26.09.2014

1

Tema 4. Nucleul

Organizarea moleculara a

MG nuclear

Nucleul – functiile majore:• Păstrează ~ 98% din MG celular:

• 46 mol ADN compactizate;• compactizarea funcţională a ADN:

• eucromatina – MG activ pentru transcripţie;

• heterocromatina – MG inactiv pentru transcripţie.

• Controlul stabilităţii IG• ADNul este de regulă compactizat, asociat cu proteine

Micşorează, indirect, posibilitatea accesului f.mutageni

• Conţine diverse sisteme de reparaţie a ADNMicşorarea ratei de mutaţii

• Controlul activităţii celulei prin expresia diferenţiată a genelor:• transcripţia genelor codificatoare de proteine, de ARNr, de ARNt

• controlul processing-uli şi exportului ARNului în citoplasmă;

• Controlul diviziunii celulare şi transmiterii IG de la cel la cel:• Controlul replicării ADN dublării exacte a IG

• Controlul desfăşurării mitozei / meiozei

• Biogeneza ribozomilor• Sinteza ARNr

• Importul proteinelor ribozomale

• Formarea RNP 40S şi 60S

• Exportul RNP 40S şi 60S in citoplasma

26.09.2014

2

Organizarea nucleului• Anvelopa nucleară:

• membrana nucleară externă – lipoproteică• spaţiul perinuclear

• membrana nucleară internă – lipoproteică

• lamina nucleară – din proteine lamine A, B, C

• complexul porului nuclear – din proteine nucleoporine

• Cromatina (ADN+histone+nonhistone+ARN)

• eucromatina

• heterocromatina

• Nucleolii (ADN+histone+nonhistone+nucleoline +ARNr+proteine ribozomale + RNP60S şi RNP40S)

• Carioplasma

• partea labilă (sucul nuclear+enzime nucleare)

• Nucleoscheletul –proteine nucleoplasmine – matrine

• Transportine: exportine şi importine - karyopherine

CROMATINA CROMOZOMII

• !!! Cromatina – materialul genetic parţial compactizat în timpul interfazei celulei;

• !!! Cromozomul – materialul genetic maximal compactizat în timpul mitozei.

• Organizarea moleculară a cromatinei sau crs:

• 30% ADN +

• 40% proteine histone +

• 25% proteine nehistone +

• 5% ARN

profaza

telofaza

ADN cromozomial – ce deţine, păstrează, transmite şi realizează IG;

• Mol. lungi liniare;

• heterogene:• Secvenţe codificatoare (gene):

• Active - transcrise;

• Neactive - netranscrise.

• Secvenţe necodificatoare structurale:

• telomerii, centromerii, sateliţii;

• Secvenţe necodificatoare reglatoare – spaţiatori de gene, En, Sl,...

26.09.2014

3

ARNm ARNr metARNt

Transcripţie

Processing

gena insulinei Gena ARNr Gena miozinei Gena ARNt

insulina

Clasificarea funcţională a

cromatinei:• Eucromatina:

- segmente de cromatină active transcripţional;

- conţine ADN codant.

• Heterocromatina:

• segmente de cromatină inactive transcripţional,

• Conţine: • ADN necodant;

• ADN codant netranscris în momentul dat sau celula dată;

• poate fi constitutivă şi facultativă.

Heterocromatina• Constitutivă:

• Conţine secvenţe de ADN necodificatoare, repititive;

• Reprezintă regiunile centromerice, telomerice, ale

sateliţilor, spaţiatori ai genelor.

• Facultativă:

• Conţine secvenţe de ADN codant, dar inactive;

• Se poate transforma în eucromatină;

• Poate fi autosomală şi sexuală;

• Intervine în:• Diferenţierea celulară;

• Diferenţierea sexuală;

• Reglarea ontogenezei;

• Reglarea ciclului celular;

• Adaptarea celulei la condţiile mediului

26.09.2014

4

• Globulare

• Bazice, bogate în Liz şi Arg;

• Există 5 clase: H1, H2A, H2B, H3, H4

• Funcţia:• compactizarea ADN – nivelul nucleosomic

• reglarea nespecifică a expresiei genice

Tipul

histonelor

Amonoacizii

reprezentativi

Nr.

aminoaciziConfiguraţia proteinei

H1 Liz 215 NH2 COOH

H2A Leu, Liz 129 NH2 COOH

H2B Ser, Pro, Liz 125 NH2 COOH

H3 Arg, Cis 135 NH2 COOH

H4 Arg, Liz 102 NH2 COOH

Proteinele histone:

Proteinele histone

ADN + histone = nucleosom

a. Miezul nucleosomic:

2H2A

2H2B

2H3

2H4

b. 200p.n. ADN nucleosomic

c. H1 – stabilizeazăcomplexul DNP

octamer

histonic

Proteine nehistone• Proteine extrem de heterogene;

• Enzime nucleare:

• p/u replicare (ADN-polimeraza, primaza, ADN-ligaza, Helicaza, etc);

• p/u reparaţie (endonucleaze, ADN-polimeraza, ADN-ligaza, etc );

• p/u transcripţie (ARN-polimeraza, factori reglatori, etc);

• p/u processing-ul ARN (nucleazeribozime….);

• p/u biogeneza ribozomilor (ARN-pol, nucleoline, ribozime…)

• Proteine situs specifice (SAP, zinc-finger P…);

• Proteinele scafoldului – axului cromozomial

26.09.2014

5

Proteine non-histone

• Proteinele scaffoldului cromozomial

• HMG proteine / hidh mobility group protein

• Familia de proteine SMC – structural maintenance of chromosomes (formează coezina, condensina)

• Factori de transcripţie ale genelor de casa I, II şi III

• Enzimele de interacţiune cu cromatina (enzimele aparatului de transcripţie, de replicare, de recombinare, ale reparaţiei, inclusiv nuclease şi protease)

• Proteinele de tranziţie (ex.: testis specific protein)

• Insulatori (domain boundary factors celular memory modules – CMMs)

Helix-Turn-Helix

Zinc finger

Nucleul în diferite etape ale ciclului celular

26.09.2014

6

Nivele de compactizare a MG• I nivel – nucleosomic = filament de cromatină;

• II nivel – solenoid = fibra de cromatină;

• III nivel – bucle

• IV nivel – cromosomului metafazic

Nivele de compactizare a MG se deosebesc prin:

- gradul de “scurtare” a firului de ADN;

- grosimea f. de cromatină;

- mecanism de formare;

- grad de activitate transcripţională;

- perioada ciclului celular.

2 nm

11 nm

30 nm

300 nm

700 nm

1400 nm

I nivel - filamentul de cromatină:• Filamentul polinucleozomic de 11nm;

• Gradul de compactizare – x6 ori;

• Mecanismul de formare:

• interacţiunea ADN- cu proteinele histone bazice+

• Transcripţia ADN este posibilă.

dar

Modificarea histonelor:

• metilarea H3 (Lys4) – expresie activă a genei

• metilarea H3 (Lys9) – atenuarea transcripţiei

• acetilarea histonelor – relaxarea cromatinei, facilitarea transcripţiei

• dezacetilarea histonelor – condensarea cromatinei, inactivarea transcripţiei

• fosforilarea H1 – supracondensarea cromatinei

• defosforilarea H1 – decondensarea cromatinei

26.09.2014

7

II nivel – solenoidul

• Fibra de cromatină de 30 nm;

• Gradul de condensare – x40 ori;

• Mecanismul de formare:

• Fosforilarea H1 superspiralizarea

filamentului polinucleosomic – câte 6

nucleosomi per spiră;

• Transcripţia ADN-ului este blocată.

Filamentul de cromatină

Solenoid – 30 nm

Fibra nucleosomică

– 11 nm

III nivel - bucle

• Buclele pot fi mari sau mici, relaxate sau

compacte, 300nm grosime;

• Grad de compactizare – x600-1000 ori;

• Mecanism de formare:

• Ancorarea fibrei de cromatină de 30nm la axul

proteic – scaffold;

• interacţiune specifică SAR – SAP – scaffold

• Transcripţia genelor este blocată

26.09.2014

8

!!! SAR (MAR) - (Scaffold /Matrix Associated Region) – situsuri specifice de ADN responsabile de ancorarea fibrei de cromatină la scaffold - axul proteic cromozomial;

!!! scaffoldul - axul proteic cromozomial

!!! SAP (Scaffold Associated Protein) -proteine situs specifice ce interacţionează cu scaffoldul şi fibra de cromatină.

26.09.2014

9

IV nivel –

cromozom metafazic

• Grad maximal de compactizare – x10000ori;

• Grosimea cromatidei ~700nm;

• Mecanismul de formare:

• Fosforilarea lamininei --- disocierea anvelopei nucleare;

• Fosforilarea totală a H1 – condensarea cromatinei,

plierea buclelor în jurul axului cromozomial.

• Transcripţia este blocată

Perioadele ciclului celular şi

nivelul de organizare a MG

• Interfaza:

• Perioada G1 presintetică;

• Perioada S – sintetică;

• Perioada G2 – postsintetică;

• Mitoza:

• Profaza

• Metafaza

• Anafaza

• Telofaza

Nivel I,II,III

Nivel IV

26.09.2014

10

Interfaza

ProfazaPrometafaza

Metafaza

Anafaza

Telofaza

Didamica cromozomilor

ReplicareClivarea

centromerului

+

Perioada S Anafaza

C

r

o

m

a

T

I

d

a

c - centromer

c

t

t

t - telomer

crs MC crs BC crs MC crs MC

Crs MC - cromozsom monocromatidian

Crs BC - cromozsom bicromatidian

• Centromer = constricţie primară

26.09.2014

11

Centromerul

• Segment de heterocromatină constitutivă

• Secvenţe de ADN repetitiv, bogate în perechi A/T +

• Proteine histone

• Histona H3 este substituită cu CENP-A

• P. coezina - asigură unirea cromatidelor surori până

în anafază

• Funcţii:

• Uneşte cromatidele surori

• Asigură formarea kinetocorilor

• Intervine în interacţiunea cu fusul de diviziune

• Reglează segregarea crs în timpul mitozei / meiozei

Centromerul participă la unirea cromatidelor-surori

după replicaţie / separarea cromatidelor surori in

anafaza

Telomerul• Segment de heterocromatină constitutivă

de la capetele crs:

• Secvenţe de nucleotide bogate în G/C repetate

în tandem (la H. sapiens – [TTAGGG]n) cu

lungimea de 3-20 kb

• formează bucle la capetele ADN crs

• Proteine telomerice TFR1, TFR2, telomeraza

• Funcţii:

• Asigură rezistenţă ADN crs la atacul

exonucleazelor

• Previne scurtarea cromozomilor în timpul

replicaţiei

• Previne fuzionarea cromozomilor

(individualizează cromozomii)

26.09.2014

12

Nucleolul –regiunea nucleară responsabilă de biogeneza

ribozomilor:

• transcripţia genelor ribozomale cu sinteza

ARNr precursor (45S);

• Processingul ARNr 45S cu formarea a trei

fracţii de ARNr: 5,8S + 18S + 28S;

• Asamblarea complexelor RNP:

• ARNr 18 S + 33 proteine ribozomale = RNP40S –

subunitatea ribosomală mică;

• ARNr 28 S + ARNr 5,8 S + ARNr 5 S + 49

proteine ribozomale = RNP60S – subunitatea

ribozomală mare

26.09.2014

13

Organizarea moleculară a nucleolului:• Organizatorul nuclelolar – secvenţe de ADN cu

gene p/u ARNr;

• ARNr: transcripţi primari 45S; ARNr 5S, ARNr 5,8S, ARNr 18S, ARNr 28S;

• RNP 40S şi 60S

• Proteine histone;

• Proteinele aparatului de sinteză şi processing a ARNr;

• Proteine ribozomale.

Transportul prin porii nuclearimediat de carioferine=importine si exportine

• Import (din citosol în nucleu):

• Proteine histone

• Proteine nonhistone

• dNTP, NTP

• Proteine ribozomale

• Export (din nucleu în citosol):

• ARNm

• ARNt

• ARNsc

• RNP 40S; RNP 60S

26.09.2014

14

Funcţiile laminei nucleare

• Menţine forma nucleului

• Organizează cromatina

• Rol în replicare, transcripţie.

• Reglează ciclul celular

• Dezasamblează şi reasamblează

membrana nucleară