Unidad I: Organización, Estructura y Actividad celular.

Núcleo y material genético.

La clonación es un procedimiento técnico mediante el cual se obtiene un nuevo individuo a partir de una célula, extraída de otro individuo ya existente; por lo que ambos tendrán idéntica carga genética.

Introducción.

C U R S O: BIOLOGÍA MENCIÓN

MÓDULO 7

La reproducción es una propiedad inherente a los seres vivos. De hecho, una de las definiciones posibles de “vida” implica autoperpetuarse. La concepción actual de la célula, indica que todas las células son hijas de otras células prácticamente idénticas.

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Figura 1. Vista de células eucarióticas almicroscopio óptico. Se puede observar unapequeña esfera que corresponde al núcleo.

1. Algunos antecedentes históricos:

Los primeros registros sobre el núcleo fueron realizados por Francis Bauer (1800) en orquídeas, sin ninguna percepción de su relación con la estructura celular. Robert Brown (1828), considerado el descubridor del núcleo celular, estableció su presencia en células eucariontes vegetales y animales (figura 1). Esta estructura contiene la información hereditaria, por lo que está involucrado en la transmisión del mensaje a través de las generaciones celulares y en su crecimiento y desarrollo.

Los cromosomas y la mitosis fueron descritos en la segunda mitad del siglo XIX. El redescubrimiento de los trabajos de G. Mendel en 1900, llevó a algunos investigadores como W. Sutton y T. Boveri, de acuerdo a observaciones realizadas en erizos, a plantear la existencia de una relación entre los cromosomas y los efectos en el desarrollo embrionario. T. H. Morgan y A. H. Sturtevant, (1910) trabajando en la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, establecieron que los genes, o factores de Mendel, que determinan los rasgos hereditarios, se encuentran en los cromosomas y distribuidos en forma lineal.

Las preguntas sobre la actividad nuclear en células que no están en mitosis, periodo de reposo aparente, lo que hoy conocemos como interfase en el ciclo celular, fueron planteadas en el ámbito del estudio del desarrollo embrionario. En otras palabras, ¿existe alguna relación entre la presencia de núcleo y la actividad celular?; ¿qué sucede con la capacidad del núcleo de generar individuos completos a medida que las células se especializan en distintos tejidos?

Hans Spemann publicó en 1938 los resultados de sus experimentos realizados con métodos simples de transferencia de núcleos en huevos de salamandra (anfibios con cola). Utilizando un cabello, hizo una ligadura en huevos recién fertilizados y separó el núcleo en un lado y el citoplasma en el otro (ver figura 2A). Después que las células nucleadas se dividieron 4 veces, es decir al estado embrionario de 16 células, soltó la ligadura y dejó pasar un núcleo hacia el citoplasma sin núcleo (ver figura 2B). Nuevamente apretó la ligadura separando así la nueva célula nucleada del resto del embrión. Una serie de divisiones celulares se iniciaron a partir de la célula aislada. Con este procedimiento obtuvo dos embriones gemelos, uno ligeramente más joven que el otro (ver figura 2C).

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Cada uno de nosotros es producto de una reproducción incesante a partir de una única célula inicial, que se formó en la unión de 2 células especiales: el óvulo y el espermio. Para hablar de reproducción celular debemos concentrarnos en el núcleo celular. En el núcleo de todas las células está contenida cierta información, como un mensaje, cuyas palabras corresponden a estructuras químicas.

Esta información tiene básicamente dos funciones:

1. provee las instrucciones que permiten el funcionamiento de la célula, y en conjunto del organismo.

2. sirve de patrón o molde original del cual se obtienen copias que perpetúan esta información en las células hijas.

El hecho que un núcleo de una célula obtenida de un embrión maduro pudiera controlar el desarrollo de un organismo completo, sustentó la idea de que la información genética no había disminuido con las divisiones celulares sucesivas. A partir de estos resultados, Spemann propuso, en 1938, “el experimento fantástico” de duplicar los organismos a partir de células especializadas, lo que hoy conocemos como clonación.

Joachim Hämmerling, biólogo danés, estudió la influencia del núcleo en la actividad celular (1943). Para ello utilizó el alga verde del género Acetabularia (Figura 3). Los individuos son unicelulares, y es posible identificar tres regiones en ellas: una región inferior, que parece un rizoide, o base, en la que se encuentra el núcleo celular; una región media o talo; y una región superior o sombrero. Tanto la base como el sombrero tienen formas que son propias de cada especie. El tamaño de las algas es de 4 a 5 cm de alto y el sombrero, cerca de 1 cm de diámetro. Hämmerling consiguió hacer cirugía en las algas, tal que pudo intercambiar los sombreros. Los sombreros así cambiados permanecieron algún tiempo en los talos, posteriormente luego de un corte las algas regeneraron los sombreros de sus respectivas especies. Conclusión, el control de la diferenciación del sombrero es dependiente del núcleo sobre el cual se realice el transplante.

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Figura 2. Demostración de Spemann de que los núcleos son totipotentes hasta el período de 16 células. Un cigoto continúa dividiéndose únicamente en la mitad que contiene el núcleo. Si se afloja la constricción en el período de 16 células, un núcleo puede escapar hacia el otro lado. Este núcleo todavía puede dar origen a un embrión completo, aunque su desarrollo estará retardado con respecto a la otra mitad. Según H. Spemann.

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Robert Briggs y Thomas King (1952) consiguieron el primer transplante exitoso de núcleos a partir de células embrionarias tempranas de Rana pipiens irradiadas con UV. Estos trabajos pioneros, además de confirmar la propiedad totipotencial de los núcleos de células de blástulas y gástrulas, abrieron el camino para estudios que llevaron a la clonación de ratones, monos, ovejas y otros mamíferos. J. Gurdon (1962) consiguió, en Xenopus laevis (rana africana), implantar núcleos de epitelio de intestino de la larva y obtener larvas y adultos. Estos últimos se produjeron en una proporción muy pequeña respecto del número inicial de núcleos transplantados (Figura 4).

¿Qué le sucede al genoma (es decir al conjunto de los genes de un individuo) cuando el huevo fertilizado, o cigoto, se desarrolla en un embrión?

Un cigoto es totipotente, o sea capaz de formar todos los tipos celulares del cuerpo. Conforme el huevo se divide, las células se diferencian o especializan en tejidos tales como hueso, piel o células intestinales, y pueden así realizar conjuntos de funciones distintas entre sí. Las hipótesis de cómo las células se diferencian, se reducen a dos: a.- las células pierden los genes a lo largo del

desarrollo, excepto aquellos que codifican las estructuras y tareas específicas, o

b.- ellas mantienen el genoma completo y activan o inactivan los genes en forma selectiva durante el desarrollo, mediante mecanismos de regulación de expresión génica.

Irradiacióncon luz UV

Óvulo sinfecundar

Óvuloenucleado

Renacuajo

Renacuajo

Adulto

Blástula

No división

Embrión anormal

MicroinyecciónDe Núcleo

Célula epitelialde intestino

Fig. 6.3Figura 4. Experimento de J. Gurdon (1962).

Figura 3. Una especie de Acetabularia tiene un sombrero en forma de sombrilla (A. mediterranea) y la otra tiene un sombrero rasgado (A. crenulata) propios de cada especie.

Las respuestas a estas interrogantes son motivo de intensa investigación. En esta guía nos referiremos a la organización del núcleo en periodo de no división (Interfase), en particular a la cromatina y estructura de cromosomas. El estudio del comportamiento de los cromosomas durante la mitosis y meiosis será objeto de análisis en las próximas guías.

2. El núcleo interfásico.

Algunos autores consideran al núcleo como un compartimento y otros lo consideran un organelo; a nosotros nos parece relevante que en la célula eucariótica es el lugar físico donde se encuentra el material genético o DNA, que es el responsable del control metabólico y de la continuidad de la vida.

En la célula eucariótica, el núcleo (Figura 5) tiene una doble membrana de similares características que la membrana celular (tiene dos bicapas o 4 capas de fosfolípidos), el tamaño y la posición es variable y depende de las necesidades de la célula; también el número de núcleos varía de acuerdo al tipo de células; en general se acepta que un determinante de esto es la necesidad de control metabólico por parte de la célula, por ejemplo, células hepáticas grandes pueden tener 2 o 3 núcleos, lo mismo ocurre con células musculares.

Figura 5. Núcleo celular interfásico.

En el núcleo interfásico se distinguen:

2.1. Envoltura nuclear. Llamada también carioteca, es una membrana doble, una de sus caras mira hacia el citoplasma y se observa la presencia de ribosomas adheridos con lo cual se postula como parte del sistema de endomembranas en la célula, ya que además se continúa con el retículo endoplasmático rugoso y con el liso. La cara interna de la membrana nuclear se relaciona con una proteína del citoesqueleto llamada lámina que le confiere la forma y estabilidad y permite que se inserten los “cromosomas” en lugares específicos. Además esta membrana nuclear está atravesada por el complejo del poro como se observa en la figura 6.

Figura 6. Anatomía general del complejo del poro.

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El complejo del poro es una estructura formada por varios tipos de proteínas que al final conforman una especie de canal que es capaz de regular el paso de

sustancias desde y hacia el núcleo, por ejemplo: permite el ingreso de nucleótidos; enzimas como la DNA polimerasa y de la ARN polimerasa (para la

transcripción del DNA o convertir los genes en RNAs); el ingreso de algunos carbohidratos, etc. Como también regula la salida de sustancias, por

ejemplo diferentes RNAs, entre ellos el RNA mensajero, el de transcripción y el ribosomal, y algunas ribonucleoproteínas.

2.2. La matriz nuclear o cariolinfa o nucleoplasma se refiere a la parte líquida del núcleo que en estado soluble puede tener minerales, nucleótidos u otro componente necesario para la conformación de la cromatina.

2.3. la cromatina presenta dos estados que es posible observar al microscopio: heterocromatina y eucromatina (Figura 7).

A) Heterocromatina: es la forma condensada en que se organiza la cromatina. Se ve como manchas densas de cromatina; frecuentemente está adherida a la membrana nuclear donde presenta espacios más claros sobre los poros de dicha membrana. Éstos permiten el transporte en ambas direcciones a través de la membrana. Las zonas de heterocromatina adosadas a la cara interna de la carioteca alternadas con las zonas claras le dan el aspecto de una rueda. La heterocromatina es considerada inactiva desde el punto de vista de la transcripción, es decir prácticamente no se está produciendo ningún tipo de RNA en las zonas heterocromáticas. Ello es consistente con la abundancia de heterocromatina en células en reposo, tales como linfocitos de memoria, los cuales se activarán al ser estimulados por una sustancia extraña o antígeno.

B) Eucromatina, tiene el aspecto de granulación fina y homogénea. Es más abundante en células que están en activa transcripción. La presencia de eucromatina nos lleva a inferir que, en las regiones donde ella se encuentra, el DNA está en procesos de replicación o transcripción. Estos procesos requieren que la cromatina esté relajada o “desenrollada”, de manera que exista el máximo contacto entre los compuestos del nucleoplasma, como sistemas enzimáticos que participan en la lectura del código genético, o sustancias que se incorporan a las cadenas de DNA, como son los nucleótidos.

Otro punto que debemos destacar al interior del núcleo es la presencia del nucléolo (Figura 7) que es una subestructura que no posee membrana de ningún tipo y que es realmente una porción bastante especial del DNA, ya que en ese lugar limitan los cromosomas que contienen genes para que se realice la transcripción de RNA ribosomal (rRNA); estas zonas especiales del DNA se llaman zonas organizadoras nucleolares (más conocidas como zonas o regiones NOR). La zona más densa que se observa a la microscopía electrónica corresponde a la acumulación de ribosomas y proteínas ribosomales en distintos estados de ensamblaje. El número de nucléolos que posea un núcleo depende de la cantidad de proteínas que tenga que sintetizar la célula, ya que el ribosoma es un organelo necesario para el desplazamiento durante la lectura del código genético como para la realización del enlace peptídico.

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Figura 7. Núcleo interfásico. La cromatina se encuentra al interior de la membrana nuclear, las zonas más claras corresponden a eucromatina y las oscuras a heterocromatina.

Figura 8. El ciclo resume eventos que ocurren entre

la fibra de cromatina y la formación del cromosoma.

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La cromatina como aparece en estas figuras, obtenidas al microscopio electrónico, presenta apariencias distintas dependiendo de la técnica de obtención. La apariencia de la cromatina observada en un corte de núcleo mostrará las típicas zonas descritas de granulación gruesa de heterocromatina y las zonas de granulación fina de eucromatina.Por otra parte, si la cromatina es obtenida entera, a partir de lisis por shock hipotónico de núcleos aislados, sin hacer cortes, entonces mostrará aspectos de filamentos y esferas unidos como cuentas en un collar. Las figuras 8 y 9 nos muestran cómo se organiza la cromatina desde las cadenas de DNA hasta la estructuración de los cromosomas. Éste es un proceso dinámico y reversible. Dinámico porque dependiendo de la diferenciación y actividad celular, habrá mayor o menor proporción de filamentos o de cromatina condensada. Reversible, por ejemplo, al entrar y salir de la mitosis, la cromatina recorrerá las etapas en uno u otro sentido, en cada ciclo celular.

La fibra de cromatina

A partir de la doble hélice de la molécula de DNA y con la incorporación progresiva de proteínas, se organizan las estructuras que forman la fibra de cromatina y desde ésta, los cromosomas. En la estructuración de la cromatina participa una familia de proteínas llamadas histonas. Estas proteínas se asocian en grupos de ocho unidades, es decir, en octámeros (2 H2a ; 2 H2b ; 2 H3 ; 2 H4 ). La molécula de DNA y los octámeros de histonas forman unidades llamadas nucleosomas. Los nucleosomas se encuentran separados en trechos regulares en los que el DNA está asociado a una molécula de histona llamada H1 (Figura 9). Lo que llamamos fibra de cromatina resulta por acercamiento y compactación de los nucleosomas entre sí. Cuando la cromatina se encuentra en su máximo grado de compactación (o enrollamiento) se le denomina cromosoma, y es observable durante la metafase mitótica.

Obviamente, las dimensiones aumentan en la medida que nuevos elementos se incorporan a la cromatina (ver valores en la figura 9). La fibra de cromatina forma asas o giros, de aproximadamente 300 nm, que se sujetan sobre proteínas de soporte que sirven de andamiajes. Varios de estos giros se repliegan sobre si mismos en sentido perpendicular a lo que será la cromátida del cromosoma. Los cromosomas no tienen ningún tipo de membrana.

3. La paradoja del valor C .Cada especie tiene un contenido de DNA característico, que es constante en todos los

individuos de esa especie y, por eso se le denomina valor C.La demostración de que todos los núcleos de un individuo tienen una cantidad constante

de DNA fue uno de los descubrimientos más importantes de la biología celular. Esto sugirió que el DNA contenía la información genética y demostró que durante la diferenciación de los distintos tejidos somáticos no hay pérdida de información. Esto se logró coloreando el DNA por la reacción de Feulgen y midiendo luego la cantidad de colorante en núcleos aislados con un microscopio especial. Todas las células de un organismo contienen la misma cantidad de DNA (2C), siempre que sean diploides. Los gametos son haploides y, por lo tanto, tienen la mitad de DNA (1C).

4. Cromosomas .8

Fig.ura 5

Figura 9. La secuencia de figuras a la izquierda corresponde a las estructuras inferidas a partir de las fotografías que se muestran a la derecha, obtenidas en el microscopio electrónico

Los cromosomas pueden presentar una o dos cromátidas, ello depende del momento del ciclo celular en que se les observe (se analiza en detalle en el estudio de la mitosis y meiosis). Cada cromátida tiene una sola molécula lineal de DNA bicatenario y sus correspondientes proteínas asociadas. Las cromátidas que forman un cromosoma se denominan hermanas, se mantienen unidas por una constricción primaria, el centrómero (Figura 10). Sobre el centrómero se sitúa una estructura en forma de semiesfera, el cinetocoro, lugar donde se anclan los microtúbulos del huso mitótico (ver figura 8). Ambas cromátidas hermanas son simétricas en todas sus características, porque contienen moléculas de DNA idénticas.

4.1. Clasificación de cromosomas:A) Según homología.

Cromosomas homólogos: son aquellos de igual tamaño, largo de brazos y composición genética. Cada célula normal tiene los cromosomas homólogos en pares (diploide), uno lo aporta la madre y el otro el padre.

Cromosomas no homólogos: son distintos entre sí. Los cromosomas homólogos y no homólogos pueden ser parecidos en tamaño y forma, pero la composición genética será distinta.

B) Según el largo de los brazos (Figura 11).

Metacéntricos: brazos iguales. Submetacéntricos: brazos perceptiblemente distintos. Acrocéntricos: un brazo mucho menor que el otro. Telocéntricos: el centrómero está en el extremo de las cromátidas.

C) Según sexo. Cromosomas somáticos o autosomas: son aquellos que determinan todas las

características somáticas de un individuo. En la especie humana corresponden a 22 pares.

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Figura 10. Componentes estructurales de un cromosoma obtenido en metafase.Las dos cromátidas se originan de una única cromátida, por lo que son cromátidas hermanas. El centrómero define segmentos de las cromátidas llamados brazos, cuya longitud puede ser distinta entre cromosomas no homólogos. El brazo corto es llamado p (del francés petit) y el brazo largo es q (letra siguiente en el alfabeto).

Figura 11. Tipos de cromosomas.

Cromosomas sexuales o heterocromosomas: son aquellos que intervienen en la determinación del género de un individuo. Están formados por un par, que en la especie humana se representan por las letras X e Y. La mujer tiene un par XX y el hombre un par XY. ¿Cómo determinan los cromosomas el sexo de un individuo? ¿Cuál es la característica clave?

Todos los hombres tienen un cromosoma Y. Pero, ¿cómo funciona? Se estudiaron cuidadosamente los cromosomas de individuos cuyos cariotipos resultaban inconsistentes con los rasgos propios del género. Algunas de estas personas se veían como mujeres pero tenían un cromosoma Y en su cariotipo. En forma similar, algunos individuos se veían como hombres pero tenían dos cromosomas X en sus células. La región del cromosoma Y que se adiciona o se pierde es llamada SRY (Sex determining Region on the Y). En ella se codifica el llamado Factor Determinante del Testículo o TDF. Ellos son los genes responsables de activar la diferenciación del tejido embrionario en testículo. Esta región puede ser transferida al cromosoma X durante la meiosis en un evento recombinatorio muy poco frecuente. El espermatozoide resultante lleva un cromosoma X, pero controla el desarrollo del embrión como un individuo masculino, puesto que él también va a contener la región SRY (Figura 12).

4.2. Condensación e inactivación del cromosoma X. La cromatina de Barr.

En el ser humano de sexo femenino, al igual que ocurre en todos los mamíferos, uno de los cromosomas X permanece condensado durante la mayor parte del ciclo celular.

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Figura 12. Presencia del gen SRY en el cromosoma Y normal. Posible recombinación al cromosoma X, determinando un individuo XX de sexo masculino.

Aparece como una masa que se tiñe intensamente con los colorantes nucleares, adyacente a la membrana del núcleo, llamada corpúsculo de Barr (por Murray Barr que lo descubrió en las neuronas del gato hembra). El corpúsculo de Barr solamente se encuentra en las células de la mujer y nunca en las del hombre, en condiciones normales. Esto permitió saber el número de cromosomas X de las células (Figura 13).

Por su parte, M. Lyon propuso que la cromatina de Barr corresponde a cromosomas X que están inactivos en la transcripción. Es decir los genes ubicados en un cromosoma X condensado no se expresan genéticamente. La hipótesis de Lyon se resume en que:

Todo cromosoma X en número mayor que 1 se condensa e inactiva. La inactivación X ocurre temprano en el desarrollo (día 16 en el hombre). La inactivación X ocurre al azar en una u otra célula. Existe la misma

probabilidad, en un organismo en desarrollo, que la inactivación sea del cromosoma heredado de la madre o del padre.

El mismo cromosoma X permanece inactivo en todas las células hijas de aquella en que primero se inactivó.

4.3. Cariotipos.Para estudiar la constitución cromosómica de un individuo, y, por extensión, los de

la especie a la cual pertenece, los cromosomas fotografiados de células detenidas en metafase, se ordenan de mayor a menor tamaño en parejas de homólogos. Este ordenamiento se denomina cariotipo. Luego se usa un segundo criterio que corresponde a la ubicación del centrómero, así en los primeros lugares se ubican los metacéntricos y al final, los acrocéntricos (todos de un mismo tamaño). Finalmente los pares homólogos se numeran (Figura 14).

Las figuras corresponden a cromosomas metafásicos en que se muestra sólo una cromátida. Note la posición de los centrómeros (flechas). Los más representativos del tipo metacéntrico, es decir en los que el centrómero está en posición equidistante respecto de los telómeros, se pueden identificar el 1, 3, 16 y el 20. La condición de metacéntrico es independiente del tamaño de los cromosomas. Observe los satélites en los cromosomas 13, 14 y 15. ¿A qué sexo representa este cariotipo? ¿Por qué?

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Detección de cuerpos de Barr Células humanas diploides. A.- 46, XY B.- 46, XX C.- 47, XXX D.- 48, XXXX E.- 49, XXXXX Figura 13. Fotografías que muestran la cromatina de Barr.

En un hombre normal no aparece, en una mujer normal se observa una marca en el núcleo.

Una técnica que ha hecho posible determinar con mejor precisión las posibles variaciones en la estructura de cada cromosoma es la llamada técnica de “bandeo”. Una vez detenidas las células en metafase mitótica, los cromosomas son tratados con colorantes que tiñen las cromátidas como líneas perpendiculares a su eje mayor (Figura 15).

Cada una de estas técnicas produce un patrón de bandas claras y oscuras (o fluorescentes versus no fluorescentes si se usa un colorante fluorescente) a lo largo del cromosoma. Un aspecto muy importante que aporta esta técnica es que cada cromosoma despliega un patrón de bandas único, podríamos decir que es análogo a un “código de barras”, lo cual hace posible diferenciar cada cromosoma de otros de igual tamaño y posición del centrómero. Los cariotipos ayudan a determinar el número, forma de cromosomas y variación del patrón de bandas. Ello es útil en el análisis comparativo de especies. A su vez, la existencia de algunas anomalías genéticas, que están dadas por la alteración del número, tamaño, forma y/o patrón de bandas de los cromosomas, tiene relación con la expresión de cuadros patológicos muy complejos que reciben el nombre genérico de síndromes (Tabla 1).

Tabla 1. Principales síndromes en el ser humano.

Anormalidades en el número de cromosomas en los humanos Frecuencia en la población.

44 A + XXY Síndrome de Klinefelter (Hombre). 1 / 2.000

44 A + XYY Duplo Y (Hombre). 1 / 2.000

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Banda G

Tinción normal

1 2 3

Figura 14. Cariotipo humano.

Figura 15. Muestra los pares de cromosomas humanos 1, 2 y 3 con y sin bandas G.

44 A + XXX Metahembra (Mujer). 1 / 1.000

44 A + XO Síndrome de Turner (Mujer). 1 / 5.000

45 A ( 21,21,21) + XX Síndrome de Down (Mujer). 1 / 700

45 A ( 21,21,21) + XY Síndrome de Down (Hombre). 1 / 700

El número de cromosomas de las especies de plantas y animales, en general, es propio de cada especie, pero no exclusivo de ellas. En otras palabras, más de una especie puede compartir el mismo número. Por lo que, si bien, el número de cromosomas es un elemento que es útil en la descripción de una especie, no la define como tal.

Figura 16: Número de cromosomas en diversas especies animales y vegetales

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