig. 6.1). Fragmentarea – este caracteristică bacteriilor

filamentoase (actinomicete) fiind implicată în formarea sporilor. Înmugurirea – este caracteristică levurilor, prin înmugurire se

formează două celule pornind de la o celulă parentală (fig. 6.2.). La nivelul celulei mamă se formează printr-un proces de

mitoză o protuberanţă (mugure), care creşte treptat, apoi se desprinde de celula iniţială şi îşi continuă dezvoltarea individual.

Diviziunile mitotică sau meiotică – sunt caracteristice microorganismelor eucariote şi presupun formarea unui fus de diviziune

mitotic, respectiv meiotic care separă cromosomii în celulele fiice.

6.2. CREŞTEREA EXPONENŢIALĂ A UNEI POPULAŢII MICROBIENE

Modelarea matematică a creşterii unei populaţii bacteriene cultivate în mediu lichid în sistem închis (de tip batch) a

permis reprezentarea grafică ca logaritm din numărul de celule în funcţie de timpul de incubare. Curba de creştere exponenţială

a bacteriilor este constituită din patru faze (fig. 6.3):

faza de lag;

faza de creştere exponenţială;

faza staţionară;

faza de declin.

Faza de lag – reprezintă faza de latenţă în care nu se realizează diviziuni celulare şi nici creşterea biomasei, ci doar

pregătirea microorganismelor pentru multiplicare. Faza exponenţială – reprezintă faza de creştere logaritmică în care se

realizează multiplicarea rapidă a microorganismelor. Celulele din această fază sunt tinere, au citoplasma abundentă şi omogenă,

fără substanţe de rezervă, în care se realizează numeroase procese metabolice. Faza staţionară – celulele din această fază sunt

mature, în citoplasma lor se acumulează substanţe de rezervă şi incluziuni, iar activitatea metabolică scade. Numărul celulelor

viabile rămâne constant pentru că numărul celulelor care mor este compensat de cel al celulelor care rezultă din diviziune. Faza

de declin – din cauza epuizării substanţelor din mediul de cultură şi a acumulării substanţelor toxice rezultate în urma activităţii

celulare numărul de celule scade progresiv. Celulele conţin cantităţi mari de substanţe de rezervă, formează spori şi se pot

prodece fenomene de liză celulară.

7. BIOPREPARATE CU CIUPERCI PRODUCATOARE DE MICORIZE

1. NOTIUNI GENERALE:

Micorizele sunt rezultatele unei asociatii in cursul careia radicelele plantelor sunt colonizate de ciuperci microscopice

specifice. Aceasta interrelatie implica:

asocierea relativ constanta a celor doi parteneri;

infectia plantei de catre ciuperci fara simptome patologice;

invadarea exclusiva a cortexului radicular cu mentinerea sterilitatii meristemului apical si a cilindrului vascular;

absenta leziunilor si mentinerea proprietatilor fiziologice normale ale celulelor radiculare;

dezvoltarea superioara a plantelor purtatoare de micorize comparativ cu cele lipsite de acestea.

Plantele si ciupercile se afla intr-o relatie simbiotica sau de parazitism reciproc fiziologic, echilibrat.

2. CLASIFICAREA MICORIZELOR:

Dupa raportul dintre hifele ciupercilor si celulele corticale ale radacinii avem:

ectomicorize (ectotrofe) – ciupercile produc infectii hifale intercelulare;

endomicorize (endotrofe) – localizare intracelulara a hifelor;

endo – ecto sau ecto – endomicorize – include ambele tipuri de infectii;

peritrofe

Caracteristicile genetice ale plantelor determina nu numai natura grupului de ciuperci care infecteaza radacina ci si tipul de

micorize stabilite.

3. ECTOMICORIZELE:

Sunt asociatii simbiotice rezultate din interactiunea complexa a miceliilor ciupercii cu radacina plantei, in care fungii

raman permanent localizati extra si intercelular. Sunt larg raspandite.

Plantele gazda sunt in special copacii care cresc pe soluri brune sau podzolizate. Micorizele sunt mai rare la arborii

izolati si situati in soluri cernoziomice. Micorizele au fost descrise la: Pinaceae (pin), Fagales (fag), Juglandales (nuc),

Dipterocarpaceae (frasin), Mirtaceae (dafin), Tiliaceae (tei).

Ciupercile de ectomicorize apartin claselor: Bazidiomycete evoluate (ciuperci cu pălărie), Ascomycetes, Rhizomycetes.

Speciile cele mai intalnite sunt: Amanita muscaria, Boletus taoides, Boletus edulis, Ruscula sp., Lactarius deliciosus etc.

Fungii de ectomicorize se dezvolta optim la 15 – 300C si pH 4 – 6 (uneori chiar 3). Aceste ciuperci produc metaboliţi

secundari: fitohormoni (auxine, citochinine, gibereline), vitamine, acizi graşi polinesaturaţi, antibiotice, pa care îi elibereaza

direct in ţesuturile plantei.

Particularităţi anatomice ale ectomicorizelor:

Ectomicorizele au unele aspecte structurale definitorii: mantaua fungică, reţeaua Hartig, hifele externe.

Teaca sau mantaua fungică formeaza un ţesut fungic gros pseudoparenchimatos care acopera radicelele plantei gazdă,

poate reprezenta pana la 40% din greutatea uscata a radacinei respective. Nu e o simpla reţea de hife ci un sistem complicat,

ramificat, întreţesut, dezvoltat din hifele care patrund între celulele epitelice si uneori chiar între celulele cortexului radicular.

Rezultat al unei dezvoltari considerabile a hifelor ciupercilor producatoare de micorize, teaca asigura o mare suprafata de

contact între cei doi parteneri ai asociaţiei fără ca hifele sa patrunda in celulele vii active.

Hifele externe

Teaca fungică are conexiuni cu solul din care se dezvolta o reţea luxuriantă de hife ramificate sau lanţuri hifale numite

rizomorfe. Frecvent acestea cresc spre suprafata solului pentru ca în condiţii favorabile sa se diferenţieze, formând corpuri

sporifere epigee sau hipogee a căror nutriţie este asigurată de planta gazdă.

Din 1949 s-a demonstrat necesitatea absolută a conexiunii corpurilor sporifere cu ţesuturile vegetale. Apariţia acestor

corpuri este împiedicată dacă se secţionează rizomorfele cu plăci metalice introduse în pământ. Acest fapt demonstrează că

majoritatea ciupercilor comestibile cu sau fără pălărie (inclusiv hifele) prezente in apropierea copacilor sunt corpuri sporifere de

ectomicorize şi nu saprofiţi de materie organică în descompunere aşa cum s-a prezentat initial.

Reţeaua Hartig este o caracteristică structurală a ectomicorizelor.

Deşi asigură un contact strâns cu celulele gazdei, hifele rămân mereu localizate între celulele cortexului fără să

producă infecţii intracelulare.

Zonele de contact dintre fungi şi planta gazdă în ectomicorize:

in zona extremităţii radiculare fungii sunt in contact direct cu celulele senescente ale vârfului vegetativ meristematic;

in zona anterioară reţelei Hartig teaca fungică este in contact cu celulele epidermice vii;

in zona reţelei Hartig fungii pătrund între celulele epidermice şi uneori între celulele corticale ca sisteme hifale vii;

in zona reţelei Hartig senescentă celulele epidermice şi cele corticale sunt pătrunse de hifele fungice.

4. ENDOMICORIZE. MICORIZELE VEZICULO – ARBUSCULARE

Acest tip de micorize este cel mai comun, fiind întâlnit la cele mai multe plante cultivate. Cele mai mult studiate sunt

micorizele plantelor cu importanţă economică: grâu, porumb, soia, tomate, măr, căpşun, trestie de zahăr, arbore de cafea, arbore

de cauciuc, orhidee, piersic. Fungii care produc aceste micorize sunt larg răspândiţi în sol, mai ales in regiunea perivasculară

radiculară.

D.p.d.v. taxonomic sunt descrise 4 genuri din familia Endogomaceae: Glomus, Sclerocystis, Gigaspora, Acaulospora.

Cele mai utilizate ciuperci producătoare de micorize sunt cele din genul Glomus.

Experimentele de inoculare a gazdelor cu suspensii sporale axenice au demonstrat că cei mai mulţi fungi au un spectru

larg de gazde. Astfel Glomus formează micorize cu mai mult de 20 specii cultivate. Există şi excepţii: fungii din micorizele de

la ovăz nu pot fi transmişi la orez şi invers; in schimb, cei izolaţi de la grâu sau secară infectează atât orezul cât şi ovăzul

(orzul?).

Fungii simbionţi obligaţi parazitează cu o specificitate de gazdă redusă. Fenomenul s-ar explica prin larga distribuţie

în sol şi printr-o proprietate fundamentală a metabolismului radicular comună mai multor specii de plante.

Formarea micorizelor veziculo-arbusculare

Micorizele endotrofe de acest tip formeaza structuri sferice numite vezicule si structuri ramificate cu funcţie de organ

absorbtiv de tipul haustorilor numiţi arbusculi.

In evoluţia infecţiei simbiotice au fost descrise 3 faze succesive:

dezvoltarea excesivă în sol a miceliului extraradicular (cel puţin la câţiva centimetri de suprafata rădăcinii);

apariţia unui sistem hifal intercelular în cortex;

infecţia intracelulară, formarea de hife încolăcite, vezicule şi arbusculi în celulele vegetale.

In cazul micorizelor veziculo-arbusculare, hifele miceliene ies din rădăcina infectată pentru a forma o reţea laxă în rizosferă

şi în solul adiacent. Greutatea hifelor extraradiculare e 1-6% din greutatea rădăcinei proaspete. Lungimea hifelor din sol e

corelată cu lungimea rădăcinei infectate, ex. trifoi – 1,29m hife/cm de rădăcină.

Contactul dintre membrii asociaţiei de tip micoriză endotrofă este foarte asemănătoare celui observat în infecţiile

fungice biotrofe ale plantelor. Pe masura ce hifele fungice infectante patrund in celula vie, peretele celular vegetal si

plasmalema par să se invagineze a.î. hifele sunt acoperite cu un înveliş derivat din aceste structuri de suprafaţă. Se pare că

fungii inhibă sau modifică activitatea enzimelor gazdei implicate in producerea si maturarea peretelui celular.

Zona de contact implica participarea plasmalemelor vii ale ambilor membrii ai asociaţiei separată de un spaţiu

apoplastic ce constă din: peretele hifal modificat şi peretele celulei gazdă. Apoplastul este ţesutul “mort” al plantei, care nu

manifestă activitate metabolică activă ci lentă, ex. peretele vaselor lemnoase, ritidomul.

Pe masură ce asociaţia îmbătrâneste se comportă ca şi cum fungii ar deveni mai puţin apţi să menţină sau să genereze

modificările caracteristice ale peretelui celular celulei gazdă. Plasmalema celulei gazdă continuă să elibereze vezicule ce conţin

polizaharide şi să formeze polimeri fibroşi, dar îşi recapătă proprietatea de a-i organiza într-o structură.

Fungii de micorize endotrofe atacă planta gazdă ca un parazit pentru că hifele se comportă ca haustorii fungilor

patogeni obligaţi. In general fungii producători de ectomicorize rămân localizaţi in straturile externe ale cortexului radicular.

Când încearcă să pătrundă în interiorul rădăcinii ei sunt distruşi de răspunsul defensiv al gazdei.

Endospermul si meristemul apical sunt lipsiţi de infecţie fungică. De aceea endospermul plantei reprezintă o barieră

fungică. Când ciupercile depăşesc această barieră, ciupercile producătoare de micorize devin patogene.

5. MICORIZELE ECTO-ENDOTROFE

Sunt prezente doar la speciile de arbori din Gimnosperme (ex. brad, pin, molid) care formează obişnuit endomicorize. Se

pare ca sunt limitate numai la primele stadii de vegetaţie ale arborilor (pepiniere). Considerate iniţial ca forme de tranziţie,

aceste micorize au particularităţi anatomice ale ambelor tipuri majore de micorize.

Rădăcinile cu ecto-endomicorize sunt mai alungite, mai subţiri, mai puţin ramificate dicotomic decât cele purtătoare

de ectomicorize. Mantaua fungică nu e atât de bine dezvoltată. Aceste micorize au concomitent reţea Hartig în cortex şi hifele

pătrund intracelular.

Speciile de plante lipsite de simbionţi fungici naturali sunt înconjurate invariabil de un miceliu abundent apartinând

speciei Cenococcum graniforme recunoscută ca fiind capabilă să intre în simbioză cu diferite plante.

6. MICORIZELE PERITROFE

Se caracterizează prin hife plastice care înconjoară rădăcina cu care au contact indirect, superficial, fără conexiune

directă. Miceliile epirizice au o foarte mare zonă de extindere, putând atinge cca 4m/m3sol. Ele preiau nutrienţii rezultaţi prin

descompunerea resturilor radiculare şi îi utilizează ca sursă de energie.

7. ROLUL MICORIZELOR IN BIOLOGIA PLANTELOR

Prezenţa micorizelor conferă plantelor avantaje numeroase şi diferite, între care cele legate de nutriţie, dezvoltare şi

protectie contra agenţilor patogeni sunt cele mai des evidenţiate.

Micorizele funcţioneaza ca adevărate organe absorbtive radiculare. Deoarece reţeaua Hartig formează o mare suprafaţă

de contact cu celulele vegetale, absorbţia nutrienţilor e mult mai mare decât cea prin perii radiculari; în plus ramificaţiile

rădăcinilor induse de fungi creşte şi mai mult suprafaţa absorbantă, creând situsuri adiţionale de legare a hifelor.

Radacinile infectate cu fungi de micorize sunt de 2-3 ori mai lungi decat cele neinfectate, de asemenea au masă mult

mai mare si sunt mai ramificate. Formarea perilor radiculare e supresată, iar funcţia lor e preluată de hifele fungice ce măresc

raza de disponibilitate a nutrienţilor din plante.

Fungii de micorize au rol foarte activ în preluarea nutrienţilor, ei secretă metaboliţi care cresc solubilitatea ionilor

minerali legaţi în sol şi care de asemenea cresc mobilitatea acestora. Ionii anorganici sunt preluaţi eficient şi translocaţi direct în

rădăcină, prevenindu-se pierderea lor prin levigare.

Hifele fungice larg răspândite în sol traversează regiunile deficitare în nutrienţi sau cu nutrienţi inaccesibili din

apropierea rădăcinilor, pentru a se ramifica şi explora zone noi, la distanţă inaccesibilă plantei ca atare. Cu timpul, în jurul

ciupercilor producătoare de micorize, apar noi zone cu deficit de nutrienţi, dar ramificarea şi creşterea continuă a hifelor şi

conexiunile lor cu solul permit exploatarea extensivă a acestuia.

Procesul e mult mai avantajos energetic pe unitatea de suprafaţă absorbantă decât creşterea şi ramificarea rădăcinii:

exploatare intensivă: fosfat anorganic insolubil, fosfat puţin solubil

exploatare extensivă

Pi e puţin mobil în sol, nu se menţine în soluţia solului. In solurile fertile Pi e mentinut în soluţia solului datorită humusului (cu

cât solul are mai mult humus cu atât Pi solubil e mai mult). Micorizele menţin Pi în soluţia solului mai ales pe soluri sărace în

humus.

In cursul simbiozei fungii produc multe substanţe care menţin echilibrul simbiotic cu celulele radiculare şi care de

asemenea influenţează semnificativ procesul de absorbţie. Ciupercile producătoare de micorize sintetizează auxină, fitohormon

care stimulează dezvoltarea sistemului radicular şi citochinină, fitohormon care împiedică maturarea şi suberizarea ţesutului

radicular, favorizând prelungirea perioadei fiziologic active. Modificarea echilibrului hormonal determină şi modificări ale

dezvoltării plantelor de cultură. S-au descris la tutun, căpşun şi porumb maturări mai rapide decât la plantele lipsite de micorize.

Unii autori susţin existenta chiar a unui fenomen de dependenţă a gazdei de micorize, în sensul acumulării superioare

de biomasă (intensificarea fotosintezei şi a cantităţii de carbon fixat care trece spre fungi).

8. ROLUL PROTECTOR AL MICORIZELOR

Ciupercile producătoare de micorize formează o barieră fizică, ce împiedică accesul fitopatogenilor din sol. Mantaua

fungică acoperă părţile mai fragile ale radicelelor fără să lase nici o breşa, împiedicând astfel un contact direct al rădăcinilor

tinere cu solul.

Mulţi fungi de micorize produc acizi volatili cu efect fungistatic şi antimicotic care limitează dezvoltarea

microorganismelor, menţinând un echilibru între fungii simbiotici şi cei patogeni din sol. Dacă o parte din rădăcini au fost

distruse de prezenţa micorizelor active, dezvoltarea de fungi în regiunea neinfectata poate compensa semnificativ aceste

distrugeri.

Ciupercile producătoare de micorize au un efect de protecţie împotriva agenţilor patogeni inclusiv a celor din filosferă

datorită inducerii rezistenţei sistemice dobândite (SAR).

9. ALTE FUNCŢII ALE MICORIZELOR

Fungii de micorize sunt responsabili uneori de degradarea şi absorbţia nutrienţilor din litieră (stratul de frunze

acumulat pe sol).

Miceliul extramatriceal al fungilor din micorizele veziculo-arbusculare are un rol important în legarea granulelor de

nisip şi în stabilizarea dunelor. Asemănător se comportă şi hifele externe ale ciupercilor producătoare de ectomicorize.

Având în vedere toate aceste efecte benefice, ciupercile producătoare de micorize sunt folosite sub forma unor

biopreparate inoculante în agricultură şi silvicultură. Inocularea artificială cu fungi producători de micorize e indicată în cazul

împăduririi regiunilor anterior lipsite de apă, regiunilor situate la mare altitudine sau a zonelor cu climă nefavorabilă, a solurilor

neprielnice şi nutriţional adverse (ex. soluri nisipoase sau podzolizate, sărăturate). De asemenea în cazul introducerii unor

specii în noi habitate e nevoie de inoculare cu ciuperci producătoare de micorize.

Biopreparatele inoculante se obţin prin prelevarea şi măcinarea rădăcinilor arborilor cu micorize bine dezvoltate. Se

obţin până la 75g spori/kg rădăcină uscată. Stabilitatea preparatului e de aproape 4 luni. Utilizarea fungilor de micorize

veziculo-arbusculare e mai limitată. Biopreparatul se obţine prin cultivarea ciupercilor de endomicorize pe rădăcinile unor

plante cu dezvoltare vegetativă mare. Ex. Glomus e cultivat pe rădăcini de salată şi se obţine produsul comercial VAM

inoculant. Rezultate spectaculoase s-au obţinut pe soluri slab fertile: brun-roşcate, podzolizate, sărăturate. În cazul solurilor cu

fertilitate naturală ridicată (cernoziomuri) efectele nu sunt la fel de semnificative.

Crearea artificială de micorize endotrofe s-a dovedit utilă în cazul colonizării plantelor pe habitate marginale (sterilul

de la mine metalifere sau cărbune, halele de cenuşi ale termocentralelor etc.). Producerea artificială a micorizelor cu fungi

foarte eficienţi reprezintă o alternativă la chimizarea solului prin creşterea eficienţei de preluare a nutrienţilor şi scăderea nevoii

de administrare a îngrăşămintelor, putându-se asigura dezvoltarea unor plante care în unele condiţii create tolerează creşterea pe

soluri cu fertilitate scăzută sau pe diferite sisteme perturbate.

8. MICROBIOTA APELOR

Microbiota izvoarelor este foarte redusă fiind formată din microorganisme provenite din acvifere sau din straturile

subterane în timpul trecerii spre suprafaţă. Microbiota izvoarelor cuprinde bacterii Gram negative (Pseudomonas) şi forme

prostecate (Caulobacter). Izvoarele pot fi de două tipuri:

-minerale (Gallionella ferruginosa, Leptothrix ochracea);

-termale (Sulfolobus acidocaldarius 570C, Leptothrix thermalis 900C).

Microbiota râurilor este foarte diferită în funcţie de viteza de curgere, debit, adâncime şi compoziţie chimică. Râurile

conţin comunităţi bacteriene ce se diversifică pe măsura îndepărtării de izvoare: Achromobacter, Acinetobacter, Caulobacter,

Flavobacterium, Hyphomicrobium, Moraxella, Pseudomonas, Gallionella.

În apele poluate predomină bacteriile Escherichia coli, Proteus sp., Pseudomonas fluorescens, Clostridium sp., etc. În

pâraiele curate şi repezi este prezent Sapromyces. În râurile bogate în substanţe organice asimilabile sunt prezenţi Fungi

Imperfecti şi Ascomycetes.

Microbiota lacurilor cu apă dulce include toate categoriile de microoganisme: eubacterii, actinomicete, cianobacterii,

microfungi, microalge şi protozoare. Dintre genurile cel mai frecvent întâlnite pot fi menţionate: Achromobacter,

Acinetobacter, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Sarcina, Spirillum,

Streptomyces, Vibrio.

Microbiota lacurilor cu apă sărată este reprezentată de bacterii halotolerante, în special halofile, care conţin vacuole

cu gaze ce le permit modificarea poziţiei pe verticala coloanei de apă şi pigmenţi carotenoizi cu rol protector faţă de intensitatea

prea mare a luminii solare, care le colorează coloniile în roşu sau oranj strălucitor. Dintre genurile cel mai frecvent întâlnite

sunt: Halobacterium halobium, Halococcus sp., Chromobacterium sp.

Microbiota apelor subterane (acviferelor) - este important de cunoscut tipul şi numărul microorganismelor prezente

în apele freatice pentru a putea stabili caracterul lor potabil. Cu ajutorul tehnicilor uzuale de numărare directă şi cultivare in

vitro a microorganismelor şi a celor moderne – utilizarea marcherilor moleculari (ATP, fosfolipide, acid muramic) au fost

evidenţiate microorganisme (bacterii, microfungi şi protozoare) nu doar în zonele superficiale ci şi în sedimentele acvifere

nisipoase şi în apa freatică. Bacteriile cel mai frecvent evidenţiate au fost bacterii anaerobe facultativ şi obligate, heterotrofe,

sulfat reducătoare, denitrificatoare, ferobacterii, metanogeni din genurile: Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus,

Nocardia, etc.

Microbiota marină este alcatuită din 3 categorii de microorganisme:

autohtone (permanente);

alohtone (temporare sau contaminante);

ubicvitare (comune solului si mediului marin)

Cele mai multe bacterii marine sunt Gram negative, mobile, aerobe, facultativ anaerobe, iar cele din adâncul

sedimentelor obligat anaerobe. Bacteriile care trăiesc la suprafaţă sunt cromogene, sintetizează pigmenţi (galbeni, portocalii,

bruni, verzi, roşii negri), care le protejează faţă de efectul nociv al radiaţiilor luminii. Bacteriile marine au diverse roluri fiind

amonificatori, nitrit şi nitrat bacterii, denitrificatori, sulfoxidante şi sulfat reducătoare, ferobacterii, proteolitice, fermentative,

chitinolitice, celulozolitice.

Caracteristici generale

a. Bacteriile marine:

speciile întâlnite aparţin genurilor: Vibrio, Streptomyces, Spirillum, Micrococcus, Sarcina, Nocardia, Pseudomonas,

Bacillus, Corynebacterium etc.;

numărul bacteriilor este maxim în regiunile litorale şi scade progresiv în zonele pelagice (apele de larg);

un număr mare de bacterii se întâlneşte în primii centimetri ai sedimentelor şi scade în profunzimea sedimentelor.

b. Cianobacteriile marine:

sunt răspândite ubicvitar;

în regiunile de ţărm sunt ataşate de plante, mâl, nisip, roci (Nodularia, Rivularia, Plectonema, Oscillatoria etc.);

unele specii formează bacterioplanctonul fiind reprezentate de genurile: Pelagothrix, Nostoc etc.;

multe specii sunt halotolerante;

unele tulpini (Anabaena, Nodularia etc.) sunt responsabile de “înfloririle” din zonele eutrofizate.

c. Fungii marini:

levurile frecvent întâlnite sunt: Cryptococcus, Saccharomyces, Candida, Rhodotorula, Torulopsis etc.;

în general se cunosc 149 specii de Ascomycetes, 91 specii de Pyrenomycetes, 51 specii de Loculoascomycetes, 56 specii

de Deuteromycetes şi 4 specii de Basidiomycetes.

d. Microfite:

se împarte în fitoplancton şi microfitobentos (bental) în funcţie de domeniul în care trăiesc;

fitoplanctonul este prezent în concentraţie maximă în stratul superior al zonei eufotice;

majoritatea microfitelor sunt fotoautotrofe, dar unele cresc şi heterotrof;

alături de bacteriile fototrofe îndeplinesc funcţia de producători primari în cadrul ecosistemelor acvatice;

compoziţia microflorei M.Negre (litoralul românesc): Bacillariophyta, Pyrophyta, Chlorophyta, Chrysophyta,

Cyanophyta, Euglenophyta, Xanthophyta;

caracteristică este dominanţa diatomeelor;

“ïnflorirea “ apelor provocată de algele planctonice (cunoscută sub numele de “apă roşie”) este un fenomen frecvent

întâlnit la litoralul românesc în zonele de mică adâncime; cel mai adesea fenomenul este cauzat de dezvoltarea masivă a

diferitelor specii de diatomee (Sceletonema costatum, Cyclotella caspis, Leptocylindrus danicus Thalassionema

nitzschioides, Nitzschisdelicatissima, N. seriata), peridinee (Exuviaella cordata, Goniaulax polyedra), cyanoficee

(Microcystis aeruginosa), coccolithophoride (Pontosphaera huxleyi);

densităţile algelor în timpul înfloririlor pot atinge valori de peste 100 milioane celule/litru, determinând mortalităţi masive

ale faunei bentale; cordonul litoral de ape înflorite reprezintă o barieră în calea peştilor ce se apropie de mal.

e. Zooplancton:

diversitate redusă – 142 specii în M. Neagră: Cystoflagellata, Hydromedusae, Tintinnoidea, Scyphomedusae, Ctenophora,

Rotatoria, Cladocera, Copepoda, Isopoda, Chaetognatha, Appendicularia;

se remarcă prezenţa unor forme dulcicole în sezonul marilor viituri ale Dunării (specii de rotifere, copepode, cladocere);

zooplanctonul are o dezvoltare sezonieră, maximile de abundenţă primăvara – vara.

f. Microorganisme bentale:

au o particularitate fundamentală şi anume activitatea metabolică lentă;

factorii determinanţi sunt: disponibilitatea redusă de nutrienţi, presiunea hidrostatică mare şi temperatura scăzută.

Zonele de dezvoltare a microbiotei marine

a. Interfaţa apă/aer:

este un habitat foarte aerat, intens luminat, cu o concentrare masivă de nutrienţi şi supus unor fluctuaţii de temperatură

diurne şi sezoniere;

organismele sunt în continuă mişcare datorită acţiunii curenţilor şi valurilor;

se dezvoltă eubacterii, cianobacterii, alge, microfungi şi protozoare alcătuind neustonul (gr. “neuo”= a aluneca);

bacteriile aflate în număr mare (câteva milioane/cm2) sunt reprezentate de bacterii heterotrofe: Nevskia (specifică acestui

habitat), Leptothrix, Caulobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina

etc.;

cianobacteriile sunt reprezentate de: Anabaena, Aphanizomenon etc., iar fungii de diferite specii de levuri şi de

Chladosporium;

b. Zona de larg până la 200 m adâncime:

cuprinde organisme microscopice care înoată sau plutesc în pătura superficială a apelor de larg; formează planctonul (gr.

“planktos” = care călătoreşte);

planctonul are densitatea maximă în zona aerobă, în care fitoplanctonul realizează producţia primară de materie organică;

fitoplanctonul ocupă coloana de apă situată la adâncimea de 20 – 50 cm, ce corespunde condiţiilor optime de fotosinteză;

cianobacteriile preferă regiuni cu intensitate mai mică a luminii, datorită complexului lor de fotopigmenţi şi anumitor

factori de mediu (temperatură, nutrienţi etc.).

c. Zona bentală:

sedimentul bentonic reprezintă un mediu favorabil pentru dezvoltarea microorganismelor; aerob la suprafaţă şi prograsiv

anaerob în adâncime permite dezvoltarea producătorilor secundari, care folosesc compuşii organici depuşi;

organismele care se dezvoltă în această zonă formează bentosul (gr. “benthos” = adâncul mării).

d. Zona litorală:

se găsesc comunităţi de microorganisme care trăiesc pe suprafaţa nisipurilor marine submerse, sub forma unor mici

colonii;

aceste comunităţi sunt alcătuite din eubacterii, cianobacterii, alge şi protozoare, formând comunitatile epipsamice (gr.

“psammos” = nisip).

e. Pe suprafaţa organismelor animale:

organismele animale acvatice (crustacee, peşti, mamifere, viermi, copepode) sunt acoperite de un strat de microorganisme

care colonizează suprafaţa corpului lor;

bacteriile formează comunităţi cu densităţi cuprinse între 1000 – 10.000 celule/cm2;

aceste organisme formează comunităţile epizoice;

comunităţile epizoice pot cuprinde şi microorganisme patogene.

f. Pe suprafaţa plantelor acvatice:

reprezintă o comunitate de suprafaţă alcătuită din microorganisme asociate cu rădăcinile plantelor acvatice;

include microoganisme fotoautotrofe, heterotrofe, saprofite şi parazite;

această comunitate de microorganisme poartă numele de epifiton (gr. “epi” = pe, “fiton” = plantă);

aproape toate plantele acvatice au un epifiton, cu excepţia părţilor tinere care sunt sterile, datorită pH-ului = 5 şi eliberării

de substanţe antibiotice; regiunile bătrâne ale plantelor au pH 8 şi sunt populate de bacterii, ce pot fi utilizate ca hrană de

către protozoare şi rotifere;

numărul bacteriilor saprofite dezvoltate pe algele saprofite variază între 104 – 109/cm2;

dintre bacterii predomină cele care au structuri de adeziune: Leucothrix;

dintre cianobacterii predomină Oscillatoria şi Lynghya.

g. Pe suprafaţa rocilor:

se dezvoltă alge brune (dominante), alge verzi, cianobacterii, eubacterii şi diatomee;

aceste comunităţi se numesc epiliton;

rocile de pe malul stâncos sunt populate de cianobacterii (Calothrix, Gloeocapsa etc.) şi uneori de licheni (Verrucaria).

9. MICROBIOTA DIN SOL

Microbiota din sol este reprezentată de bacterii (eubacterii, actinomicete, cianobacterii), fungi microscopici, alge şi

protozoare.

Bacteriile reprezintă grupul cel mai numeros şi mai activ din sol, predominante fiind bacteriile Gram negative.

Bacteriile Gram pozitive sunt şi ele prezente fiind mai numeroase decât în mediile acvatice.

Rolul bacteriilor din sol:

Sunt implicate în circuitele geobiochimice (carbonului, azotului, fosforului, sulfului, fierului);

Participă la procesele de mineralizare asigurând fertilitatea solului şi nutriţia plantelor

Participă la solubilizarea compuşilor organici şi anorganici, insolubili şi inaccesibili plantelor;

Sunt organisme care fixează azotul molecular atmosferic, necesar pentru nutriţia plantelor;

Participă la agregarea particulelor de sol prin polizaharidele extracelulare;

Participă la formarea şi degradarea humusului;

Exemple:

Acinetobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Alcaligenes, Arthobacter;

Bacillus, Brevibacterium;

Cellulomonas, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium;

Flavobacterium;

Micrococcus, Mycobacterium;

Pseudomonas;

Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus;

Xanthomonas.

Actinomicetele sunt un grup de bacterii tranzitoriu sau constant filamentoase, care formează o reţea micelială

ramificată.

Rolul actinomicetelor în sol:

Participă la mineralizarea unor compuşi (chitina) mai rezistenţi la acţiunea bacteriilor şi fungilor;

Formarea humusului prin producerea unor compuşi aromatici, structurarea solului prin agregarea particulelor de sol;

Fixarea azotului molecular (reprezentanţii genului Frankia);

Formarea simbiozlor de tipul actinorizelor;

Sintetizează diferite antibiotice, care pot regla densitatea bacteriilor sau fungilor în anumite habitate sau îndepărta unii

patogeni – streptomicină, cloramfenicol, tetracicline, kanamicină, micostatin;

Actinomicetele termofile sunt predominante în în paiele încinse, în grămezile de compost şi în unele gunoaie de grajd.

Exemple:

Actinomyces, Actinoplanes;

Mycobacterium, Mycococcus, Micromonospora;

Nocardia;

Streptomyces, Streptosporangium;

Thermoactinomyces

Nocardia cellulans, N. vaccinii – pot degrada celuloza;

Streptomyces violaceus, S. cellulosae – pot degrada celuloza;

Nocardia paraffinae – poate degrada chitina şi parafină;

N. opaca şi N. rubra - pot degrada fenoli

Cianobacteriile sunt bacterii fototrofe care formează cruste pe suprafaţa solurilor umede fără vegetaţie sau se dezvoltă

pe stratul superior iluminat al solului.

Rolul cianobacteriilor:

Se pot dezvolta pe suprafaţa solurilor aride datoriă capacităţii de a realiza fotosinteza şi de a utiliza compuşi anorganici

simpli;

Fixează azot molecular – Anabaena, Calothrix, Nostoc, Plectonema, Schizothrix;

Legarea particulelor de sol şi stabilizarea structurii acestuia

Exemple:

Anabaena, Aulosira; Calothrixm;

Microcoleus; Nodularia, Nostoc;

Oscillatoria; Phormidium, Plectonema;

Schizothrix, Scytonema; Tolypothrix.

Fungii sunt microorganisme care trăiesc liber sau în asociaţie cu rădăcinile plantelor, reprezentând o parte

semnificativă din biomasa microbiană din sol, deşi sunt mai puţin numeroşi decât bacteriile.

Levurile sunt reprezentate de următoarele genuri:

Candida, Cryptococcus;

Debaromyces;

Hansenula;

Kluyveromyces;

Lipomyces;

Pichia;

Rhodotorula;

Saccharomyces, Schizoblastosporium;

Torula, Torulopsis, Trichospora;

Zygosaccharomyces

Mucegaiurile din sol aparţin la peste 600 specii dintre care:

200 din clasa Phycomycetes – ordinul Mucorales (Absidia, Cunninghamella, Mucor, Rhizopus); - ordinul Peronosporales

(Phytium);

32 Ascomycetes - Chaetomium şi Morchella;

385 Fungi Imperfecti – Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum,

Gliocladium, Penicillium, Phoma, Trichothecium, Verticillium.

Rolul fungilor din sol

Pot degrada substanţe organice simple (hexoze, pentoze, acizi organici, aminoacizi, peptide) complexe (proteine,

celuloză, lignină);

Participă la formarea structurii solului prin efectul de imobilizare mecanică şi agregare a particulelor de sol, asigurând

stabilitatea acestora;

Participă la formarea humusului prin sinteza de substanţe aromatice asemănătoare ligninelor care sunt introduse în rezerva

din sol şi prin conversii transformate în substanţe humice;

Produc substanţe antibiotice;

Formează asociaţii de tip simbiotic cu rădăcinile plantelor, numite micorize;

Unele specii acţionează ca prădători, participând la menţinerea echilibrului biologic din sol.

10. BIOSURFACTANŢI

Cercetările din domeniul biosurfactanţilor au început să se intensifice în ultimii ani datorită potenţialului mare de

utilizare a acestora în diferite ramuri ale economiei cum ar fi: agricultura, industriile alimentară, farmaceutică, petrochimică, a

ţiţeiului şi hârtiei. Dezvoltarea acestei direcţii de cercetare este foarte importantă în principal datorită preocupării actuale pentru

protecţia mediului înconjurator. Cel mai mare avantaj al surfactanţilor microbieni faţă de cei chimici este faptul că sunt

biodegradabili şi nu sunt toxici pentru mediul natural.

Biosurfactanţii au devenit un produs biotehnologic important cu aplicaţii în industrie şi medicină. Motivul popularităţii

lor ca produşi microbieni foarte valoroşi constă în activitatea lor specifică, toxicitatea scăzută, relativ uşor de obţinut şi

domeniile variate de aplicabilitate. Pot fi utilizaşi ca emulsifianţi, de-emulsifianţi, agenţi de înmuiere, agenţi de dispersare,

agenţi de spumare, ingredienţi alimentari activi şi detergenţi în diferite sectoare industriale cum ar fi: petrol şi petrochimie,

chimie organică, alimentară şi a băuturilor, cosmetică şi farmaceutică, minieră şi metalurgică, agrochimie şi fertilizanţi,

protecţia şi managementul mediului, etc. Numeroase specii de bacterii, levuri şi fungi filamentoşi produc macromolecule care

au proprietăţi tensioactive, “surface-active’’. Biosurfactanţii produşi de aceste microorganisme au un potenţial comercial mare,

putând fi utilizaţi în numeroase aplicaţii alimentare şi nonalimentare, precum: bioremediere, recuperarea ţiteiului, formularea

erbicidelor şi pesticidelor, produse cosmetice (ex. detergenţi şi cosmetice), formularea lubrifianţilor şi inhibitori ai creşterii

microorgansimelor. Soforolipidele, substanţe de natură glicolipidică sintetizate de mai multe specii de Candida sau alte specii

de levuri înrudite, conţin diglucide legate de acizi graşi hidroxilaţi prin legături glicozidice. Soforolipidele sunt un grup de

biosurfactanţi cu aplicaţii potenţiale şi produse noi (Solaiman, 2004).

10.1. UTILIZAREA MICROORGANISMELOR ÎN RECUPERAREA ŢIŢEIULUI

Un domeniu cu considerabile potenţiale aplicaţii ale biosurfactanţilor este recuperarea ţiţeiului – “microbial enhanced

oil recovery” (MEOR). Microorganismele din rezervoare sunt stimulate să producă polimeri şi surfactanţi care ajută prin

scăderea tensiunii superficiale la interfaţa dintre ţiţei şi rocă. Pentru a produce biosurfactanţi in situ, microorganismelor din

rezervoare li se furnizează substraturi ieftine, precum melasa sau substanţe anorganice, pentru stimularea creşterii şi producerea

biosurfactanţilor. Pentru a putea fi utile în recuperarea ţiţeiului in situ, bacteriile trebuie să fie capabile să crească în condiţiile

extreme din rezervoarele de ţiţei: temperatura ridicată, presiune, salinitate şi un nivel scăzut de oxigen. Au fost izolate câteva

bacterii aerobe şi anaerobe termofile tolerante la presiune şi salinitate moderată, care sunt capabile să mobilizeze ţiţei nerafinat

în experimente de laborator. Clark şi colab. au estimat ca 27% din rezervoarele de ţiţei din USA sunt influenţate de creşterea

microorganismelor şi pot fi folosite în recuperarea ţiţeiului. Eficacitatea acestei tehnici a fost raportată în studii în câmp care s-

au realizat în USA, Cehia, Slovacia, România, Ungaria, Polonia şi Olanda.

10.2. DEGRADAREA HIDROCARBURILOR ÎN SOL

Degradarea depinde de prezenţa în sol a speciilor de microorganisme care degradează hidrocarburi, de compoziţia

hidrocarburilor, disponibilitatea oxigenului, apa, temperatura, pH-ul şi substanţele anorganice. Natura fizică a hidrocarburilor

poate de asemenea influenţa biodegradarea. Adăugarea surfactanţilor sintetici sau biosurfactanţilor duce la creşterea mobilităţii

şi solubilităţii hidrocarburilor, fapt foarte important pentru o degradare microbiană eficace. Utilizarea biosurfactanţilor în

degradarea hidrocarburilor a dat rezultate diferite. Lindley şi Heydeman au utilizat tulpina fungică Cladosporium resiuae care

crescut pe un amestec de alcani a produs acizi graşi extracelular şi fosfolipide, în principal acid dodecanoic şi fosfatidilcolina.

Suplimentarea mediului de cultură cu fosfatidilcolina a îmbunătăţit degradarea alcanilor cu 30%. Foght şi colab. au raportat că

emulsifiantul Emulsan stimulează mineralizarea compuşilor aromatici de o cultură pură bacteriană, dar inhibă procesul de

degradare când este utilizată o cultură mixtă de bacterii. Oberbremer şi Muller-Harting au utilizat populaţii mixte de

microorganisme din sol pentru testarea degradării hidrocarburilor conţinute de ţiţei. În prima fază a degradarii hidrocarburilor a

fost folosit naftalenul; în timpul celei de-a doua faze au fost degradate alte componente ale ţiţeiului, după producerea

biosurfactanţilor de anumite microorganisme care au scăzut tensiunea interfacială. O metodă de îndepărtare a contaminanţilor

cu hidrocarburi din sol este adăugarea biosurfactanţilor în solul contaminat pentru a creşte astfel mobilitatea acestora.

Hidrocarburile astfel emulsionate pot fi apoi recuperate cu o sondă şi apoi biodegradate. A fost studiată spălarea solului in situ

cu doi surfactanţi sintetici Adsee 799 şi Hyonic NP-90. Îndepărtarea hidrocarburilor din sol prin adăugarea surfactanţilor la apa

de spălare a avut un oarecare succes. Mai multe tulpini de bacterii anaerobe produc biosurfactanţi care reduc tensiunea

superficială de la 27 la 50 mN/m ceea ce permite “solubilizarea” hidrocarburilor. Biosurfactanţii au fost utilizaţi şi pentru

recuperarea substanţelor xenobiotice. Astfel, Berg şi colab. au utilizat surfactanţi produşi de o tulpină de Pseudomonas

aeruginosa UG2, care au crescut solubilitatea hexaclorobifenilului adăugat unei probe de şlam permiţând recuperarea acestuia

în proporţie de 30% în faza apoasă. Comparativ cu utilizarea unui surfactant chimic - ligninsulfonat de sodiu, acest procent a

fost de 3 ori mai mare (9,3%). Adăugarea simultană a surfactantului biologic şi a celui chimic a avut un efect sinergic,

solubilizarea hexaclorobifenilului fiind de 41,5%. Un alt exemplu este tulpina Pseudomonas ceparia AC1100 care produce un

emulsifiant ce formează o suspensie stabilă cu 2,4,5,-T şi de asemenea prezintă o activitate de emulsifiere faţă de clorofenoli,

putând fi folosit în degradarea bacteriană a compuşilor organocloruraţi.

10.3. DEGRADAREA HIDROCARBURILOR ÎN MEDIUL ACVATIC

Atunci când este deversat petrol în mediul acvatic hidrocarburile uşoare se volatilizează, iar hidrocarburile polare se

dizolvă în apă. Totuşi din cauza solubilităţii scăzute a petrolului < 1ppm, majoritatea componentelor acestuia rămân la suprafaţa

apei. Îndepărtarea acestora se poate face prin procese de fotooxidare, evaporare şi degradare microbiană. Deoarece

microorganismele care degradează hidrocarburile sunt prezente în apa de mare, biodegradarea poate fi una dintre cele mai

eficiente metode de îndepartare a poluanţilor. Surfactanţii amplifică procesul de degradare prin disperarea şi emulsionarea

hidrocarburilor. Microorganisme care sunt capabile să degradeaze compuşi CxHy au fost izolate din mediul acvatic. Aceste

microorganisme care manifestă activitate de emulsionare ca şi microorganismele din sol produc surfactanţi care pot fi utili în

mediul acvatic. Chakrabarty a raportat că un emulsifiant produs de tulpina Pseudomonas aeruginosa SB30 este capabil să

disperseze petrolul în picături foarte fine, putând fi util în curăţarea tancurilor cu petrol. Astfel, un compartiment al unui tanc

petrolier ce conţinea balast de apă uleioasă a fost suplimentat cu uree, K2HPO4 şi aerat timp de 4 zile. S-a constat că tancul nu

mai prezenta stratul fin de reziduuri care au fost îndepărtate, datorită acţiunii surfactanţilor care au fost produşi de bacterii în

urma suplimetării cu substanţe nutritive şi oxigen. Surfactanţii au fost studiaţi pentru utilizarea în reducerea viscozităţii titeiului,

pentru a facilita recuperearea şi transportul lui. Emulsan, un lipopolizaharid produs de Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 a

fost propus pentru utilizarea în industria petrolieră pentru: curăţarea petrolului şi nămolului din barje şi tancuri, reducerea

viscozităţii ţiţeiului, recuperea ţiţeiului şi stabilizarea emulsiei apă-petrol în combustibili. Solubilizarea specifică a unor

compuşi CxHy în timpul creşterii organismelor procariote a fost observată de Reddy şi colab. Solubilizarea compuşilor CxHy a

fost puternic inhibată de EDTA care a fost depaşită de ionii de Ca2+ în exces, ceea ce a dus la concluzia că solubilizarea

specifică a compuşilor CxHy este un mecanism important în înţelegerea modului de degradare a acestora.

10.4. DEGRADAREA PESTICIDELOR

Datorită proprietăţilor biodegradative a biosurfactanţilor aceştia pot fi utilizaţi în aplicaţii de bioremediere pentru

protecţia mediului, în special pentru îndepărtarea pesticidelor. Studiind literatura de specialitate se poate remarca faptul că

aplicarea biosurfactanţilor în domeniul degradării pesticidelor este încă la început comparativ cu domeniul degrădării

hidrocarburilor. În India câteva laboratoare au iniţiat studii în acest sens, remarcându-se lucrările cercetătorilor: Banarjee şi

colab. pe 2,4,5-acid tricloroacetic, Patel şi Gopinath pe Fenthion, Anu Appaiah şi Karanth pe α HCH, care au fost susţinute la

diferite simpozioane. Hexaclorociclohexanul HCH este un pesticid înca foarte mult utilizat în numeroase ţări. Dintre cei opt

izomeri cunoscuţi ai HCH, forma α constituie mai mult de 70% din produsul tehnic, care nu are efect insecticid şi se presupune

că este carcinogenic. În India utilizarea HCH, care este un amestec izomeric, continuă datorită preţului mai scăzut cu de 10

până 12 ori faţă de Lindan care conţine γ HCH pur. Trebuie subliniat faptul că poluarea mediului cu HCH ameninţă toate

formele de viaţă. Solubilitatea mică a acestuia este unul dintre factorii limitativi în degradarea microbiană a α HCH. Prezenţa

celor 6 ioni de clor în molecula HCH este un alt factor care face ca acesta să fie persistent în biosferă. Deşi există câteva

cercetări în legătură cu biodegradarea izomerilor specifici ai HCH în animale, plante, sol şi sisteme microbiene, datele

referitoare la metabolizarea α HCH de către microorganisme este limitată. Mai mult, mecanismul exact al translocării HCH-lui

la locul descompunerii şi degradării α HCH în bacterii nu este foarte bine înţeles. În cursul experimentelor realizate de

cercetători din India care au avut ca scop degradarea bacteriană a HCH au fost izolate mai multe tulpini bacteriene capabile să

degradeze HCH. Una dintre tulpini care este eficace în degradarea HCH a fost identificată ca aparţinând genului Pseudomonas

Ptm+. Aceste tulpini produc biosurfactanţi extracelular în mediu mineral ce conţine HCH. Biosurfactanţii obtinuţi emulsionează

organoclorura HCH solidă într-o măsură mai mare decât alte substanţe organoclorurate ca DDT şi ciclodienele, sugerând astfel

specificitatea surfactanţilor în dispersarea HCH. De asemenea, a fost demonstrat faptul că cea mai mare cantitate de

emulsifianţi se sintetizează înainte de începerea degradării HCH de către tulpina de Pseudomonas crescută în mediu lichid.

Rolul biosurfactanţilor în degradarea HCH a fost descoperit utilizând biosurfactanţi parţial purificaţi. Biosurfactanţii

extracelulari sunt substanţe macromoleculare de natură lipoglicoproteică. Componenta glucidică a fost identificată prin diferite

metode analitice ca fiind ramnoza. Această componentă este stabilă şi este necesară activitaţii surfactantului. Cercetări

minuţioase au relevat faptul că fracţia proteică reprezintă enzime din metabolismul HCH. În prezenţa biosurfactanţilor HCH

este convertit prin acţiunea isomerazei şi declorinazei la tetraclorohexan şi apoi la clorofenol. Producţia biosurfactanţilor pe

Fenthion un insecticid lichid a stârnit de asemenea interesul cercetătorilor. Bacillus subtilis secretă biosurfactanţi atât în timpul

fermentaţiei în mediu lichid cît şi pe mediu solid. Surfactanţii microbieni produşi de aceste două tulpini prezintă proprietăţi de

agenţi de curăţare pentru îndepărtarea pesticidelor din containerele utilizate, tancurile de amestecare şi de păstrare. S-au făcut

testări pentru standardizarea parametrilor producţiei biosurfactanţilor în ambele sisteme de fermentaţie lichid şi solid. Un alt

sudiu a relevat faptul că biosurfactanţii produşi de tulpina Pseudomonas Ptm+ au permis mărirea gradului de dispersare a HCH

în apă de 250 de ori. Adăugarea fie a microorgansimelor fie a biosurfactanţilor produşi de acestea pe fructe, legume şi seminţe a

îndepărtat reziduurile de HCH foarte bine. Studii de laborator au arătat că biosurfactanţii sunt foarte eficienţi în curăţarea

containerelor în care reziduurile de HCH sunt aderate de perete. Au fost realizate studii pentru producerea la scară industrială a

biosurfactanţilor produşi de tulpina Pseudomonas Ptm+ şi se preconizează bioformularea acestora pentru utilizarea în

îndepărtarea HCH din soluri contaminate.

10.5. IMPORTANŢA BIOSURFACTANŢILOR PENTRU ARHITECTURA CELULARĂ

Recent a fost raportată importanţa biosurfactanţilor pentru arhitectura celulară bacteriană. Aceasta include rolul

surfactinului în formarea sporilor la Bacillus subtilis, rolul ramnolipidului în formarea biofilmelor la Pseudomonas aeruginosa

şi rolul streptofactinului în formarea miceliilor aeriene la Streptomyces tendae. Din punct de vedere structural biosurfactanţii

sunt molecule amfifile, conţin părţi polare şi nonpolare distincte care le conferă capacitatea de a se acumula la suprafaţă şi la

interfaţă.

Biosurfactanţii sunt produşi de bacterii din diferite genuri. Genele care codifică pentru biosinteza biosurfactanţilor sunt

diferite şi ca rezultat structura moleculară asociată fiecarei clase de surfactanţi este foarte variată, ceea ce conferă acestora

proprietăţi fizico-chimice diferite. Grupările nonpolare – ”coada” sunt în general asemănătoare la biosurfactanţi, ceea ce îi

diferenţiază sunt grupările polare – ”capul”, de aceea biosurfactanţii sunt clasificaţi în funcţie de capul polar în următoarele

clase: glicolipide, fosfolipide, săruri ale acizilor graşi şi surfactanţi polimerici.

10.6. UTILIZAREA BIOSURFACTANŢILOR ÎN AGRICULTURĂ

Extractul lipidic obţinut ca bioprodus în timpul producerii drojdiei uscate, este un lichid de culoare brună cu miros

caracteristic şi activitate interfacială ridicată. Acest produs are aplicaţii multiple în agrochimie, flotaţia mineralelor, producerea

şi prelucrarea bitumului. Produsul poate fi utilizat ca agent de emulsionare şi dispersare în timpul formulării erbicidelor,

pesticidelor şi prepararea reglatorilor de creştere ai plantelor. Includerea fosfolipidelor în formulare facilitează penetrarea

substanţelor active în ţesuturile plantelor, făcând posibilă aplicarea la o concentraţie foarte scăzută a substanţelor. Acizii graşi

constituenţi ai extractului biolipidic au activităţi antifitovirale şi antifungice şi pot fi aplicate în combaterea bolilor plantelor. De

asemenea, aceşti acizi graşi cresc toleranţa la stres a plantelor, ducând la creşterea producţiei în ciuda secetei.

10.7 PRODUCEREA MICROBIANĂ A BIOSURFACTANŢILOR

Numeroase microorganisme produc substanţe tensioactive, biosurfactanţi, care variază în ceea ce privesc proprietăţile

chimice şi dimensiunea moleculei. În general surfactanţii cu masă moleculară mică sunt de natură glicopilidică, iar cei cu masă

moleculară mare sunt fie heteropoliglucide polianionice care conţin o parte hidrofobă legată prin legături covalente sau

complexe constituite din poliglucide şi proteine. Producţia de biosurfactanţi depinde foarte mult de mediul de creştere al

microorganismelor. Marea diversitate a biosurfactanţilor face din ei un grup interesant de substanţe cu aplicaţii în multe

domenii cum ar fi agricultura, sănătatea, industria alimentară, conbaterea poluării mediului (de ex. în degradarea

hidrocarburilor prezente în sol). Biosurfactanţii sunt compuşi amfifili produşi la suprafaţa celulelor microbiene sau secretaţi în

mediu fiind formaţi dintr-o parte hidrofilă şi una hidrofobă, care reduc tensiunea superficială şi interfacială dintre două

molecule diferite la suprafaţă şi respectiv interfaţă. Deoarece biosurfactanţii şi bioemulsifianţii manifestă proprietăţi de

emulsionare, bioemulsifianţii sunt adesea categorisiţi ca biosurfactanţi, deşi aceştia pot să nu scadă tensiunea superficială. Un

biosurfactant poate avea una dintre următoarele structuri: acid micolic, glicoplipide, complex lipopolizaharidic, lipoproteine sau

lipopeptide, fosfolipide sau suprafaţa celulară în sine. O atenţie considerabilă s-a acordat producerii moleculelor active de

origine biologică datorită utilizării potenţiale în prelucrarea alimentelor, farmacologie şi industria petrolului. Deşi tipul şi

cantitatea de surfactanţi microbieni produsă depinde în primul rând de organismul producător, factori precum sursa de carbon,

azot, microelementele, temperatura, gradul de aerare afectează de asemenea producţia organismului. Poluanţii hidrofobi

prezenţi în hidrocarburile din petrol, sol şi mediu acvatic necesită o solubilizare înainte de a fi degradate de microorganisme.

Mineralizarea este guvernată de desorbţia hidrocarburilor din petrol. Surfactanţii pot mări suprafaţa materialelor hidrofobe, cum

ar fi pesticidele din sol şi mediul acvatic, astfel crescându-le solubilitatea în apă. Astfel, prezenţa surfactanţilor poate creşte

gradul de degradare de către microorganime al poluanţilor.

10.8. MICROORGANISME PRODUCĂTOARE DE BIOSURFACTANŢI

Microorganismele utilizează o varietate mare de compuşi organici ca sursă de carbon şi energie pentru creşterea lor.

Atunci când sursa de carbon este un substrat insolubil de ex. o hidrocarbură (CxHy), microorganismele facilitează difuzia

acestui compus în celulă prin producerea biosurfactanţilor. Unele bacterii şi levuri secretă surfactanţi ionici care emulsionează

substratul – hidrocarbura în mediul de cultură. Câteva exemple de biosurfactanţi din această categorie sunt ramnolipidele care

sunt produse de diferite specii de Pseudomonas sau soforolipidele care sunt produse de mai multe de specii de Torulopsis. Alte

microorganisme sunt capabile să-şi modifice structura peretelui celular, care se traduce prin sintetizarea lipopolizaharidelor sau

surfactanţilor anionici în peretele celular. Ca exemple de microorganisme din această categorie pot fi enumerate: Candida

lipolytica şi C. tropicalis care produc lipopolizaharide legate de peretele celular atunci când sunt crescute pe n-alcani;

Rhodococcus erytropolis şi multe specii ale genului Mycobacterium; Arthrobacter sp. care sintetizează corinomicolat trehaloza

anionică. Există lipopolizaharide cum este Emulsanul sintetizat de Acinetobacter sp., lipoproteine sau lipopeptide cum sunt

Surfactinul şi Subtilinul produse de Bacillus subtilis. Alţi biosurfactanţi sunt: Micolatul şi Corinomicolatul produse de

Rhodococcus sp., Corynebacteria sp., Mycobacteria sp., Nocardia sp. şi ornitinlipide care sunt produse de Pseudomonas

rubescens, Gluconobacter cerinus şi Thiobacillus ferroxidans.

10.9. CLASIFICAREA ŞI NATURA CHIMICĂ A BIOSURFACTANŢILOR

Surfactanţii microbieni sunt molecule comlexe cu structură foarte variată care includ peptide, acizi graşi, fosfolipide,

glicolipide, antibiotice, lipopeptide, etc. Microorganismele produc de asemenea surfactanţi care pot fi combinaţii de mai multe

substanţe, aceştia fiind numiţi surfactanţi microbieni polimerici (PMS). Mulţi dintre biosurfactanţi au fost purificaţi şi a fost

elucidată structura chimică. Biosurfactanţii cu masă moleculară mare sunt în general heteropolizaharide polianionice ce conţin

atât polizaharide cât şi proteine, iar biosurfactanţii cu masă moleculară mică sunt în general glicolipide. Cantitatea de

biosurfactanţi produsă de microorganisme variază în funcţie de condiţiile de mediu. Celulele microbiene intacte care au o

suprafaţă puternic hidrofobă pot fi ele însele biosurfactanţi. În unele cazuri, surfactanţii pot avea un rol imporant în creşterea

microorganismelor pe substraturi insolubile precum hidrocarburile şi sulful. Surfactanţii extracelulari au rol în aderenţa,

emulsifierea, dispersia, floculaţia, agregarea celulelor şi în fenomenul de desorbţie. În continuare vor fi descrise pe scurt tipurile

de biosurfactanţi în funcţie de natura lor chimică:

1. Glicolipidele - sunt cele mai obişnuite tipuri de biosurfactanţi. Constituenţii mono-, di-, tri- şi tetraglucidi includ glucoza,

manoza, galactoza, acidul glucuronic, ramnoza şi sulfatul de galactoză. Componenta lipidică este constituită din acizi graşi

asemănători fosfolipidelor. Glicolipidele pot fi clasificate astfel:

a) Trehalozolipide - creşterea în formă de serpentină observată la diferite specii ale genului Mycobacterium se datorează

prezenţei esterilor de trehaloză situaţi pe suprafaţa celulară. Factorii de legatură de la diferite specii de Mycobacteria,

Corynebacteria, Nocardia şi Brevibacteria diferă în dimensiunea şi strucutra esterilor acidului micolic.

b) Soforolipidele - sunt produse de diferite tulpini de levuri din genul Torulopsis. Unitatea glucidică este diglucidul soforoză,

care este constituit din două unităţi β-1,2-glucoză. Grupările hidroxi sunt în general acetilate. Soforolipedele reduc tensiunea

superficială dintre două molecule diferite la suprafaţă, deşi sunt agenţi de emulsionare. Soforolipidele produse de Torulopsis au

proprietăţi de stimulare, inhibare şi nu au efect asupra creşterii levurilor pe substraturi insolubile în apă.

c) Ramnolipidele – unele tulpini de Pseudomonas sp. produc cantităţi mari de glicolipide constituite din două molecule de

ramnoza şi două molecule de acid β hidroxidecanoic. Una din grupările OH ale unuia dintre acizi este implicată în legatura

glicozidică cu capătul reducător al ramnozei, iar altă grupare OH a celui de-al doilea acid este implicată în formarea esterului.

Deoarece unul dintre acizii carboxilici este liber ramnolipidele au caracter acid pH=4. Ramnolipidele scad tensiunea

superficială, emulsifică hidrocarburile şi stimulează creştrea celulelor de Pseudomonas pe mediu ce conţine n-hexadecan.

Sinteza ramnopilidelor este influenţată în mare măsura de limitarea sursei de azot. Ramnolipidele purificate scad tensiunea

superficială faţă de n-hexadecan în apă cu 1 mN/m şi au o concentraţie micelară critică (cmc) de 10 până la 30 mg/l în funcţie

de pH şi salinitate.

2. Acizii graşi – sunt produşi din alcani de către microorganisme pe cale oxidativă. Pe lângă lanţul de acizi, microorganismele

produc un complex de acizi graşi care conţin grupări OH şi ramificări alchil. Unii dintre aceşti acizi sunt de exemplu, acizii

corinomucolici, care sunt surfactanţi.

3. Fosfolipidele – sunt o componentă importantă a membranelor microbiene. Când anumite bacterii care degradează

hidrocarburi sau levuri sunt crescute pe substrat de alcani, nivelul fosfolipidelor creşte foarte mult. Fosfolipidele secretate de o

tulpină de Acinetobacter cultivată pe substrat cu hexadecan prezintă proprietăţi de potenţiali surfactanţi. Fosfolipidele produse

de Thiobacillus thiooxidans sunt responsabile de solubilizarea sulfului necesar creşterii.

4. Antibiotice

a) Gramicidin S – multe bacterii produc un antibiotic decapeptid, gramicidin S. Un preparat obţinut din spori de la

Brevibacterium brevis conţine o cantitate foarte mare de gramicidin S puternic legat de suprafaţa externă a sporilor. Mutantele

cărora le lipseşte gramicidinul S germinează rapid şi nu au o suprafaţă lipofilică. Activitatea antibacteriană a gramicidin S se

datorează activităţii de suprafaţă mari.

b) Polimixinele – acest grup de antibiotice produs de Brevibacterium polymyxa şi alţi bacili înrudiţi. Polimixin B este un

decapeptid în care aminoacidul din poziţia 3 până la cel din poziţia 10 formează o octapeptidă ciclică. Un lanţ ramificat de acizi

graşi este legat la acidul terminal 2,4-diaminobutiric. Polimixinele sunt capabile să solubilizeze (degradeze) anumite enzime din

membrana celulară.

c) Surfactinul (subtilisinul) – unul dintre cei mai activi biosurfactanţi produşi de Bacillus subtilis este un lipopetid ciclic numit

surfactin. Cantitatea de surfactin produsă de B. subtilis poate fi îmbunătăţită până la 0,8 g/l prin îndepărtarea continuă a

surfactinului prin fracţionarea spumei şi adăugarea unor săruri cu fier sau magneziu la mediul de cultură.

d) Antibioticul TA – Myxococcus xanthus produce antibioticul TA care inhibă sinteza peptidoglicanului prin interferarea cu

polimerizarea pentapeptidelor lipodizaharidice. Acest antibiotic este folosit în aplicaţii chemoterapeutice.

5. Surfactanţii microbieni polimerici – mulţi dintre aceştia sunt heteroglucide polimerice ce conţin proteine.

a) Emulsanul – Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (ATTC 31012) a fost izolată în timpul investigării unui factor care limita

degradarea petrolului în apa marină. Această bacterie emulsifia eficient hidrocarburile în apă şi a fost folosită mai târziu cu

succes pentru curăţarea compartimentelor cargourilor unui tanc petrolier. Acest fenomen s-a datorat producerii extracelulare a

unui factor emulsifiant cu greutate moleculară mare, emulsanul.

b) Complexul poliglucid proteic – o mutantă a tulpinii A. calcoaceticus BD413, secretă cantităţi mari de poliglucide împreună

cu proteine. Activitatea de emulsifiere necesită ambele substanţe atât poliglucidele cât şi proteinele.

c) Alti emulsifianţi produşi de Acinetobacter – producerea de emulsifianţi extracelulari este larg răspândită printre speciile

genului Acinetobacter. În urma unui screening 8 din 16 tulpini de A. calcoaceticus produceau cantităţi mari de emulsifianţi

după creştrea pe mediu cu etanol. Această fracţiune extracelulară a fost foarte activă în deemulsifierea unei emulsii formată din

cherosen şi apă stabilizată cu o mixtură de Tween 60 şi Span 60.

d) Complexe poliglucide-lipide produse de levuri – un emulsifiant, liposan, parţial purificat ce conţine 95% glucide şi 5%

proteine este produs de specia Endomycopsis lypolitica YM pe mediu cu CxHy. Torulopsis petrophilum produce diferite tipuri de

surfactanţi în funcţie de mediul de cultură. Pe substraturi insolubile această levură produce glicolipide care sunt incapabile să

stabilizeze emulsii, dar dacă este folosită glucoza ca substrat levura sintetizează un potenţial emulsifiant.

e) Proteine emulsifiante – bacteria Pseudomonas aeruginosa produce proteine emulsifiante. Această proteină PA este produsă

pe substraturi ce conţin n-alcani cu catena mare, 1-hexadecan şi alcool acetic, dar nu şi substraturi precum glucoza, glicerolul

sau acidul palmitic. Proteina are masa moleculară de 14.000 Da şi conţine mulţi aminoacizi serină şi treonină.

f) Surfactanţi produşi de Pseudomonas PG-1 – Pseudomonas PG-1 este o bacterie care produce surfactanţi foarte eficienţi, ea

utilizează diferite hidrocarburi inclusiv alcani, alchene şi benzen-alchil sub forma gazoasă şi lichidă.

g) Biofloculanţi produşi de Cyanobacterium phormidium J-1 – modificările stării hidrofobe a suprafeţelor celulare ale

cianobateriei Cyanobacterium phormidium au fost corelate cu producerea unui agent emulsifiant numit emulcian. Emulcianul

parţial purificat are o greutate moleculară mai mare de 10.000 Da şi conţine glucide, proteine şi esteri ai acizilor graşi.

Adăugarea emulcianului la celulele hidrofobe modifică această stare făcându-le hidrofile şi permite detaşarea de picăturile de

hexadecan sau bilele de fenil sefaroză.

6. Surfactanţi particulaţi

a) Vezicule extracelulare produse de Acinetobacter sp. H01-N – Acinetobacter sp. când creşte pe mediu cu hexadecan

acumulează vezicule extracelulare cu diametru de 20 până la 50 mm diametru cu o densitate de 1,158 g/cm3. Aceste vezicule

par a avea rol în utilizarea alcanilor de către Acinetobacter sp. H01-N.

b) Celule microbiene cu suprafaţa celulară hidrofobă foarte mare – majoritatea microorganismelor care pot degrada

hidrocarburi, multe dintre cele care nu degradează hidrocarburile, unele specii ale genului Cyanobacteria şi multe

microorganisme patogene au o puternică afinitate pentru interfeţele hidrocarburi-apă şi aer-apă. În aceste cazuri celulele

microbiene sunt ele însele surfactanţi.

10.10 FACTORII CARE AFECTEAZĂ PRODUCEREA BIOSURFACTANŢILOR

Deşi biosurfactanţii au structuri diferite, aşa cum a fost evidenţiat în paragraful anterior, există câteva caracteristici

asemănătoare în ceea ce priveşte sinteza lor. De exemplu, producţia biosurfactanţilor poate fi indusă de glucide sau alte

substraturi insolubile. Acest efect descris de diferiţi cercetători se referă la mulţi compuşi tensioactivi. Un alt fenomen este

represia catabolică a sintezei biosurfactanţilor de către glucoză sau alţi metaboliţi primari. De exemplu, în cazul speciei

Arthrobacter paraffineus nu a putut fi izolat nici un biosurfactant din mediu atunci când a fost utilizată glucoza ca sursă de

carbon în locul hexadecanului. În mod similar tulpina Pseudomonas aeruginosa S7B1 a sintetizat o proteină activator pentru

oxidarea n-alcanilor atunci când a fost cultivată pe substrat cu hidrocarburi, dar nu a sintetizat nimic pe mediu cu glucoză,

glicerol sau acid palmitic. Torulopsis petrophilum nu a produs nici un glicolipid atunci când a fost crescută pe un mediu care

conţinea doar o sursă de carbon solubilă. Atunci când a fost utilizat glicerolul ca substrat producerea ramnolipidului de către P.

aeruginosa a fost redusă prin adăugarea glucozei, acetatului, succinatului sau citratului în mediu. Tipul, calitatea şi cantitatea

producerii biosurfactanţilor sunt influenţate de natura sursei de carbon, de concentraţia ionilor de azot, fosfor, magneziu, fier şi

mangan din mediu, de condiţiile de cultură, cum sunt pH-ul, temperatura, agitarea şi rata diluţiei în cultura continua.

Producerea biosurfactanţilor de către tulpinile de Pseudomonas MEOR171 şi MEOR171 nu este afectată de temperatură, pH,

Ca, Mg fiind îmbunătăţită de salinitatea crescută. Sursa de azot poate fi o cheie importantă în reglarea sintezei biosurfactanţilor.

Tulpina Arthrobacter paraffineus ATTC 19558 preferă amoniul în locul nitratului ca sursa de azot anorganică pentru

producerea de biosurfactanţi. De asemena, utilizarea ureei poate mări producţia de biosurfactanţi. O modificare a ratei de

creştere a anumitor microorganisme este adesea suficientă pentru mărirea producţiei biosurfactanţilor. În unele cazuri

adăugarea cationilor multivalenţi la mediul de cultură poate avea un efect benefic în producerea biosurfactanţilor. În afară de

substanţele enumerate anterior implicate în reglarea producerii biosurfactanţilor, şi alţi compuşi cum ar fi etanbutolul,

penicilina, cloramfenicolul şi EDTA influenţează sinteza biosurfactanţilor. Reglarea producerii biosurfactanţilor prin aceşti

compuşi se face fie prin efectul lor de solubilizare a substraturilor nepolare glucidice fie prin mărirea producţiei pe substraturi

solubile (polare). În unele cazuri sinteza biosurfactanţilor este reglată de pH şi temperatură. De exemplu în producerea

ramnolipidului de Pseudomonas sp., în formarea celobiozolipidului de către Ustilago maydis şi în formarea soforolipidului de

către Torulopsis bombicola, pH–ul joacă un rol important, iar în cazul tulpinilor Arthrobacter paraffineus ATTC 19558,

Rhodococcus crythropolis şi Pseudomonas sp. DSM 2874 temperatura este importantă. În toate aceste cazuri totuşi producţia

biosurfactanţilor a fost dependentă de temperatură.

11. TEHNICI MOLECULARE PENTRU IDENTIFICAREA RAPIDĂ

A MICROORGANISMELOR DIN ECOSISTEME ACVATICE ŞI TERESTRE POLUATE

11.1. PRINCIPII GENERALE DE IZOLARE ŞI CARACTERIZARE A ACIZILOR NUCLEICI

Acizii nucleici sunt substanţe macromoleculare alcătuite din nucleotide. Nucleotidele sunt formate dintr-o bază

azotată, o pentoză şi un radical fosfat. Bazele azotate sunt de două tipuri: purinice – adenina şi guanina, respectiv pirimidinice –

timina, citozina şi uracilul. În structura ADN intră dezoxiriboza, adenina, guanina, timina, citozina şi radicalul fosfat. În

structura ARN intră riboza, adenina, guanina, uracilul, citozina şi radicalul fosfat. O bază azotată şi o pentoză sunt legate prin

legături β-N-glicozidice formând o nucleozidă. Adăugarea radicalului fosfat la nucleozidă duce la formarea unei nucleotide.

Nucleotidele sunt legate între ele prin legături fosfodiesterice.

ADN este materialul genetic al majorităţii organismelor cu excepţia viroizilor şi a ribovirusurilor.

În vederea izolării şi purificării acizilor nucleici trebuie parcurse mai multe etape:

1. Alegerea materialului biologic de la care se izolează acizii nucleici.

Virusuri – se folosesc suspensii ce conţin particule virale (obţinute în urma lizei celulare a bacteriilor sensibile);

Bacterii – se folosesc suspensii bacteriene obţinute dintr-o cultură proaspătă de 18h;

Drojdii – se folosesc suspensii de drojdii obţinute dintr-o cultură proaspătă de 18 h;

Fungi filamentoşi – se foloseşte miceliu obţinut în mediu lichid de 24-48 h;

Organisme animale – se aleg organe, ţesuturi moi, culturi de celule;

Plante – se alege ţesut foliar tânăr, calus, embrioni.

2. Distrugerea peretelui celular.

Virusuri – distrugerea proteinelor capsidale se realizează cu fenol. ADN-ul şi ARN-ul celulei gazdă sunt degradate

prin tratament enzimatic cu DN-ază şi RN-ază;

Bacterii – prin îngheţ-dezgheţ se fragmentează peretele celular şi se obţin protoplaşti, care fiind sensibili la presiunea

osmotică se lizează;

- tratament enzimatic cu lizozim, lizostafin; pentru bacterii Gram-pozitive concentraţia de lizozim trebuie să

fie mai mare (15-30 mg/ml) decât la bacteriile Gram-negative (5-15 mg/ml). Lizozimul este un complex

enzimatic extras din albuş de ou activ la pH alcalin (minim pH=8). Lizozimul degradează legăturile β-1,4-

dintre acidul N-acetilmuramic şi N-acetilglucozamina componente ale peptidoglicanului. La bacteriile Gram-

pozitive din genul Staphylococcus se utilizează lizostafin – un complex enzimatic sintetizat de anumite tulpini

de stafilococi, lizozimul fiind ineficient;

-utilizarea antibioticelor din gama β-lactamilor (penicilină, tetraciclină), care au rol în inhibarea formării

peretelui celular;

-ultrasonicarea – ultrasunetele provoacă ruperea pereţilor celulari. Ele sunt generate prin trecerea unui curent

alternativ printr-un cristal de cuarţ;

Drojdii şi fungi filamentoşi

-mojarare cu nisip de cuarţ sau bile de sticlă urmat de vortexare;

-tratament enzimatic cu “suc de melc” (complex enzimatic extras din sucul gastric al Helix pomatia), care

conţine chitinază, celulază, protează, amilază, etc;

-ultrasonicarea;

Plante

-îngheţ-dezgheţ şi mojarare cu nisip de cuarţ;

-tratament enzimatic cu celulază

3. Liza celulară – se realizează cu scopul de-a distruge membrana plasmatică şi de-a elibera conţinutul celular. Liza se

realizează cu detergenţi (membrana plasmatică fiind de natură fosfolipidică) de tipul SDS (dodecil sulfat de sodiu), CTAB

(cetiltrimetil amoniu brom), sarcozil, deoxicolat de sodiu. În urma lizei celulare se eliberează şi endonucleaze, care

degradează materialul genetic. Astfel, pentru protejarea ADN de acţiunea endonucleazelor se adaugă în tamponul de liză

EDTA (etilendiaminotetraacetat) - agent chelator ce fixează ionii de Mg2+, care sunt cofactori ai DN-azelor şi fără de care

nu pot funcţiona. pH-ul tamponului de liză trebuie să fie alcalin. Liza celulară este totală atunci când soluţia se clarifică şi

devine vâscoasă (până atunci suspensia are un aspect lăptos).

4. Deproteinizarea se realizează fie cu solvenţi organici fenol, amestec de cloroform: alcool izoamilic (24:1 v/v) sau amestec

fenol: cloroform: alcool izoamilic (25:24:1 v/v), fie prin tratament enzimatic (pronază E, proteinază K), fie cu soluţii

saline concentrate (KCl 2,5M). Se obţine o emulsie, care după centrifugare se separă astfel: faza apoasă (supernatantul)

conţine soluţia de ADN, stratul proteic (peliculă proteică), faza organică, iar la baza tubului de centrifugă nisip de cuarţ,

resturi celulare.

5. Precipitarea ADN

-alcool etilic absolut rece (-20°C), urmat de incubare peste noapte la congelator;

-alcool izopropilic, urmat de incubare 10-20 minute la temperatura camerei (20°C);

6. Recuperarea ADN – se realizează prin centrifugare 5-10 minute la 15.000 rpm şi reluare într-un volum minim de tampon

TE.

7. Purificarea ADN – pentru a putea fi folosit în experimentele ulterioare (transformare genetică, clivare cu enzime de

restricţie, PCR, RFLP) ADN trebuie să fie pur, necontaminat cu proteine şi ARN. Pentru aceasta se repetă deproteinizarea

(pelicula proteică va fi mai subţire), apoi se tratează cu RN-ază pentru a degrada ARN-ul contaminant.

11.2. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ŞI PURITĂŢII ACIZILOR NUCLEICI

11.2.1. DETERMINAREA PURITĂŢII ŞI DOZAREA ACIZILIOR NUCLEICI PRIN METODE

SPECTROFOTOMETRICE

Concentraţia de ADN sau ARN se poate determina pe baza absobţiei radiaţiilor UV la λ= 260 nm. Astfel, s-a

determinat că la o valoare a absorbanţei de 1 la 260 nm concentraţia unei probe de ADN dublu catenar este de 50 µg/ml şi a

unei probe de ARN este de 40 µg/ml.

Verificarea spectrofotometrică a purităţii ADN se face prin citirea absorbanţei la lungimi de undă specifice pentru

ADN şi pentru contaminanţii posibili (polizaharide, EDTA, etanol λ= 230 nm; fenol λ= 270 nm; proteine λ=280) faţă de

tampon TE.

Pentru evaluarea purităţii ADN trebuie să se ţină cont de următoarele criterii:

O valoare a raportului A260/A280 între 1,8 şi 2 indică o puritate mare a soluţiei de ADN; dacă raportul este mai mare de 2

atunci proba este contaminată cu ARN, iar dacă raportul este mai mic de 1,8 atunci proba este contaminată cu proteine;

O valoare a raportului A260/A230 mai mică de 2 indică o contaminare cu polizaharide;

Raportul A260/A270 indică gradul de contaminare cu fenol.

11.3. VERIFICAREA ELECTROFORETICĂ A ADN

Electroforeza reprezintă o metodă fizico-chimică analitică şi preparativă, care se bazează pe fenomenul migrării unor

particule încărcate electric într-un mediu solid sub acţiunea unui câmp electric extern.

Migrarea moleculelor de acizi nucleici în gel de agaroză în câmp electric este o tehnică folosită în biologia moleculară

pentru separarea şi identificarea acestora. Principiul general al electroforezei acizilor nucleici constă în faptul că la pH neutru

sau alcalin acizi nucleici au sarcină globală negativă şi într-un câmp electric vor migra spre electrodul pozitiv (anod).

Moleculele migrează în gel cu viteze diferite, în funcţie de dimensiunea lor. Moleculele de dimensiuni mici vor migra

cel mai repede, iar moleculele de dimensiuni mari vor migra mai încet. Moleculele de ADN plasmidial pot avea diferite

conformaţii moleculare: circulare închise covalent (CIC), supraîncolăcite circulare deschis (CD) şi lineare. Moleculele cu astfel

de conformaţii migrează diferit în gelul de electroforeză: cel mai rapid migrează forma CIC, apoi forma L şi ultima forma CD.

Intensitatea curentului electric aplicat gelului trebuie să fie de 5 V/cm. O tensiune mai mare determină distorsionarea

benzilor de ADN, acestea apărând curbate. Grosimea gelului trebuie să fie de 3-4,5 mm. Concentraţia de agaroză poate varia

între 0,3-2% în funcţie de dimensiunea moleculelor de ADN ce urmează a fi separate. Pentru gelul de verificare a unor extracte

de ADN cromosomal se foloseşte o concentraţie de 0,7-0,9%. Colorarea moleculelor de ADN se realizează cu bromură de

etidiu, care este un agent intercalant de tip fluorocrom (se intercalează între bazele azotate ale acizilor nucleici). Bromura de

etidiu se prepară ca soluţie stoc în apă cu concentraţia de 10 mg/ml şi se utilizează la o concentraţie de 0,5-1µg/ml. Bromura de

etidiu se adăugată fie direct la agaroză când se prepară gelul fie gelul poate fi colorat după electroforeză. Benzile de ADN pot fi

vizualizate după migrare la transiluminator UV (λ=250-310 nm).

Avantajele electroforezei în gel de agaroză: este o metodă rapidă şi simplă; prin această metodă pot fi separate şi

identificate fragmente de ADN cu dimensiuni variabile; ADN poate fi localizat în gelul de agaroză prin colorare cu bromură de

etidiu.

Mobilitatea electroforetică a ADN în gelul de agaroză depinde de: mărimea moleculelor de ADN; concentraţia

agarozei; conformaţia moleculară a ADN; curentul aplicat.

11.4. TEHNOLOGIA PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) – REACŢIA DE POLIMERIZARE ÎN LANŢ

Reacţia de polimerizare în lanţ a unui fragment de ADN a fost elaborată în 1983 de Kary Mullis. În scurt timp

tehnologia PCR a devenit una dintre cele mai importante şi mai puternice metode în biologia moleculară. Acumularea

cunoştinţelor despre modul de funcţionare al ADN polimerazelor termostabile, pe de o parte şi dezvoltarea automatizării

aparaturii (termocicler), pe de altă parte, au permis utilizarea tehnologiei PCR pentru cercetare şi diagnostic (Sreenivasaprasad

şi Mills, 1998).

Reacţia PCR este o metodă cu foarte multe aplicaţii în biologia moleculară. Această reacţie enzimatică permite

amplificarea in vitro a unui anumit fragment de ADN dintr-o probă de ADN complex putând genera cantităţi de ordinul

microgramelor din fragmentul ţintă. De la apariţia metodei în 1985, specificitatea, sensibilitatea şi viteza acestei tehnologii au

generat dezvoltarea mai multor metode cu aplicativitate în diverse arii de cercetare în domeniul biologiei pentru toate clasele

de organisme. Dintre aplicaţiile tehnologiei PCR pot fi amintite cele din domeniile micologiei, care includ genetica fungilor şi

sistematica, ecologiei şi microbiologiei solului, fitopatologiei, micologiei medicale, biotehnologiei fungilor, etc. (Edel, 1998).

11.4.1. PRINCIPIUL REACŢIEI PCR

Reacţia PCR este o metodă de amplificare exponenţială enzimatică in vitro a unui fragment de ADN, fiind constituită

din cicluri succesive de replicare a ADN, utilizând doi primeri oligonucleotidici care flanchează regiunea ţintă şi care

hibridizează cu cele două catene ale matriţei de ADN, care conţin regiunea ce va fi amplificată. Amplificarea se bazează pe

utilizarea unei enzime, ADN polimeraza termostabilă numită Taq polimeraza izolată de la Thermus aquaticus.

După ce toate componentele necesare desfăşurării reacţiei PCR au fost amestecate, termociclerul parcurge o

succesiune de etape care necesită diferite temperaturi de lucru: denaturarea ADN, legarea primerilor şi amplificarea ADN.

Prima etapă presupune incubarea amestecului de reacţie la o temperatură mare (90-95oC) care permite denaturarea

matriţei de ADN dublucatenar. Următoarea etapă constă în răcirea amestecului de reacţie la o temperatură în jurul valorii de

55oC (±) pentru hibridizarea primerilor oligonucleotidici la capetele 3’ ale celor două catene monocatenare ale matriţei de

ADN. A treia etapă necesită creşterea temperaturii la 72oC pentru iniţierea sintezei noilor catene de ADN. Această secvenţă de

trei etape corespunde unui ciclu al reaţiei PCR. Timpul necesar desfăşurării fiecărei etape este de regulă de 1-2 minute. În ciclul

al doilea, catena de ADN nou sintetizată este separată de catena matriţă prin denaturare şi fiecare catenă serveşte din nou ca

matriţă în următoarele etape – legarea primerilor şi amplificare. De obicei se realizează 30-40 de cicluri. Teoretic după

parcurgerea a n cicluri în reacţia PCR se vor forma 2n molecule de ADN ţintă.

Diferenţa faţă de replicarea in vivo constă în faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix de ADN

matriţă şi ataşarea primerilor nu sunt realizate enzimatic ci cu ajutorul temperaturii, singura enzimă utilizată fiind o polimerază

termostabilă dependentă de ADN cu funcţie de replicază.

11.4.2. COMPONENTELE ŞI PARAMETRII REACŢIEI PCR

ADN matriţă, primerii oligonucleotidici, ADN polimeraza şi deoxiribonucleotidele trifosfat (dNTP) sunt amestecate

într-un tampon ce conţine ioni de Mg2+ (MgCl2). Volumul de reacţie este de regulă cuprins între 25-100 μl. Condiţiile

standard pentru concentraţiile diferitelor componente sunt redate în tabelul 4 şi permit amplificarea majorităţii secvenţelor

ţintă, dar pot fi optimizate pentru fiecare reacţie PCR nouă. De exemplu, concentraţia de MgCl2 necesară funcţionării Taq

polimerazei este 1,5 mM. În cazul în care nu se obţin rezultate bune după reacţia PCR această concentraţie poate fi

optimizată: o concentraţie mai mare de clorură de magneziu poate creşte cantitatea produşilor de amplificare, dar totodată

scade specificitatea. O concentraţie mai mică de clorură de magneziu creşte specificitatea, dar scade cantitatea produşilor de

amplificare. În mod similar temperatura şi timpul necesare pentru fiecare etapă a reacţiei, în special în etapa de legare a

primerilor, ar trebui optimizate pentru fiecare secvenţă ţintă şi pentru fiecare pereche de primeri. Temperatura pentru legarea

primerilor este în general optimizată prin tatonări empirice, creşterea făcându-se până se vor obţine rezultate bune în ceea ce

priveşte cantitatea produşilor de amplificare şi specificitatea de reacţie a enzimei.

11.6. TEHNICA ARDRA

Identificarea unor organisme prin amplificarea unor secvenţe specifice de ADN prin tehnica PCR a început să devină

tot mai frecvent utilizată datorită simplităţii şi a reproductibilităţii metodei. Prin tehnica ARDRA (Amplified Ribosomal DNA

Restriction Analysis) – analiza profilurilor electroforetice a unor secvenţe de ADN ribosomal amplificate şi urmat de un

tratament cu enzime de restricţie, pot fi diferenţiate levurile la nivel de specie. Astfel, analiza profilului electroforetic a unor

secvenţe intergenice spaţiatoare dintre genele ce codifică pentru ARNr 18S şi ARNr 28S a permis diferenţierea unor specii ale

genului Saccharomyces. In urma clivării acestor secvenţe de ADNr cu enzima de restricţie Hae III s-au obţinut rezultate

semnificative care au permis diferenţierea între speciile S.cerevisiae şi S.bayanus (Guillamon colab., 1998).

Metodologia de lucru pentru identificarea şi caracterizarea tulpinilor de drojdii prin tehnica ARDRA cuprinde

următoarele etape:

1. izolarea ADN (tehnica descrisă anterior)

2. determinarea concentraţiei şi purităţii prin măsurarea absorbanţei la 260 nm şi 280 nm

3. amplificarea ADNr cu un termocycler

12. METODĂ DE IDENTIFICARE RAPIDĂ A MICROORGANISMELOR - TEHNICA FISH

Tehnica FISH – fluorescence in situ hybridization” permite identificarea microorganismelor din orice tip de probe din

mediu (probe de apă sau sol). Tehnica presupune trei etape:

fixarea celulelor (astfel sunt conservate moleculele de ADN sau ARN);

permeabilizarea pentru a facilita accesul sondelor oligo- sau polinucleotidice la situsul ţintă;

hibridizarea ARN ribozomal cu sondele nucleotidice. Sondele pot fi marcate direct cu fluorocromi sau colorantul este

introdus în următoarea etapă de detecţie a microorganismelor.

Probele pot fi apoi analizate prin tehnici de microscopie cu epifluorescenţă, laser scanning (CLSM – Confocal Laser

Scaning Microscopy) sau flow cytometry. Tehnica FISH clasică se bazează numai pe utilizarea ARNr (în general 16S) ca ţintă

pentru sondele nucleotidice, deoarece acesta este prezent în toate celulele într-un număr relativ mare de copii. Deoarece ARNr

este utilizat ca marker filogenetic există numeroase baze de date legate de secvenţierea acestuia necesare pentru design-ul

sondelor.

Pe parcursul celor douăzeci de ani de când a fost pusă la punct această tehnică a devenit o unealtă preţioasă pentru

microbiologi. Motivele popularităţii acestei tehnici sunt evidente:

FISH permite detecţia şi identificarea celulelor microorganismelor fără a fi necesară cultivarea lor, fapt foarte important

deoarece doar 0,3% dintre bacteriile din sol şi mai puţin de 0,1% dintre bacteriile marine pot fi cultivate în laborator in

vitro (Amann şi colab., 1995);

Posibilitatea detectării celulelor in situ permite pătrunderea în interiorul structurii comunităţilor microbiene şi poate ajuta

la identificarea lor rapidă şi sigură.

Tehnica FISH clasică poate prezenta unele limite cum ar fi de exemplu o intensitate foarte mică a semnalului cauzată

de permeabilitatea scăzută a membranelor celulare sau de numărul mic de ribosomi din celulă. Permeabilitatea scăzută a

peretelui celular împiedică accesul sondelor în celule şi ajungerea lor la situsurile ţintă.

În cazul în care semnalul emis de substanţele fluorocrome cu care sunt marcate sondele de nucleotide, în urma excitării

de către fasciculul laserului sau radiaţiei ultraviolet, are o intensitate foarte mică acestea nu pot fi detectate.

Introducerea unor pretratamente enzimatice sau cu diferite substanţe chimice poate mări permeabilitatea pereţilor

celulari. Trebuie avut grijă însă ca aceste tratamente să nu distrugă celulele ducând la liza lor şi deci la pierderea lor.

Numărul mic de ribosomi din celulele care cresc greu sau în celulele metabolic inactive din probe prelevate din mediu

(apă, sol) este una din cauzele importante a semnalului slab detectat în tehnica FISH clasică în care ţinta este ARN ribosomal.