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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS

NOVAS TECNOLOGIAS EM VACINAS DE ANIMAIS DE COMPANHIA

Maria da Graça Uarth Caetano

Porto Alegre

2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS

NOVAS TECNOLOGIAS EM VACINAS DE ANIMAIS DE

COMPANHIA

Maria da Graça Uarth Caetano

Monografia apresentada à

Faculdade de Veterinária como

requisito parcial para obtenção

do grau de Especialista em

Análises Clínicas Veterinárias.

Orientador: Itabajara da Silva Vaz Junior

Porto Alegre

2011

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UNIVARSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

CURSO DE ESPECIALISTA EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS

Aluna: Maria da Graça Uarth Caetano

Monografia apresentada como parte integrante dos requisitos de avaliação do Curso de Especialista em Análises Clínicas Veterinárias.

Aprovado por:

........................................................................................

Professor Orientador – Itabajara da Silva vaz Junior

.......................................................................................

Professora Membro da Banca – Adriana Seixas

.......................................................................................

Professor Membro da Banca – Claudio W. Canal

Porto Alegre

2011

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Resumo

Avanços na tecnologia de produção das vacinas têm modificado a forma de abordagem da prevenção de doenças em animais de companhia, não apenas pelo surgimento de doenças emergentes que requererão nossa atenção, mas os métodos tradicionais de imunização deverão ser submetidos a um olhar crítico. O modo como a tecnologia de produção vacinal tem evoluído ao longo dos anos forçará os Médicos Veterinários a reverem seus conceitos de seleção e uso de vacinas. Assim como a ciência continua a redefinir nossa abordagem na prevenção de doenças, a tecnologia vacinal continuará como uma área de pesquisa inovadora e desafiadora dos próximos anos.

Palavras-chaves: recombinante, canino, felino, vacina, imunidade

Abstract

Advances in production of vaccines have modified the approach to prevention of diseases in pets. Not only the appearance of emerging diseases that require our attention, but traditional methods of immunization must undergo a careful look. The vaccine production methods have been improved and it will induce veterinarians to review the concepts of selection and use of vaccines. The science continues to redefine our approach to disease prevention and, the vaccine technology will continue as an important area research area.

Keywords: recombinant, canine, feline, vaccination.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 07

2 IMUNIDADE................................................................................................... 08

2.1 Imunizações: Ativa e Passiva............................................................................ 12

3 HISTÓRIA DA PRIMEIRA VACINA......................................................... 14

3.1 Revolução da Ciência....................................................................................... 15

4 OBJETIVO DAS IMUNIZAÇÕES.............................................................. 17

5 COMPONENTES DA VACINA................................................................... 19

5.1 Processamentos de vacinas............................................................................... 19

5.2 Vacinas para animais de companhia................................................................ 21

5.2.1 Vacinas atenuadas (vivas modificadas)............................................................ 22

5.2.2 Vacinas inativadas (mortas).............................................................................. 23

5.2.3 Vacinas recombinantes..................................................................................... 25

5.2.3.1 Vacinas recombinantes de subunidade............................................................. 26

5.2.3.2 Vacinas recombinantes de gene deletado......................................................... 30

5.2.3.3 Vacinas recombinantes vetoriais...................................................................... 31

5.2.3.4 Vacinas de DNA.............................................................................................. 35

6 CONCLUSÃO................................................................................................ 39

REFERÊNCIAS............................................................................................. 40

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Células fagocitárias do sistema imunológico: Neutrófilo, Mastócito, Macrófago.....................................................................................................

08

Figura 2. Diapedese...................................................................................................... 09

Figura 3. Estrutura Anticorpos IgG, IgA, IgE, IgD e IgM........................................... 10

Figura 4. Linfócito B.................................................................................................... 11

Figura 5. Linfócito T.................................................................................................... 11

Figura 6. Memória Imunológica.................................................................................. 12

Figura 7. Jenner inoculando Phipps............................................................................. 14

Figura 8. Produção de vacinas.................................................................................... 21

Figura 9. Vacina atenuada........................................................................................... 23

Figura 10. Vacina inativada.......................................................................................... 24

Figura 11. Esquema de produção de vacina recombinante de subunidade................. 29

Figura 12. Vacina recombinante vetorial...................................................................... 33

Figura 13. Esquema de produção de vacina recombinante vetorial............................. 34

Figura 14. Vacina de DNA-Equinos............................................................................. 38

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1 – INTRODUÇÃO

Nos tempos atuais, buscar informações sobre novos rumos na Medicina Veterinária se faz necessário uma vez que os animais de companhia são cada vez mais introduzidos nos grupos familiares. Neste aspecto, o papel do veterinário é fundamental como veículo de auxílio médico, assim como orientador e informador dos males que podem afetar os animais e, indiretamente, os humanos. A gama de doenças que envolvem os animais de companhia é extensa e precisa ser tratada com seriedade e responsabilidade, uma vez que a desinformação sobre prevenção de tais doenças por parte dos proprietários pode contribuir para a disseminação das doenças.

Além dos aspectos clínicos, tratamentos e também a prevenção de doenças infecciosas, através das imunizações, contribuem para o controle efetivo de doenças nos animais de companhia. As novas tecnologias em produção de vacinas seguras e eficazes num futuro próximo substituirão de forma efetiva as vacinas tradicionais. Apesar disso, ainda se utilizam as vacinas atenuadas e inativadas na grande maioria das atividades rotineiras das clínicas veterinárias, poucas utilizam uma vacina de tecnologia mais avançada, a vacina recombinante.

As vacinas tradicionais desempenham seu papel e conferem uma boa resposta imunológica desde que o hospedeiro esteja apto para responder satisfatoriamente através de um sistema imunológico competente. Efeitos adversos podem ser esperados uma vez que a produção destas vacinas necessita de adjuvantes e a presença do agente infeccioso vivo (atenuado) ou morto (inativado).

As vacinas recombinantes, através de sua tecnologia de fabricação que utiliza a biologia molecular, confere a vacina uma segurança efetiva, uma vez que o agente infeccioso sofre vários processos de neutralização do seu potencial infeccioso e com isso impossibilita o desenvolvimento da doença.

Portanto, na retomada de seus conceitos, Médicos Veterinários devem reformular seus protocolos vacinais, uma vez que com isso, certamente estarão contribuindo para uma geração de animais de companhia mais saudáveis e resistentes às doenças.

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2 – IMUNIDADE

O termo imunidade é derivado da palavra latina Immunitas, que se refere à proteção contra processos legais que os senadores romanos sofriam durante seu mandato. Historicamente, imunidade significava proteção contra doenças, em particular contra doenças infecciosas. As células e moléculas responsáveis pela imunidade formam o sistema imunológico e a sua resposta coletiva e coordenada à introdução de substâncias estranhas é chamada de resposta imunológica (ABBAS et al., 2008).

A imunologia, em sua forma moderna, é uma ciência experimental em que as explicações dos fenômenos imunológicos são baseadas na observação de experimentos. A evolução da imunologia como uma disciplina ligada a pesquisas dependeu de nossa habilidade em manipular as funções do sistema imunológico em condições controladas.

A primeira linha de defesa são as barreiras mecânicas compreendendo a pele e as mucosas. A pele é queratinizada impedindo a entrada da maioria dos microrganismos, já as mucosas, além de possuírem uma defesa em nível celular, eliminam secreções que irão combater e eliminar a maioria dos agentes patogênicos. Porém, devido a algumas injúrias na pele, essa barreira mecânica é quebrada entrando em ação a segunda linha de defesa que é a linha dos fagócitos. Os fagócitos são células com grande capacidade de fagocitose, ou seja, de englobar uma partícula para destruí-la (GUYTON & HALL, 1996).

Existem principalmente duas células fagocitárias, os macrófagos e os neutrófilos (Figura 1). Os macrófagos são células fagocitárias do tecido conjuntivo propriamente dito, tem origem nos monócitos (Figura 1) sanguíneos que migram para o tecido conjuntivo propriamente dito, crescem e vão constituir a segunda linha de defesa (USP, 2004).

(1) (2)

Figura 1: Células fagocitárias do sistema imunológico:Neutrófilo (1),Mastócito (2), Macrófago (3). Fonte: UNIFESP-Escola Paulista de Medicina: http://www.virtual.emp.br/material/tis/curr-bio/trab2004/2ano/imuno/index.htm

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Quando os macrófagos teciduais necessitam de auxílio contra o agente invasor, os neutrófilos, que são sanguíneos, migram em defesa do macrófago atravessando as paredes dos vasos por um processo conhecido como diapedese (Figura 2). Neste processo inflamatório, há uma resposta de defesa do organismo para que possa ocorrer a migração das células sanguíneas para o tecido conjuntivo. Durante sua função, os mastócitos liberam, entre outras moléculas, a histamina que é vasodilatadora, provocando a dilatação dos capilares e com isso favorecendo a saída dos neutrófilos para a região onde está ocorrendo à inflamação. A dilatação dos capilares facilita o extravasamento plasmático que dificulta para o agente agressor penetrar mais profundamente nos tecidos (GUYTON & HALL, 1996).

Figura 2: Diapedese. Fonte:Ivan Roitt, Fundamentos da Imunologia

A imunidade humoral é mediada pelas moléculas presentes no sangue e nas secreções das mucosas, chamadas de anticorpos que são produzidas pelos linfócitos B (Figura 3) (também chamados de células B). Os anticorpos (Ac) reconhecem antígenos microbianos, neutralizam a infecciosidade dos microrganismos e os preparam para serem eliminados por diversos mecanismos efetores. A imunidade humoral é o principal mecanismo de defesa contra microrganismos extracelulares e suas toxinas, pois os anticorpos podem se ligar a eles e ajudar na sua eliminação. Os próprios anticorpos são especializados e diferentes tipos de anticorpos podem ativar mecanismos efetores diferentes (Abbas et. al., 2008).

Neutrófilo

Vaso

Sanguíneo

Sítio de infecção

Oligossacarídeo

específico

Célula endotelial

Lectina

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Figura 3: Linfócito B. Fonte: UNIFESP-Escola Paulista de Medicina: http://www.virtual.emp.br/material/tis/curr- bio/trab2004/2ano/imuno/index.htm

Os anticorpos combatem microrganismos que tenham ultrapassado a barreira mecânica e escapado da resposta imune inata. Uma molécula de anticorpo possui uma estrutura básica composta de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Tanto as cadeias leves quanto as pesadas contêm uma série de unidades repetidas, cada uma com aproximadamente 110 aminoácidos, que se dobram em uma forma globular chamada de domínio da Ig. Alguns aminoácidos dessas alças são críticos para o reconhecimento do antígeno. Ambas as cadeias leves e pesadas possuem uma região aminoterminal variável (V) que participa no reconhecimento do antígeno e de regiões constantes HA carboxiterminais; as regiões C das cadeias pesadas possuem as funções efetoras (Abbas et. al., 2008).

Antígeno é toda partícula, seja ela, vírus, bactéria, protozoário, substâncias químicas, qualquer substância estranha ao organismo que seja capaz de estimular o sistema imunológico. Quando um agente infeccioso penetra em um organismo, existem vários detectores que irão desencadear a secreção de anticorpos específicos para este agente. O fato de que para cada antígeno existe um anticorpo específico é chamada especificidade (GUYTON & HALL, 1996).

Existem cinco classes de anticorpos, as imunoglobulinas IgM, IgG, IgA, IgD e IgE (Figura 3). A imunoglobulina IgG compreende 75% dos anticorpos séricos de um animal normal e a IgE, que constitui uma pequena porcentagem dos anticorpos mas está envolvido com a alergia. A classe IgM também é importante porque uma grande parte dos anticorpos produzidos durante a resposta primária é deste tipo. Estes anticorpos possuem 10 sítios de ligação, o que os torna eficazes na proteção do organismo contra invasores (GUYTON & HALL, 1996).

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Figura 4: Estrutura de Anticorpos IgG, IgA, IgE, IgD e IgM. Fonte: Ivan Roitt, Fundamentos da Imunologia

Muitas vezes, as células são invadidas por microrganismos, porém existe uma célula chamada de linfócito T citotóxico ou CD8 (Figura 5) que monitora estas invasões. Quando a célula CD8 reconhece uma célula que tenha sido invadida por um vírus ou que esteja alterada no caso de um tumor, o linfócito T se liga a esta célula e a destrói. Logo, a finalidade da célula CD8 é identificar células que não pertencem ao organismo, que tenham sido alteradas ou que sofreram uma infecção viral (UNIFESP, 2004).

Figura 5: Linfócito T. Fonte: UNIFESP-Escola Paulista de Medicina: http://www.virtual.emp.br/material/tis/curr- bio/trab2004/2ano/imuno/index.htm

A exposição do sistema imunológico a um antígeno estranho aumenta sua habilidade em responder novamente àquele antígeno. Respostas à exposição posteriores ao mesmo antígeno, chamadas de respostas imunológicas secundárias, em geral, ocorrem mais rapidamente, são de maior intensidade e, com frequência, são qualitativamente diferentes da primeira resposta, ou

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resposta imunológica primária ao antígeno (Figura 6). A memória imunológica é específica, pois cada exposição ao antígeno expande o clone de linfócitos específicos para cada antígeno. Além disso, a estimulação de linfócitos inativos pelos antígenos gera células de memória de longa duração. Essas células de memória possuem características especiais que as tornam mais eficientes na eliminação do antígeno do que os linfócitos naive que ainda não foram expostos ao antígeno (GUYTON & HALL, 1996).

Figura 6: Esquema da memória imunológica. Fonte: Abbas. Imunologia Molecular e Celular

2.1 – IMUNIZAÇÕES ATIVA E PASSIVA

Imunização ativa acontece quando há o contato direto com o antígeno e esta induz a resposta imune. A imunização pode ser natural ou artificial. A imunização é ativa natural porque houve contato direto com o antígeno que causa a doença. Imunização ativa artificial é o contato induzido pelo homem, em geral com o antígeno não patogênico. Um antígeno inofensivo (não patogênico) contém epítopos semelhantes aos apresentados por um patógeno que pode ser, por exemplo, um vírus ou bactéria que seja incapaz de causar doença. Sendo assim, uma reação é induzida no sistema imunológico contra epítopos inoculados. Quando um antígeno não atenuado entra em contato com o organismo que recebeu o antígeno atenuado, desenvolverá uma resposta imunológica mais rápida evitando assim, que desenvolva a doença

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porque já apresenta memória. Este é o princípio da vacinação. A vacinação é uma medida profilática porque faz com que o organismo combata o antígeno antes que este seja capaz de efetivamente provocar doença (NELSON & COUTO, 2006).

Imunização passiva é aquela em que o anticorpo é fornecido antes do animal ter contato com o Ag, por exemplo, no contato com veneno de um animal peçonhento, neste caso não a tempo do organismo reconhecer o antígeno e produzir os anticorpos, logo, é administrado o soro que é uma solução de anticorpos que foi produzido por outro animal. O antígeno atenuado é injetado em animais de laboratório e o sistema imune deste animal produz os anticorpos. Esses anticorpos são retirados e purificados e é produzido o soro que, com esses anticorpos, dará combate imediato ao antígeno peçonhento. Neste caso o organismo não é capaz de produzir células de memória (GUYTON & HALL, 1996).

A imunização passiva natural pode tornar um indivíduo imune pela transferência de plasma, é um método eficaz para conferir resistência rapidamente, sem que haja a necessidade de se esperar uma resposta imunológica ativa. Um exemplo de imunidade passiva é a transferência de anticorpos maternos para o feto, o que possibilita que os neonatos combatam infecções antes que adquiram a habilidade de produzir anticorpos. Esta imunidade passiva é conferida via amamentação e também passagem de anticorpo via placenta que protegerá o neonato até o final da lactação momento em que já está desenvolvendo seu sistema imunológico. Esta imunização dura um curto espaço de tempo suficiente para proteger o organismo do neonato (NELSON & COUTO, 2006).

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3 – HISTÓRIA DA PRIMEIRA VACINA

Em 1796, Edward Jenner, um médico inglês, num período de epidemia, observou que um número expressivo de pessoas mostrava-se imune a varíola. Todas eram ordenhadoras e tinham se contaminado com o cowpox, uma doença do bovino semelhante à varíola, pela formação de pústulas, mas que não causava a morte dos animais. Após uma série de experiências, constatou que estes indivíduos mantinham-se refratários à varíola, mesmo quando inoculados com o vírus. Neste período, Jenner inoculou Jammes Phipps, um menino de oito anos com o pus retirado de uma pústula de Sarah Nelmes, uma ordenhadora infectada com o cowpox. O garoto contraiu uma infecção extremamente benigna e, dez dias depois estava recuperado. Meses depois, Jenner inoculava Phipps com pus varioloso (Figura 7). O menino não adoeceu. Era a descoberta da vacina. A partir de então, Jenner começou a imunizar crianças com material retirado diretamente das pústulas dos animais. Em 1798, divulgava sua descoberta no trabalho Um Inquérito sobre as Causas e os Efeitos da Vacina da

Varíola (ABBAS et al., 2008).

Figura 7: Jenner inoculando Phipps. Fonte: http://pt.ars-curandi.wikia.com

Jenner enfrentou várias resistências. A classe médica demonstrava ceticismo. Os variolizadores, que na época tentavam provocar a doença de forma mais branda fazendo com que os não-doentes tivessem contato com roupas íntimas e objetos de pessoas doentes, fizeram ferrenha oposição. Grupos religiosos alertavam para o risco de degeneração da raça

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humana pela contaminação com material bovino: a vacalização ou minotaurização, como foi chamada. Mas, em pouco tempo, a vacina conquistou a Inglaterra. Em 1799, era criado o primeiro instituto vacínico em Londres e, em 1802, sob os auspícios da família real, fundava-se a Sociedade Real Jenneriana para a Extinção da Varíola (PLOTKIN, 2005).

A descoberta de Jenner logo se espalhou pelo mundo. A partir de 1800, a Marinha Britânica começou a adotar a vacinação. Napoleão Bonaparte introduziu-a em seus exércitos e fez imunizar seu filho. Nas Américas, chegou pelas mãos do médico Benjamin Waterhouse, de Harvard, popularizando-se, a partir de 1801, quando o presidente Thomas Jefferson foi vacinado (SAÚDE., 2011).

O imunizante chegou a Portugal em 1799, dentro de um pequeno frasco. D. Pedro, futuro imperador do Brasil e seu irmão foram inoculados. Em 1804, o marquês de Barbacena trouxe a vacina para o Brasil, transportando-a pelo Atlântico, por seus escravos, que iam passando a infecção vacinal, um para o outro, braço a braço, durante a viagem (SAÚDE.gov, 2011).

A oposição à vacina jamais cessou. Camponesas francesas recusavam-se a imunizar seus filhos na esperança de que a varíola lhes trouxesse tal degradação física, que os tornasse inaptos para o serviço militar e, portanto, para a guerra. Vacinadores eram obrigados a pagar para conseguir voluntários que se deixassem inocular, conservando o vírus vacinal. Para muitos a imunização causava repulsa, porque o fluido vacinal era conservado em jovens confiados a caridade pública, muitos portadores de doenças venéreas e outras moléstias. Foram registrados casos de sífilis, eripsela e hepatite B (está última doença ainda desconhecida) associados à vacina. Mas nada contribuiu tanto para a resistência a vacinação quanto as epidemias de varíola na década de 1820, quando um grande número de imunizados adoeceu. Descobriu-se então que a proteção não era eterna. Era preciso revacinar-se. Além disso, a conservação da linfa braço a braço não só adulterava o fluido vacinal, como, com o tempo, fazia com que este perdesse sua potência. A solução foi retornar ao vírus original: o da cowpox ou varíola das vacas. Apesar de toda a oposição a vacinação aos poucos foi se generalizando, mesmo que sob pressão governamental. Ela se tornou obrigatória na Baviera, em 1807, na Dinamarca, em 1810, na Suécia, em 1814, em vários estados germânicos, em 1818, na Prússia, em 1835 e, finalmente, na Inglaterra, em 1853 (SAÚDE.gov, 2011).

3.1 – REVOLUÇÃO NA CIÊNCIA

Em julho de 1885, chegava ao laboratório de Louis Pasteur um menino alsaciano de nove anos, Joseph Meister, que havia sido mordido por um cão raivoso. Pasteur que vinha desenvolvendo pesquisas na atenuação do vírus da raiva injetou na criança material proveniente da medula de um coelho infectado. Ao todo, foram 13 inoculações, cada uma com material mais virulento. Meister não chegou a contrair a doença. Em 26 de outubro, o

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cientista francês comunicava a Academia de Ciências a descoberta do imunizante contra a raiva, que chamou de vacina em homenagem a Jenner (SAÚDE.gov, 2011).

Louis Pasteur já era famoso quando salvou Meister. Desenvolvera pesquisa sobre fermentação, elaborando um método para a conservação da cerveja, a pasteurização. Formulou a teoria da origem microbiana das doenças. Comprovou que o carbúnculo era causado por um microrganismo e descobriu o estafilococo. Desenvolveu imunizações contra a cólera das galinhas e o carbúnculo no gado. As vacinas de Pasteur foram às primeiras obtidas seguindo uma metodologia científica. Portanto, o desenvolvimento racional de vacinas seguras e eficazes foi dado por Louis Pasteur e seus colaboradores. Pasteur observou que as bactérias de uma cultura de aviseptica Pasteurella parecia menos virulenta sobre o cultivo prolongado e que os animais inoculados com esta cultura estavam protegidos contra a cepa virulenta. Desde então, o princípio geral tornou-se para adaptar o patógeno em uma cultura in vitro e, posteriormente, testar sua eficácia e segurança através da vacinação de animais de laboratório. Quase que imediatamente após a descoberta de que utilizando bactérias atenuadas poderiam ser usadas como vacinas, se descobriu que, em alguns casos, bactérias mortas pelo calor também eram eficazes. Estes foram os pilares para o desenvolvimento de vacinas e muitas das vacinas atuais são baseadas nestes princípios (SCHTTERS, 2008).

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4 – OBJETIVOS DAS IMUNIZAÇÕES

Schatzmayr (2003) relata que os objetivos principais das imunizações são prevenir o desenvolvimento do quadro clínico do indivíduo e, ao se alcançar um nível de imunidade elevado em grandes segmentos da população, se obter o controle ou mesmo a eliminação de determinada doença. Em relação ao ser humano, essa eliminação foi alcançada nas Américas com a varíola e poliomielite. O desenvolvimento de vacinas depende fundamentalmente do conhecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na resposta às infecções, bem como dos mecanismos de patogênese das infecções.

As vacinas e kits de diagnóstico são importantes ferramentas para diagnóstico e prevenção de um grande conjunto de doenças que afetam a espécie humana e as espécies animais. Existem ainda diversos soros para tratamento, como os antiofídicos, antirrábico e antitetânico. Ao conjunto de vacinas e kits de diagnóstico denominamos produtos imunobiológicos. Sempre que seja tecnicamente possível e os estudos epidemiológicos demonstrarem a importância de uma dada doença ou um dado agente etiológico, a melhor forma de enfrentar o problema é por medidas profiláticas (CRAVEIRO, 2008).

Toxóides induzem a imunidade humoral, mas pouca ou nenhuma imunidade celular. Vacinas de vírus morto contêm componentes imunogênicos e as respostas imunes contra os componentes não imunogênicos são inteiramente irrelevantes para a prevenção de infecções e pode mesmo interferir e reduzir a resposta imunológica aos componentes imunogênicos. Podem também causar efeitos colaterais adversos devido aos componentes indesejáveis, tais como endotoxinas (WEGENER apud SHAMS, 2005).

Vacinas de vírus vivos atenuados e modificados são capazes de induzir imunidade humoral e celular mediada por respostas imunes, e nos últimos anos tem havido uma grande quantidade de pesquisas e debates sobre o atual protocolo e recomendações para a vacinação com vacinas de vírus vivos modificados (SHAMS, 2005).

Em veterinária, os estudos sobre vacinação abordam um amplo espectro de objetivos. Fornecer abordagens de custo eficaz para prevenir e controlar as doenças infecciosas em animais, para melhorar o seu bem-estar e para diminuir o custo de produção são os objetivos primários. Também, a vacinação em massa de animais tem sido considerada como um meio de prevenir a incidência de zoonoses. Além disso, devido aos programas de vacinação em massa, o consumo de diferentes medicamentos veterinários tem sido reduzido

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significativamente. Com a vacinação, além de melhorar o setor de saúde animal em si, também tem melhorado substancialmente a saúde pública. Embora o uso generalizado das vacinas, contribui consideravelmente para a melhoria da saúde pública e animal em todo o mundo, há deficiências graves e estão longe de ser perfeitas. Vacinas convencionais são geralmente onerosas para produzir, necessitam de adjuvantes e múltiplas doses para induzir imunidade ideal, pode interferir com os anticorpos maternos e, consequentemente, conferem pouca ou nenhuma proteção em recém-nascidos (CHAPPUIS apud SHAMS, 2005).

Atualmente o uso de vacinas em animais pode ser dividido nas seguintes classes: 1- vacinas para animais de produção, aqui se incluem vacinas aplicadas na forma injetável, típica para bovinos, suínos, ovinos e caprinos; vacinas injetáveis ou administradas na água, para peixes; vacinas administradas na água ou via aspersão, para aves; 2 – vacinas para animais de companhia, onde se incluem cães, gatos e equinos, são usualmente injetáveis, mas existem também de aplicação intra-nasal; 3 – vacinas para controle de animais silvestres que possam ser reservatório de microorganismos patogênicos para o homem, como é o caso da raposa em relação à raiva (CRAVEIRO, 2008).

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5 – COMPONENTES DA VACINA

Uma vacina é composta por diversos componentes. Antígeno: responsável por promover a resposta imune no organismo a ser protegido. É muito comum uma vacina conter diversos antígenos, de modo que com um manejo simplificado dos animais, podemos deixá-los protegidos contra diversas doenças; Adjuvante: é uma substância, como hidróxido de alumínio ou saponina, que aumenta a resposta imune; Conservantes ou estabilizantes: como por exemplo, o fenol e o timerosal. O timerosal é um conservante que contém mercúrio, é mais eficaz contra as bactérias, durabilidade melhor em prateleira, melhora a estabilidade da vacina, apresenta potência e segurança (CRAVEIRO, 2008).

5.1 – PROCESSAMENTO DE VACINAS

A produção industrial de vacinas envolve uma série de etapas. Para que se tenha uma produção eficiente, cada uma dessas etapas deve ser otimizada, para que o processo industrial resulte numa vacina com qualidade e preço competitivo (Figura 8). 1- Cepas: é essencial dispor-se de cepas eficientes, ou seja, que sejam produtoras dos antígenos de interesse. Essas estirpes devem passar por programas de melhoramento genético para serem cada vez mais eficientes. É fundamental estruturar de modo adequando o Banco de Cepas, de modo a não perder as características requeridas dos microorganismos, visto que eles representam um patrimônio da empresa; 2 – Cultivo em escala de bancada: nesta etapa estabelecem-se as melhores condições ambientais para o máximo crescimento celular ou de produção do antígeno de interesse (proteína). As condições a serem otimizadas, a depender do processo ser conduzido na presença de oxigênio (aeróbio) ou na sua ausência (anaeróbio), são: temperatura, pH, potencial redox, concentração da fonte de carbono, concentração de macro-nutrientes, concentração de micro-nutrientes. Algumas substâncias geradas no metabolismo microbiano, ao longo do processo fermentativo também podem precisar ter suas concentrações controladas, pois podem ser fontes inibidoras dos processos, aqui se inclui o amônio, o lactato, etc. Para que se alcance altas taxas de conservação dos substratos no produto desejado, o tipo de biorreator onde será conduzido o processo também pode ser um fator determinante da viabilidade do processo. Busca-se um comportamento cinético que assegure a máxima produção do produto de interesse, bem como que tal ocorra no menor

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tempo possível; isso é importante para que o volume dos equipamentos de produção, bem como o gasto com insumos, sejam os menores possíveis, de forma a contribuir para o menor custo de produção possível. Os biorreatores podem ser muito diferentes, principalmente quando se compara a produção das vacinas virais com as bacterianas. Biorreatores, dotados de sistemas de agitação são normalmente empregados para produção de vacinas bacterianas. A produção de vacinas virais é mais complexa, pois se tem que, inicialmente, produzir as células (de mamífero, tipo BHK, ou de insetos, como de Spodoptera frugiperda), para posteriormente infectar e promover a produção massiva de vírus. Diversos sistemas podem ser utilizados, desde biorreatores dotados de sistema de agitação, quando as células não precisam ficar ancoradas (caso da vacina anti-aftosa), ou sistemas ancorados (caso dos antígenos da vacina para proteção contra doenças do complexo respiratório/reprodutivo), como garrafas roller, bandejas “cell factories”, cubos “cell cubes” e biorreatores com micro-carregadores; 3 – Cultivo em escala industrial: nesta etapa, faz-se ajustes do processo para que o aumento de escala efetuado não implique em perda de eficiência. Para tanto, o próprio projeto do biorreator industrial deve ser feito mediante critérios adequados de escalonamento considerando relações geométricas, coeficientes de transferência de oxigênio, potência para a agitação fornecida ao meio líquido por unidade de volume, etc; 4 – Inativação do agente: para vacinas inativadas, é necessário proceder à inativação do agente, o que pode ser feito por via química ou térmica. Em ambos, os casos é necessário determinar a cinética de inativação, de forma a ter uma vacina inócua; 5 – Separação, purificação e concentração do produto: não basta produzir bem os antígenos de interesse, é necessário que as operações unitárias utilizadas no processo sejam eficientes, para que não se perca parte do antígeno nessas operações subsequentes; 6 – Formulação: Esta última etapa consiste em se adicionar o adjuvante e eventuais preservantes, de modo que a vacina tenha a máxima eficiência e seja estável por longos períodos de armazenamento. As condições de armazenamento são de 2 a 8°C. Existem vários tipos de adjuvantes comerciais utilizados em vacinas aquosas ou vacinas em emulsão. Alguns deles são de tal modo eficientes que pode-se obter a resposta imune desejada, mesmo com quantidades muito pequenas de antígeno; isto tem evidentemente um grande impacto no custo da vacina produzida; 7 – Controle de qualidade: Os controles de qualidade são efetuados durante o processo de produção e também no produto final obtido. Os controles de processo incluem o pH, confirmação de inativação, quantificação do antígeno e pureza (ou seja a ausência de outros microorganismos contaminantes). No produto final faz-se controle do pH, aspectos visuais, esterilidade/pureza, inocuidade e teste de potência. O teste de potência é feito através de métodos imunoquímicos: in vivo – realizado em animais de biotério (camundongos, cobaios e coelhos) e nas espécies-alvo para as quais a vacina é indicada; in vitro – ELISAs, soro-neutralização, Lf, ToBI, etc (CRAVEIRO, 2008).

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Figura 8: Produção de vacinas. Fonte:www.aen.pr.gov.br

5.2 – VACINAS PARA ANIMAIS DE COMPANHIA

As vacinas disponíveis comercialmente para uso veterinário são para combate de doenças virais e bacterianas; quando se refere aos parasitas, ainda não foram verificados produtos eficientes (CRAVEIRO, 2008).

Nelson & Couto (2006) relatam que vacinas estão disponíveis para algumas doenças infecciosas de cães e gatos e podem ser administradas para prevenir infecções ou limitar a doença. A vacinação estimula as respostas imunes, humoral, mucosal ou mediada por células. A resposta imune humoral é caracterizada pela produção de anticorpos das classes IgM, IgG e IgA, que são produzidos pelos linfócitos B ou plasmócitos, após a apresentação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos. A ligação do anticorpo com o agente infeccioso ou sua toxina auxilia na prevenção de infecções ou de doenças porque facilita a aglutinação (dos vírus), melhora fagocitose (devido à opsonização que é o processo que facilita a ação do sistema imune por fixar opsoninas ou fragmentos do complemento na superfície bacteriana, permitindo a fagocitose), neutraliza toxinas, bloqueia a ligação na superfície celular, inicia a cascata de complemento (é composto por proteinas de membrana plasmática e solúveis no sangue e participam das defesas inatas e adquiridas e promove a toxicidade celular dependente de anticorpos). As respostas dos anticorpos são mais eficazes no controle de agentes infecciosos durante a replicação extracelular ou a produção de toxinas. A resposta imune mediada por células depende, principalmente dos linfócitos T. Os linfócitos específicos para o antígeno podem mediar à destruição dos agentes infecciosos ou a eliminação dos antígenos pela produção de citocinas, que estimulam os outros leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos e células NK. A imunidade mediada por células é necessária para o controle da maioria das infecções associadas a células.

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5.2.1 – VACINAS ATENUADAS ( vivas modificadas)

Os processos de atenuação de virulência tradicionalmente utilizados para a obtenção de vacinas vivas se baseiam na passagem dos vírus em células de hospedeiros diversos e em diferentes condições e temperaturas, levando a seleção de mutantes menos virulentos, sendo frequentemente difícil definir com clareza os mecanismos dessa atenuação. Assim, por exemplo, nunca foi possível reproduzir as mutações que geraram a vacina contra a febre amarela, apesar de serem utilizadas as mesmas condições experimentais. O avanço da biologia molecular permitiu reconhecer algumas mutações envolvidas com a modificação de virulência de alguns vírus, como o da poliomielite, sendo este o mais bem estudado desse ponto de vista. O contínuo progresso da biologia molecular deverá permitir o desenvolvimento de partículas virais com modificações dirigidas que levem à criação de partículas atenuadas e estáveis, em condições de serem aplicadas como imunizantes (SCHATZMAYR, 2003).

Vacinas atenuadas geralmente apresentam uma massa antigênica baixa e raramente induzem reações no local de aplicação da vacina; podem ser administradas localmente (p. Ex., vacina intranasal de Bordetella brochiseptica atenuada) ou parenteralmente (p.ex., vacina para cinomose canina com vírus atenuado). Entretanto, essas vacinas são vivas e precisam se replicar no hospedeiro para estimular uma resposta imune (NELSON & COUTO, 2006).

Os autores também descrevem sobre as vantagens das vacinas atenuadas que se referem a proteção rápida, imunidade prolongada, podem requerer apenas uma dose, adjuvantes não são necessários, baixo custo de produção, induzem boa resposta mediada por células, induzem potencialmente respostas com IgA, importante na proteção de mucosas, e podem estimular a produção de interferon (uma proteína produzida por todos os animais vertebrados para defendê-los de agentes externos como vírus, bactérias e células de tumores); as desvantagens estão relacionadas à reversão potencial da virulência, virulência potencial para os imunossuprimidos, potencialmente imunodepressoras e efeitos adversos fatais, conservação mais difícil.

Azevedo (2002) descreve que neonatos são capazes de reagir imunologicamente a antígenos, porém a resposta é menor e lenta. O título de anticorpos maternos do neonato dependerá do título da mãe sendo a principal rota de transferência de imunoglobulinas, o colostro e a gema nas aves. Existem 2 a 18% de transferência de imunoglobulinas pela placenta, em carnívoros. Este título protege por algumas semanas, porém inativa as vacinas. O colostro deixa o neonato com títulos de anticorpos quase iguais aos da mãe, com o tempo, perdem-se em ordem: IgA, IgM e IgG. Quanto maior a ninhada, menor a quantidade de imunoglobulinas que cada um recebe. O autor coloca que veterinários podem utilizar doses repetidas de vacinas (com 2 a 4 semanas de intervalo) para suplementar o bloqueio dos anticorpos colostrais, isso, porém depleta mais rapidamente o nível de anticorpos circulantes. A indicação de vacinas atenuadas é em surtos, para a produção de imunidade de mucosa e

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para rotina de vacinação. Vacinas atenuadas existem contra parvovirose, cinomose, hepatite infecciosa, bordetelose, parainfluenza, panleucopenia, calicivirose, rinotraqueíte e raiva (Figura 9).

Figura 9: Vacina Atenuada. Fonte: Pfizer Saúde Animal

5.2.2 – VACINAS INATIVADAS (mortas)

As vacinas inativadas incluem vírus mortos, bactérias mortas (bacterinas) e vacinas de subunidades, são produzidas da mesma forma que as atenuadas, porém os agentes são desnaturados sem destruir a imunogenicidade. De modo geral, as vacinas inativadas requerem uma massa antigênica maior do que as vacinas atenuadas para estimular a resposta imune, uma vez que elas não se replicam no hospedeiro. As vacinas inativadas estimulam resposta imune de menor magnitude e menor tempo de duração do que vacinas atenuadas, a menos que sejam adicionadas adjuvantes. Os adjuvantes melhoram a resposta imune ao estimular a captação dos antígenos pelos macrófagos que os processam e apresentam aos linfócitos. Os adjuvantes podem causar ou potencializar os efeitos adversos da reação à vacina; a indução de sarcomas associados à vacina (ou ao sítio da injeção) pode ser um exemplo. A maioria das vacinas com adjuvantes estudadas em gatos induz reações piogranulomatosas que podem passar por transformação maligna para sarcoma nos tecidos moles (NELSON & COUTO, 2006).

O sarcoma pós-vacinal felino, também chamado sarcoma das partes moles, sarcoma de locais de injeção, é uma patologia de ocorrência crescente na clínica de pequenos animais e é um desafio para os médicos veterinários, pois é de difícil tratamento e potencialmente

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evitáveis. Desenvolve-se após a aplicação de substâncias injetáveis, principalmente vacinas. A formação de um nódulo no local da aplicação, em geral, é decorrente de uma resposta inflamatória desencadeada pela vacina, sendo considerada normal e até esperada em até 3% dos animais. Os nódulos pós-vacina costumam desaparecer em 15 dias, a não ser que evoluam para a formação de um granuloma, reação de hipersensibilidadede tipo IV ou tardia, no local da aplicação. Considere-se normal a persistência de um pequeno granuloma no local de aplicação por um período de três meses, desde que não evolua em tamanho e a partir de então, preconiza-se a realização de medidas diagnósticas precisas, como biópsia incisional e excisional (MARTINS, 2008).

No momento da fabricação das vacinas inativadas, os vírus ou bactérias são mortos utilizando-se um elemento químico, geralmente, a formalina ou fenol. Fragmentos mortos de microrganismos que causam a doença (geralmente bactérias e vírus) são colocados na vacina. Como os antígenos estão mortos, a potência vacinal o tempo é menor, resultando em imunidade com menor duração. Então, várias doses de vacinas são geralmente necessárias para fornecer a melhor proteção (ANDRADE et. al., 2003).

Para Azevedo (2002), calor e luz costumam destruir a antigenicidade das vacinas inativadas. As vantagens da vacina inativada em relação às atenuadas é o fato de não reverter à virulência, tem sua atividade aumentada com adjuvantes e maior estabilidade na estocagem. Como desvantagem, a vacina inativada precisa de, no mínimo, duas doses para conferir proteção, aumenta o risco de alergias, pela maior massa antigênica, duração da imunidade é mais curta, restrita às vias parenterais e, frequentemente, necessita de adjuvantes. Segundo Azevedo, está indicada na prenhez, animais debilitados ou imunossuprimidos e neonatos privados de colostro que não receberam soroterapia. Vacinas inativadas existem contra coronavirose, parvovirose, hepatite infecciosa, bordetelose, leptospirose, panleucopenia, calicivirose, rinotraqueíte, leucemia viral felina e raiva (Figura 10).

Figura 10: Vacina Inativada. Fonte: Merial do Brasil

5.2.3 – VACINAS RECOMBINANTES

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As práticas convencionais de desenvolvimento de vacinas têm sido, com o passar dos anos, substituídas por uma nova metodologia que aperfeiçoa as a produção de vacinas, tendo como base a identificação de alvos potenciais, formas mais eficazes de administração dos antígenos e apresentação destes as células do sistema imune. As vacinas convencionais, baseadas no patógeno inteiro, podem apresentar alguns riscos na administração, como o desenvolvimento da doença. Neste sentido, a engenharia genética vem despontando como alternativa para o melhoramento das vacinas já existentes e no desenvolvimento de novas vacinas, as chamadas vacinas recombinantes. Estas vacinas podem ser desenvolvidas de diversas maneiras, dependendo do antígeno em questão e do tipo de resposta imune que se busca desencadear contra ele (HARTWIG, 2006).

Para Juliano (2004), com os avanços científicos, uma nova geração de vacinas, conhecidas como recombinantes, decorrentes de manipulação genética, tem sido implementadas. Como estas vacinas não apresentam o patógeno íntegro, elas são altamente seguras e são capazes de centralizar a resposta do sistema imune em antígenos específicos que estão relacionados com a proteção imunológica contra a doença, ou seja, não é necessário expor o sistema imune a uma série de antígenos. Além disso, as vacinas recombinantes permitem diversas rotas de administração. Podem também funcionar como vacinas marcadoras, ou seja, podem ser usadas em conjunto com um teste diagnóstico que permite diferenciar o animal vacinado do animal que entrou em contato com o patógeno.

Conforme o autor, com o objetivo de regulamentar o uso das vacinas recombinantes, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA – United States Departament of Agriculture) as classificou em três categorias de acordo com a tecnologia utilizada:

Categoria I: Vacinas recombinantes de subunidade;

Categoria II: Vacina de genes deletados;

Categoria III: Vacinas vetoriais.

Além disso, a tecnologia recombinante também compreende as vacinas de DNA que estão sendo amplamente pesquisadas para uso, tanto em humanos quanto em animais (JULIANO, 2004).

Nos dias atuais vacinas recombinantes (indicadas com um “r” antecedendo o antígeno, p.ex. rCDV para o vírus da cinomose canina), encontram-se autorizadas e disponíveis para administração a várias espécies, incluindo cães, gatos, cavalos, furões e humanos. Diferentemente das vacinas com vírus morto ou com vírus vivo-modificado, pelo fato do agente patogênico não estar presente na vacina, não há possibilidade das vacinas recombinantes dos tipos I ou III induzirem a doença que pretendem prevenir. Fundamentalmente, o que distingue uma vacina recombinante das convencionais (vírus morto e MLV), é a habilidade da vacina recombinante em induzir uma resposta protetora utilizando apenas frações selecionadas do vírus ou bactéria patogênica. Na realidade, vírus vivos modificados (p.ex., CDV) e bactérias (p.ex., B. bronchiseptica) replicam-se no paciente e são

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capazes de causarem os sinais de infecção que a vacina pretendia prevenir. Além disso, a vacina de vírus vivo atenuado (p.ex., cinomose) replica-se no interior do hospedeiro e pode aparecer em locais distantes daquele onde fora inoculado (FORD, 2009).

A obtenção de uma molécula de DNA recombinante, através da ligação de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, é um processo relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma fração pequena de DNA total. Este é o caso encontrado comumente quando o objetivo é o isolamento de genes presentes em uma única cópia num genoma complexo, ou quando o objetivo é o isolamento de clones portadores do DNA complementar à RNA mensageiro raro. Deste modo, é claro que quando queremos clonar um determinado gene ou DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s) é necessário à obtenção de coleções de clones recombinantes, portadores de moléculas representantes de todo genoma, ou de coleções de clones de cDNAs derivados de toda a população de mensageiros da célula ou do tecido de interesse. Essas coleções de clones de DNA recombinante são chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genômica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genômico ou Biblioteca cDNA, no caso dos clones terem sido construídos a partir de DNA complementar (NASCIMENTO et al., 2003).

Conforme os mesmos autores o DNA de organismos superiores é bastante complexo: por exemplo, o genoma � infoide do mamífero é composto de aproximadamente 3x109 pares de base. Portanto se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreenderá somente uma parte em 106 de uma preparação do DNA total. De modo similar, uma espécie de RNAm particularmente rara pode compreender somente uma parte em 105 ou 106 da fração de RNA mensageiro de uma célula. Deste modo, para que seja garantida a presença na biblioteca de pelo menos uma versão de todas as sequências da população alvo, um dos pontos principais na construção de bibliotecas úteis é a obtenção de grande quantidade de clones. Embora a solução deste problema envolva estratégias específicas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs segue um procedimento básico bastante semelhante.

5.2.3.1 – VACINAS RECOMBINANTES DE SUBUNIDADES

As vacinas de subunidades podem ser superiores às vacinas inativadas que utilizam o microrganismo inteiro, porque somente as partes imunogênicas dos microrganismos são usadas. Isso reduz o potencial de reações vacinais. Produzidas por técnicas de biologia molecular, reduzem a alergenicidade. Essas vacinas contêm apenas os antígenos importantes para conferir imunidade. As vantagens da vacina de subunidade é que não provoca doença pós-vacinal, contém reduzida quantidade de proteína estranha e é mais potente. As desvantagens estão relacionadas à produção onerosa e dificuldades na manufatura. São especialmente indicadas em prenhez, animais debilitados ou imunossuprimidos e para diminuir a alergenicidade de vacinas inativadas ou quando as vacinas vivas causam doenças.

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Vacinas de subunidade existem contra leptospirose (envelope bacteriano), bordetelose (antígeno de parede celular), leucemia viral (glicoproteína gp70 e antígeno P45) e raiva (glicoproteína G) (AZEVEDO, 2002).

As vacinas de subunidade são baseadas em frações do microrganismo e estão entre as mais produzidas e administradas para prevenção de uma ampla gama de enfermidades. Atualmente, o exemplo clássico de vacina de subunidade é a vacina contra hepatite B humana, que vem sendo utilizada há vários anos. A substituição das purificações convencionais, mais trabalhosas e complexas, pela produção de proteínas recombinantes heterólogas, que apresentam maior rentabilidade com um custo menor, tem sido cada vez mais comum (HARTWIG, 2006).

As proteínas recombinantes heterólogas são produzidas tanto em organismos procariotos como em eucariotos e, uma vez expressas, podem ser rapidamente purificadas e administradas aos animais em altas concentrações. Isto, somado a novas estratégias de apresentação de antígeno e a uma nova geração de adjuvantes, aumentará significativamente o potencial destas subunidades de antígenos de induzirem uma imunidade celular e humoral (CLARK; CASSIDY-HANLEY apud HARTWIG, 2006).

A bactéria E. coli é um importante microrganismo utilizado na expressão de proteínas recombinantes. Uma ampla variedade de antígenos já foi expressa neste microrganismo. No entanto, em alguns casos a estimulação do sistema imune por estes antígenos pode ser variável, pois uma série de fatores pode intervir, tais como: características peculiares do antígeno, formas de apresentação destes ao sistema imune e via de imunização utilizada. Sistemas de expressão de proteínas baseadas em E. coli ou em leveduras, podem gerar uma conformação incorreta da proteína, acarretando ausência de epítopos conformacionais requeridos na produção de anticorpos neutralizantes e protetores no hospedeiro. Similarmente, a formação de agregados proteicos (corpúsculo de inclusão), comumente formados devido a níveis muito elevados de expressão, compromete a estrutura tridimensional nativa das proteínas. Em contraste, níveis baixos de expressão podem estar relacionados com a degradação das proteínas por proteases do hospedeiro, frequência de códon e toxicidade da proteína recombinante para a célula hospedeira e, além disso, a incapacidade destes sistemas de expressão efetuar modificações pós-traducionais e a dificuldade de expressarem estas proteínas para o sobrenadante do cultivo (HARTWIG, 2006).

Para sua fabricação, primeiramente deve-se conhecer os antígenos, ou seja, as proteínas imuno-protetoras do patógeno. Dentre estas, deve-se escolher aquela que seja crucial para a sobrevivência do microrganismo, para que a proteção adquirida com a vacina não seja prejudicada por mutações no patógeno. Com a escolha do antígeno, o DNA que codifica deve ser isolado e inserido em outro microrganismo, que sintetizará a proteína antigênica. O antígeno é posteriormente purificado e inoculado no animal, onde desencadeará uma resposta imune protetora (VAN KAMEM apud JULIANO, 2004).

Uma série de vacinas de subunidade baseadas no método recombinante vem sendo testadas na imunização contra vários patógenos, tanto na área médica quanto veterinária. A

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proteína MPB83 de Mycobacterium bovis foi clonada e expressa em E. coli, para desenvolvimento e avaliação de uma vacina de subunidade contra tuberculose bovina. A imunização via oral de suínos com a proteína recombinante FaeG, obtida de E. coli enterotoxigênica (ETEC), foi capaz de induzir imunidade sistêmica e de mucosas específicas contra a proteína heteróloga (HARTWIG, 2006).

Um exemplo de tecnologia de subunidade se refere À vacina RECOMBITEK® Lyme (MERIAL), que protege cães contra Borrelia burgdorferi, causadora da doença de Lyme, transmitida por carrapatos, composta pela proteína OspA da Borrelia burgdorferi em E. coli.

Age como vacina inativada e o processo de produção de uma vacina de subunidade é semelhante ao utilizado para produção de insulina recombinante para o tratamento de diabetes e fatores de coagulação. Este processo de produção é realizado obtendo-se DNA de Borrelia

burgdorferi, com parte que codifica para a proteína de superfície A (OspA), este DNA é inserido no plasmídeo, criando um plasmídeo recombinante que é inserido em uma E. coli. A E. coli é multiplicada em cultura e o plasmídeo recombinante proporciona a produção de OspA pela E .coli que é lisada se extraindo a OspA. A OspA é utilizada para produzir a RECOMBITEK Lyme, sem adjuvante (Figura 1) (SIMSON, 2009).

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Figura11: Esquema de produção da vacina recombinante de subunidade. Fonte: Simson

As bactérias são muito utilizadas para sintetizar o antígeno recombinante de interesse, pois muitas delas já estão bem caracterizadas e apresentam um baixo custo de manutenção. Algumas vezes, o sistema de expressão bacteriano não é recomendado quando o objetivo é a produção de vacinas de subunidade virais, pois células procarióticas não fazem as modificações pós-translacionais necessárias para a síntese de proteínas virais, fazendo com que as proteínas recombinantes produzidas tenham uma estrutura diferente das proteínas do patógeno e, por isso, não sejam capazes de induzir uma resposta protetora no animal (BABIUK, 1999).

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Existem estratégias para aperfeiçoar a produção de uma proteína recombinante como, por exemplo, promotores que aumentam os níveis de proteína sintetizada, sequências sinalizadas que fazem com que a proteína recombinante seja excretada pela célula facilitando a purificação do produto e técnicas que minimizam a degradação proteolítica da molécula de interesse. É também possível, através dessa técnica, desenvolver proteínas quiméricas contendo epítopos importantes de diferentes patógenos ou proteínas quiméricas contendo imunomoduladores, como citocinas, que podem aumentar a resposta imune desencadeada com a vacina de subunidade (BABIUK, 1999).

A Leucogen® (VIRBAC batch k242), outra vacina de subunidade disponível comercialmente apresenta um antígeno que é uma proteína não glicosilada derivada da glicoproteína de envelope do vírus da leucemia felina do subgrupo A, expresso também em E.

coli e administrado com adjuvante. Essa vacina pode proteger contra três subtipos do vírus da leucemia felina de forma eficaz (JARRET & CANIERE apud JULIANO, 2004).

As principais vantagens da vacina de subunidade é a segurança, menor competição antigênica, já que poucos componentes imunogênicos são encontrados na vacina, e a possibilidade de produzir vacinas contra proteínas importantes comuns para vários membros da mesma família de vírus (BABIUK, 1999).

5.2.3.2 – VACINA RECOMBINANTE DE GENE DELETADO

Deleções representam a retirada de um segmento genômico da partícula viral, com a consequente eliminaçãoda s´ntese de uma ou mais proteínas, reduzindo na atenuação da amostra para o hospedeiro. Essas proteínas podem ser responsáveis pela virulência da amostra ou por um mecanismo de fuga do sistema imunológico. Como muitas dessas deleções são de difícil restauração pelos vírus, considera-se que constituem um mecanismo seguro de se obter mutantes ainda imunizantes, porém de mais baixa virulência (BABIUK, 1999). As deleções têm sido mais facilmente obtidas em vírus maiores, nos quais ocorrem regiões não essenciais para a replicação (SCHATZMAYR, 2003).

Atualmente, não existem vacinas comerciais atenuadas pela deleção de genes para animais de companhia, porém pesquisas estão sendo feitas com sucesso usando-se esta tecnologia na tentativa de se proteger contra diversas doenças nestes animais, como por exemplo, contra coronavírus felino e herpes vírus felino tipo 1 (HAIJEMA, et al.; 2004).

Outra razão para se deletar genes de um organismo é a necessidade diferenciar animais vacinados de animais infectados, como no caso da vacina IBRAXION® IBRV (inativada) (MERIAL). Muito útil em programas de erradicação, essa vacina é composta por um herpesvírus bovino tipo 1, cepa ST, do qual foram deletados os genes que codificam para a proteína gE. Essa vacina induz a produção de anticorpos seroneutralizantes contra herpesvírus, protegendo os animais da doença, porém não induz produção de anticorpos anti-gE. Isso permite que, com um simples teste de

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anticorpos anti-gE os animais infectados sejam identificados como positivos, e os vacinados não positivos (SIMSON, 2009).

5.2.3.3 – VACINAS RECOMBINANTES VETORIAIS

As vacinas recombinantes em sua maioria utilizadas em medicina de animais de companhia são classificadas pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos como vacinas de categoria III, também chamadas de “vacinas por vetor”. Esses produtos são caracterizados pelo fato de segmentos definidos de DNA isolados do genoma de um vírus patogênico sejam recombinados com o DNA de um vírus vetor. O vírus vetor, que carrega o DNA recombinante, é em seguida administrado tais quais as vacinas de vírus. Apesar do vírus vetor não ter um papel destacado na imunização do paciente contra o vírus patogênico desejado, ele é efetivamente capturado pelas células apresentadoras de antígenos (p.ex., macrófagos e células dentríticas), que processam o antígeno recombinante e apresentam aminoácidos fundamentais (proteínas) a linfócitos. A ativação subsequente de linfócitos B e T culminam uma resposta imune humoral e celular direcionada especificamente contra as proteínas do vírus patogênico (FORD, 2009).

Os vetores podem ser tanto homólogos nos quais a espécie alvo da vacina é um hospedeiro natural para o vírus vetor, ou heterólogos, quando a espécie alvo da vacina não é o hospedeiro natural para o vetor. Essas proteínas do patógeno que são secretadas pelo vetor estimulam a produção de anticorpos ou são quebradas em pequenos peptídios que são transportados para a superfície celular levando a uma resposta celular por linfócitos T citotóxicos CD8. O sinal imunogênico pode ser ampliado quando o vetor vivo inicia múltiplos ciclos de replicação (ELLIS apud JULIANO, 2004).

Diversos tipos diferentes de vírus vetores de vacinas recombinantes estão sendo estudados neste momento. Retrovírus, adenovírus e herpesvírus, além de diversos poxvírus, são exemplos de vírus conhecidos para a atuação no papel de vetores vacinais. Hoje, o único vírus vetor utilizado em vacinas de animais de companhia é o vírus canaripox. Em geral, poxvírus são apropriados como vetores vacinais, pois o genoma destes é extenso e pode acomodar, em diferentes porções, múltiplas inserções de DNA de um organismo não relacionado. No entanto, é importante notar que nem todos os vírus vetores são iguais. Da mesma forma, nem todos poxvírus vetores partilham as mesmas características; este é um ponto importante, considerando as semelhanças das vacinas com novos vetores de poxvírus que estão em estudo e que podem ser introduzidas na medicina de animais de companhia em um futuro próximo (FORD, 2009).

Os vetores bacterianos apresentam um custo relativamente baixo, são de fácil manuseio e seguros, pois cepas bacterianas não patogênicas têm sido desenvolvidas e continuam atenuadas mesmo quando inoculadas em animais imunossuprimidos. Além disso, o tratamento com antibióticos é possível se alguma reação adversa acontecer durante os testes clínicos. Muitas vezes, esse tipo de vetor permite que a vacina seja administrada oralmente, e

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o tropismo de bactérias entéricas para o tecido � infoide associado às mucosas intestinais permite o desenvolvimento de imunidade de mucosa (SHATA et al., 2000).

É importante que os médicos veterinários entendam as vantagens clínicas por trás do uso de vacinas recombinantes em vez de mortas ou vivas atenuadas. Porém, é também importante entender as diferenças entre os vários tipos de vacinas recombinantes. Por exemplo, o vírus canarypox representa, particularmente, um vetor único quanto à segurança e eficácia. Desta forma, obteve a licença para uso em vacinas para equinos, caninos, felinos e furões. O fato importante é que, se comparado com vacina ou poxvírus de guaxinim, o vetor canarypox não possui a capacidade de se replicar em mamífero. O vírus canarypox é designado como um vetor não replicante. Desta maneira, não é esperado o desenvolvimento de anticorpos contra este vetor com o decorrer das vacinações. Além disso, vacinas com vetor canarypox mostraram a habilidade de promoverem uma resposta de reforço em cães e cavalos previamente vacinados com vacinas convencionais (FORD, 2009).

Bactérias e vírus têm sido muito estudados para sua utilização como vetores. Os vírus são excelentes vetores, pois infectam as células de forma eficiente, incluindo as células apresentadoras de antígeno (APCs) evitando, portanto, a necessidade de apresentação cruzada. Além disso, as proteínas do vetor podem atuar como potentes adjuvantes na imunização. A principal desvantagem decorre dos animais que são imunes ao vetor onde a memória imunológica limita a sua replicação reduzindo a resposta imune contra a proteína recombinante. Isto pode ser parcialmente contornado escolhendo-se um vetor o qual o hospedeiro não foi previamente exposto (BABIUK, 1999).

A escolha do vetor viral é determinada por muitos fatores, dentre os quais, o grupo de hospedeiros do vetor, replicação no alvo animal, expressão de antígenos estranhos, tamanho do genoma, indução da imunidade protetora, duração de imunidade, custo de produção, segurança e estabilidade do vírus recombinante, são alguns dos mais importantes (YOKOYAMA et al., 1997).

Tanto as vacinas vivas atenuadas quanto as vacinas recombinantes vetoriais induzem a formação de imunidade humoral e celular. Para alguns agentes infecciosos (como o vírus da cinomose canina), a intensidade da produção de anticorpos pós-vacinais apresenta boa correlação com o nível de proteção do indivíduo (imunidade). Para outros, a concentração sérica de anticorpos não se correlaciona bem com o nível de proteção, como no caso da leucemia viral felina (FeLV). Esta é uma das razões pela qual a determinação da concentração sérica de anticorpos e interferências sobre a imunidade do indivíduo deve ser analisada com cautela na dependência do agente infeccioso em questão. Por este motivo, estudos de imunização de indivíduos devem ser realizados com testes de desafio do microrganismo virulento, de modo a determinar de modo efetivo o grau de proteção conferido pela vacina (BRANDÃO, 2008).

Como exemplo, a vacina RECOMBITEK® Cinomose (Figura12). Nesta vacina, o vírus da cinomose tem seu RNA purificado, codificando-se para proteína F(fusão) e proteína HA (hemaglutinina), na sequência o RNA é reversamente transcrito para cDNA. Este cDNA é inserido no genoma do vírus da bouba de canário (ALVAC), criando a semente da vacina

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recombinante de cinomose. O vírus recombinante é multiplicado em cultivo celular e após o cultivo, este vírus recombinante é adicionado aos demais antígenos para produzir a vacina. Após a aplicação da vacina no cão por via subcutânea, o vírus penetra nas células do animal sendo o DNA viral transcrito e ao tentar se replicar na célula, inicia a produção das proteínas HA e F que são expressas pela célula do cão. As células do sistema imune do cão fagocitam as proteínas estranhas HA e F e as apresentam aos linfócitos, sendo assim, o cão desenvolve imunidade aos antígenos HA e F, ficando protegido contra cinomose (Figura13) (SIMSON, 2004).

Figura 12: Vacina recombinante vetorial. Fonte: Merial

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Figura13: Esquema de produção de vacina recombinante vetorial. Fonte: Simson

As vacinas vetoriais foram desenvolvidas na tentativa de buscar a eficácia e segurança testadas em várias espécies de mamíferos: baixa imunidade ao vetor, boa capacidade para inserção de vários genes adicionais, espectro estreito em hospedeiros, baixo risco, ciclo de replicação intracitoplasmático e termoestável. Como exemplo temos a PUREVAX®

(MERIAL) a nova vacina contra raiva para gatos é uma vacina sem adjuvante composta pelo vetor ALVAC que expressa o gene do vírus da raiva com ótimos níveis de segurança e proteção para os animais vacinados (JULIANO, 2004).

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A EURIFEL FeLV® (MERIAL), contra o vírus da leucemia felina, leva a imunidade protetora que se desenvolve a partir da expressão de antígenos env e gag num vetor ALVAC sem a necessidade da administração simultânea de adjuvante. Essa vacina mostrou-se eficiente para proteger animais expostos a cepas altamente virulentas. Além disso, ela pode ser associada a outras vacinas felinas sem interferir em sua eficácia como é o caso da vacina EURIFEL RCCP FeLV® (MERIAL) (POULET et al., apud JULIANO, 2004).

As vacinas baseadas em vetores têm suas limitações, pois tem como base os microrganismos vivos. Os vírus, por exemplo, utilizados como vetores neste tipo de vacina apresentam problemas quanto à proliferação, pois o crescimento de grandes quantidades destes organismos fora do corpo do indivíduo não é fácil. Bactérias também podem ser usadas como vetores vacinais. Neste caso o material genético inserido provoca a exibição de antígenos de outros microrganismos na superfície bacteriana, induzindo resposta imune. No entanto, são necessários vários ensaios com estes organismos para garantir a segurança na sua administração em humanos e animais, pois o principal problema das vacinas vetorizadas é a imunidade contra o vetor (vírus ou bactéria) (HARTWIG, 2006).

5.2.3.4 – VACINAS DE DNA

Em 1990, Wolff e seus colegas foram os primeiros a relatarem a expressão bem sucedida de DNA plasmidial no tecido muscular de camundongos. Alguns anos mais tarde foi relatado que a injeção de DNA codificando uma proteína antigênica do vírus da gripe conferiu imunidade camundongos. Vários trabalhos têm descrito e discutido a imunidade protetora induzida pelo DNA contra a grande variedade de vírus, bactérias e protozoários. Também tem sido investigada para o tratamento do câncer, doenças autoimunes. A administração de um simples plasmídeo pode induzir a um amplo espectro de respostas imunes. Eles incluem a ativação de linfócitos T CD8, implicado na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares através de linfócitos T citotóxicos e os linfócitos CD4, que secretam citocinas desempenhando papel na produção de células B de anticorpos específicos (DUFOUR, 2001).

Na última década, o grande avanço da biologia molecular permitiu a introdução de novas estratégias para a obtenção e a produção de antígenos e foram aprimoradas novas maneiras de se administrar e apresentar esses antígenos para as células do sistema imune. As vacinas gênicas ou de terceira geração surgiram com a introdução de genes, que codificam antígenos potencialmente imunogênicos, em vetores virais ou em DNA plasmidial (RODRIGUES, 2004).

O gene que codifica o antígeno de interesse é inserido num plasmídeo que é purificado e injetado por diversas vias no organismo, sendo que a mais comum é a intramuscular. O DNA é incorporado pelas células do animal vacinado e entra para o núcleo onde o gene do antígeno é transcrito, o mRNA é transportado para o citoplasma e, consequentemente o antígeno é sintetizado, secretado e apresentado associado à molécula de MHC de classe I na superfície

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celular para os linfócitos T de modo a desenvolver uma resposta imune protetora (ELLIS, 2001).

Um estudo avaliou fatores que determinam a eficiência da transferência do gene e da imunogenicidade conferida pela inoculação do plasmídeo. Posteriormente, a inoculação de DNA que codifica uma proteína imunogênica do vírus influenza conferiu imunidade protetora em camundongos (Kano, et al., 2007). A partir destes resultados, o entendimento sobre o mecanismo imunológico induzido por este tipo de vacina despertou interesse da comunidade científica.

O sucesso com imunização com DNA depende, principalmente, da natureza dos antígenos, da frequência e via de administração, da concentração de DNA administrada, da localização celular do antígeno codificado pelo plasmídeo (secretado, ligado à membrana ou citoplasmático), da idade do hospedeiro e da espécie dos animais vacinados (RAINCZUK, 2003).

As vacinas de DNA oferecem uma série de vantagens quando comparadas às vacinas clássicas, em termos econômicos e técnicos. O custo de produção das vacinas gênicas em larga escala é consideravelmente menor ao custo da produção das vacinas compostas de fração subcelular, proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos (WHALEN, 1996). O controle de qualidade é mais fácil, a comercialização não necessita de uma refrigeração, pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas (WAINE, 1995). Estes fatores facilitam o transporte, a distribuição e o estabelecimento de amplos programas de imunizações em regiões de difícil acesso, o que seria interessante para a realidade brasileira e de outros países em desenvolvimento (AZEVEDO, 1999).

A principal vantagem da vacina de DNA é que assim como as vacinas atenuadas ela induz a produção de anticorpos e de resposta imune celular, tanto de linfócitos T auxiliares (CD4) quanto T citotóxico (CD8). Adicionalmente as vacinas gênicas não são afetadas pelos anticorpos maternos, não apresentam risco de reversão da atenuação e podem ser produzidas contra agentes infecciosos de difícil cultivo e atenuação. A vacina pode ainda ser coadministrada para multiagentes ou multiepitopos de um determinado agente infeccioso (HAN, 1999).

Um dos vetores utilizados nas vacinas de DNA é o plasmídeo bacteriano, desenvolvido originalmente para expressão in vitro de proteínas em células de mamíferos. Os plasmídeos apresentam maior segurança biológica, baixo custo, fácil produção, relativa estabilidade e capacidade genômica de 2 a 19 kilobase, que podem ser transferidos para as células musculares (ULMER, 2006).

Os plasmídeos utilizados como vacinas devem conter os seguintes elementos essenciais:

• Um promotor de expressão para células de mamíferos

• Sinal de poliadenilação (poliA) do transcrito (mRNA)

• Um marcador de seleção

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• Uma origem de replicação procariótica

• Sítio de múltipla clonagem onde é inserido o gene de interesse.

Outras sequências também são importantes como intron que aumenta atividade do promotor, peptídio sinal e sequência de seis nucleotídeos com função imunoestimulatória (GLENTING, 2005).

A tecnologia DNA recombinante permite modificações nas sequências gênicas, objetivando a melhoria na resposta imunológica do hospedeiro, tais como incorporações de sequências imunoestimulatórias (ISS), sequências de genes que codificam interleucinas e gene virais que codificam proteínas que melhoram a propagação em células (KANO et al., 2007).

Apesar deste tipo de vacina ser eficiente em levar a formação de uma resposta imune celular, ela normalmente não desencadeia uma grande produção de anticorpos específicos. Esta técnica ainda é nova e mais estudos são necessários para que se entenda como o plasmídeo é agregado e como as células apresentadoras de antígeno estariam envolvidas. Um ponto que ainda está em discussão neste tipo de vacinação é a possibilidade do plasmídeo integrar-se ao genoma da célula do hospedeiro, levando a consequências indesejáveis, como por exemplo, a ativação de oncogenes, inativação de genes supressores de tumores, mutações e alterações nos cromossomos (LILJEQVIST & STAHL apud JULIANO, 2004).

Poderá haver riscos gerados com as vacinas de DNA, como a integração do plasmídeo ao genoma hospedeiro, gerando mutagênese pela ativação protoconcogenes ou pela inativação de genes supressores de tumor, estão sendo avaliados. Estudos têm mostrado baixa probabilidade de ocorrer integração do plasmídeo. Outros riscos incluem a indução de tolerância, devido à apresentação do antígeno em longo prazo, ou reações autoimunes devido à indução de anticorpos anti-DNA. Os níveis destes anticorpos têm aumentado de 20-30% em seres humanos, mas não induzem qualquer doença com os títulos apresentados, ao contrário do aumento de 100-1000 vezes detectado em pacientes com doenças autoimunes (HENKE apud KANO, 2007).

A vacina de DNA, no que se refere a recentes avanços para aumentar sua imunogenicidade, tem apresentado baixa imunogenicidade em primatas, entretanto duas vacinas foram recentemente licenciadas para animais, uma contra o vírus da febre do Nilo em equinos WEST NILE-INNOVATOR®DNA (Figura14) e a outra, contra vírus da necrose hematopoiética em salmão, APEX®-IHN (ULMER et al., apud KANO, 2007).

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Figura14: Vacina de DNA-Equinos. Fonte:Fort Dodge

Provavelmente, a falha de várias vacinas de DNA em induzir forte resposta imune é a pequena produção de antígenos, a liberação celular do DNA plasmidial e a estimulação ineficiente. Os esforços para aumentar estes aspectos da vacina de DNA aumentam sua eficácia em animais (ULMER, et al., 2006).

Portanto, a vacina de DNA, é um dos mais novos e mais promissores tipos de vacinas, apesar de não ter ainda resultados em seres humanos. Experimentos com animais mostram que a injeção intramuscular de plasmídeo contendo DNA “nu” resulta na produção da proteína modificada por esse DNA. Essas proteínas permanecem no organismo receptor e desencadeiam uma resposta imune. A segurança desse tipo de vacina é incerta, mas estão sendo consideradas muitas aplicações, especialmente contra câncer e vírus que possuem altas taxas de mutação como influenza e HIV (ANDRADE apud KANO, 2007).

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6 - CONCLUSÃO

Quando se fala em evolução, nos reportamos a mudanças de estilo, de conceitos. Para que as novas visões em todas as áreas do mundo sejam alcançadas, se faz necessário a mudança individual e coletiva dos indivíduos no que se refere ao desapego aos parâmetros convencionais.

Na medicina humana assim como na medicina veterinária, avanços significativos foram atingidos ao longo de décadas, demonstrando, através das pesquisas e descobertas, novas formas de tratamento de muitas doenças até então consideradas como incuráveis ou intratáveis.

O avanço tecnológico, principalmente dos produtos farmacêuticos tanto, para humanos quanto para animais, representa papel fundamental na cura e prevenção de doenças. Neste aspecto as novas gerações de vacinas produzidas através da biologia molecular estão despontando como proposta fundamental e promissora na prevenção de doenças infectocontagiosas.

As vacinas de tecnologia tradicional são ainda as mais utilizadas nos animais de companhia. Provavelmente, esta conduta protocolar esteja alicerçada a desinformação das novas propostas vacinais. Resta, portanto, estimular aos profissionais a busca de novos conhecimentos a respeito dos avanços tecnológicos e seus benefícios, visando o bem-estar animal.

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REFERÊNCIAS

ABBAS, A.K.; et al.; Imunologia Celular e Molecular. 6.ed. USA: Saunders, 2008.

ANDRADE, R.V.; ET AL., Vacinas: Novos Desafios Farmacêuticos. V.1, n.1, jan/mar 2003. Disponível em: http://www.saudeemmovimento.com.br/revista/artigos/cienciafarmaceutica/v1n1a7.pdf. Acesso em: 21 mar 2001.

AZEVEDO, João Sérgio Coussirat. Caderno de Medicina de Cães e Gatos. Canoas, 2002. p. 127-141.

AZEVEDO, V.; LEVITUS, G.; MIYOSHI, A.; CÂNDIDO, A.L.; GÓES, A. M.; OLIVEIRA, S. C. Mainfeatures of DNA based immunization vectores. Brazilian Journal of Medical and

Biology Research, Ribeirão Preto, v.32, n.2, p.147-153, nov. 1999.

BABIUK, Lorne. Broadenig the approaches to developing more effective vaccines. Vaccine. Canadá, v. 17, p. 1587-1595, 1999.

BRANDÃO, LEONARDO P.; Imunização rápida de filhotes de cães contra cinomose em condições de abrigo com o uso de Recombitek. Brasil, 2008. Disponível em: http://www.merial.com.br/veterinarios/caes_gatos. Acesso em: 08 mar 2011.

CRAVEIRO, Américo Martins. Biotecnologia e biossegurança na produção de vacinas e kits diagnósticos. Recife, v. 11, suplemento 1, abril 2008. Disponível em: http://www.veterinária-nos-trópicos.org.br. Acesso: 25 fev. 2011.

DUFOUR, VINCIANE. New applicattions for veterinary medicine. Service de Biologie Moleculaire, Agence Française de Sécurité Sanitaire dês Aliments (AFSSA), França, abr. 2001.

ELLIS, R. W.; New Vaccine Technologies. Massachusetts, USA, Landes Bioscience, 2001.

FORD, RICHARD B.; Vacinas não são todas iguais: Os benefícios da tecnologia Recombinante. Universidade da Carolina do Norte, Raleigh, Carolina do Norte, EUA, abril 2009. Disponível em: < http://www.merial.com.br/veterinarios/caes_gatos>. Acesso em: 08 mar. 2011.

GLENTING, J., WESSELS, S. Ensuring safety of DNA vaccines. Microbial Cell Factories, Barcelona, v.4, n.26, p.1-5, set. 2005.

GUYTON, A.C., HALL, J.E. Tratado de Fisiologia Médica. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara, 1996.

HAIJEMA, Bert J.; VOLDERS, Haukeline.; ROTTIER, PETER. J.M. Live, attenuated coronavirus vaccines through the directed deletion of group-specific gene provide protection

41

against feline infections peritonitis. Journal of Virology. Netherlands, p. 3863-3871, abril 2004.

HAN, R.; CLADEL, N. M.; REED, C. A.; PENG, X.;CHRISTENSEN, N. D. Protection of rabbits from viral challenge by gene gun-based intracutaneous vaccination with a combination of cottontail rabbit papillomavirus E1,E2, E6, and E7 genes. Journal of Virology, Princeton, v.73, n.8, p.7039–7043, ago. 1999. HARTWIG, Daiane Drawanz. Vacina recombinante de subunidade contra leptospirose: avaliação do potencial imunogênico de lipoproteínas. Centro de Biotecnologia Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2006.

JULIANO, Priscila Bianchi. O uso da tecnologia recombinante na produção de vacinas para cães e gatos. Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 2004.

KANO, FLORA, S.; VIDOTTO, O.; VIDOTTO, MARILDA C. Vacina de DNA: aspectos gerais e sua aplicação na medicina humana e veterinária. Seminário de Ciências Agrárias, Londrina, v. 28, n. 4, p. 709-726, out/dez 2007.

MARTINS, V.D.S., Sarcoma vacinal em felinos domésticos. Universidade Castelo Branco. São José do Rio Preto, São Paulo, 2008.

NASCIMENTO, A. C., et al., Tecnologia do DNA Recombinante. Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2003.

NELSON, R.W., COUTO, C.G. Medicina Interna de Pequenos Animais. 3. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006.

PLOTKIN, S. Vaccines: past, present and future. Nature medicine supplement. Pennsylvania, USA, v. 11, n. 4, abr. 2005. RAINCZUK, A.; SMOOKER, P. M.; KEDZIERSKI, L.;BLACK, C. G.; COPPEL, R. L.; SPITHILL, T. W. The protective efficacy of MSP4/5 against lethal Plasmodium chabaudi

adami challenge is dependent on the type of DNA vaccine vector and vaccination protocol. Vaccine, Kidlinton, v.21, p.3030-3042, 2003. RODRIGUES JÚNIOR, J.; LIMA,K. M.; FACCIOLI, L. H.; SILVA, C. L. É possível uma vacina gênica auxiliar no controle da tuberculose? Jornal Brasileiro de Pneumologia, Ribeirão Preto, v.30, p. 468-477, 2004.

SAÚDE.GOV. A história das vacinas: uma técnica milenar. Disponível em: < http://www.ccs.saúde.gov.br/revolta> Acesso em: 11 abr. 2011.

SCHATZMAYR, H.G. Novas Perspectivas em Vacinas Virais. História de Ciência e Saúde-Manguinhos. Vol. 10 supl.2. Rio de Janeiro, 2003.

SCHETTERS, T.P.M. Development of vaccines against of veterinary importance. In: VI SEMINÁRIO INTERNACIONAL DE PARASITOLOGIA ANIMAL, 2008, Boca Del Rio Veracruz, 2008.

42

SHANS, Homayoun. Recent developments in veterinary vaccinology. The Veterinary Journal. Texas, 07. 2004, p. 4.

SHATA, M., et al., Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors. In:______Molecular Medicine Today. Japão, ed. Reviews, v. 6, 2000.

SIMSON, C. V. Últimas notícias sobre vacinas recombinantes. In: VI Conpavet- Congresso Paulista de Medicina Veterinária. São Paulo, 2004.

ULMER, J. B., DONNELY, J. J. DNA vaccines for viral diseases. Department of Virus and Cell Biology, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, West Point, USA, n. 32, p. 215-222, nov. 2006. UNIFESP. Células e órgãos do sistema imune. Disponível em: http://www.virtual.emp.br/material/tis/curr-bio/trab2004/2ano/imuno/intro.htm . Acesso em: 25 dez 2010. WAINE, G. J., McMANUS, D. P. Nucleic Acids: vaccines of the future. In:______ Parasitology Today, Califórnia, v. 11, n. 3, p. 113-116, 1995. WHALEN, R. G. DNA vaccines for emerging infectious diseases what if? Centre National de la Recherche Scientifique, Paris, France, v. 2, n. 3, p. 168-175, 1996. YOKOYAMA, N., MAEDA K., MIKAMI T. Recombinant viral vector vaccines for the veterinary use. Departament of Veterinary Microbiology, Faculty of Agriculture, University of Tokyo, Japan, Pubmed.gov, maio 1997.