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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
NOVAS ABORDAGENS DA PESQUISA EM CACAU NA BUSCA DE SOLUÇÕES INOVADORAS PARA PRAGAS E AGREGAÇÃO
DE VALOR AOS SUBPRODUTOS
Fábio Neves dos Santos
Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas
Brasília, 09 de março de 2017.
1
2
Sumário de apresentação
I – Identificação de fitopatógenos do cacau para
inspeção fitossanitária
II – Metabolômica de clones do cacau infectados por
Moniliophthora perniciosa (vassoura de bruxa)
III – Aproveitamento e uso sustentável do mel de cacau
em novos produtos
3
Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas
4
Novas metodologias em espectrometria de massas
5
6
7
8
Local do estudo – Centro de Pesquisas do Cacau, Ilhéus - Bahia
9
Novas metodologias analíticas por
espectrometria de massas para diferenciar as
principais espécies de fitopatógenos do
cacau
10
11
Moniliophthora roreri causador da moniliase do cacau
Identificação
Morfologia
forma, cor, cheiro ...colorações de microscopia
Testes Bioquímicos
Molecularspecific-PCRs, RT-PCRsSNP, MLST, RFLP, VNTR, PFGE…
Testes imunologicos
Anticorpos mono- ou policlonais, aglutinação, teste ELISA...
Atividade metabolica
12
1988 MALDI - TOF
1988 MALDI - TOF
Matrix-assisted laser desorption/ionization
MALDI-MS
1988 MALDI - TOF
13
E.coli4
36
4.0
6
53
80
.64
62
54
.64
63
15
.49
50
96
.01
71
57
.65
72
73
.87
64
10
.90
78
70
.62
83
68
.99
0
1000
2000
3000
4000
5000Inte
ns.
[a.u
.]
4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000
m/z
Proteina
Ribossomalm/z
RL36 4364,33
RS32 5095,82
RL34 5380,39
RL33meth. 6255,39
RL32 6315,19
RL30 6410,60
RL35 7157,74
RL29 7273,45
RL31 7871,06
RS21 8368,76
Modo Positivo
Faixa de massa 4-10 kDa
14
Perfil de peptídeos/proteínas de E. Coli por MALDI-TOF-MS
15
Jacyr Pasternak – Chefe da Comissão Hospitalar do Albert Einstein
“Finalmente sentimo-nos em tempo de fornecer um resultado de
maneira tempestiva útil - porque pouco adianta explicar para o
clínico que nossa bactéria cuidadosamente cultivada é tal
depois que o doente faleceu”.
CLASSIFICAÇÃO DE FITOPATÓGENOS DO CACAUEIRO
Patógenos (espécies)
Patógenos (gêneros)
Doenças Cacaueiro
TheobromaCacao L.
Vassourade bruxa
Moniliophthora
perniciosa
roreri
Podridãoparda
Phytophthora
P. capsici
P. palmivora
P. citrophthora
P. hevea
Murcha deCeratocystis
Ceratocystis
cacaofunesta
fimbriata
paradoxa16
17
Moniliophthora perniciosa
• Fruto
• Caule
• Ilhéus
Ceratocystis cacaofunesta
• Caule
• Pecíolo/folha
• Ilhéus
• Santo Amaro
• Belmonte
• Mutuípe
• Uruçuca
Ceratocystis paradoxa
• Pecíolo/folha de coqueiro
• Una - Bahia
• Itacaré -Bahia
Ceratocystis fimbriata
• Caule de Eucalipto
• Pecíolo/folha de Eucalipto
• Caule seringueira
• Pecíolo/folha de seringueira
Hospedeiros, tecidos vegetais e localidades de coleta dos isolados dos fitopatógenos
18
Phytophthora palmivora
• Fruto de cacau
• Fruto de mamão
• Itabuna
• Eunapolis
• Gandu
• Mutuipe
• Una
Phytophthora capsici
• Fruto de cacau
• Pecíolo/folha de seringueira
• Pau Brasil
• Camacan
• Ituberá
• Una
• Gonguji
Phytophthora heveae
• Pecíolo/folha de seringueira
• Rizosfera de seringueira
• Una
• Uruçuca
• ituberá
Phytophthora citrophthora
• Fruto de cacau
• Pecíolo/folha de seringueira
• juçari
• Ituberá
• Belmonte
• Santo Amaro
• Gandú
Hospedeiros, tecidos vegetais e localidades de coleta dos isolados dos fitopatógenos
Vortex
Adicionar 50 μL TFA 80% (30 min a 1000 rpm)
50 μL água + 100 μL ACN
Depositar um 1,0 µL do sobrenadante na placa MALDI +
1,0 μL de CHCACentrifugar 2 min a 13.000xg
Centrifugar por 2 min a 13.000xg. Retirar etanol
residual e secar 10 min
300µL água900µL etanol
•Extração de peptídeos/proteínas
Microrganismo isolado
19
4878
2032
2857
31523413 5173 6206 6618 7903
0
1
2
3
4
5
x104
7234
6093361530462376 6777
0.0
0.5
1.0
1.5
5328
2086
6380
7016
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
m/z
Moniliophthora perniciosa
Ceratocystis cacaofunesta
Phytophthora palmivora
x104
x104
Inte
nsid
ade
Perfis de peptídeos/proteínas de Moniliophthora perniciosa,Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora palmivora (diferentesgêneros).
20
6271
3698
5318
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0x10
4
5877
6371
61773693 5343
1
2
3
4
62973695
82424114
5642
0.0
0.5
1.0
1.5
6174
4853 58903802 5266 88956855 93297604 8085
0
2
4
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
m/z
6374
x104
x104
x104
P. palmivora
P. heveae
P. citrophthora
P. capcisi
Inte
nsid
ade
Perfis de peptídeos/proteínas das espécies Phytophthora
21
6173
37886998 101937576
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
x104
6174
4852 592852658900
808740413691 93297372
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
6172
3693 6999 81897408
0
1
2
3
4
5
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
m/z
x104
x104
6998
P. capsici 1454
P. capsici 1442
P. capsici 1597
Inte
nsi
dad
ePerfis de peptídeos/proteínas de Phytophthora coletados deseringueira (1454, 1597) e cacau (1442)
22
6273
3695
61401
2
3x104
62663698
6143
0.5
1.0
1.5
2.0
53526277
2085
0.25
0.50
0.75
5326
20876379
0.00.51.01.52.0
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
m/z
x104
x104
x104
0.0
0.0
6374
6376
6379
P. palmivora 1662
P. palmivora 1629
P. palmivora 262
P. palmivora 250
Inte
nsi
dad
ePerfis de peptídeos/proteínas de Phytophthora coletados de mamão (250, 262) e cacau (1629, 1662)
23
Perfis de peptídeos/proteínas de Phytophthora coletados de folhas (989) e rizosfera (1170, 1144) de seringueira
24
58796372
6180534636941
2
3
5202
3827765061813701 58781
2
3
50944588 63745879
525036896183
4281
0.0
0.5
1.0
1.5
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
m/z
x104
x104
x104
P. heveae 1170
P. heveae 989
P. heveae 1144
Inte
nsi
dad
e
2857
4877
23192646
62075171 6914
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
x105
4878
2032
2857
31523413 5173 6206 6618 6916 7903
0
1
2
3
4
5
x104
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
m/z
2783M. perniciosa (caule)
M. perniciosa (fruto)
Inte
nsid
ade
Perfis de peptídeos/proteínas de Moniliophthora perniciosacoletado de caule e fruto de cacau.
25
Perfil de peptídeos/proteínas dos fitopatógenos
26
M . perniciosa
C. Cacaofunesta
C. Paradoxa
C. fimbriata
P. palmivora
P. citrophthora
P . heveae
P. capsici
27
PERSPECTIVA: BIBLIOTECA DE FITOPATÓGENOS DO CACAUEIRO
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos na caracterização de fitopatógenos do
cacau mostram importante avanço na contribuição científica
para diferenciação das pragas usando a técnica MALDI-
TOF/MS, sobretudo a discriminação de isolados de uma mesma
espécie coletado de diferentes hospedeiros.
29
Espera-se que esse trabalho gere impacto científico para a
sociedade brasileira, visto que a instrução normativa IN-47 do
MAPA sobre inspeção fitossanitária do cacau está sendo
revisada atualmente, devido as recentes suspeitas de
contaminação de amêndoas de cacau vindo da África.
Metabolômica de clones resistentes e suscetíveis do
cacaueiro infectados por Moniliophthora perniciosa
(vassoura de bruxa)
Perdas de 70 a 90% da produção
Não existem genótipos totalmente resistentes
30
31
Ciclo de
desenvolvimento
do Moniliophthora
perniciosa no
cacau
L. M. Scarpari et al. J. Exp. Bot. 2005;56:865-877
Published by Oxford University Press [2005]
Fases da infecção do Moniliophthora perniciosa no cacau: genes
ativados, proteínas expressas e os metabólitos???
32
33
Interação planta-patógeno e produção de metabólitos
Metabólitos responsáveis pelos
sintomas
Metabólitos específicos de defesa
Metabólitos de defesa do cacaueiro
Germoplasmascontrastantes
Metabolômica da interação patógeno-
hospedeiro
Theobroma cacao vsMoniliophthora perniciosa
Genótipo resistente (Scavina-6)
controle inoculado
Fase assintomática
Fase sintomática
Genótipo suscetível (Catongo)
controle Inoculado
Fase assintomática
Fase sintomática
Delineamento Experimental
34
35
Delineamento Experimental
Mudas de cacau na casa de vegetação e na camara fria 24 h antes da inoculação
36
Delineamento Experimental
Inoculação de basidiósporos de M. perniciosa e sintomas em cacau
Cacao inoculado com M. perniciosa
Amostra do caule Maceração em nitrogênio liquido
100 mg do caule triturado extraído com 1 mL methanol.
1 µl do extrato analisado por LC-MS
Agilent 6550 Q-TOF/MS
SPE C18 ou cetrifugação/diluíção
Parametros ESI (+) Q-TOF
capillary voltage 3,5 kV
cone voltage 40 V
Cone gas 50 L h-1
desolvation gas 600 L h-1
desolvationtemperature
250 °C
Full MS scan m/z 50-1500
scan time 0.2 s
Preparo de amostra e análise por LC-MS
37
38
A B
Diferenciação estatística dos clones Scavina-6(resistente) e Catongo (suscetível) controle e inoculado(A) e biomarcadores dos clones
39
Metabólitos nas fases de infecção do SCAVINA-6 (resistente) pelo Moniliophthora perniciosa
40
AB
Fase 1: detecção/sinalização Fase 2: Resposta de defesa
Fase 1: detecção/sinalização
B
Fases de infecção do CATONGO (suscetível) infectado pelo Moniliophthora perniciosa
41Fase 1: detecção/sinalização
Fase 2: Resposta de defesa
Fase 3: Morte celular
42
Os resultados obtidos podem levar à melhor compreensão
dos níveis de resistência e suscetibilidade das variedades
de cacaueiro contra Moniliophthora perniciosa e revelar os
principais metabólitos de resistência do cacaueiro.
43
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Perfil molecular por espectrometria de massas
possibilitou a discriminação das fases de infecção de
clones resistentes e suscetíveis ao Moniliophthora
perniciosa e identificar os principais biomarcadores.
44
Modelo de negócio para agregação de valor:
Aproveitamento e uso sustentável do mel
de cacau
45
Cacau, chocolate, mel de cacau...
46
Mel de cacau
Alimentos
Adoçante (chocolate, alimentos...
bebidas
In natura
Isotônicos
Cervejas especiais
cosméticos
Sabonete liquido
Shampoo
Condicionador
hidratantes
47
Compostos bioativos do mel de cacau
48
49
Modelo de negócio:
Desenvolvimento de novos cosméticos
baseados em mel de cacau
Empresa Start up – S Cosméticos do Bem
50
Agradecimentos
Obrigado!!!