Praca poglądowa/Review

Nowe techniki kariotypowania molekularnegoprzydatne w rozpoznawaniu mikroaberracjichromosomów u dzieci z zespołami wad,opóźnieniem psychoruchowymi niepełnosprawnością intelektualną

Usefulness of novel molecular karyotyping techniques inidentification of chromosomal microaberrations in children withmalformation syndromes, psychomotor retardation andintellectual disability

Małgorzata Henkelman *, Krzysztof J. Piotrowski, Zofia Litwińska,Małgorzata Dera, Stanisław ZajączekSamodzielna Pracownia Cytogenetyki Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, Polska

p e d i a t r i a p o l s k a 8 8 ( 2 0 1 3 ) 5 5 5 – 5 6 0

i n f o r m a c j e o a r t y k u l e

Historia artykułu:Otrzymano: 15.07.2013

Zaakceptowano: 26.08.2013

Dostępne online: 30.08.2013

Słowa kluczowe:� kariotypowanie molekularne� chromosomy� mikroaberracje

Keywords:� Molecular karyotyping� Chromosomes� Microaberrations

a b s t r a c t

Precise cytogenetic diagnostics (e.g. FISH) in patients harboring chromosomal microaber-

rations is difficult, mostly due to a manifestation of similar clinical symptoms. Possible

cost of the diagnosis could be increased to an unacceptable extent which results in

resignation from further analyses. However these patients might account for the large

number of people in genetic counselors' offices; therefore they demand precisely ano-

maly-oriented further diagnostics. These problems could be usually solved by introduc-

tion of molecular karyotyping techniques (e.g. Real-time PCR, multiplex ligation-depen-

dent probe amplification, BACs-on-BeadsTM), which allow detection of different chromo-

somal microaberrations in a single DNA sample required for final diagnosis of genetic

syndrome, and thus seem to be very useful in patients suspected of harboring such an

aberration.

© 2013 Polish Pediatric Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All

rights reserved.

* Adres do korespondencji: Samodzielna Pracownia Cytogenetyki Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, ul. Połabska 4,70-115 Szczecin, Polska. Tel./Fax: +48 91 466 15 45.

Dostępne online www.sciencedirect.com

ScienceDirect

journal homepage: www.elsevier.com/locate/pepo

Adres email: malgorzata.henkelman@wp.pl (M. Henkelman).0031-3939/$ – see front matter © 2013 Polish Pediatric Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.pepo.2013.08.009

p e d i a t r i a p o l s k a 8 8 ( 2 0 1 3 ) 5 5 5 – 5 6 0556

Mikrodelecje i mikroduplikacje chromosomowe (CNV; copynumber variants) dotyczą około 12% ludzkiego genomu [1].W zależności od miejsca ich występowania (w sekwencjachkodujących, regulatorowych bądź niekodujących) mogą miećróżny, nie zawsze aktualnie jasno określony wpływ nafenotyp pacjenta, ale wiele z nich stanowi potwierdzonąprzyczynę zespołów dysmorficznych [2]. Mikroaberracjetakie mogą powstać de novo lub też jako wynik wcześniejistniejących w rodzinie rearanżacji chromosomowych(inwersje, translokacje) [3]. Niepełnosprawność intelektual-na, której etiologia jest często nieznana, występuje u 2–3%ogólnej populacji [4, 5], a jednak tylko mniej niż 50% takichosób ma postawione rozpoznanie [6, 7]; w tej grupie aberra-cje chromosomów są wykrywane jako przyczyna u 4–28%przypadków w zależności od kryteriów kwalifikacji pacjentai zastosowanych technik diagnostycznych [8].

Rutynowe techniki cytogenetyczne, które umożliwiająwykrywanie wielu aberracji w obrębie ludzkiego genomumają szereg ograniczeń wynikających z charakterystykibadanego materiału, zastosowanej techniki badania orazumiejętności wykonującego badanie cytogenetyka [9]. Najważ-niejsze ograniczenie badania związane jest z jego rozdziel-czością – w klasycznym badaniu cytogenetycznym możnauwidocznić aberracje o długości do 5–10 Mb (5–10 milionówpar zasad) w zależności od lokalizacji w genomie [10].

Wraz z wprowadzeniem fluorescencyjnej hybrydyzacjiin situ (FISH; Fluorescence in situ Hybridization) stało sięmożliwe celowane wykrywanie submikroskopowych niepra-widłowości przy użyciu komercyjnych sond i sprecyzowa-nym podejrzeniu znanych powszechnie zespołów klinicz-nych mikrodelecji [10–12]; jednakże u wielu pacjentów

Tabela I – Techniki cytogenetyczneTable I – Cytogenetic techniques

Metoda Zalety

Kariotyp klasyczny - wykrywa anomalie w całościgarnituru chromosomów

- wysoka specyficzność

FISH (Fluorescence in situ Hybridization) - możliwość detekcji poliploidiimonosomii, trisomii i wybranmałych delecji

- szybkość analizy (1–2 dni)MLPA (Multiplex Ligation- dependentProbe Amplification)

- szybkość analizy (1–3 dni)- niski koszt badania

QF-PCR (Quantitative FluorescencePolymerase Chain Reaction)

- szybkość analizy (3–4 dni)

BACs-on-BeadsTM -wyniki w mniej niż 48 godzin- niski koszt- prosta interpretacja- metoda umożliwia wykryciemikroduplikacji i mikrodelecjiużycia celowanych sond

Array-CGH (Array-ComparativeGenomic Hybridization)

- szybkość analizy (5 dni)- możliwość wykrywania bardzdelecji, duplikacji i amplifikac

- bardzo wysoka rozdzielczość b- nieprawidłowości wykrywanecałego genomu

wykazujących fenotypy nie do końca nakładające się naznaną fenomenologię kliniczną diagnostyka taka wymagałaczęsto wielu kolejnych badań FISH, co z uwagi na problemyfinansowe skutkowało jej zaniechaniem. Ponadto technikiFISH charakteryzują się o wiele większą skutecznościąw wykrywaniu mikrodelecji aniżeli mikroduplikacji – powo-dowało to zaniżenie liczby wykrywanych aberracji tegotypu.

Dalszy postęp w diagnozowaniu aberracji chromosomo-wych o mniejszych rozmiarach wniosły metody moleku-larne, takie jak ilościowy PCR (Q-PCR; Quantitative PCR;) czyMLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), umoż-liwiające wykrycie submikroskopowych wariantów liczbykopii (CNVs) z możliwością jednoczesnego zbadania wieluregionów w czasie jednej analizy [13].

Metody oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy, ilo-ściowy fluorescencyjny PCR (QF-PCR; Quantitative FluorescencePolymerase Chain Reaction;) i MLPA mają udokumentowanąprzydatność diagnostyczną i w wielu przypadkach zastępująstosowaną wcześniej metodę FISH [14] (Tab. I).

MLPA daje możliwość ilościowej oceny około 40 róż-nych sekwencji DNA w jednym badaniu i polega nahybrydyzacji specyficznej sondy zawierającej dwa wyzna-kowane fluorescencyjnie nukleotydy hybrydyzujące dodwóch sąsiadujących miejsc w specyficznej dla sondysekwencji badanego DNA, a połączenie hybrydyzowanychsond pozwala następnie na ich amplifikację w reakcji PCR[15]. Ilościowa ocena produktów PCR odbywa się w oparciuo ich długość i intensywność fluorescencji i umożliwiaocenę liczby kopii w określonym miejscu w badanej sek-wencji DNA [15, 16].

Wady

- ograniczona rozdzielczość (5–10 Mb)- ograniczona możliwość wykrywania mikroaberracji- możliwy brak wzrostu hodowli lub matczynakontaminacja

- długi czas hodowli (10–21 dni),ych

- konieczność stosowania celowanych sond

- mozaicyzm, poliploidie i rearanżacje zbalansowanenie są wykrywane

- dostarcza jedynie informacji dotyczącychograniczonej liczby chromosomów

bez

- poliploidie nie są wykrywane

o małychjiadania

w obszarze

- wysoki koszt badania- możliwość stwierdzenia nieprawidłowości onieznanym jeszcze znaczeniu klinicznym

p e d i a t r i a p o l s k a 8 8 ( 2 0 1 3 ) 5 5 5 – 5 6 0 557

Dostępne są komercyjne zestawy sond przeznaczone dodiagnostyki wybranych miejsc genomu, w których najczę-ściej pojawiają się mikroaberracje, a technika pozwalaróżnicować fragmenty DNA wielkości 130–480 pz (130–480par zasad).

Detekcję zmian rzędu 3 Mpz (3 milionów par zasad)umożliwia metoda porównawczej hybrydyzacji genomowej(CGH; Comparative Genomic Hybridization) [16] i jej dalszerozwinięcie, jakim jest hybrydyzacja do mikromacierzy(Array-CGH) ze znacznie zwiększoną rozdzielczością dopoziomu 15 kpz (15 tysięcy par zasad); technika ta zostałapo raz pierwszy opisana w 1997 r. [17].

Technika ta polega na hybrydyzacji badanego DNA doumieszczonych na mikropłytce badających sond komple-mentarnych do określonych fragmentów genomu, sondy terozmieszczone są z określoną gęstością. Stosowanie tej

Ryc. 1 – Zakres diagnostyczny mikroaberracji chromosomów rozBACs-on-BeadsTM

Oznaczenia czerwone – klasyczne mikrodelecje, mikroduplikacjOznaczenia niebieskie – zakres diagnostyczny metody KaryoLiteZgodnie z protokołem badania firmy PerkinElmerFig. 1 – Diagnostic chromosomes microaberrations range examined itechniqueRed mark – microdeletions, microduplicationsBlue mark – KaryoLite BoBs technique range of diagnosticAccording to the PerkinElmer protocol

metody jest jednak ograniczone ze względu na wysoki kosztpojedynczego badania, ograniczenie sprzętowe poszczegól-nych pracowni i konieczność udziału diagnostów o bardzowysokich kwalifikacjach [17, 18]. Przy zastosowaniu najwyż-szych poziomów rozdzielczości metoda ta nierzadko poka-zuje unikatowe zmiany liczby kopii DNA (delecje, duplikacje)o niejasnym znaczeniu klinicznym – niekiedy mogą to byćpolimorfizmy niezwiązane przyczynowo z obserwowanympatologicznym fenotypem. Tym samym metoda ta jestwciąż jeszcze zbyt rzadko stosowana w rutynowej praktyceklinicznej.

Najnowszą techniką wprowadzoną do użytku klinicznegojest zaproponowane przez firmę PerkinElmer kariotypowaniemolekularne metodą BACs-on-BeadsTM. Jest ona przezna-czona do szybkiego wykrywania typowych aneuploidii, naj-częstszych mikrodelecji i mikroduplikacji oraz aberracji

poznawanych w pojedynczej próbce DNA pacjenta techniką

e BoBs

n a single sample of the patient DNA by BACs-on-BeadsTM

Ryc. 2 – Delecja chromosomu 8 charakterystyczna dla zespołu Langera i Giediona wykryta techniką BACs-on-BeadsTM.Fragment zapisu badania całego kariotypu pacjenta (materiał własny)Fig. 2 – Deletion of chromosome 8 characteristic of Langer-Giedion syndrome detected by BACs-on-BeadsTM technique. Fragment ofthe whole patient karyotype (own material)

p e d i a t r i a p o l s k a 8 8 ( 2 0 1 3 ) 5 5 5 – 5 6 0558

subtelomerowych ramion krótkich i długich wszystkichchromosomów z pojedynczej próbki DNA pacjenta (Ryc. 1)[19].

Metoda ta charakteryzuje się co prawda mniejszą roz-dzielczością aniżeli Array-CGH, jednakże nieprawidłowywynik może być jednoznacznie powiązany z patologicznymfenotypem. Hybrydyzacja z poszczególnymi sondami jestsygnalizowana przez znaczniki barwne rozróżniane przezlaserowy odczyt w mikrokapilarze, który uwidacznia zmniej-szenie lub zwiększenie o połowę intensywności sygnału [20].Technika ta była pierwotnie przeznaczona dla diagnostykiprenatalnej i dostępna jest w tej chwili w 7 ośrodkacheuropejskich [21].

Okazała się ona jednak jednocześnie wysoce przydatnaw diagnostyce pacjentów podejrzanych o mikroaberracjechromosomów. Ogromną zaletą tej metody jest możliwośćjednoczesnej weryfikacji wielu spośród podejrzeń klinicz-nych w badaniu pojedynczej próbki w czasie około 48 godzini przy znacznie mniejszych kosztach aniżeli techniki QF-PCRi MLPA [21]. W naszej dotychczasowej praktyce technikiBACs-on-BeadsTM jak i techniki Array-CGH stosujemy w ruty-nowej diagnostyce pacjentów Poradni Genetycznej od 2 lat.Pozwoliły one na szybkie i proste technicznie zdiagnozowanie

Ryc. 3 – Delecja chromosomu 17 charakterystyczna dla zespołu

Fragment zapisu badania całego kariotypu pacjenta (materiał wFig. 3 – Deletion of chromosome 17 characteristic of Miller-Dieker synwhole patient karyotype (own material)

wielu mikroaberracji wśród naszych pacjentów, u którychniekiedy w ciągu wielu lat metodami klasycznymi nie możnabyło uzyskać rozpoznania. Przykłady wyników uzyskanychmetodą BACs-on-BeadsTM pokazano na rycinach 2, 3, 4.

Z uwagi na fenotypy tych pacjentów, które zwykle niekwalifikowały ich jednoznacznie do poszczególnych katego-rii diagnostycznych, rozpoznanie takie byłoby praktycznieniemożliwe przy użyciu metod celowanych, takich jakspecyficzne sondy FISH. Szczególnie zastosowanie technikiArray-CGH pozwoliło na uzyskanie rozpoznania u znacznejgrupy pacjentów, u których nie było to poprzednio możliwe(Ryc. 5), zwłaszcza dotyczy to zmian o charakterze duplika-cji, których wykrywanie techniką FISH okazuje się mniejskuteczne aniżeli wykrywanie mikrodelecji. Zaburzenia iloś-ciowe genów (niezrównoważenia) w obrębie poszczególnychsekwencji można następnie analizować pod kątem zawar-tych w tym obszarze genów i porównywać z fenotypempacjenta w odniesieniu do funkcji obecnych tam genów.Analizę taką można przeprowadzić przez odniesienie siędo baz danych opisujących lokalizację i charakterystykęobecnych w poszczególnych obszarach niezrównoważeniagenów. Znacznie rozszerzyło to możliwości diagnostyki anali-zy klinicznej wielu pacjentów o bardzo zindywidualizowanym

Millera i Diekera wykryta techniką BACs-on-BeadsTM.łasny)drome detected by BACs-on-BeadsTM technique. Fragment of the

Ryc. 4 – Delecja chromosomu 4 charakterystyczna dla zespołu Wolfa i Hirschhorna wykryta techniką BACs-on-BeadsTM.Fragment zapisu badania całego kariotypu pacjenta (materiał własny)Fig. 4 – Deletion of chromosome 4 characteristic of Wolf-Hirschhorn syndrome detected by BACs-on-BeadsTM technique. Fragment ofthe whole patient karyotype (own material)

Ryc. 5 – Wynik analizy techniką Array CGH; w obszarze mikroduplikacji wymieniono poszczególne geny obecne w obszarzeniezrównoważenia, które mogą mieć wpływ na charakterystykę kliniczną pacjenta (pacjent naszej poradni, analiza dr n.med. A. Jamsheer, Genesis, Poznań)Fig. 5 – Array CGH analysis technique result, in the microduplication listed specific genes present in the area of imbalance, which mayaffect the clinical characteristics of the patient (patient in our clinic, dr n. med. A. Jamsheer analysis, Genesis, Poznań)

p e d i a t r i a p o l s k a 8 8 ( 2 0 1 3 ) 5 5 5 – 5 6 0 559

fenotypie, u których poprzednio procedury diagnostycznetrwały kilka lat często bez większego efektu. Jednakżew przypadku unikatowych zmian wykrywanych w Array-CGH u około ¼–1/3 pacjentów obserwowanych odchyleń niemożna obecnie jasno interpretować w kategoriach patologiiczy też niechorobotwórczych polimorfizmów z uwagi naskąpą liczbę nagromadzonych do tej pory obserwacji w piś-miennictwie światowym.

Wnioski

1. Współczesne techniki kariotypowania molekularnego(MLPA, Array-CGH, BoBs) pozwalają na znaczne rozsze-rzenie zakresu diagnostycznego, możliwego do zrealizo-wania u dzieci z niepełnosprawnością intelektualną

i zespołami cech dysmorficznych; skracają czas badaniai zmniejszają jego koszty.

2. Wysoka rozdzielczość powyższych technik pozwala nauzyskanie danych niekiedy o rozdzielczościach wykracza-jących poza aktualnie dostępne klinicznie możliwościinterpretacyjne.

3. Nowe techniki molekularne już obecnie zastępują w wy-branych ośrodkach w praktyce diagnostycznej klasycznetechniki jak rutynowe kariotypowanie.

Wkład autorów/Authors' contributions

MH – koncepcja pracy, zebranie i interpretacja danych,analiza statystyczna, przygotowanie literatury. SZ – koncep-cja pracy, interpretacja danych, akceptacja ostatecznej

p e d i a t r i a p o l s k a 8 8 ( 2 0 1 3 ) 5 5 5 – 5 6 0560

wersji. KP – akceptacja ostatecznej wersji. ZL, MD – przygo-towanie literatury.

Konflikt interesu/Conflict of interest

Nie występuje.

Finansowanie/Financial support

Źródłem finansowania Pracy jest działalność statutowaSamodzielnej Pracowni Cytogenetyki Pomorskiego Uniwer-sytetu Medycznego w Szczecinie.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadamiDeklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymiwymaganiami dla czasopism biomedycznych.

p i �s m i e n n i c t w o / r e f e r e n c e s

[1] Łaczmańska I, Jakubiak A, Ślęzak R, Pesz K, Stembalska A,Łaczmański Ł, et al. Multiplex Ligation- dependent ProbeAmplification as screening test in children withdevelopmental defects and intellectual disability ofunknown etiology. Med Wieku Rozwoj 2011;15(2):132–139.

[2] Kozłowski P, Jasińska AJ, Kwiatkowski DJ. New applicationsand development in the use of multiplex ligation-dependent probe amplification. Electrophoresis 2008;29(23):4627–4636.

[3] Stankiewicz P, Lupski JR. The genomic basis of disease,mechanisms and assays for genomic disorders. GenomeDyn 2006;1:1–16.

[4] Roeleveld N, Zielhuis GA, Gabreels F. The prevalence ofmental retardation: a critical view of recent literature.Dev Med Child Neurol 1997;39:125–132.

[5] Yeargin-Allsopp M, Murphy CC, Cordero JF, Decoufle P,Hallowell JG. Reported biomedical causes and associatedmedical conditions for mental retardation among10-year-old children, metropolitan Atlanta, 1985 to 1987.Dev Med Child Neurol 1997;39:142–149.

[6] De Vries BB, van den Ouweland AM, Mohkamsing S,Duivenvoorden HJ, Mol E, Gelsema K, et al. Screening anddiagnosis for the fragile X syndrome among the mentalnyretarded: an epidemiological and psychological survey.Collaborative Fragile X Study Group. Am J Hum Genet1997;61:660–667.

[7] De Vries BB, White SM, Knight SJ, Regan R, Homfray T,Young ID, et al. Clinical studies on submicroscipicsubtelomeric rearrangements: a checklist. J Med Genet2001;38:145–150.

[8] Vermeesch JR, Fiegler H, de Leeuw N, Szuhai K, SchoumansJ, Ciccone R, et al. Guidelines for molecular karyotyping inconstitutional genetic diagnosis. European Journal ofHuman Genetics 2007;15:1105–1114.

[9] Łaczmańska I, Stembalska A, Ślęzak R, Kozłowska J,Makowska I, Czemarmazowicz H, et al. Rapid-FISH jakoszybka metoda wykrywania najczęstszych liczbowychaberracji chromosomowych w diagnostyce prenatalneju kobiet z grupy wysokiego ryzyka. Ginekol Pol2007;78:952–955.

[10] Sellner LN, Taylor GR. MLPA and MAPH: New Techniquesfor Detection of Gene Deletions. Hum Mutat 2004;23:413–419.

[11] Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW,Waldman F, et al. Comparative genomic hybridization formolecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science1992;258:818–821.

[12] Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D,et al. High resolution analysis of DNA copy numbervariation using comparative genomic hybridization tomicroarrays. Nat Genet 1998;20:207–211.

[13] Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J,Benner A, Döhner H, et al. Matrix-based comparativegenomic hybridization: biochips to screen for genomicimbalances. Genes Chromosomes Cancer 1997;20:399–407.

[14] Kirchhoff M, Bisgaard AM, Bryndorf T, Gerdes T. MLPAanalysis for a panel of syndromes with mental retardationreveals imbalances in 5,8% of patients with mentalretardation and dysmorphic features, includingduplications of the Sotos syndrome and Williams-Beurensyndrome regions. Eur J Med Genet 2007;50:33–42.

[15] Bocian E, Kasprzycka J, Jakubów-Durska K, Łuszczek A,Bernaciak J. Przydatność metody MLPA do szybkiejprenatalnej identyfikacji aneuploidii. Wyniki 409 badańdiagnostycznych. Ginekol Pol 2011;82:680–684.

[16] Gerdes T, Kirchhoff M, Lind A, Vestergaard Larsen G,Kjaergaard S. Multiplex ligation-dependent probeamplification (MLPA) in prenatal diagnosis-experience of alarge series of rapid testing for aneuploidy of chromosomes13, 18, 21, X, and Y. Prenat Diagn 2008;28:1119–1125.

[17] Coe BP, Olstra B, Carvalho B, Meijer GA, Macaulay C,Lam WL. Resolving the resolution of array CGH. Genomics2007;89:647–653.

[18] Gross SJ, Bajaj K, Garry D, Klugman S, Karpel BM, Roe AM,et al. Rapid and novel prenatal molecular assay fordetecting aneuploidies and microdeletion syndromes.Prenat Diagn 2011;31:259–266.

[19] Vilard F, Simoni G, Aboura A, De Toffol S, Molina Gomes D,Marcato L, et al. Prenatal BACs-on-Beads: a new technologyfor rapid detection of aneuploidies and microdeletions inprenatal diagnosis. Prenat Diagn 2011;31:500–508.

[20] Vialard F, Simoni G, Gomes DM, Abourra A, De Toffol S,Bru F, et al. Prenatal BACs-on-BeadsTM: the prospectiveexperience of five prenatal diagnosis laboratories. PrenatalDiagnosis 2012;32:329–335.

[21] Piotrowski K, Henkelman M, Zajączek S. Czy nowa technikakariotypowania molekularnego BACs-on-Beads zastąpiklasyczną cytogenetyczną diagnostykę prenatalną? Wynikiwstępne Ginekol Pol 2012;83:284–290.