Universidad de Santiago de Compostela

Facultad de Medicina y Odontología

Departamento de Medicina

Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela

Laboratorio de Investigación 4

NUEVOS FACTORES EN LA HOMEOSTASIS DEL CARTÍLAGO

ARTICULAR.

ADIPONECTINA Y OBESTATINA

Tesis Doctoral

Rocío Lago Cabaleiro

2009

El Dr. Oreste Gualillo, investigador principal del Laboratorio de Investigación 4 del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, y el Dr. Juan Jesús Gómez-Reino Carnota, Jefe del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela y Profesor Titular del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN QUE: El presente trabajo que lleva por título: Nuevos factores en la homeostasis del cartílago articular. Adiponectina y Obestatina, realizado por Rocío Lago Cabaleiro en el Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela bajo nuestra dirección, ha sido revisado y está en disposición de ser presentado para optar al grado de Doctor en Biología. El Director de la Tesis: El Co-Director de la Tesis: Fdo. Dr. Oreste Gualillo Fdo. Prof. Dr. Juan J. Gómez-Reino Carnota

5

Agradecimientos Al haber llegado a este momento de la vida, en el que parece que se acaba una etapa y se abren las puertas de muchas otras, toca echar la vista atrás y meditar sobre el camino recorrido. Esto me lleva a pensar en todas las personas que me han acompañado y que han estado ahí, siempre, en cada momento, apoyando, ayudando, escuchando… Y me veo obligada a citarlos porque es necesario que sepan lo agradecida que les estoy por estar a mi lado, y porque sin ellos ni sería lo que soy ni estaría donde estoy. En primer lugar quiero agradecer esta tesis a mis padres. Sin vosotros no lo habría conseguido. Siempre me habéis apoyado, escuchado y aconsejado. Espero que estéis orgullosos de mí y de la persona en la que me he convertido. Lo he hecho lo mejor que he podido y que he sabido. Muchas gracias por todo. En segundo lugar quiero agradecer a mis directores la oportunidad de realizar este trabajo. Al Dr. Oreste Gualillo tengo que agradecerle el haberme abierto las puertas del NEIRID lab y haberme facilitado el contacto con el mundo científico, unas veces más agradecido que otras. El haberme facilitado la posibilidad de aprender todas las técnicas que he podido manejar a lo largo de estos años y el haberme enseñado muchas otras cosas al márgen del aprendizaje técnico, como su frase ‘saber, saber hacer y saber ser’. Al Dr. Juan J. Gómez-Reino quiero agradecerle el que haya formado y dirija una unidad de investigación de la envergadura de ésta. Gracias por haberme facilitado las cosas en la medida de lo posible y por haberme acogido en el grupo. Al Hospital Clínico y a la Fundación IDICHUS por hacer posible la investigación y colaborar en su desarrollo y mejora en este centro. Especialmente al Gerente, el Dr. J. Ramón Seoane Trigo, por la dedicación e ilusión con la que desempeña su trabajo cada día. Y a las chicas por estar ahí. También al Servicio de Reumatología, especialmente al Dr. Antonio Mera y a la Dra. Miriam Liz, por estar ahí y enseñarme tanto. Indiscutiblemente tengo que agradecerle a la Dra. Mª Soledad Ruiz su eterna amistad y apoyo. Gracias Sole por estar siempre ahí para mí, en las buenas y en las malas, especialmente en las malas... Por haberme introducido en el mundo de la ciencia, por ser tan entusiasta con los bichines y habérmelo transmitido, por ser mi mentor.

6

Gracias a la Dra. Maite Castaño, a pesar de habernos conocido en la etapa final de esta tesis me has enseñado mucho. Esas discusiones sobre qué estamos analizando y qué no. Me encanta esa capacidad tan necesaria de cuestionarlo todo, ese aspecto crítico tan sano del que tantos carecen... Y los chicos del laboratorio. Los que están y los que se han ido. Enumeraros a todos es muy difícil pero siento la necesidad de hacerlo, muchos habéis influído profundamente en mí, y si de alguno me olvido, espero que sepáis disculparme. Así que ahí va: Miguel, el Dr. Otero!, qué orgullo!!!. Muchas gracias por enseñarme tanto, prácticamente todo lo que sé. Por estar ahí, a mi lado, por ser tan paciente, y por las horas juntos, especialmente en el animalario… Chus y Rober. Me habéis enseñado muchísimo, de ciencia y de lo que no es ciencia. Cuántas horas a horas poco decentes y en días en que no se debería trabajar. La instalación radiactiva, los uptakes, los westerns... Gracias por vuestra paciencia y por haberme mostrado lo mejor en todo momento. Al 3, especialmente a Patricia, Marina, Julio, Eva, María y a Lens, por supuesto. Gracias por ser como sois. Por saber ser personas y amigos. Por vuestro apoyo, siempre. Por vuestros consejos. Por esas risas. Por todo. No dejéis de ser así, nunca. Ezequiel y Sonia. El que la sigue la consigue. Gracias por luchar y demostrar día a día que con trabajo todo es posible. ¡Y gracias por las pachangas! Chicha, gracias por todo lo que trajiste contigo. Algo se ha quedado pero ya no es lo mismo. Se te echa mucho de menos. Y no es sólo por los cumpleaños, jajaja, aunque también… Gracias por ser tú, por ser como eres, por ser mi amiga. Marta. Bufff, qué decirte… todo y nada. Eres increíble, ya sabes lo mucho que te quiero. Gracias por ser tú y por estar ahí, por ser mi amiga por encima de todo y quererme y aguantarme. Ruddy. Gracias por todos los nombres habidos y por haber. Por ser mi compañero y amigo. Por aguantarme cuando las cosas iban bien y cuando iban mal y cuando me dolía el ‘estruegamoooooooo Ruuuuuuuuuuuu’ jajajaja. Y por todas mis bandas sonoras ‘Rochi Rochi…’. Por estar siempre de broma, por los chistes, por las parodias, por las clases de patadas, por las ponzoñas, pomadas y movidas varias... Las horas en el animalario, a pesar de lo mal que lo pasas, siempre que has podido me has acompañado... Eres el mejor compi de lab que podría tener, yo y cualquiera. Te quiero un montón, pero que no se te suba, que luego no hay quien te aguante! Anna Iacono y Cecilia, gracias por ser mis amigas en tan poco tiempo. Vero, Bea, Carmen, Paula y Ana. Para mi sois las niñas. Gracias por ser la alegría de los laboratorios, por estar ahí siempre.

7

Isi. Gracias por todos esos momentos de confe, por todas las charlas, por el buen rollo, por hacer lo que hiciste y haber conseguido tanto… Poto, por esos momentos de pitillo, la compañía y el buen rollo, gracias por tu alegría. Anita y Samu del 5, Bruno, Toño, Sandra, Diego y Lilian del 1, Julio, Rebeca, Marián, Elisa, Cristina, Manolo, Isabel, Yoli, Inés del 2,… gracias por la compañía. Sulay, Chus, Omar, Richi, Martha L.,... la gente de Fisio, por esas horas en el animalario, por ayudarme, acompañarme y enseñarme sobre ratas. Stela, Maite, Manuel, Darío y Lucas, por ayudarme en Vigo, con el Luminex... Y mis amigos. Los de Santiago y los de Redondela. Loli y Liz que siempre habéis estado ahí, a pesar de la distancia y del tiempo, gracias por ser mis amigas. Migui, esas partidas, qué bien para desconectar... Vane, por ser mi amiga, pase el tiempo que pase, a pesar de todo, siempre estás ahí, no cambies nunca. Adri, Luz, Alex, Piti... lo que la carrera ha unido... esos mails, esas quedadas fugaces, esa preocupación mutua porque todo nos vaya bien. Yago y Susana por esos mails, por mantener el contacto y estar ahí. Rocío, mi Ro, mi rubia favorita, mi amiga. Todas esas tardes, los mails, las rajadas en común, gracias por quererme y apoyarme. Gracias a mi hermana, Carmen, a mis tíos Pedro y Berto, a mis abuelos, a Nulla, (siempre pienso en ti, formarás parte de mi vida siempre…) y a toda mi familia. Gracias por estar siempre ahí. A Kira y a Tico, gracias porque vosotros nunca me habéis fallado. Eso es ser incondicional. Por aguantarme, mimarme y levantarme el ánimo cuándo nadie más puede. Y por último, pero no menos importante, gracias a Toño. Mi marido. Gracias por ser como eres, por tu mala ostia, por tu cariño y comprensión, por tu paciencia. No habría podido sin ti, eres lo más importante. Te quiero. Gracias a todos los que habéis hecho que esta tesis sea posible, a los que me habéis apoyado en esta hazaña.

Índice

Índice

11

ÍNDICE

Agradecimientos 5

ÍNDICE 9

I. INTRODUCCIÓN 15

1. La articulación. 17

1.1 El cartílago articular. 17

1.2 El condrocito. 18

1.3 Patologías del cartílago articular. 20

1.3.1 Artritis reumatoide. 20

1.3.2 Artrosis. 24

2. El sistema del óxido nítrico en el cartílago articular y otros tejidos. 25

2.1 El óxido nítrico. 25

2.2 La nitróxido sintasa tipo 2. 26

2.3 Inducción de NOS tipo 2 y producción de NO. 27

3. Adipoquinas y cartílago articular. 28

3.1 Leptina y cartílago articular. 29

3.2 Adiponectina y cartílago articular. 31

3.3 Visfatina y cartílago articular. 33

3.4 Resistina y cartílago articular. 34

4. Ghrelina y Obestatina y cartílago articular. 35

4.1 Ghrelina y cartílago articular. 36

4.2 Obestatina y cartílago articular. 37

5. Hipótesis. 38

Índice

12

II. OBJETIVOS 39

III. MATERIAL Y MÉTODOS 43

1. Pacientes. 45

2. Cultivos celulares. 45

2.1 La línea celular ATDC5. 45

2.2 Las líneas celulares humanas. 46

2.3 Aislamiento y cultivo primario de condrocitos humanos. 47

3. Inmunohistoquímica. 48

4. Extracción de ARN y RT-PCR. 49

4.1 Extracción de ARN mediante TRIzol ®. 49

4.2 Retrotranscripción. 50

4.3 Reacción en cadena de la polimerasa. 51

5. Determinación de nitritos: ensayo colorimétrico de Griess. 52

6. Western Blot. 53

7. Ensayo de unión a receptor (Binding Assay). 56

8. Ensayo colorimétrico para medir actividad metabólica (MTT). 57

9. Ensayo de captación de ácidos grasos (BODIPY 3823). 57

10. Ensayo de captación de glucosa. 58

11. Ensayo de viabilidad con Yoduro de Propidio. 59

12. ELISAs. 60

13. Análisis estadístico. 60

14. Reactivos. 61

Índice

13

IV. RESULTADOS 63

1. Determinación de los niveles plasmáticos de leptina, adiponectina,

visfatina y resistina en pacientes con artritis reumadoide y en sus

correspondientes controles sanos. 65

2. Estudio del efecto de la adiponectina sobre condrocitos en cultivo y vías

de señalización implicadas en el mismo. 66

2.1 Expresión de los receptores de adiponectina y funcionalidad. 66

2.2 Efecto de la adiponectina sobre la expresión y actividad de NOS tipo 2. 69

2.3 La inhibición de PI3K bloqueó la producción de NO inducida por

adiponectina y la expresión de la proteína NOS tipo 2. 71

2.4 El efecto de la adiponectina sobre citoquinas, metaloproteasas y

prostanoides. 72

3. Estudio del efecto de la obestatina sobre condrocitos en cultivo. 74

3.1 Secreción de obestatina al sobrenadante celular de las células ATDC5. 74

3.2 Ensayo de unión de obestatina (binding). 75

3.3 Actividad de la obestatina sobre la viabilidad celular. 75

3.4 Actividad de la obestatina sobre el metabolismo de la célula. 77

3.5 Efecto de la obestatina sobre las metaloproteasas de matriz. 78

V. DISCUSIÓN 81

1. Niveles de adipoquinas en plasma de pacientes con AR comparado con

controles sanos. 83

2. Efecto de la adiponectina sobre condrocitos. 87

3. Efecto de la obestatina sobre condrocitos. 90

Índice

14

4. Relación de las citoquinas en estudio y el tejido adiposo con las

patologías articulares. 91

VI. CONCLUSIONES 95

VII. ABREVIATURAS 99

VIII. BIBLIOGRAFÍA 105

Introducción

Introducción

17

I. INTRODUCCIÓN 1. La articulación.

La articulación es una estructura compleja formada por una amplia variedad de tejidos

entre los que se encuentran: músculo, hueso, cartílago, ligamentos, sinovia y tendones

(1). El correcto funcionamiento de esta estructura proporciona estabilidad y capacidad

de flexión y movimiento al esqueleto minimizando el roce.

Las alteraciones en la fisiología de la articulación tienen una alta prevalencia en la

población. Las patologías más destacables son aquellas que afectan al cartílago

impidiéndole su función, como puede ser la artrosis (OA) y las que afectan a la sinovia

como la artritis reumatoide (AR) (2-5). A pesar del origen y evolución diferentes de

ambas patologías, el resultado final es el mismo, culminando con la degradación

irreversible de la matriz extracelular del cartílago articular (2-4).

1.1 El cartílago articular.

El cartílago articular es un tejido conectivo especializado que cubre las superficies

expuestas a estrés mecánico en la articulación (1). El cartílago favorece la baja fricción,

aporta estabilidad, facilita la rapidez de movimientos y contribuye a la estabilidad

articular.

Estructuralmente, el cartílago articular es un tipo especial de cartílago hialino

caracterizado por su apariencia translúcida. Es un tejido avascular que se nutre por

difusión entre el hueso subcondral y el fluido sinovial. Entre los componentes del

cartílago destacan el agua, que constituye más del 70% del mismo, el colágeno y otros

tipos proteicos que conforman la matriz extracelular entre la que se intercalan los

condrocitos, el único tipo celular presente en este tejido que representan tan sólo entre el

1 y el 2 por ciento del cartílago articular (1).

El cartílago articular maduro es un tejido en el cual se pueden diferenciar con claridad

cuatro zonas (Figura 1): 1) superficial; con condrocitos aplanados y con finas fibras de

colágeno paralelas entre si formando una red en la que se asocian una elevada

concentración de decorina y una baja concentración de agrecano; 2) media; que supone

entre el 40-60% del peso total del cartílago; está formada por condrocitos rodeados por

fibras de colágeno más gruesas que las anteriores; 3) profunda; con menor

concentración de colágeno y mayor concentración de agrecano, con niveles decrecientes

de condrocitos desde la zona más superficial a la más profunda dispuestos en columnas

Introducción

18

o grupos y 4) calcificada; con presencia de condrocitos hipertróficos y colágeno tipo X,

que sirve de tampón, protección mecánica, entre el cartílago articular no calcificado y el

hueso subcondral (1, 5).

1.2 El condrocito.

El condrocito es una célula completamente diferenciada y altamente especializada que

pertenece a la familia de las células del tejido conjuntivo, al igual que los fibroblastos,

osteocitos, adipocitos y miocitos. Desde un punto de vista ontogénico, los condrocitos

proceden de una célula precursora de origen mesenquimal, la cual expresa de forma

diferencial colágeno tipo I y ácido hialurónico, implicados en la formación de la matriz

extracelular. Su función en el cartílago articular es la de sintetizar y mantener la

estabilidad de las macromoléculas que componen la matriz extracelular (2) (Tabla 1). A

medida que la célula se diferencia, varía su fenotipo y expresa distintos tipos de genes

marcadores de formación de matriz. Así, podemos hablar de una célula

condroprogenitora, inmediatamente posterior a la precursora mesenquimal, que expresa

Introducción

19

tenascina y colágeno tipo IIA; condrocitos proliferativos (que expresan colágenos tipo

II, IX y XI, además de agrecano) y condrocitos hipertróficos (colágeno tipo X,

osteocalcin, fosfatasa alcalina y metaloproteasa de matriz (MMP)-13) (6, 7) con una

tasa de reemplazo celular baja. Este proceso de maduración ó diferenciación de los

condrocitos está modulado y dirigido por un gran número de factores reguladores

activos en los distintos estados de diferenciación de los condrocitos. Entre éstos se

encuentran el factor transformador de crecimiento (TGF)-β, el factor de crecimiento

insulínico (IGF)-1, proteínas morfogenéticas óseas (BMP)-6, BMP-4 o el factor de

crecimiento de endotelio vascular (VEGF) (8, 9).

El condrocito articular maduro está embebido en la matriz extracelular y sin

vascularización. Por ello depende de la difusión desde la superficie articular para el

intercambio de nutrientes y metabolitos. Su función principal es la de mantener los

componentes de la matriz en un estado de equilibrio con una baja tasa de reemplazo. El

condrocito maduro tiene muy poca actividad metabólica, aunque es capaz de responder

a estímulos mecánicos, factores de crecimiento y citoquinas que influyen en su

homeostasis normal, ya sea positiva o negativamente (10, 11).

Estas células se desarrollan en concentraciones bajas de oxígeno. Sin embargo, en

condiciones de concentraciones de oxígeno elevadas, como en presencia de la

membrana sinovial altamente vascularizada presente en artritis reumatoide, se puede

incrementar la rotura de los colágenos del cartílago articular (10, 12).

Introducción

20

El condrocito mantiene un equilibrio metabólico entre los procesos anabólicos y

catabólicos necesarios para la renovación de las moléculas de la matriz. Cuando se

produce un daño severo en la matriz que les rodea, como en la OA, el condrocito

aumenta la proliferación y desestabiliza la síntesis de proteínas de matriz, proteinasas y

citoquinas (3, 10, 11). La respuesta temprana de los condrocitos a las lesiones artrósicas

es la de aumentar la síntesis de colágeno tipo II y agrecano. Sin embargo, la capacidad

de regenerar la arquitectura normal de la matriz del cartílago es limitada y el daño se

hace irreversible a menos que se interrumpa el proceso degradativo.

Durante el envejecimiento y en patologías articulares, tales como la AR y la OA, el

equilibrio entre síntesis y degradación de los componentes de la matriz se ve alterado y

la tasa de pérdida de colágenos y proteoglicanos supera la tasa de deposición de nuevas

moléculas (2, 11-13). En la AR la destrucción del cartílago se produce en áreas

contiguas a la proliferación sinovial, o pannus, debido a la liberación de proteinasas,

citoquinas y otros mediadores que influyen en la desregulación del condrocito (10). En

OA, la destrucción del cartílago parece ser mediada por los propios condrocitos en

respuesta al daño mecánico o directa o indirectamente a la producción de citoquinas que

estimulan la producción de proteinasas que degradan la matriz del cartílago (10).

Diferentes citoquinas inflamatorias como interleuquina (IL)-1 o factor de necrosis

tumoral (TNF)-α, modulan la actividad normal del condrocito haciendo que entren en

apoptosis, sufran procesos de des-diferenciación e incrementen la producción de

proteinasas de matriz (14). La actividad de estas citoquinas puede estar modulada por

adipoquinas como la leptina, que potencia el efecto dañino de estas citoquinas en estas

células (15-17).

1.3 Patologías del cartílago articular.

1.3.1 Artritis reumatoide.

La AR es una enfermedad inflamatoria crónica, degenerativa, sistémica, autoinmune y

multifactorial que afecta a la sinovia ocasionando daño articular y destrucción ósea. La

AR es una enfermedad que afecta a la articulación en la que el daño al cartílago se

produce de forma secundaria, a diferencia de la OA, dónde este daño es el

desencadenante de la enfermedad. La AR es la enfermedad inflamatoria crónica más

común y se caracteriza por ser poli-articular, simétrica y afectar principalmente a las

articulaciones de pies y manos. Produce fatiga, debilidad general, pérdida de apetito y

fiebre. Es una enfermedad de etiología desconocida en la que están implicados distintos

Introducción

21

factores genéticos y ambientales como el sexo, la edad o los agentes infecciosos. Se

produce un desajuste del sistema inmune que ataca a las articulaciones propias

provocando la inflamación de la membrana sinovial que aumenta de grosor formando el

pannus y produciendo derrames de líquido sinovial. Afecta al 1% de la población y la

esperanza de vida en pacientes con AR se ve reducida entre 3 y 18 años. Una de las

consecuencias asociadas a esta patología es la caquexia inflamatoria. Esta patología

asociada a la AR se caracteriza por un desequilibrio metabólico, que produce un mayor

gasto energético, movilización de la grasa, una elevada gluconeogénesis, catabolismo

proteico y un balance negativo del nitrógeno. Estas perturbaciones homeostáticas,

parecen acelerar la morbilidad y mortalidad en la AR (18-22). Este desequilibrio

metabólico lleva asociado un desequilibrio en el sistema endocrino con un marcado

incremento en la producción de citoquinas inflamatorias y un desequilibrio en la síntesis

de factores orexigénicos y anorexigénicos [por ejemplo, las citoquinas inflamatorias

inducen la producción de moduladores anorexigénicos como la leptina, y los niveles de

ghrelina están disminuidos en pacientes con AR] (21, 23-26). Al tratarse de una

enfermedad inflamatoria crónica y sistémica puede afectar a cualquier órgano del

cuerpo pudiendo llegar a formarse amiloidosis. La amiloidosis dificulta el

funcionamiento de los órganos y empeora el pronóstico del enfermo. La AR puede

provocar inflamación de los vasos sanguíneos, pericarditis, úlceras gástricas, afectación

de pulmones, ojos y piel acelerando la mortalidad de los pacientes a causa de una mayor

incidencia de enfermedades cardiovasculares, infecciones, cáncer, etc.

El origen de esta patología tiene un importante componente auto-inmune y se basa en

una fuerte reacción inflamatoria como respuesta a un antígeno todavía desconocido (27,

28). En los primeros estadíos de la

enfermedad, la sinovia se inflama, se

estratifica, hay una gran proliferación

celular, se forman nuevos vasos y se

forma un frente de tejido agresivo

denominado pannus (29). El pannus

invade y destruye todas las

estructuras locales de la articulación

(Figura 2). En esta sinovia

modificada empiezan a infiltrarse

Introducción

22

algunas células del sistema inmune que no están presentes en el tejido normal, como los

macrófagos y los linfocitos (Tabla 2). Se observa una hiperplasia de la sinovia a causa

del aumento del número de células infiltradas y de sinoviocitos, tanto de tipo fibroblasto

como de tipo macrófago. La médula ósea adyacente también presenta infliltración de

células del sistema inmune (30). Para colaborar en el reclutamiento de células del

sistema inmune hacia la articulación (29, 31-34) y en la degradación que el pannus

ejerce sobre las estructuras colindantes de la misma, se expresan un elevado número de

citoquinas (Tabla 3) y enzimas degradativas de la matriz extracelular (28, 30, 32, 35-

40). Las citoquinas juegan un papel fundamental en la AR promoviendo la

autoinmunidad y manteniendo la inflamación de la sinovia, engloban la regulación

inmune, la destrucción tisular y la progresión de la enfermedad. Una de las funciones de

las citoquinas es la de regular el fenotipo de las células T, siendo el fenotipo TH1, capaz

de producir citoquinas pro-inflamatorias como IFN-γ o TNF, clave en AR.

Recientemente se ha descubierto que las células T que producen IL-17 (TH17) son

cruciales en la AR y que la inhibición o sobre-expresión de IL-17 en modelos animales

de AR hace que la inflamación articular se elimine o empeore respectivamente (30). De

hecho, se ha propuesto que la IL-17 está jugando un papel importante en la destrucción

Introducción

23

articular actuando de forma sinérgica con IL-1β y TNF en el catabolismo del cartílago.

Aunque el síndrome caquéctico asociado a la AR está caracterizado por una pérdida de

masa corporal significativa, la caquexia reumatoide está acompañada de un incremento

de la masa grasa y un peso corporal estable. En pacientes con AR, todos estos cambios

metabólicos llevan a una condición aparentemente contradictoria llamada obesidad

caquéctica reumatoide que afecta aproximadamente al 50% de los pacientes con AR

(18). Actualmente, la obesidad está considerada como un desorden metabólico crónico

caracterizado por un bajo grado de inflamación sistémica dado que los adultos obesos y

con sobrepeso tienen aumentadas las concentraciones de marcadores inflamatorios en la

sangre, la mayoría de ellos producidos por el tejido adiposo blanco (41). La obesidad, y

junto con ella las adipoquinas que el tejido adiposo produce, parece estar afectando a la

AR (42). La adiponectina se ha visto relacionada con la AR y su papel en ella es

altamente controvertido, en algunos casos la consideran anti-inflamatoria y en otros pro-

inflamatoria (43). La resistina también está resultando controvertida, en algunos

estudios se han encontrado niveles elevados de resistina en pacientes con AR y en otros

no (42, 44). La visfatina está aumentada en líquido y membrana sinovial de pacientes

Introducción

24

con AR y parece jugar un claro papel pro-inflamatorio (45, 46). La leptina está elevada

en pacientes con AR y se ha estudiado ampliamente como adipoquina pro-inflamatoria

(42, 47).

1.3.2 Artrosis.

La OA es una enfermedad articular degenerativa que se caracteriza por la fibrilación y

erosión del cartílago, la proliferación condrocitaria, la formación de osteofitos en los

márgenes articulares y esclerosis del hueso subcondral, derivando en la pérdida

paulatina del cartílago. Esta enfermedad tiene una elevada prevalencia en la sociedad

afectando a más de la mitad de la población mayor de 65 años en diferente grado. La

causa primaria de esta enfermedad no está clara aunque existen factores de riesgo como

son: un componente mecánico, la edad y el peso (3, 48, 49). Cabe destacar la

importancia de factores genéticos y bioquímicos asociados a esta patología como

pueden ser el TGF-β, las metaloproteasas y sus inhibidores o la leptina (48, 50-54).

La presencia de una primera lesión en el cartílago desencadena el mecanismo de

reparación de matriz por parte de los condrocitos. En la OA, los condrocitos no son

capaces de reparar la lesión y se produce una pérdida de estructura de la matriz que

conlleva una pérdida de funcionalidad haciendo que los condrocitos no puedan nutrirse

y terminen muriendo. Los factores bioquímicos y genéticos contribuyen, junto con los

mecánicos, al desarrollo de la lesión artrósica del cartílago, que consiste en la

desestabilización de las interacciones entre el condrocito y la matriz de forma que se

altera la respuesta metabólica normal del condrocito. El balance entre las proteínas de

síntesis y degradación de matriz se desequilibra y lleva a una pérdida de colágeno que

se traduce en una pérdida de tensión en el tejido llevando a la degeneración del mismo

(Figura 3).

La obesidad se considera un factor de

riesgo importante para la artrosis. Se ha

visto una asociación fuerte entre el BMI

y el riesgo de padecer OA de rodilla, una

asociación débil con la OA de mano y

con respecto a la OA de cadera hay datos

controvertidos (49, 55-60). Esta relación

entre OA y obesidad se ha asociado al

Introducción

25

componente mecánico inducido por el incremento de peso, especialmente en las

extremidades inferiores. Sin embargo, la obesidad, como enfermedad inflamatoria de

bajo grado, altera los niveles sistémicos de citoquinas pro-inflamatorias. Muchas de

estas sustancias son adipoquinas secretadas por el tejido adiposo que pueden estar

jugando un papel en la OA, como son la leptina, la resistina, la adiponectina y la

visfatina (48, 61, 62). Cabe destacar la leptina que, siendo la adipoquina más estudiada,

se ha postulado como el nexo de unión entre la OA y la obesidad (50, 53, 60, 63-65).

2. El sistema del óxido nítrico.

Los condrocitos pueden sintetizar óxido nítrico (NO) de forma normal (66, 67) y su

estimulación con citoquinas inflamatorias incrementa esta producción (68). Debido a

que el NO modula procesos inflamatorios articulares actuando sobre los condrocitos

(13, 69), esta producción acaba resultando dañina para la configuración óptima del

cartílago articular.

2.1 El óxido nítrico.

El NO es un radical libre, gaseoso, de pequeño tamaño, que difunde libremente desde su

punto de síntesis hasta su zona de acción (70-72). Puede actuar como vasodilatador,

neurotransmisor, o modulador de la respuesta inmune e inflamatoria (69, 71-77). Al ser

un radical libre, puede actuar como agente citotóxico en distintas patologías, eliminando

distintos agentes patógenos (73, 78-80).

La producción de NO en los organismos está catalizada por una familia de enzimas de

entre 130-160 kDa conocidas como nitróxido sintasas (NOS) (81). Para la biosíntesis

del NO, las NOS emplean la L-Arginina en una reacción de oxidación en la que utilizan

NADPH, FAD y/o FMN como cofactores. El resultado final de dicha reacción es la

síntesis del NO y de una molécula de citrulina (Figura 4) (82, 83).

Dentro de esta familia de enzimas, se engloban distintos isotipos, isoformas, que

comparten un 50-60% de homología en sus secuencias pero que se expresan

específicamente en determinados tejidos (81) y se pueden dividir en dos grupos:

constitutivas e inducible.

Dentro de las NOS constitutivas (Calcio [Ca2+] y Calmodulina [CaM] dependientes) se

agrupan la NOS neuronal (nNOS o NOS tipo 1, unida a membrana) (81, 84) y la NOS

endotelial (eNOS o NOS tipo 3, soluble) (81, 85, 86).

Introducción

26

Figura 4. Síntesis del óxido nítrico. El óxido nítrico se sintetiza endógenamente por la conversión de L-arginina a L-citrulina mediante las Nitróxido Sintasas.

2.2 La nitróxido sintasa tipo 2.

La NOS tipo 2 es una isoforma de NOS no constitutiva, soluble e independiente de las

concentraciones de Ca2+ intracelular (81, 82). Es una proteína de 131 kDa que no está

presente en células en reposo pero su expresión está inducida por distintos estímulos

(citoquinas o productos de la pared bacteriana) en distintos tipos celulares (macrófagos,

monocitos, hepatocitos y células endoteliales, entre otras) relacionados casi todos con

funciones inmuno-reguladoras (74, 87-91).

La NOS tipo 2 es activa sólo en forma dimérica (81). Para que forme dímeros y sea

estable y activa, es necesaria la unión del grupo Hemo a su dominio con función

oxigenasa. En las formas de NOS tipo 1 y 3, también el dominio reductasa participa en

la dimerización (81).

La NOS tipo 2 produce NO en mayor concentración que las isoformas constitutivas

(μM frente a nM). La expresión de NOS tipo 2 en macrófagos (y otros tipos celulares)

está activada por inductores de procesos inflamatorios como el lipopolisacárido (LPS),

el TNF o distintas interleuquinas. El NO producido incrementa la tasa de muerte celular

(74, 78, 79, 92). El efecto del NO sobre el cartílago provoca la inducción de

metaloproteasas de matriz, la pérdida de fenotipo por parte de los condrocitos y el

incremento de la apoptosis (2, 93).

Son varios los agentes farmacológicos que inhiben la producción de NO mediada por

NOS tipo 2 (81, 94), aunque no todos son igual de específicos. Aminoguanidina y N-

Introducción

27

nitro-L-arginín-metil-éster (L-NAME) son los inhibidores de la actividad de la NOS

tipo 2 más utilizados.

2.3 Inducción de NOS tipo 2 y producción de NO.

Gran parte de las citoquinas pro-inflamatorias emplean como mediador final de sus

acciones el NO a través de la inducción de la NOS tipo 2. Así, por ejemplo, se sabe que

el interferon (IFN)-γ induce NOS tipo 2 mediante la ruta de señalización JAK-STAT

(95). La IL-1, por su parte, induce la expresión de NOS tipo 2 y la formación de NO a

través de una ruta que involucra al factor nuclear (NF)-κB (90).

La biosíntesis de NO está controlada a distintos niveles: transcripción, post-

transcripción, traducción y post-traducción.

Se sabe que la dexametasona modula la expresión del ARNm de NOS tipo 2 de forma

muy efectiva (82, 96-101); sin embargo, aunque hay numerosos datos al respecto, los

mecanismos por los que dicha regulación tiene lugar todavía no han sido

completamente esclarecidos. También se ha descubierto que la anexina-1 (Anxa-1) es

capaz de modular la actividad de la NOS tipo 2 a nivel post-transcripcional (102).

Se han estudiado los mecanismos de transcripción de NOS tipo 2 en distintos tipos

celulares bajo distintos estímulos. Se observó que distintas vías de señalización

participan en la inducción de NOS tipo 2. Las vías activadas dependen tanto del

estímulo empleado como del tipo celular (82). En ellas participan una gran variedad de

quinasas y factores de transcripción, entre los que se encuentran las Janus quinasas

(JAK), proteín quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), el NFκB así como

reguladores negativos de los receptores tipo Toll (TLR) y la fosfoinositol-3-quinasa (PI-

3K) que, paradójicamente, es fundamental en la inducción de NOS tipo 2 (90, 100, 103-

105).

Se ha demostrado, además, que la región promotora del gen de NOS tipo 2 contiene

regiones de unión a distintos factores de transcripción, como el NFκB o signal

transducers and activators of transcription (STATs) y que el promotor de NOS tipo 2 en

humanos contiene secuencias homólogas a estas regiones (81, 82). Por otra parte, se ha

comprobado que la sobre-expresión del supresor de señalización de citoquinas

(supressor of cytokine signaling (SOCS))-1 en respuesta a la presencia de citoquinas

bloquea la ruta JAK/STAT y, por tanto, inhibe la expresión de NOS tipo 2 (106, 107).

Introducción

28

Dentro de los estímulos que participan activamente en la inducción de NOS tipo 2 y la

producción de NO se encuentran distintas citoquinas inflamatorias, entre ellas la IL-1

(90) y el IFN-γ (95). Ambas citoquinas tienen en el NO a uno de los principales

mediadores de sus acciones inflamatorias (13, 69).

La IL-1 induce, a través de NF-κB (90, 108), la expresión de distintos genes entre los

que se encuentran la ciclooxigenasa (COX)-2 o la NOS tipo 2, esenciales para las

respuestas inmune e inflamatoria (90, 105). El NF-κB se encuentra inactivo en el

citosol, formando un complejo IκB-NFκB. Frente a determinados estímulos, la IκB

quinasa (IKK) fosforila y, posteriormente, ubiquitina el complejo IκB-NFκB con lo que

ésta se degrada y libera al NF-κB, que transloca al núcleo y activa la expresión de

distintos genes (82, 90, 105).

Además de para la inducción de la NOS tipo 2 a través de los TLR, se ha demostrado

que el NFκB es un factor de transcripción esencial para la inducción de NOS tipo 2 por

parte de la gran mayoría de citoquinas (109).

3. Tejido adiposo y adipoquinas.

El tejido adiposo estaba considerado como un órgano pasivo cuya única función era la

de servir de reserva energética. Actualmente el tejido adiposo blanco se considera un

órgano endocrino que produce una serie de moléculas, que comparten unas propiedades

funcionales y estructurales con las citoquinas, que se llaman adipoquinas y que

participan en diversos procesos metabólicos de forma endocrina, paracrina, autocrina y

juxtacrina (110) (Figura 5).

Entre estos factores se

encuentran la leptina, la

adipsina, la proteína agouti, la

angiotensina, el TNF-α y

ácidos grasos libres, entre otros

(111). El tejido adiposo ejerce

un papel crítico modulando las

interacciones entre diferentes

tejidos y órganos incluyendo la

glándula supra-renal, el sistema

nervioso central y periférico y

Introducción

29

el sistema inmune.

Se considera que el tejido adiposo es una fuente de péptidos pro-inflamatorios que

contribuyen de forma significativa al llamado “estado inflamatorio de bajo grado”

presente en sujetos con obesidad y síndrome metabólico (41). Este conjunto de

anormalidades metabólicas está caracterizado por resistencia a insulina, dislipidemia,

alteración de la coagulación y también se asocia con un mayor riesgo de cáncer,

diabetes tipo II, complicaciones cardiovasculares y enfermedades inflamatorias

autoinmunes. Sin embargo, el tejido adiposo también produce factores anti-

inflamatorios como el antagonista del receptor de IL-1 y la IL-10, cuyos niveles

circulantes están elevados en individuos obesos (112).

La obesidad está considerada como un estado pro-inflamatorio caracterizado por niveles

elevados de marcadores de inflamación, incluyendo citoquinas pro-inflamatorias y

proteínas de fase aguda (113).

La fisiología del adipocito se ha ignorado durante décadas, pero se han encontrado

numerosas evidencias que demuestran que es extremadamente compleja y está muy

regulada. Tras el descubrimiento de la leptina se ha profundizado en la identificación de

otros factores proteicos que el adipocito secreta de forma específica, y, en los últimos 10

años, se han caracterizado más de 50, lo que ha constituido el llamado “adipoquinoma”.

Estudios recientes han demostrado diferentes relaciones entre el tejido adiposo, las

adipoquinas y las enfermedades articulares inflamatorias. Por ejemplo, las citoquinas

pro-inflamatorias se producen en la grasa infra-patelar de pacientes con OA (61).

Además, estudios que pretendían determinar los niveles de adipoquinas en

enfermedades articulares inflamatorias han demostrado altos niveles de adiponectina y

resistina en el líquido sinovial de pacientes con OA y AR (62). A nivel plasmático

también se han visto niveles elevados de adiponectina en pacientes con AR aunque no

se han visto diferencias en los niveles plasmáticos de resistina (42). La leptina, también

está fuertemente asociada a procesos inflamatorios en patologías articulares (15-17). Se

ha visto que los niveles de leptina están elevados en pacientes con AR (42, 114) y que la

producción de leptina es más alta en cartílago articular artrósico que normal (50).

3.1 Leptina y cartílago articular.

La leptina, el producto del gen Ob, es una hormona de 16 kDa sintetizada por los

adipocitos (111). Es una hormona tipo citoquina con acciones pleiotrópicas. La primera

función que se le atribuyó a la leptina fue la de actuar como una señal anorexigénica

Introducción

30

para las neuronas en el sistema nervioso central para disminuir la ingesta y aumentar el

gasto energético (115, 116).

La leptina ejerce funciones periféricas entre las que se incluyen la regulación de la

función endocrina, de la reproducción, del crecimiento óseo, y la modulación del

sistema inmune y de la inflamación, entre otras (47, 115, 117-119). Varios estudios han

demostrado que los niveles circulantes de leptina aumentan durante la infección e

inflamación, sugiriendo que la leptina es parte de la respuesta inmune y de los

mecanismos de defensa (115). Además, los niveles de leptina están elevados durante la

inflamación experimental (117) y ejerce un efecto pro-inflamatorio marcado en

condrocitos en cultivo activando a la NOS tipo 2 mediante sinergias con citoquinas

como la IL-1 y el IFN-γ (15, 16). En cuanto a la modulación inmune innata, promueve

la activación de los monocitos/macrófagos, la quimiotaxis, la activación de los

neutrófilos y la activación de las células T natural killer (120). Además, la leptina

influye en la inmunidad adaptativa incrementando la expresión de moléculas de

adhesión mediante células T CD4+ y promoviendo la proliferación y secreción de IL-2

por células T CD4+ “vírgenes” (120-122). La leptina también promueve la proliferación

de las células T CD4+ (allogenicas), aunque se correlaciona de forma negativa con las

células T reguladoras CD4+ CD25+, y modifica el equilibrio de células T favoreciendo

su activación hacia un patrón de liberación de citoquinas tipo Th1 (112).

Los niveles elevados de leptina están asociados a la obesidad, lo que supone un factor

de riesgo para la OA (58, 123, 124). Resulta interesante que en pacientes con OA, la

leptina está presente en el líquido sinovial, y también se ha visto que los condrocitos

articulares de pacientes con OA la sobre-expresan (50). Los condrocitos humanos

normales expresan la isoforma funcional, Ob-Rb, del receptor de leptina (15, 125).

También se ha visto que la leptina exógena aumenta la expresión tanto de la propia

leptina como de su receptor en el cartílago de rata, lo que sugiere que esta hormona

podría ser un nexo de unión entre la obesidad y la OA (126).

Por si sola la leptina no parece actuar sobre el cartílago como un activador directo de la

respuesta inflamatoria, pero cuando interactúa con otras citoquinas pro-inflamatorias

amplifica la inflamación y puede contribuir a aumentar el daño del cartílago.

Recientemente, nuestro grupo ha demostrado un efecto sinérgico de la leptina con IFN-

γ e IL-1 sobre la inducción de la producción de NO en condrocitos en cultivo mediante

la inducción de la expresión y actividad de la NOS tipo 2 (15-17). Este efecto estaba

Introducción

31

mediado por la JAK2, PI3K, extracelullar regulated MAP kinase (ERK)1/2 y p38K (15,

17).

3.2 Adiponectina y cartílago articular.

La adiponectina, también llamada gelatin-binding protein (GBP)-28, adipose most

abundant gene (apM)1, adipocyte complement related protein (ACRP)30 ó AdipoQ, es

una proteína de 244 aminoácidos y 30kDa sintetizada mayoritariamente en el tejido

adiposo (127, 128). Esta proteína posee homología estructural con el colágeno VIII y X

y con el factor C1q del complemento (15, 127-129). Tiene un dominio tipo colágeno en

el extremo N-terminal y un dominio globular en el extremo C-terminal (130). Pertenece

a la súper-familia del C1q-TNF, cuyos miembros parecen derivar de una molécula

ancestral común y compartir propiedades pro-inflamatorias comunes (130, 131). La

adiponectina circula en sangre en concentraciones elevadas y constituye el 0.01% de las

proteínas totales del plasma. La adiponectina se encuentra en plasma en su forma

completa o “full length” o en su forma globular o truncada con sólo el dominio C-

terminal. Se ha visto que la adiponectina, cuando está en su forma completa, es capaz de

ensamblarse en homo-trímeros mediante la interacción de las regiones tipo colágeno y

formar así estructuras oligoméricas (128, 130) constituidas de manera preponderante

por trímeros, hexámeros y también por isoformas de alto peso molecular (12-18 mer)

(132).

La adiponectina es una proteína que participa en el balance de la homeostasis energética

interrelacionando la ingesta, el metabolismo de carbohidratos y de lípidos (128). La

adiponectina es capaz de disminuir los niveles circulantes de glucosa, ejerciendo una

función insulin-mimética, aumentando su captación a través de la proteín quinasa AMP-

activada (AMPK), aunque de forma independiente de insulina (130, 132, 133). Por otra

parte la adiponectina también se ha mostrado capaz de disminuir la síntesis de lípidos y

de aumentar la oxidación de ácidos grasos libres además de regular la producción y

actividad de proteínas asociadas al metabolismo de los triglicéridos (130, 132, 133).

La adiponectina se ha estudiado principalmente en el contexto del metabolismo

energético de los ácidos grasos y de la glucosa (133) y por su papel en el sistema

cardiovascular, donde se le ha atribuido un papel anti-aterogénico y, en general,

propiedades anti-inflamatorias a nivel endotelial (134, 135). Se ha demostrado que la

adiponectina posee función anti-aterogénica, mejora la sensibilidad a insulina y reduce

la concentración de ácidos grasos circulantes y triglicéridos en músculo e hígado (136).

Introducción

32

Además, la adiponectina está implicada en la modulación de la respuesta inflamatoria

(136) dado que atenúa la respuesta inflamatoria mediada por TNF-α, inhibe la actividad

fagocítica de los macrófagos y la producción de TNF-α, y también inhibe la

proliferación de las células mielomonocíticas induciendo apoptosis.

La adiponectina puede actuar como nexo entre el sistema neuroendocrino, inmune y

procesos metabólicos. Parece tener un importante papel en la regulación del desarrollo

de enfermedades metabólicas e inmunes como la diabetes (137) y también interviene

como mediador de la inflamación en obesidad (138).

Recientemente se han clonado dos receptores de adiponectina, AdipoR1 y AdipoR2

(139). Estos receptores son funcionalmente diferentes de otros receptores acoplados a

proteínas G, aunque también tienen siete dominios transmembrana. El receptor 1 se

encontró por primera vez en músculo esquelético y el tipo 2 en tejido hepático. La

adiponectina transduce a través de la AMPK fosforilándola (133, 140). La adiponectina

globular fosforila a la AMPK en músculo esquelético, mientras que la forma completa

lo hace además de en el músculo esquelético, también en el hígado (133).

A nivel del cartílago, se ha sugerido que la adiponectina está implicada en la

modulación de la destrucción del cartílago en el condrocito mediante la regulación al

alza del inhibidor tisular de metaloproteasas (TIMP)-2 y la regulación a la baja de

MMP-13 inducida por IL-1β (141). Además, la adiponectina induce la oxidación de los

ácidos grasos libres en células musculares (140). Los niveles plasmáticos de

adiponectina están inversamente relacionados con la masa grasa y también están

disminuidos en enfermedades cardiovasculares y diabetes mellitus tipo II. En humanos,

los niveles plasmáticos de adiponectina se correlacionan negativamente con la cantidad

de grasa acumulada, glucosa e insulina (129, 142). También se ha observado un claro

dimorfismo sexual, siendo los niveles circulantes de adiponectina más altos en las

mujeres que en los hombres, lo que no influye sobre su sensibilidad a la insulina (143).

Además, bajos niveles plasmáticos de adiponectina están relacionados con diabetes,

resistencia a insulina, enfermedad de las arterias coronarias y macroangiopatía (142).

Por otro lado, se han detectado niveles séricos elevados de adiponectina en pacientes

con AR (62) y en el líquido sinovial de pacientes con AR, lo que sugiere un papel pro-

inflamatorio de esta adipoquina. Además, resultados recientes, han demostrado que la

adiponectina se expresa en fibroblastos sinoviales, y que aumenta la producción de IL-6,

IL-8 y MCP-1 a través de una ruta compleja en la que están implicados los receptores

específicos de adiponectina y sus intermediarios intra-celulares (144-147).

Introducción

33

Considerando que adipoquinas como la leptina se han descrito como factores pro-

inflamatorios a nivel articular (15-17) y dado que la adiponectina parece estar jugando

un importante y controvertido papel en las enfermedades inflamatorias articulares

degenerativas, resulta interesante profundizar en el estudio del papel que la adiponectina

pueda ejercer sobre el condrocito.

3.3 Visfatina y cartílago articular.

La visfatina, a la que también se le ha llamado pre-B cell colony-enhancing factor

(PEBF) o nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt), es una adipoquina de

52kDa descubierta por primera vez en 1994 producida y secretada por linfocitos

activados y por el tejido adiposo visceral (148, 149). La visfatina se ha descrito como

una molécula tipo citoquina que sinergiza con la IL-7 y el stem cell factor (SCF)

promoviendo la formación de colonias de células B (149). Se ha visto que miembros de

la familia del TNF y que el IFN-γ son capaces de inducir la expresión de visfatina en

células B (150, 151). Otros estímulos inflamatorios, como el LPS, el TNF-α o la IL-1β,

son capaces de inducir la expresión de visfatina en células del sistema inmune innato

como neutrófilos, monocitos, macrófagos e incluso células epiteliales y endoteliales (46,

152-156). La visfatina es una citoquina que está elevada en el fluido bronco-alveolar en

modelos animales de daño agudo de pulmón y en neutrófilos de pacientes con sepsis

(148, 157).

Se ha visto que la visfatina actúa de tres maneras diferentes (158, 159). Por una parte es

capaz de unirse y activar al receptor de insulina, en un sitio de unión distinto a ésta,

ejerciendo un efecto insulina-mimético tanto in vitro como in vivo (148). La visfatina

puede actuar como un enzima niconitamide adenine dinucleotide (NAD)

phosphoribosyl transferase, ejerciendo esta función en el citoplasma celular (160).

Esta adipoquina también está elevada en el líquido sinovial de pacientes con AR y su

expresión en el tejido sinovial es mayor en pacientes con AR que en pacientes con OA

(45, 46). Los niveles séricos de visfatina están aumentados en pacientes con síndrome

metabólico y se relacionan con los niveles de IL-6 y proteína C reactiva (CRP) (161-

163). Los niveles de visfatina en suero y en líquido sinovial se correlacionan con el

grado de inflamación y actividad clínica de la enfermedad (45). La presencia de

polimorfismos específicos de un solo nucleótido en el gen de la visfatina/PBEF aumenta

el riesgo de desarrollo de daño agudo de pulmón en pacientes con sepsis (157). La

visfatina, además de verse estimulada por diferentes citoquinas, induce la transcripción

Introducción

34

y traducción de IL-1β, IL-1Ra, IL-6, IL-10 o TNF-α en distintos tipos celulares (164).

En sinoviocitos y condrocitos, la visfatina es capaz de estimular además de algunas

interleuquinas, algunas metaloproteasas como MMP-1, MMP-3 y MMP-13 (45, 165).

También se ha visto que PI-3K/Akt, MAPK y NF-κB están implicados en la cascada de

señalización intracelular mediada por la visfatina (45, 164, 166, 167).

Aunque la conexión entre los efectos insulina-miméticos y anti-apoptóticos todavía no

se han investigado, esta proteína representa claramente un nexo de unión adicional entre

el tejido adiposo y la inflamación (45, 136, 157).

3.4 Resistina y cartílago articular.

La resistina es una proteína de 12,5kDa rica en cisteína recientemente descubierta y que

se localizó por primera vez en adipocitos de roedores. Esta proteína se dio a conocer de

forma simultánea por tres grupos, por una parte como factor secretado de forma

específica por tejido adiposo (resistina) (93), por otra parte como un gen perteneciente a

la familia multigénica llamada moléculas tipo-resistina (RELMs) o “found in

inflammatory zone” (FIZZ), que son una familia de moléculas similares en roedores y

humanos siendo FIZZ3 similar a resistina (168), y por último como un gen modificado

por los antidiabéticos tiazolidinedionas (TZD) (169). Los residuos de cisteína en la

secuencia aminoacídica de la resistina y en la familia de moléculas similares a resistina

sugiere que los puentes disulfuro pueden tener un importante papel estructural en estas

moléculas (170). Los niveles de ARNm de resistina están incrementados durante la

diferenciación de células 3T3-L1 y pre-adipocitos primarios hacia adipocitos, y la

proteína inhibe la diferenciación a adipocito, sugiriendo que este factor actúa como

regulador de la adipogénesis (93, 169).

El interés en la resistina surgió porque su expresión estaba aumentada en animales

obesos y su administración deterioraba la acción de la insulina tanto in vivo como in

vitro. Además, la inmuno-neutralización de los niveles circulantes de resistina en

animales obesos mejoraba la sensibilidad a insulina (169). Se ha demostrado que altos

niveles de resistina circulante estimulan la producción de glucosa en presencia de

niveles fisiológicos de insulina (171), mientras que la insulina aumenta la expresión de

resistina (93). Estudios iniciales en la regulación de resistina han indicado que su

expresión génica está reducida por ayuno y por las TZD antidiabéticas (93, 169). Se ha

visto que los niveles de resistina circulantes están incrementados en ratones obesos,

tanto los inducidos por dieta como los genéticamente obesos (ob/ob, db/db) (169). Los

Introducción

35

niveles de ARNm de resistina están disminuidos en animales sujetos a una restricción

crónica de alimento (172) sugiriendo que los niveles de resistina están marcadamente

influenciados por el estado nutricional. Además, la resistina está regulada por la

dexametasona, la insulina, los glucocorticoides, las hormonas tiroideas, la glucosa, el

TNF-α y el LPS, que ejercen sus funciones en diferentes tejidos (173-179). Estos

resultados, de forma conjunta, sugieren que la resistina podría ser el nexo de unión entre

la obesidad y la diabetes tipo II mediante la inducción de resistencia a insulina (169).

Sin embargo, los datos obtenidos en humanos sobre la expresión génica de resistina en

individuos normo-peso y obesos son conflictivos. Algunos autores describen niveles

elevados de resistina en tejido adiposo abdominal de individuos obesos, mientras que

otros no encuentran una relación clara entre la expresión génica de resistina y masa

grasa (172).

No existe por lo tanto una visión consensuada sobre los niveles de resistina y su relación

con obesidad y diabetes tipo II frustrando el entusiasmo inicial que atribuía a la resistina

la posibilidad de ser el nexo entre cantidad de masa grasa y la resistencia a insulina

(136). En humanos, la resistina parece actuar como un mediador crítico en la resistencia

a insulina asociada a sepsis y posiblemente con otras condiciones inflamatorias (172,

180).

La resistina parece estar asociada con la inflamación articular aunque hay datos

controvertidos al respecto. Hay trabajos en los que se han encontrado variaciones en los

niveles plasmáticos y en líquido sinovial de pacientes con AR y OA y otros trabajos en

los que no se han visto tales diferencias (42, 61, 62). La resistina parece correlacionarse

con marcadores de inflamación, IL-6 y TNF-α colaborando en la inflamación y en la

destrucción articular (44, 62, 181).

4. Ghrelina y Obestatina y cartílago articular.

La leptina, además de ser una molécula relacionada con la homeostasis energética, se ha

establecido como una adipoquina ampliamente estudiada como sustancia relacionada

con el sistema inmune con propiedades pro-inflamatorias (182). La ghrelina se ha

estudiado como molécula opuesta a la leptina en términos de homeostasis energética. Su

estudio también puede resultar interesante a nivel del sistema inmune.

Introducción

36

4.1 Ghrelina.

La ghrelina se descubrió a finales de 1999 (183) como el ligando endógeno del receptor

del secretagogo de la hormona de crecimiento (GHS-R); GHSs son un grupo de

compuestos sintéticos con la habilidad de inducir la secreción de la hormona de

crecimiento en todas la especies testadas hasta la fecha (184). Esta nueva hormona es un

péptido gástrico orexigénico y un ligando para GHS-R que estimula fuertemente la

liberación de GH tanto in vivo como in vitro (183, 185, 186). Es una hormona capaz de

estimular la ingesta independientemente de la secreción de GH (187, 188). El péptido

maduro de la ghrelina de 28 amino ácidos se rompe de su precursor, pre-pro-ghrelina, y

se caracteriza por una modificación estructural muy peculiar, dado que el grupo

hidroxilo de la serina en posición 3 está covalentemente acilado por un residuo de un

ácido n-octanoico, aunque se han observado otros tipos de acilaciones (ácidos grasos de

10 carbonos con y sin insaturaciones) (183, 189, 190). El mecanismo de acilación no

estaba muy claro hasta que muy recientemente se ha descubierto el enzima implicado en

este proceso y se le ha llamado Ghrelin O-Acyltransferase (GOAT) (191, 192). La

acilación de la ghrelina puede ser necesaria para cruzar la barrera hemato-encefálica; de

cualquier forma, esta singularidad tiene implicaciones potencialmente terapéuticas sobre

el bloqueo de la ghrelina, ya que un antagonista de la GOAT, enzima que media la

acilación y que octanoila a la ghrelina, debería inactivar esta hormona de una forma

selectiva. Esta modificación bioquímica post-traduccional se observó por primera vez

en péptidos aislados de sus fuentes naturales y se postulan cruciales para la actividad

biológica del péptido, aunque la acilación se ha visto en proteínas G y receptores, que

están conjugados al ácido miristoílico (C14) o al ácido palmítico (C16) (193).

Sorprendentemente, pequeños fragmentos acompañantes de los primeros 4-5 residuos

de la ghrelina (con la serina acilada intacta) eran capaces de activar la transducción de

señal del GHS-R tipo a. Además, un mecanismo de splicing alternativo del gen de la

ghrelina origina un péptido análogo excepto en la posición de la glutamina 14, que se

pierde (194). Esta depleción resulta del uso de un codón CAG, que codifica para Gln14

como señal de splicing. Así pues, se producen dos tipos de péptidos de ghrelina en el

estómago de rata: ghrelina y des-Gln14-ghrelina. La actividad de ambas ghrelinas es la

misma. Sin embargo, des-Gln14-ghrelina está sólo presente en bajas concentraciones en

el estómago, lo que indica que ghrelina es la forma activa principal.

Se ha comprobado que la ghrelina disminuye la pérdida de masa corporal en modelos de

caquexia asociada a fallo cardíaco crónico (195) y en ratones con caquexia asociada al

Introducción

37

cáncer (196) estimulando la ingesta (197) y disminuyendo el uso de grasa a través de un

mecanismo independiente de GH. También antagoniza a la leptina a través de la

activación de la ruta del receptor hipotalámico del neuropéptido Y/Y1 (198). Por tanto,

es posible que esta hormona esté participando en el desarrollo de la caquexia

inflamatoria o bien que sus niveles plasmáticos y su expresión, estén regulados de

forma diferencial durante los procesos inflamatorios crónicos. Existe pues la posibilidad

de que ghrelina pueda ejercer un papel importante en la regulación del balance

metabólico en enfermedades inflamatorias como la AR. Aún así, el papel de ghrelina en

el balance metabólico asociado a estas condiciones y su relación con la actividad de la

enfermedad sigue sin conocerse.

4.2 Obestatina.

La obestatina en un péptido de 23 aminoácidos identificado recientemente como el

producto del procesado post-traduccional del pre-pro-ghrelina (199), el polipéptido

precursor de la ghrelina. La estructura primaria de la obestatina es una secuencia

homóloga a la del pre-pro-ghrelina conservada entre especies y, al igual que ghrelina,

requiere un procesamiento post-traduccional cerca del extremo amino-terminal. La

obestatina necesita, además de la acilación cerca del extremo N-terminal, una amidación

en su extremo C-terminal para ser biológicamente activa. Se ha purificado del estómago

de rata y se ha descrito que se une a un receptor huérfano unido a proteína G, el GPR39

(200, 201) que está presente en muchos tejidos. Posteriormente a este hallazgo se

publicaron datos contradictorios indicando que no había relación entre la obestatina y el

GPR39 (202, 203).

La obestatina se ha presentado como un péptido con propiedades antagónicas a la

ghrelina. Se ha visto que actúa inhibiendo la sed (204), inhibe el vaciado estomacal y la

motilidad intestinal (205), inhibe la secreción de insulina inducida por glucosa (206),

regula el sueño (207), inhibe la ansiedad, mejora la memoria (208), aumenta la

secreción de jugos pancreáticos (209), aumenta la proliferación adipocitaria e inhibe la

secreción de IGF-1 (210). En cambio, también se han encontrado resultados

contradictorios. No se encontraron efectos de obestatina en el vaciado estomacal, ni en

la motilidad intestinal, ni en el ayuno inducido por hiperfagia (211-213), ni sobre el

balance energético (214), ni sobre la secreción de GH, PRL, TSH ni ACTH (215), ni

sobre el metabolismo y viabilidad de los cardiomiocitos (216). Se plantea la duda de si

este péptido tendrá efecto antagónico o no a la ghrelina.

Introducción

38

La ghrelina se sintetiza y se secreta en los condrocitos y con una importante actividad

en el metabolismo de las células del cartílago (217). Estas células están emergiendo

como productores locales y diana de varios factores endocrinos, incluyendo ghrelina

(217) y leptina (42, 218). La ghrelina se ha visto como un factor que relaciona el

metabolismo óseo con la homeostasis energética (219, 220). Es interesante saber si la

obestatina, el péptido relacionado, obtenido por modificación post-traduccional del

mismo péptido previo que ghrelina, ejerce alguna acción fisiológica sobre los

condrocitos.

5. Hipótesis.

El tejido adiposo y sus productos están jugando un papel importante en patologías con

componente inflamatorio, como son la artrosis y la artritis reumatoide.

El estudio de los niveles de adipoquinas en plasma de pacientes con AR frente a

controles sanos es necesario para ampliar los datos de los que dispone la comunidad

científica.

Por otra parte, la adiponectina es una de las adipoquinas más controvertidas a nivel

inflamatorio. El estudio del efecto que produce a nivel del condrocito ayudará a

entender mejor su papel en las patologías articulares.

Tanto la leptina como la ghrelina se han visto relacionadas con el metabolismo

condrocitario, sería interesante determinar si la obestatina, producto del mismo gen que

ghrelina, tiene alguna función en el mismo.

Objetivos

Objetivos

41

II. OBJETIVOS

1. Determinar los niveles plasmáticos de distintas adipoquinas en pacientes con artritis

reumatoide y en individuos sanos

2. Estudiar el efecto de la adiponectina sobre condrocitos en cultivo y la ruta a través de

la cuál ejerce su función

3. Estudiar el efecto de la obestatina sobre condrocitos en cultivo

Material y Métodos

Material y Métodos

45

III. MATERIAL Y MÉTODOS

1. Pacientes.

Antes de la realización del estudio todos los individuos firmaron el consentimiento

informado de acuerdo con la legislación vigente. El diseño del estudio ha sido aprobado

por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia. Han participado en el estudio

31 pacientes diagnosticados de artritis reumatoide (edad media ±S.E.M.=46.1±14.1;

índice de masa corporal, BMI=25.88±0.63; H:M=9:22) según los criterios de

clasificación del colegio americano de reumatología (ACR). 22 pacientes tenían más de

8 articulaciones inflamadas junto con un elevado índice de sedimentación eritrocitaria

(ESR, todos los pacientes de artritis tenían ESR>20mm/hora) y CRP (media CRP±

S.E.M=0.61±0.19mg/dl). 28 (81%) de los pacientes se estaban tratando con

methotrexate, 23 (62%) con dosis bajas de prednisona (<10mg diarios) y 9 (26%) con

antagonistas del TNF.

Asimismo, 18 sujetos sanos de edad y género similar (edad media±S.E.M.=48.3±16.1;

índice de masa corporal, BMI=24.36±0.83; H:M=8:10) se emplearon como controles.

En todos los casos, la sangre se recogió en tubos Vacutainer con EDTA entre las 9.00 y

las 11.00 de la mañana tras ayuno nocturno.

2. Cultivos celulares.

2.1. La línea celular ATDC5.

La línea celular condrogénica murina ATDC5 ha sido donada por el Dr. Agamemnon E.

Grigoriadis (Dept of Craniofacial Development King’s College, London Guy’s

Hospital, London Bridge, London SE1 9RT, UK).

Esta línea celular se aisló en el año 1990 a partir de un cultivo de terato-carcinoma con

características fenotípicas fibroblásticas durante su fase de crecimiento (221).

Posteriormente, se observó que la insulina (a una concentración de 10μg/ml) les

permitía seguir creciendo aún después de la fase de confluencia e inducía la formación

de agregados similares a los nódulos que se forman en el cartílago (222). Al teñir esta

línea celular con azul alcián se comprobó que sintetizaba proteoglicano y colágeno tipo

II, ambos marcadores específicos de condrogénesis (222). Así, se llegó a la conclusión

de que esta línea celular es un modelo óptimo para el estudio de los procesos de

diferenciación condrocítica.

Material y Métodos

46

Además, se descubrió que las células ATDC5 se volvían hipertróficas cuando el

crecimiento celular se detenía (222). La hipertrofia de los condrocitos va acompañada

de la expresión de colágeno tipo X, el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina y

la expresión de osteopontina, un marcador de diferenciación condrocítica terminal (222-

224). Nuestro grupo de investigación ha realizado varios trabajos donde se ha puesto de

manifiesto que las células ATDC5 muestran un comportamiento similar tanto en su

estado desdiferenciado como diferenciado, al menos en términos de activación de la

nitróxido sintasa tipo II (15, 16).

Para su mantenimiento, las células se cultivaron en medio DMEM/ Hams’F12 al que se

le añadió el 5% de Suero Fetal Bovino (FBS), antibiótico (50U/ml penicilina y 50µg/ml

estreptomicina), apo-transferrina (10µg/ml) y selenito sódico (3X10-8).

Para el mantenimiento en cultivo de las células se les hicieron diferentes pases en los

que se despegaron las células una vez alcanzado el 80% de confluencia,

aproximadamente cada 2-3 días. Para ello se retiró el medio de cultivo, se lavaron las

células con 3 ml de Tampón Fosfato Salino 1X (PBS: NaCl 8g/l, KCl 2g/l, Na2HPO4

1.44g/l, KH2PO4 0.24g/l) y se despegaron usando 1 ml de Tripsina/0.5% EDTA por

cada placa petri. Las células se dejaron unos 5 minutos a 37ºC hasta que estuvieron

despegadas y después se resuspendieron en medio con suero y se sembraron a una

densidad de 3x105 células por placa petri.

2.2. Las líneas celulares humanas.

Las líneas celulares humanas han sido cedidas por la Dra. Mary B. Goldring (Hospital

for Special Surgery, NYC, USA). Estas líneas celulares han sido aisladas a partir de

condrocitos juveniles de costilla inmortalizados. Para su mantenimiento, las células se

cultivaron en medio DMEM/ Hams’F12 al que se le añadió el 10% de FBS y antibiótico

(50U/ml penicilina y 50µg/ml estreptomicina).

Para su mantenimiento en cultivo, las células se despegaron una vez alcanzado el 80%

de confluencia, aproximadamente cada 5-6 días. Se retiró el medio de cultivo, se

lavaron las células con 3 ml de PBS 1X y se despegaron con 1 ml de Tripsina/0.5%

EDTA por placa. Las células se dejaron unos 5 minutos a 37ºC, se resuspendieron en

medio con suero y se sembraron a una densidad de 3x105 células por placa.

Material y Métodos

47

2.3. Aislamiento y cultivo primario de condrocitos humanos.

Todas las muestras humanas han sido obtenidas previa firma del correspondiente

consentimiento informado por parte de los pacientes. Se necesitó, además, conocer parte

del historial clínico de los pacientes de tal forma que se descartaron las muestras de

pacientes tratados con glucocorticoides u otros fármacos que afectasen a los

experimentos llevados a cabo con los condrocitos primarios, además de los pacientes

con artritis o alguna otra patología que afectase al cartílago.

El cartílago articular se obtuvo de pacientes a los que se les practicó una amputación

supra-condílea, se extrajo el cartílago articular procurando seleccionar y separar, por

examen morfológico, el cartílago normal, “sano”, del cartílago artrósico.

El cartílago se incluyó, siempre en condiciones estériles, en medio sin suero:

DMEM/F12 con Antibiótico (50U/ml penicilina y 50µg/ml estreptomicina).

Para el aislamiento de los condrocitos, el cartílago se troceó en una solución de PBS y

se sometió a digestiones secuenciales con Pronasa (número de catálogo 165921; Roche

Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) y Colagenasa P (número de catálogo

1213873; Roche Molecular Biochemicals) que se esterilizaron por filtración. El

cartílago troceado se incubó en una solución de Pronasa (1mg/ml en DMEM/F12 +

Antibiótico + 10% FBS) durante 30 minutos a 37ºC en agitación continua.

Pasado ese tiempo, se retiró la solución de Pronasa y se lavó el cartílago dos veces con

PBS 1X. A continuación se incubó el cartílago ya lavado en una solución de Colagenasa

P (1mg/ml en DMEM/F12 + antibiótico + 10% FBS) durante 6-8 horas a 37ºC en

agitación constante.

La suspensión celular final se filtró a través de un colador de nylon de 40μm de poro

(BD Biosciences Europe, Erembodegem, Belgium) para eliminar restos. Tras la

filtración, las células se centrifugaron 8-10 minutos a 200xg y se lavaron dos veces en

PBS.

Después de la centrifugación, se realizaron dos lavados en PBS 1X (centrifugando

nuevamente durante 8-10 minutos, 200xg después de cada lavado) y un lavado en

DMEM/F12 con Antibiótico y el 10% FBS.

Finalmente, se contaron las células, distinguiendo células vivas de células muertas

mediante Trypan Blue, y se sembraron a la densidad deseada en medio completo

(DMEM/F12 con Antibiótico y el 10% FBS).

Para su mantenimiento en cultivo, se renovó el medio de cultivo a los condrocitos en

cultivo cada dos días. Cuando fue necesario realizar pases a los condrocitos, se empleó

Material y Métodos

48

1ml de Tripsina/0.5% EDTA después de haber retirado el medio de cultivo y lavado las

células con PBS. Una vez añadida la tripsina, las células se dejaron a 37ºC durante unos

5 minutos para, posteriormente, resuspender las células en medio completo y sembrarlas

a la densidad deseada, tanto para la realización de experimentos como para su

mantenimiento en cultivo.

Todos los experimentos fueron realizados con condrocitos primarios con menos de tres

pases.

Para los distintos experimentos con los distintos tipos celulares, las células se sembraron

en placas de 24 ó 6 pocillos hasta lograr una adhesión completa y una confluencia del

85-90%. A las células se les retiró el suero durante toda la noche y se trataron a la

mañana siguiente según correspondiese. Con la serodeprivación se buscaba detener y

sincronizar el ciclo de crecimiento de las células, eliminar los distintos componentes del

suero para evitar posibles interferencias con nuestros tratamientos y liberar los distintos

receptores de membrana de sus respectivos ligandos. Cada experimento se hizo al

menos 3 veces de forma independiente.

3. Inmunohistoquímica.

Se sembraron 18000 células en portaobjetos de cristal estériles concentradas en una

pequeña gota de medio. Se dejaron adherir durante 4 horas, se cubrieron con medio y se

dejaron toda la noche para que se estabilizaran. Se fijaron en etanol al 90% durante 10

minutos y se montaron en portaobjetos de adhesión Dako (DakoCytomation,

Carpinteria, CA, USA).

-Anticuerpos primarios y procedimiento

Los anticuerpos de conejo anti-receptor de adiponectina 1 (AdipoR1), y anti-receptor de

adiponectina 2 (AdipoR2) (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, Belmont, CA, USA) se

diluyeron 1:100 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo de

ratón anti-colágeno II (Chemicon, Temecula, CA, USA) se diluyó 1:20 y se incubó toda

la noche a 4ºC. La liberación del epítopo del colágeno II se hizo en horno microondas

en tampón Tris EDTA 0.05M a pH9 (20 min a 700W) y proteinasa K (40 ml en 2 ml de

Tris HCl 0.05 M a pH 7.5, Dako) 5 minutos a 37ºC.

En la inmunohistoquímica sencilla, los anticuerpos primarios se incubaron como se

describió arriba. El sistema de detección empleado en este caso fue un anticuerpo

secundario anti-conejo conjugado con Alexa 488 (1:200 durante 1 hora con retro-

Material y Métodos

49

transcriptasa (RT) (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)) para AdipoR1 y AdipoR2.

Para detectar el colágeno II se utilizó un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con

Cyanine 3 (Sigma, St Louis, MO, USA) 1:100 durante 1 hora.

Para la tinción doble el protocolo empleado fue el siguiente: (1) liberación del epítopo

del colágeno II: 20 minutos en horno microondas en tampón Tris EDTA a pH9 y

proteinasa K (5 minutos a 37ºC); (2) incubación con el primer anticuerpo primario: anti-

colágeno II de ratón 1:20 toda la noche a temperatura ambiente; (3) incubación con el

anticuerpo secundario anti-ratón Cyanine 3 (1:100, 1 hora); (4) incubación con el

segundo anticuerpo primario: AdipoR1 o AdipoR2 (1:100, 1 hora); (5) e incubación con

el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa 488 (1:200, 1 hora). Entre

cada paso, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 5 minutos con TBS y tras el

último paso, se lavaron con agua destilada. Al final, los portaobjetos se montaron con el

medio de montaje Immuno-Fluore (ICN, Aurora, OH, USA). Las secciones se

observaron y fotografiaron usando un microscopio Provis AX70 (Olympus Corp.,

Tokyo, Japan).

4. Extracción de ARN y RT-PCR.

4.1. Extracción de ARN mediante TRIzol ®.

El ARN se extrajo de células en cultivo utilizando TRIzol LS® (Gibco BRL Life

Technologies, Grand Island, NY, USA), según lo que recomienda el proveedor.

Cuando fueron necesarios tratamientos previos a la extracción de ARN, las células se

sembraron en placas de 6 pocillos, sembrando 3.5x105 células en cada uno. Se dejaron

hasta adhesión completa y se privaron de suero toda la noche. A continuación se les

hizo el tratamiento pertinente y se esperó el tiempo estipulado antes de proceder a la

extracción del ARN. Cuando no fueron necesarios los tratamientos, el ARN se extrajo

de células sin serodeprivar.

Se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS. A continuación

las células se lisaron directamente en la placa de cultivo con 500 μl de reactivo de

TRIzol en cada pocillo. Se dejó reposar 5 minutos y el lisado celular se rascó y pipeteó

varias veces hasta conseguir reducir la viscosidad del lisado.

El lisado celular se transfirió a tubos de microcentrífuga tipo eppendorf de 1.5ml y se

les añadió 100μl de cloroformo por muestra, se agitaron los tubos y se incubaron

durante 2-3 minutos a temperatura ambiente.

Material y Métodos

50

Las muestras fueron centrifugadas a 12000xg durante 15 minutos a 4ºC. A continuación

se recogió la fase acuosa (superior) que contiene el ARN y se transfirió a un nuevo tubo

de 1.5 ml.

Para la precipitación del ARN, se mezcló la fase acuosa con 250μl de isopropanol. Las

muestras se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a

12000xg durante 10 minutos a 4ºC.

Se retiró el sobrenadante y se añadieron 500μl de etanol al 75% (en agua tratada con

dietilpirocarbonato [agua-DEPC]) para lavar el precipitado. Se agitaron las muestras en

un “vortex” y se centrifugaron durante 5 minutos a 7500xg y 4ºC.

Finalmente, se retiró el exceso de etanol y se secó el ARN precipitado (sin llegar a

secarlo completamente, lo cual dificultaría su resuspensión) para, a continuación,

resuspenderlo en agua libre de ARNasas (agua-DEPC).

La concentración de ARN de la muestra se determinó en un NanoDrop (ND-1000

Spectophotometer) seleccionando la aplicación de ácidos nucleicos y la sección de ARN

para determinar la concentración y el grado de pureza. La absorción a 260nm

proporciona la cantidad de ácidos nucleicos mientras que la absorción a 280nm informa

sobre la cantidad de proteína presente en la muestra. El grado de pureza de la muestra se

determinó obteniendo el cociente entre 260/280, considerándose aceptable un valor

entre 1.8 y 2.

4.2 Retrotranscripción.

El ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de 2μg de ARN total en un

volumen final de 30 μl. Para ello se utilizaron 200 unidades de la Moloney Murine

Leukemia Virus Reverse Transcriptase (MMLV-RT) (Invitrogen) y 6µl de la mezcla de

deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs,10µl de cada dNTP), 6µl de tampón de primera

cadena 5X (250µl Tris HCl, pH 8.3, 375µl KCl, 15µl MgCl2), 1.5µl de MgCl2 50mM,

0.17µl de solución de cebadores inespecíficos (3mg/ml), y 0.25µl de inhibidor

recombinante de las ribonucleasas (RNAseOutTM, 40 unidades/µl). La reacción se

llevó a un volumen final de 30µl con agua destilada estéril.

Las mezclas de reacción se incubaron a 37ºC durante 50 minutos y a 42ºC durante 15

minutos. Después se calentaron 5 minutos a 95ºC y se pusieron directamente en hielo

para conservarlas a 4-8ºC.

Material y Métodos

51

4.3. Reacción en cadena de la polimerasa.

Se utilizaron 3µl de ADNc obtenido de la mezcla de reacción de RT para la

amplificación por PCR. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 5µl de

tampón de PCR 10X (200µl Tris HCl, pH 8.4, y 500µl KCl), 1.5µl de MgCl2 50µl, 4µl

de mezcla de dNTP (0.2mM de cada dNTP), 150 ng de cada cebador (sentido y

antisentido) y 1.25 unidades de Taq ADN Polimerasa. Se añadió agua destilada estéril

hasta llegar al volumen final de reacción de 50μl.

Mediante PCR se estudió la expresión de los Receptores de Adiponectina 1 y 2 y se

utilizó la gliceraldehido-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga.

Los cebadores empleados fueron los siguientes:

-AdipoR1 de ratón del Genbank BC014875

sentido: 5’-ACGTTGGAGAGTCATCCCGTAT-3’

antisentido: 5’-CTCTGTGTGGATGCGGAAGAT-3’

-AdipoR2 de ratón del Genbank XM_132831

sentido: 5’-CCCAGGAAGATGAAGGGTTTAT3’

antisentido: 5’-TTCCATTCGTTCGATAGCATGA-3’

-AdipoR1 humano del Genbank NM_015999

sentido: 5’-TTCTTCCTCATGGCTGTGATGT-3’

antisentido: 5’-AAGAAGCGCTCAGGAATTCG-3’

-AdipoR2 humano del Genbank NM_024551

sentido: 5’-ATAGGGCAGATAGGCTGGTTGA-3’

antisentido: 5’-GGATCCGGGCAGCATACA-3’

-GAPDH del Genbank AK002273

sentido:5’-TCCATGACAACTTTGGCATCGTGG -3’

antisentido:5’-TTGCTGTTGAAGTCACAGGAGAC -3’

Las condiciones de amplificación para los receptores de ratón fueron: desnaturalización

a 95ºC durante 1 minuto, hibridación a 60ºC durante 1 minuto y extensión a 72ºC

durante 1 minuto; se completaron 40 ciclos de amplificación. Las condiciones de

amplificación para los receptores humanos fueron: desnaturalización a 95ºC durante 1

minuto, hibridación a 62ºC durante 1 minuto y extensión a 72ºC durante 1 minuto

completándose 35 ciclos de amplificación. Las amplificaciones fueron realizadas en un

termociclador automático (Mastercycler gradient®-Eppendorf).

La reacción de PCR generó un único producto de 132 pares de bases (pb) para el

AdipoR1 de ratón, un único producto de 72 pb para el AdipoR2 de ratón, un único

Material y Métodos

52

producto de 70 pb para el AdipoR1 de humanos, un único producto de 75 pb para el

AdipoR2 de humanos y un único producto de 376 pb para el GADPH.

Los controles negativos consistieron en la omisión de la mezcla de reacción de RT de

cada una de las muestras y en la amplificación de cada una de las muestras de la mezcla

de reacción de RT sin MMLV. La identidad del amplicón se confirmó con el uso de

controles positivos para la RT-PCR. Los productos de PCR se separaron en geles de

agarosa al 1.5% en TAE 1X (TAE 50X: Trizma base 2M, EDTA 50µl, ácido acético

glacial 8µl) teñidos con bromuro de etidio y se visualizó a continuación en un Typhoon

9410 Documentation System (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK).

5. Determinación de nitritos: ensayo colorimétrico de Griess.

Para los experimentos en los que se realizó la determinación de la producción de óxido

nítrico por parte de los condrocitos primarios o de la línea celular ATDC5, las células se

sembraron en placas de 24 pocillos, 80.000 células por pocillo en 1 ml de medio de

cultivo. Una vez que las células estuvieron adheridas de forma estable se serodeprivaron

toda la noche.

Pasado ese tiempo, se realizaron los distintos tratamientos, tanto con los inhibidores

farmacológicos empleados como con la adiponectina y el LPS como control positivo.

Tras 24 y 48 horas, se retiró el medio de cultivo, se centrifugó para eliminar la presencia

de células en él y se pasó a la determinación de la producción de óxido nítrico por parte

de las células.

Dicha determinación se realizó de forma indirecta, a través de la presencia de nitritos en

el medio de cultivo mediante el ensayo colorimétrico de Griess.

Para ello se emplearon dos reactivos [Sulfanilamida 1% en ácido fosfórico al 5% en

agua (P/V) y α-naphtylamina al 0.1% en agua (P/V)] mezclados en una relación 1:1.

Para la determinación en el sobrenadante celular de la cantidad de nitritos se mezclaron

volúmenes iguales del reactivo de Griess y el medio de cultivo: se mezclaron 50μl de

medio y 50μl de solución de trabajo por cada uno de los distintos tratamientos.

Se hicieron mediciones en duplicado de cada uno de los puntos. El medio sin suero se

utilizó como blanco. Esta mezcla se dejó reposar 5-10 minutos a temperatura ambiente.

Los nitritos, el ácido nitroso, reaccionan con la sulfanilamida formando ácido 4-

diazobencenosulfónico, el cual reacciona con la α-naphtylamina dando lugar a un

colorante rojo-violeta, la sal de diazonio (Figura 6). La intensidad de color es mayor

Material y Métodos

53

cuanta mayor es la cantidad de nitrito en el medio de cultivo. Una vez pasados 5-10

minutos, se determinó la cantidad de nitrito midiendo la absorbancia a 520-550 nm en

un lector de ELISA evitando la formación de burbujas que alterasen las lecturas de

absorbancia dentro de los pocillos.

Figura 6. Reacción de Griess. En la determinación colorimétrica de nitritos según Griess, los nitritos (ácido nitroso) reaccionan con la sulfanilamida dando ácido 4-diazobencenosulfónico [1]. Éste se condensa con la α-naphtylamina formando un colorante rojo-violeta, ácido diazoico [2].

A partir de las absorbancias obtenidas y, debido a la relación lineal existente entre la

absorbancia y la concentración, es posible extrapolar la concentración de nitritos

presente en el medio de cultivo interpolando las absorbancias obtenidas en una curva

estándar, previamente realizada a partir de distintas diluciones de nitrito sódico (0 -

0.0625 - 0.125 - 0.25 - 0.5 – 1 – 2 – 4 – 6μg/ml).

6. Western blot.

Para la realización de esta técnica los condrocitos humanos en cultivo y las células

condrogénicas de ratón ATDC5 se sembraron en placas de 6 pocillos. Se les permitió

llegar a adhesión completa y estar a un 85-90% de confluencia. Posteriormente, las

células se serodeprivaron toda la noche. Las células se estimularon con adiponectina

(BioVision Research Products, Mountain View, CA, USA) a diferentes tiempos (5, 10,

1)

2)

COLORANTE DIAZOICO

1)

2)

COLORANTE DIAZOICO

1)

2)

1)

2)

COLORANTE DIAZOICO

Material y Métodos

54

30, 120 min) para los estudios de activación de AMPK. Se hizo un tratamieto con

adiponectina a diferentes dosis (0.1 y 1mg/ml) a 48 horas para los estudios de activación

de NOS tipo 2 y PI3-K. En los experimentos de activación de NOS tipo 2 se utilizó el

LPS (500 ng/ml) como control positivo.

Pasado ese tiempo se lisaron las células para la extracción de proteína total. Se retiró el

medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS 1X a 4-8ºC. Una vez

lavadas, las células se despegaron raspando y usando 200μl de tampón de lisis (Triton,

Tris 1M pH 7.5, PMSF 0.1M, NaVO4 0.1M, Pirofosfato sódico 0.1M, EDTA 0.5M,

Aprotinina, Leupeptina, NaF 1X). Los lisados se transfirieron a tubos de micro-

centrífuga de 1.5ml y se incubaron durante 15-20 minutos en hielo, pipeteando arriba y

abajo cada 5 minutos para favorecer la lisis.

Los lisados se centrifugaron a 14000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante,

que contiene el lisado celular total, se transfirió a tubos nuevos y limpios de micro-

centrífuga de 1.5ml. Una vez obtenido el lisado celular, se cuantificó la cantidad total de

proteína mediante el método colorimétrico de Bradford que, enfrentando la absorbancia

de una muestra desconocida con la de una muestra con una cantidad de proteína

conocida, nos permitió extrapolar la cantidad de proteína en nuestras muestras.

La recta estándar se preparó partiendo de albúmina bovina sérica (BSA) a una

concentración de 1mg/ml y reactivo Biorad 1X (obtenido diluyendo el reactivo

comercial, 5X, en agua destilada). A partir de esa concentración de BSA, mediante

diluciones seriadas, se obtuvo la recta estándar (1, 2.5, 5, 10, 15 y 20μg/ml de BSA) que

nos permitió extrapolar la cantidad de proteína en las muestras. Se midieron las

absorbancias, de la recta estándar y las muestras, a 595nm y se extrapoló la

concentración de proteína de las muestras.

La separación por electroforesis de las proteínas, previamente desnaturalizadas, (30μg

de proteína hervida en tampón de carga [Glicerol, Azul de bromofenol y β-

mercaptoetanol] 4X) se realizó en un gel de acrilamida al 10% de SDS-PAGE (agua

destilada; acrilamida 30%; SDS 10%; Tris-HCl 1.5M, pH 8.8; persulfato amónico 10%

y TEMED) empleando como tampón de migración el formado por Tris Base, Glicina y

SDS al 10%. La electroforesis se realizó durante dos horas y media a voltaje constante

(90V).

Una vez separadas, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond

TM-P; Amersham International, Little Chalfont, K). La membrana se hidrató usando

Material y Métodos

55

metanol (1 minuto), agua (5 minutos) y dejándola en tampón de transferencia (Tris

Base, Glicina, Metanol 20% y agua) hasta su uso. El gel se equilibró en tampón de

transferencia 1X durante, aproximadamente, 5 minutos.

La transferencia se realizó mediante el método de transferencia húmeda. En la carcasa

se colocó papel Whatman hidratado en tampón de transferencia 1X. A continuación, se

colocó el gel de electroforesis, sobre él la membrana ya hidratada y, finalmente, se

colocó papel Whatman, también hidratado en tampón de transferencia 1X. Se

eliminaron las burbujas de aire entre el gel y la membrana y se procedió a la

transferencia (aplicando un voltaje constante de 90V durante 1 hora).

Una vez transferida, la membrana se bloqueó (tampón de bloqueo: 5% de leche

desnatada en polvo en TBS-T [NaCl 150mM; Tris 20mM, pH 7.6; Tween 0.1%])

durante 2 horas, a temperatura ambiente y con agitación continua. Una vez bloqueadas,

las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios pertinentes diluidos en

tampón de bloqueo toda la noche a 4ºC en agitación continua. Los anticuerpos

utilizados han sido los siguientes: (1) anti-NOS2 diluido 1:1000 (Upstate, Lake Placid,

NY, USA), (2) anti-AMPK diluido 1:1000, (3) anti-Phospho-AMPK diluido 1:1000 (2 y

3 de Cell Signalling Technology, Inc, Dambers, MA, USA), (4) anti-PI3-K diluido

1:1000 (Upstate, Lake Placid, NY, USA) y (5) anti-b-actin diluido 1:2500 (Sigma, St

Louis, MO, USA) .

Una vez pasado el tiempo de incubación, la membrana se lavó en TBS-T (3 lavados de

10 minutos cada uno, a temperatura ambiente y en agitación continua) y se incubó con

el anticuerpo secundario (α-rabbit, o α-mouse, según correspondiese) durante 1 hora, a

temperatura ambiente y agitación continua, en tampón de bloqueo a una dilución

1:5000.

La membrana se lavó en TBS-T (3 lavados, 10 minutos cada uno) y se incubó con ECL

plus (5 minutos, temperatura ambiente) para, posteriormente, revelarla en un EC3

Imaging System (UVP, Upland, CA, USA).

Posteriormente, la membrana se liberó del anticuerpo para posteriores hibridaciones con

otros anticuerpos y el control de carga: anti-beta-actina (β-actina). Para ello se empleó

un tampón con SDS 10%, Tris-HCl 2M, pH 6.8; β-mercaptoetanol y agua. El tampón se

precalentó a 55ºC y, posteriormente, la membrana se incubó en ese tampón durante 30

minutos a 55ºC. Finalmente, se lavó la membrana 3 veces, 10 minutos cada lavado, en

TBS-T.

Material y Métodos

56

Se bloqueó nuevamente la membrana en una solución al 5% de leche en TBS-T (2 horas

a temperatura ambiente, en agitación continua). Posteriormente, la membrana se lavó en

TBS-T y se le hizo la incubación con el siguiente anticuerpo como se ha descrito

anteriormente.

Las imágenes obtenidas fueron densitometradas utilizado la herramienta ImageMaster

TotalLab (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

7. Ensayo de unión a receptor (Binding Assay).

Se utilizaron las células ATDC5 para ver si había unión de obestatina a las mismas.

Para ello, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 350000

células por pocillo. Las células se dejaron adherir completamente y crecer hasta una

confluencia de un 70-80% para incubarlas después en medio sin suero toda la noche.

Las células se lavaron una vez en el tampón del kit antes de realizar las incubaciones en

presencia de obestatina marcada con 125I. Se preparó un tampón de binding formado por

PBS con 0.5% p/v de BSA (fracción V), y con 120000 cuentas por minuto (cpm) de

obestatina 125I (con una actividad específica de 1500Ci/mmol). El tampón de binding se

mezcló con diferentes concentraciones conocidas de obestatina sin marcar para hacer

los estudios de desplazamiento de unión. Además, se hicieron un punto de unión total

compuesto por obestatina marcada y un punto de unión inespecífica, en el que las

células se incubaron en presencia de obestatina marcada y con un exceso de hormona

sin marcar. La incubación se hizo en 1 ml de volumen final por pocillo durante 16-18

horas. La incubación se hizo a 4ºC para evitar la internalización del receptor y/o el

ligando y sobre-estimar la capacidad de unión.

Al final de la incubación, se aspiró el sobrenadante y se eliminó el marcaje no unido con

dos lavados de PBS frío. Las células se lisaron con 1ml de NaOH 1N, se dejó 10

minutos a temperatura ambiente, se resuspendió bien y se transfirió el lisado a tubos de

RIA. Se midió la radioactividad en los lisados utilizando un γ-counter (1261; LKB-

Wallac, Gaithersburg, MD).

La unión específica de obestatina a las células se determinó restando la cantidad de

obestatina marcada en presencia de obestatina sin marcar.

Para el análisis de scatchard, se utilizaron cantidades crecientes de obestatina sin marcar

(1-1000nM) para competir con la obestatina marcada con 125I en condiciones de

saturación. Se utilizó el software de ligando (Elsevier-Biosoft, Cambridge, UK) para

calcular la constante de disociación (Kd) y la capacidad de unión.

Material y Métodos

57

8. Ensayo colorimétrico para medir actividad metabólica (MTT)

El ensayo MTT analiza la actividad metabólica de las células viables dentro del cultivo.

El ensayo se realiza empleando el compuesto marcado 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-

diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Roche Molecular Biochemicals, Barcelona,

España). Este producto es metabolizado por las enzimas deshidrogenasas

mitocondriales de la célula, dando lugar a la formación de una sal (cristales violeta de

formazán) que presenta un grupo diazónico. La metabolización del compuesto MTT

depende de la actividad redox de la célula y es reflejo de la función mitocondrial por lo

que se utiliza como indicador del estado metabólico de la célula. Se emplea además

como medida indirecta de la viabilidad o proliferación celular (225). Esta sal absorbe la

luz a una longitud de onda de 550nm. La absorbancia se correlaciona directamente con

la actividad metabólica, de forma que cuanta más actividad metabólica hay, más

absorbancia. Los ensayos se realizaron de acuerdo a las instrucciones y protocolo

aportado por el fabricante.

Las células ATDC5 se sembraron en placas de 96 pocillos, sembrando 8000 células por

pocillo. Tras la adhesión completa, las células se incubaron en medio sin suero y se

estimularon con obestatina (1000, 100 y 10nM) a 37ºC. Tras 44 horas de tratamiento, se

añadió la solución con el reactivo marcado MTT (concentración final 0.5mg/ml) a cada

pocillo, y la incubación continuó durante 4 horas más a 37ºC hasta alcanzar las 48 horas

de tratamiento. Tras esta incubación, se añadieron 100μl de solución de solubilización

(SDS 10% en HCl 0.01M) a cada pocillo hasta lograr una solubilización completa de los

cristales violeta de formazán. Se midió la absorbancia por espectrofotometría en un

lector de ELISA microtiter a 550nm (Multiskan EX, Labsystem, Helsinki, Finland). Se

hicieron al menos 4 experimentos independientes con 16 observaciones por tratamiento

cada uno.

9. Ensayo de captación de ácidos grasos (BODIPY 3823).

Para la realización del experimento de captación de ácidos grasos, se utilizó el ácido

graso de cadena larga 4,4-difluoro-5-metil-4-bora-3-diaza-3-indaceno-3-dodecanoico

(BODIPY 3823 [Boron dipyrromethene], Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) marcado

con FITC. Este ensayo nos permite medir la capacidad de las células de captar ácidos

grasos de cadena larga, que al estar marcados con fluorescencia, se puede analizar por

citometría de flujo.

Material y Métodos

58

Este experimento se hizo en la línea celular ATDC5. Se sembraron 300000 células en

placas de 6 pocillos que se dejaron hasta adhesión completa y llegar a un 85-90% de

confluencia. A continuación las células se privaron de medio toda la noche y se trataron

con obestatina (1 y 0.1μM) durante 2 horas. Tras el tratamiento se lavaron dos veces

con PBS a temperatura ambiente y se incubaron en una solución de PBS con BSA

20μM (libre de ácidos grasos) y BODIPY 3823 10μM durante 30 segundos. Tras la

incubación las células se lavaron dos veces con PBS-0.1%BSA para eliminar el exceso

de BODIPY unido inespecíficamente a la superficie.

Las células se despegaron con tripsina y se resuspendieron en PBS. Se centrifugaron 5

minutos a 1500rpm y se resuspendieron en 1ml de PBS al que se le añadió Yoduro de

Propidio ([1μM]) para discriminar las células muertas en el análisis de citometría de

flujo. La fluorescencia del BODIPY se midió en un citómetro de flujo FACS Calibur

Becton Dickinson (BD; San Jose, CA) y los resultados se analizaron usando el software

CellQuest (BD).

10. Ensayo de captación de glucosa.

En este ensayo se analiza la capacidad de las células para incorporar la glucosa a través

del citoplasma para posteriormente ser metabolizada.

Para la realización de este experimento se utilizaron las células ATDC5 y se sembraron

en placas de 24 pocillos. Se sembraron 80000 células por pocillo y se dejaron hasta

adhesión completa tras lo que se las privó de suero toda la noche. A continuación, las

células se trataron con insulina (12,5μg/ml), interleuquina 1-beta (100ng/ml) y

obestatina (1 y 0.1μM) durante 24 horas (226).

Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con la solución equilibrada de

Hanks libre de glucosa (HBS: NaCl 140mM, KCl 5mM, MgSO4 2.5mM, CaCl2 1mM,

HEPES 20mM a pH7.4). A continuación, las células se trataron durante 30 minutos con

una solución compuesta por glucosa 2-deoxy-D-[3H]glucosa (500000cpm por pocillo)

(Amersham Pharmacia Biotechnology Inc. Bioscience, Freiburg, Germany), con una

actividad específica de 16Ci/mmol, diluida en HBS con 2-deoxi-D-glucosa (10μM) a

temperatura ambiente.

Para cuantificar la captación de glucosa no específica, y como control negativo, se

utilizó un inhibidor de la captación de glucosa, la cytochalasin B (10μM). El valor de

este punto se le restó a todas las mediciones, hechas cada una al menos en triplicado.

Material y Métodos

59

Finalmente, las células se lavaron dos veces con NaCl al 0.9% frío y se lisaron con

500μl de NaOH 0.05N. De los lisados celulares se cogió una alícuota de 50μl para

hacer la medición de la concentración de proteína en cada punto. El lisado restante se

mezcló con 3 volúmenes de líquido de centelleo y se midió en un contador beta (Wallac

1414 WinSpectral v.140 S/N 4140376).

La cuantificación de la proteína se realizó mediante el método de Lowry, utilizando el

kit de Protein Assay (Bio-Rad Laboratorios, Hercules, CA, USA). Se hizo una recta con

concentraciones conocidas de BSA para interpolar en ella los resultados obtenidos. Se

mezclaron 40μl de la solución A con 400 μl de la solución B del kit de cuantificación

con 10μl de la muestra. Tras 15 minutos de incubación se realizó la lectura de la

absorbancia a 750nm en un espectofotómetro (Beckman DU62).

El resultado final del análisis de incorporación de glucosa se expresó como la molaridad

de glucosa marcada de cada punto del ensayo con respecto a la concentración proteica y

al tiempo de exposición de la glucosa marcada en competición con la glucosa fría:

pmoles/mg de proteína/minuto y se representó como % sobre el control no estimulado.

11. Ensayo de viabilidad con Yoduro de Propidio.

Para la realización de este experimento se sembraron 1x106 células ATDC5 en frascos

de cultivo de 25 cm2 y se dejaron hasta adhesión completa. Las células se privaron de

suero durante toda la noche. Las células se trataron con obestatina (1000, 100 y 10nM)

durante 48 horas. A continuación las células se tripsinizaron y resuspendieron en PBS y

se centrifugaron durante 5 minutos a 1500rpm. Las células se resuspendieron en 1 ml de

paraformaldehido al 0.1% en PBS y se dejaron durante 5 minutos. A continuación se le

añadieron 4 ml de PBS antes de centrifugar 5 minutos a 1500rpm. Después las células

se resuspendieron en 2ml de etanol al 70% en agua, se guardaron a –20ºC y se dejaron

toda la noche a –20ºC. Al día siguiente se añadieron 4 ml de PBS a las células y se

centrifugaron 5 minutos a 1500rpm. Las células se resuspendieron en 0.5ml de PBS y se

les añadió 1mg/ml de ARNasa y 40μg/ml de yoduro de propidio. El yoduro de propidio

se intercala entre el ADN, lo que permite determinar la cantidad y calidad del ADN

presente en la célula, además de clasificar las fases del ciclo celular. Tras 30 minutos de

incubación a oscuras las células se analizaron por citometría de flujo en un

FACSCalibur (Becton & Dickinson, San José, CA, USA) y se analizaron utilizando el

programa de análisis Cell Quest.

Material y Métodos

60

12. ELISAS

Los ensayos de ELISA se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Los

ensayos realizados han sido los siguientes:

MMP-2 (DMP200), MMP-3 (MMP300), MMP-9 (MMP900), y TIMP-1 (MTM100)

que se compraron a R&D Systems Europe, Abingdon, UK y se desarrollaron en

sobrenadante de cultivo celular.

IL-1b (EMIL1B), IL-6 (EM2IL6), monocyte chemoattractant protein (MCP)-1

(EMMCP1), TNF-a (EMTNFA), prostaglandin E2 (PGE2) (EHPGE2) y leukotriene B4

(LTB4) (EHLTB4) que se compraron a Pierce Biotechnology, Rockford, USA y se

utilizaron con sobrenadante de cultivo celular.

Leptina, adiponectina y resistina se compraron a LINCO Research, St.Charles, Missouri

63304 USA y se desarrollaron en plasma.

Visfatina se obtuvo de Phoenix Pharmaceuticals, Inc (Belmont, CA) y se utilizó con

muestras plasmáticas.

Obestatina (EK03190) se compró a Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, California,

USA y se analizó en sobrenadantes celulares.

El rango, la sensibilidad y la precisión inter-ensayo están descritos en las hojas técnicas

del proveedor.

13. Análisis estadístico

Los datos obtenidos en este trabajo se expresan como media ± error estándar medio

(S.E.M.) de al menos tres experimentos independientes y se analizaron con un programa

de análisis estadístico (Instat-GraphPad Software Inc.).

Para calcular las diferencias significativas de los niveles plasmáticos de las adipoquinas

estudiadas entre pacientes y controles se utilizó el test no paramétrico de Mann-

Whitney. En el estudio de correlación entre pacientes y controles se empleó el test no

paramétrico de Spearman. La correlación entre las concentraciones de adipoquinas y la

CRP se analizó por regresión lineal.

En los experimentos de densitometría, acumulación de nitritos, concentración de

analitos en sobrenadante celular, ensayos de actividad metabólica, ensayos de viabilidad

celular y ensayos de captación de glucosa y ácidos grasos, las diferencias se analizaron

mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido de un test de comparación múltiple

Student-Newman-Keuls. En el ensayo de unión (binding) se utilizó un software

Material y Métodos

61

especializado para calcular la constante de disociación (Kd), la capacidad de unión

máxima (Bmax) y el número de puntos de unión por célula.

Se consideraron significativos los valores de p<0.05.

14. Reactivos.

Todos los reactivos se compraron a Sigma (Louis, MO, USA) a menos que se

especifique lo contrario. Los productos de reverse transcriptase-polymerase chain

reaction (RT-PCR) se obtuvieron de Invitrogen (Invitrogen, Life Technologies,

Carlsbad, CA, USA) y el medio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/Ham’s

F12 y la Tripsina/EDTA se compraron a Lonza (Lonza Group Ltd, Basel, Q13

Switzerland).

Resultados

Resultados

65

IV. RESULTADOS

1. Determinación de los niveles plasmáticos de leptina, adiponectina, visfatina y

resistina en pacientes con artritis reumatoide y en sus correspondientes controles

sanos.

Hemos analizado los niveles plasmáticos de cuatro de las adipoquinas más relevantes

sintetizadas por el tejido adiposo, leptina, adiponectina, visfatina y resistina, en

pacientes con artritis reumatoide. Estos valores los hemos comparado con los controles

sanos para determinar si hay variaciones en los niveles plasmáticos de estas adipoquinas

a causa de la enfermedad. Los resultados obtenidos por ELISA específico para cada una

de las adipoquinas se expresan en la Figura 7 y en la siguiente tabla (Tabla 4).

Figura 7. Niveles plasmáticos de adipoquinas en pacientes con artritis reumatoide y en pacientes sanos. A. Niveles plasmáticos de leptina (ng/ml). B. Niveles plasmáticos de adiponectina (μg/ml). C. Niveles plasmáticos de resistina (ng/ml). D. Niveles plasmáticos de visfatina (ng/ml).

Resultados

66

Tabla 4. Concentraciones de adipoquinas en pacientes y controles.

Adipoquina Artritis Reumatoide Control Significatividad

Leptina 33.9±7.3ng/ml 13.3±3.04ng/ml p=0.0144

Adiponectina 13.56±2.1μg/ml 7.6±0.7μg/ml p=0.0375

Visfatina 100.35±1.2ng/ml 89.56±1.1ng/ml p<0.001

Resistina 9.956±0.7ng/ml 8.62±0.8ng/ml ns

Se puede observar que los niveles de leptina, adiponectina y visfatina son

significativamente más altos en los pacientes con artritis reumatoide que en los

controles. Y además se puede ver que no hay diferencias significativas en los niveles de

resistina entre los pacientes y los controles.

Además, hemos analizado la relación entre las concentraciones de adipoquinas y los

niveles de proteína C reactiva (CRP) en los pacientes con artritis reumatoide. Este

estudio ha mostrado que los niveles de CRP se correlacionaban significativamente con

leptina, adiponectina y visfatina, aunque no así con resistina. Los valores se muestran en

la siguiente tabla (Tabla 5).

Tabla 5. Correlación entre adipoquinas y CRP.

Leptina r=0.71 p=0.0079

Adiponectina r=0.59 p=0.031

Visfatina r=0.63 p=0.043

Resistina r=0.15 ns

2. Estudio del efecto de la adiponectina sobre condrocitos en cultivo y vias de

señalización.

2.1 Expresión de los receptores de adiponectina y funcionalidad.

Hemos hecho el estudio de la presencia de los receptores de adiponectina en los

condrocitos, para determinar la posibilidad de que la adiponectina ejerza alguna función

sobre estas células.

En primer lugar determinamos la presencia de los receptores de adiponectina por

inmuno-fluorescencia (Figura 8). Con los anticuerpos específicos frente a AdipoR1 y

AdipoR2 determinamos la inmuno-reactividad en las siguientes líneas celulares: la línea

de ratón ATDC5, tanto en su estado pre-condrogénico como en su estado diferenciado y

Resultados

67

en la línea humana de condrocitos inmortalizados C28/I2. En todas ellas se aprecia la

presencia de los anticuerpos unidos en el citoplasma de las células.

C28Adipo R1

C28Adipo R2

ATDC5 Adipo R1

ATDC5Adipo R2

ATDC5 DIFAdipo R1

ATDC5 DIFAdipo R2

a b

c

e

d

f

hCondr OAAdipo R1

hCondr OA Adipo R2

hCondr OAColageno II

hCondr OAColageno II

hCondr controlAdipo R1

hCondr controlColageno II

hCondr controlAdipo R2

hCondr controlColageno II

m

conjunto

conjunto

conjunto

conjuntoa b

d

c

g

e f

h i

lkj

Figura 8.Expresión de los receptores de adiponectina en condrocitos. Panel superior: los receptores de adiponectina tipo 1 y 2 se expresan en la línea de ratón no diferenciada ATDC5 (a y b, respectivamente), en la línea de ratón ATDC5 diferenciadas (c y d, respectivamente) y en la línea de condrocitos humanos inmortalizados (e y f, respectivamente). Panel inferior: el receptor de adiponectina tipo 1 se expresa en condrocitos en cultivo normales (a) y en condrocitos en cultivo de pacientes artrósicos (g). El receptor de adiponectina tipo 2 se expresa en condrocitos humanos normales en cultivo (d) y en condrocitos humanos en cultivo de pacientes artrósicos (j). Todos los condrocitos en cultivo mostraron inmuno-fluorescencia positiva para colágeno tipo II como marcador específico de condrocitos (b, e, h y k). La co-localización de los receptores de adiponectina con el colágeno tipo II se muestra en c, f, i y j.

La presencia de los receptores de adiponectina también se testó en los condrocitos

humanos normales y artrósicos en cultivo. Para detectar los receptores en estas células,

Resultados

68

se hizo una doble inmunocitoquímica, para comprobar la presencia de los mismos, y

además, para comprobar el fenotipo de las células con el anticuerpo frente a colágeno II,

marcador de condrocito. Con el anticuerpo frente a colágeno descartamos la posibilidad

de que las células humanas en cultivo sean otro tipo celular diferente de condrocitos,

siendo así un control positivo para este tipo celular. En los estudios de co-localización

se aprecia positividad para AdipoR1 y AdipoR2 de forma conjunta con el colágeno II en

los dos tipos de condrocitos humanos en cultivo, normales y artrósicos (panel inferior

de la Figura 8).

Además comprobamos la expresión de estos receptores por RT-PCR corroborando los

datos obtenidos en inmuno-histoquímica. Se utilizaron parejas de cebadores específicos

para la amplificación de cada uno de los receptores y, a su vez, para cada especie,

humano y ratón. Como se puede ver en la Figura 9, se obtuvo un producto de 132 pb y

otro de 72 pb que indican la expresión de los ARNm de los receptores de adiponectina,

AdipoR1 y AdipoR2 respectivamente, en las células de la línea de ratón ATDC5 (AT)

(A). Los condrocitos humanos normales en cultivo (hC), así como las líneas de

condrocitos humanos inmortalizados TC20a2 (TC), C28/I2 (C28) y C20/A4 (C20)

también expresan el ARN mensajero de los receptores, en este caso originando unos

productos de 70 pb para el AdipoR1 y 75 pb para el AdipoR2 (B). El músculo

esquelético (SM) y el hígado (Liv) se utilizaron como control positivo para la expresión

del ARN mensajero de AdipoR1 y AdipoR2 respectivamente.

Una vez comprobada la presencia de los receptores de adiponectina en nuestras líneas

celulares, nos propusimos comprobar la funcionalidad de los mismos. Para ello

elegimos las células ATDC5. Hicimos tratamientos con adiponectina (1μg/ml) a

diferentes tiempos (5, 10, 30 y 120 minutos) sobre estas células y estudiamos, mediante

Western blot, la fosforilación de AMPK. La AMPK es una de las primeras enzimas

implicadas en la ruta de señalización de estos receptores y se puede apreciar, en estas

células, con esta dosis y a estos tiempos, una rápida fosforilación a los 5 minutos de

AMPK (C1). Los Western blot realizados se cuantificaron con densitometría (C2), y se

vio que esta rápida fosforilación a los 5 minutos disminuía con el tiempo.

Resultados

69

Figura 9. Expresión de los receptores de Adiponectina (AdipoRs) y su funcionalidad en condrocitos. Panel A: expresión de AdipoR1 y AdipoR2 en células ATDC5 (AT) determinado por RT-PCR. El músculo esquelético (SM) y el hígado (Liv) se utilizaron como controles positivos para AdipoR1 y AdipoR2 respectivamente. Panel B: expresión de AdipoR1 y AdipoR2 en las líneas humanas C20A4 (C20), C28/I2 (C28), TC28a2 (TC) y en condrocitos humanos en cultivo (hC), determinado por RT-PCR. El músculo esquelético (SM) y el hígado (Liv) se utilizaron como controles positivos para AdipoR1 y AdipoR2 respectivamente. Panel C: Western blot para AMPK fosforilada. AMPK fosforilada se identificó mediante el anticuerpo anti-fosfo-AMPKα Thr172 (Cell Signalling catalog number 2531, 62kDa) en lisados de células ATDC5 estimuladas con adiponectina (1μg/ml). Los niveles de fosforilación se evaluaron, en experimentos tiempo-respuesta y se compararon con los niveles totales de AMPK (anticuerpo anti-AMPKα, Cell Signalling catalog number 2532, 62kDa). La imagen es representativa de al menos 4 experimentos independientes (C1). El análisis de densitometría de los experimentos de western blot se muestra en el panel C2. Los datos se muestran como porcentaje ± S.E.M. sobre el nivel basal de fosforilación de AMPK en las células no estimuladas.

2.2 Efecto de la adiponectina sobre la expresión y actividad de NOS tipo 2.

Cuando las células de ratón ATDC5 se trataron con adiponectina (0.1 y 1 μg/ml), se

observó un incremento significativo de la acumulación de nitritos en el sobrenadante

celular. Se vio que este efecto era dosis dependiente y se tomaron datos a 24 y 48 horas.

Como control positivo de la inducción de la acumulación de nitritos, se utilizó el LPS

(500 ng/ml), un fuerte inductor de la NOS tipo 2. Como se muestra en la Figura 10

(panel A, recuadro interior), el incremento en la acumulación de nitritos va acompañado

de la inducción de la proteína, NOS tipo 2, como se puede apreciar por Western blot a

48 horas.

Resultados

70

Figura 10. Inducción de NOS tipo 2 por adiponectina. Panel A: Adiponectina (0.1 y 1μg/ml) induce la acumulación de nitritos en las células ATDC5 de una forma dosis dependiente. El LPS (500 ng/ml) se utilizó como control positivo. Los nitritos se evaluaron a 24 (barras negras) y 48 (barras grises) horas. Este resultado se confirmó por Western blot. La inducción de la síntesis de NOS tipo 2 por adiponectina es dosis dependiente y el LPS se utilizó como control positivo a 48 horas (panel interno). Panel B. La acumulación de nitritos inducida por adiponectina (1μg/ml) en las células ATDC5 estaba modulada por distintos inhibidores farmacológicos específicos [aminoguanidina (1mM), LY294002 (10μM) y dexametasona (10μM)]. Todos los inhibidores se añadieron una hora antes del tratamiento con adiponectina y redujeron significativamente la acumulación de nitritos mientras que la síntesis de NOS tipo 2 se redujo con LY294002 (B1). Panel C. La acumulación de nitritos en condrocitos humanos en cultivo inducida por adiponectina (1μg/ml) en presencia o no de diferentes inhibidores farmacológicos [aminoguanidina (1mM) y LY294002 (10μM)] a 24 (barras negras) y 48 (barras grises) horas. La expresión de la proteína NOS tipo 2 estaba selectivamente disminuida por LY294002 (C1).

Para corroborar que la formación de óxido nítrico era producido vía NOS tipo 2, las

células se trataron con adiponectina en presencia de inhibidores del enzima.

En la línea celular ATDC5 se utilizó la dosis de 1 μg/ml de adiponectina en presencia

de aminoguanidina (1µl), un inhibidor específico de la actividad de la NOS tipo 2 en

comparación con las otras isoformas, y de dexametasona (10µl), un inhibidor clásico de

Resultados

71

la síntesis de novo de NOS tipo 2. Ambos inhibidores se añadieron una hora antes de la

administración de la adiponectina al cultivo. Los nitritos se midieron a las 24 y 48 horas

(Figura 10, panel B). La acumulación de nitritos inducida por la adiponectina se vio

fuertemente inhibida en presencia de ambos inhibidores, apoyando el que la

acumulación de nitritos es debida a la inducción de la NOS tipo 2.

Estos mismos experimentos se realizaron en condrocitos humanos en cultivo (Figura

10, panel C). Las células se trataron con adiponectina y con aminoguanidina, a las

mismas dosis. También en estas células se observa como el inhibidor de la NOS tipo 2

es capaz de inhibir la acumulación de nitritos inducida por la adipoquina. Este resultado

nos indica que los datos observados no se deben a la línea celular, sino que en

condrocitos humanos en cultivo también sucede, dándole más importancia a este

resultado, que no es ni especie- ni línea- específico.

2.3 La inhibición de PI3K bloqueó la producción de NO inducida por adiponectina y la

expresión de la proteína NOS tipo 2.

Dado que hay numerosos estudios en los que se sugiere que la PI3K está participando

en la activación de la NOS tipo 2, nos propusimos estudiar si esta quinasa está

implicada en la ruta de señalización de la adiponectina que culmina con la expresión y

activación de NOS tipo 2.

Para testar la implicación de PI3K en esta ruta, utilizamos un inhibidor farmacológico

específico, el LY294002 a una dosis de 10µl. La dosis se seleccionó de acuerdo con la

literatura publicada hasta la fecha (16, 17). Al tratar las células ATDC5 con

adiponectina y con el inhibidor LY294002, se observa cómo, tras 48 horas de

tratamiento, la adiponectina ha fosforilado a PI3K (Figura 10, panel B). Esta

fosforilación está inhibida en presencia del LY294002. Además, tanto en la línea celular

de ratón ATDC5 como en condrocitos humanos en cultivo, se ve cómo la presencia del

LY294002, añadido una hora antes que la adiponectina al cultivo, no sólo inhibe la

fosforilación de PI3K, sino que también es capaz de bloquear específicamente la

acumulación de nitritos (Figura 10, panel C). Este resultado también se confirmó en

términos de expresión de NOS tipo 2, ya que se vio como el pre-tratamiento con

LY294002 bloqueó la expresión de NOS tipo 2, como se puede ver en los paneles

interiores por Western blot.

Resultados

72

2.4 El efecto de la adiponectina sobre citoquinas, metaloproteasas y prostanoides.

Para completar el estudio del efecto de la adiponectina sobre los condrocitos,

analizamos la presencia de algunos factores importantes en el desarrollo de patologías

asociadas al cartílago en el sobrenadante celular.

Hemos visto que la adiponectina es capaz de incrementar la acumulación de IL-6, MCP-

1, MMP-3 y MMP-9 en el sobrenadante de células ATDC5 estimuladas durante 48

horas (Figura 11). Se trata de citoquinas pro-inflamatorias y enzimas que degradan la

matriz extracelular. También se ha visto que es incapaz de modular IL-1β, MMP-2,

TIMP-1, LTB4, PGE2 y TNF-α (Figuras 11 y 12). Se trata de citoquinas pro-

inflamatorias, enzimas que degradan la matriz, inhibidores de las mismas y derivados

prostanoides.

Figura 11. La adiponectina induce citoquinas pro-inflamatorias. La adiponectina (0.1 y 1μg/ml) induce un aumento significativo en la producción de IL-6, MCP-1, MMP-3 y MMP-9 en las células ATDC5 de ratón de forma dosis dependiente (paneles A, B, E y F). Este efecto está fuertemente disminuido por el inhibidor de PI3K LY294002 (10μM) para IL-6 y MMP-9 (paneles A y F). LY294002 atenúa de forma parcial la inducción de MCP-1 por adiponectina (B). La adiponectina es incapaz de modular los niveles de IL-1β y MMP-2 (paneles C y D).

Cuando las células tratadas con adiponectina se estimularon con el inhibidor LY294002

de la PI3K, se bloqueó la inducción producida por adiponectina sobre IL-6 y MMP-9,

indicando así que la activación de estas sustancias son vía PI3K. Por otra parte, el

Resultados

73

LY294002, por si mismo, ha sido capaz de disminuir la acumulación espontánea basal

de MMP-2. La adiponectina no influye en la acumulación de esta metaloproteasa, pero

la activación de su síntesis basal está mediada por PI3K.

Sorprendentemente, el inhibidor farmacológico de PI3K es capaz de inhibir

parcialmente la acumulación de MCP-1 inducida por adiponectina cuando se utiliza la

dosis de adiponectina más baja aunque no fue capaz de contrarrestar la dosis alta de

adiponectina, indicando que tal vez haya una ruta alternativa de inducción de MCP-1

además de la de la adiponectina a través de PI3K. Se observó un patrón similar cuando

se analizó MMP-3, donde, sorprendentemente, se observó una co-estimulación con

LY294002 y parece que la adiponectina sinergiza para incrementar la producción de

MMP-3 en condrocitos en cultivo.

Figura 12. La adiponectina no modula los prostanoides, TIMP-1 ni TNF-α. La adiponectina (0.1 y 1μg/ml) no induce ninguna modulación significativa sobre TIMP-1 (A), LTB4 (B), PGE2 (C) ni TNF-α (D).

Resultados

74

3. Estudio del efecto de la obestatina sobre condrocitos en cultivo.

El grupo de investigación había hecho estudios recientes en los que había demostrado

que ghrelina ejercía un efecto importante sobre los condrocitos. Zhang y col, en 2005,

descubrieron a la obestatina como un péptido derivado del mismo gen que ghrelina y

con efectos antagónicos al mismo (199). Nos propusimos averiguar qué efecto ejercía

obestatina sobre nuestras células.

3.1 Secreción de obestatina al sobrenadante celular de las células ATDC5.

En un primer momento, en el sobrenadante de cultivo de las células ATDC5,

detectamos, mediante ELISA, que las células secretan obestatina. Como se ve en la

Figura 13, los tratamientos con ghrelina (100nM), interleuquina-1β (100ng/ml) e

insulina (12.5 μg/ml) parecen modificar los niveles basales de obestatina aunque de

forma no significativa. Esto nos sugiere que los condrocitos están equipados con la

maquinaria bioquímica necesaria para el procesado post-traduccional del péptido del

pre-pro-ghrelina generando ambos, ghrelina y obestatina.

contr

ol

Ghrelin

a

insuli

na

interl

eukin

a 1 LPS

FBS

conc

entr

ació

n en

ng/

ml

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Figura 13. Los niveles de obestatina, analizados mediante ELISA, no se ven modificados de manera significativa en el sobrenadante celular de la línea ATDC5 con ninguno de los tratamientos empleados.

Resultados

75

3.2 Ensayo de unión de obestatina (binding).

Para saber si la obestatina era capaz de interactuar con nuestras células, requisito

indispensable para que pueda ejercer alguna función sobre ellas, hicimos un estudio de

unión de la obestatina a las células. Con este ensayo de binding radioactivo detectamos

si la obestatina se podía unir específicamente a la superficie celular de los condrocitos

de ratón ATDC5. Observamos que, al contrario que ghrelina, la obestatina[125I] es capaz

de unirse débilmente a los condrocitos (Figura 14). El análisis de scatchard mostró que

la Kd para el receptor era 2.22x10-8 M con una capacidad de unión máxima (Bmax) de

1.186x10-10 M. La densidad del receptor ó número de puntos de unión por célula, se

calculó con el GraphPad Radioactive Calculator, con un grupo de 3 experimentos

independientes en condiciones de saturación de unión con obestatina 125I. El análisis

cuantitativo de los puntos de unión por célula dio un resultado de 1145±72 puntos de

unión por célula.

Figura 14. En el análisis de unión de la obestatina marcada radiactivamente con 125I, se aprecia una débil unión a las células ATDC5, panel de la izquierda. El análisis scatchard, panel de la derecha, muestra la presencia de un receptor para la hormona con una Kd de 2.22x10-8M con una Bmax de 1.186x10-10M.

3.3 Actividad de la obestatina sobre la viabilidad celular.

Una vez que comprobamos que, aunque débilmente, la obestatina se unía a nuestras

células quisimos saber si la obestatina ejercía algún efecto fisiológico relevante sobre la

actividad metabólica de las células. Para ello hicimos ensayos de actividad metabólica

en las células de ratón ATDC5 y en las células humanas C28/I2 utilizando obestatina a

diferentes concentraciones (10, 100 y 1000nM) (Figura 15). En el ensayo colorimétrico

de MTT la obestatina mostró una reducción significativa de la actividad metabólica de

forma dosis dependiente, siendo un resultado similar al de ghrelina. Esta línea celular

COLD OBESTATIN (ng/ml) 100 101 102 103

CPM

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

BOUND (M)-5,0e-11 0,0e+0 5,0e-11 1,0e-10 1,5e-10

B/F

0e+0

1e-3

2e-3

3e-3

4e-3

5e-3

6e-3

7e-3

COLD OBESTATIN (ng/ml) 100 101 102 103

CPM

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

COLD OBESTATIN (ng/ml) 100 101 102 103

CPM

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

BOUND (M)-5,0e-11 0,0e+0 5,0e-11 1,0e-10 1,5e-10

B/F

0e+0

1e-3

2e-3

3e-3

4e-3

5e-3

6e-3

7e-3

BOUND (M)-5,0e-11 0,0e+0 5,0e-11 1,0e-10 1,5e-10

B/F

0e+0

1e-3

2e-3

3e-3

4e-3

5e-3

6e-3

7e-3

Resultados

76

mostró una respuesta proliferativa significativa al Suero Fetal Bovino, mientras que la

estimulación con obestatina causó una disminución significativa (60%) en la actividad

metabólica celular cuando las células se incubaban con el péptido en condiciones libres

de suero.

Figura 15. Ensayo de actividad metabólica MTT. La obestatina mostró una fuerte reducción de la actividad metabólica a todas las dosis empleadas (desde 10 a 1000nM) tanto en la línea de ratón ATDC5 (panel de la izquierda) como en la línea de condrocitos humanos inmortalizados C28/I2 (panel de la derecha).

Además, se hicieron análisis del ciclo celular con citometría de flujo mediante la tinción

de yoduro de propidio (Figura 16). Las células que se estimularon con obestatina no

mostraron ninguna alteración en el porcentaje de células hipodiploides (apoptóticas) ni

en las fases del ciclo G0/G1 y S/M en comparación con las células usadas como

controles no tratados. Con este experimento se excluyó un potencial efecto citotóxico de

la obestatina sobre las células, de forma que la disminución de la actividad metabólica

medida por MTT no se debía a muerte celular.

Resultados

77

contr

ol

obes

tatina

1000

obes

tatina

100

obes

tatina

10

Nº d

e cé

lula

s ap

optó

ticas

por

mill

ón d

e cé

lula

s

0,0

2,0e+4

4,0e+4

6,0e+4

8,0e+4

1,0e+5

1,2e+5

1,4e+5

Figura 16. Las células ATDC5 se tiñeron con Yoduro de Propidio y se analizaron por citometría de flujo. Se cuantificó el número de células apoptóticas y se relativizó por millón de células analizadas. El tratamiento con Obestatina a diferentes dosis (10, 100 y 1000nM) no afectó al número de células apoptóticas, y por consiguiente, no modificó el ciclo celular. 3.4 Actividad de la obestatina sobre el metabolismo de la célula.

Las principales fuentes de energía para las células son los ácidos grasos y la glucosa.

Dado que se está proponiendo a la obestatina como un péptido con efectos sobre el

metabolismo y como antagonista de ghrelina, hemos estudiado el efecto de esta

hormona sobre la captación de ácidos grasos y glucosa en las células ATDC5.

Para determinar si la obestatina era capaz de modular la incorporación de ácidos grasos

en condrocitos utilizamos el ácido graso se cadena larga fluorescente, BODIPY 3823

(Figura 17, panel de la izquierda). Lo analizamos por citometría de flujo para examinar

el efecto de la obestatina sobre el transporte de ácidos grasos en condrocitos de ratón

ATDC5. Los resultados tras dos horas de tratamiento con obestatina 100nM y 1 μM

indican que la obestatina es incapaz de modificar de forma alguna la captación de

BODIPY independientemente de la concentración utilizada.

Para comprobar el efecto de la obestatina sobre la captación de glucosa en condrocitos

de ratón ATDC5, se utilizó glucosa [3H]. El análisis de la radiactividad incorporada al

interior celular se midió en un contador beta (Figura 17, panel de la derecha). Con esta

técnica pudimos comprobar que la obestatina es también incapaz de modificar la

captación de glucosa en los condrocitos de ratón. Como control positivo utilizamos la

insulina, que no resultó ser adecuado como control positivo para nuestras células, y

Resultados

78

también se utilizó la IL-1 beta, que como se ha descrito en la bibliografía, es un buen

control positivo para este tipo celular.

Figura 17. Captación de ácidos grasos y glucosa inducida por obestatina (0.1 y 1μM). La obestatina no altera la captación de ácidos grasos como se observa en el panel de la izquierda empleando un ácido graso marcado con un fluorocromo. La obestatina no modifica significativamente la captación de glucosa aunque parece mostrar una tendencia como se aprecia en el panel de la derecha. 3.5 Efecto de la obestatina sobre las metaloproteasas de matriz.

Para profundizar en el estudio del efecto de la obestatina en la fisiología del condrocito,

también hemos evaluado que efecto ejerce sobre la secreción de las metaloproteasas-3 y

–9 (R&D Quantikine system, Minneapolis, MN) en la línea celular de condrocitos de

ratón ATDC5 estimulada o no con varias dosis de obestatina (0.1, 1, 5 y 10 μM) durante

48 horas. Hemos visto que todas las dosis testadas fueron incapaces de modular los

niveles de MMP-3 y MMP-9 en el sobrenadante celular de las células ATDC5 (Figura

18).

A B

2Deo

xy-D

-[23 H

]Glu

cose

Upt

ake

%ov

er u

n sti m

ulat

edc o

ntro

l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Control 0.1μM 1μM INS IL-1β?obestatina

*

0

100

200

300

400

500

600

BO

DIP

Y 38

23Ab

solu

te F

luor

esce

nce

(A.U

.)

Control 0.1μM 1 μMobestatina

A B

2Deo

xy-D

-[23 H

]Glu

cose

Upt

ake

%ov

er u

n sti m

ulat

edc o

ntro

l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Control 0.1μM 1μM INS IL-1β?obestatina

*

2Deo

xy-D

-[23 H

]Glu

cose

Upt

ake

%ov

er u

n sti m

ulat

edc o

ntro

l 2D

eoxy

-D-[2

3 H]G

luco

se U

ptak

e%

over

un s

ti mul

ated

c ont

rol

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Control 0.1μM 1μM INS IL-1β?obestatina

*

0

100

200

300

400

500

600

BO

DIP

Y 38

23Ab

solu

te F

luor

esce

nce

(A.U

.)

Control 0.1μM 1 μMobestatina

0

100

200

300

400

500

600

BO

DIP

Y 38

23Ab

solu

te F

luor

esce

nce

(A.U

.)

Control 0.1μM 1 μMobestatina

Resultados

79

contr

ol

obes

tatina

0.1

obes

tatina

1

obes

tatina

5

obes

tatina

10

conc

entr

ació

n en

ng/

ml

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

contr

ol

obes

tatina

0.1

obes

tatina

1

obes

tatina

5

obes

tatina

10

conc

entr

ació

n en

ng/

ml

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

Figura 18. Análisis mediante la técnica de ELISA de la acumulación de MMP-3 (panel superior) y MMP-9 (panel inferior) en el sobrenadante celular de las células de la línea de ratón ATDC5 tratadas con obestatina a diferentes dosis (0.1, 1, 5 y 10 μM). Obestatina no modifica ninguna de las metaloproteasas estudiadas.

Discusión

Discusión

83

V. DISCUSIÓN

1. Niveles de adipoquinas en plasma de pacientes con AR comparado con controles

sanos.

Los resultados obtenidos en plasma de pacientes con AR nos indican que presentan una

concentración de leptina, adiponectina y visfatina mayor que en sujetos sanos. En este

estudio no se han encontrado diferencias significativas en los niveles de resistina.

Las posibles limitaciones y discrepancias de este trabajo con respecto a los publicados

hasta la fecha pueden ser debidas a la diferencia en el número de pacientes empleados,

lo que puede sesgar el resultado. Además hay que tener en cuenta la presencia de otras

enfermedades o infecciones subyacentes de los pacientes, que quizá no se reflejan en las

historias clínicas, y que puedan afectar a los resultados.

Los niveles de adipoquinas se han estudiado en relación a las patologías articulares,

siendo la leptina una de las más estudiadas. La leptina está presente en el líquido

sinovial, osteofitos y cartílago de pacientes con OA, siendo su concentración en la

cavidad articular similar o mayor a la circulante (48, 50, 61). La ausencia del receptor

soluble de leptina en el líquido sinovial hace que la biodisponibilidad de la misma sea

mayor (61). Estudios recientes han confirmado nuestros resultados en los que los

niveles de leptina están elevados en pacientes con AR, son mayores en suero que en

líquido sinovial y se correlacionan con marcadores de inflamación como CRP (227-

229). Hizmetli y col. han encontrado que los niveles de leptina plasmática no se

diferencian entre pacientes con AR y controles, esto podría deberse a que parece que la

presencia de una inflamación crónica disminuye la concentración de leptina plasmática

(230, 231). Los ratones deficientes en leptina muestran una menor inflamación en

modelos de AR, aunque se han encontrado datos opuestos en artritis séptica (115). Los

niveles séricos de leptina varían en función del género, siendo mayores en mujeres que

en hombres (61, 229). Se ha estudiado la función de la leptina a nivel de la cavidad

articular y se ha visto que está implicada, por una parte en la homeostasis celular, y por

otra parte ejerce una función pro-inflamatoria. La leptina se correlaciona con el BMI,

independientemente de si está elevada en plasma o no, y también se relaciona con el

grado de destrucción del cartílago, con la producción de citoquinas pro-inflamatorias y

óxido nítrico, regulación ósea, factor reumatoide, TNF, síntesis de metaloproteasas, IL-

1β… (48, 50, 60, 64, 182, 231, 232). A su vez, la expresión y niveles de leptina están

Discusión

84

modificados por corticosteroides, glucocorticoides, LPS y citoquinas pro-inflamatorias

(23, 24, 50, 232-234). La leptina está asociada a la regulación de la ingesta, de hecho, el

tratamiento con corticosteroides aumenta la expresión génica de la leptina lo que hace

disminuir el peso corporal y la ingesta (233). A nivel sistémico la ghrelina actúa como

hormona opuesta a la leptina. En pacientes con AR se han observado niveles bajos de

ghrelina en comparación con controles sanos, lo que concuerda con los niveles altos de

leptina presente en estos individuos apoyando la función opuesta de ambas hormonas

(26).

La adiponectina se ha dado a conocer como una adipoquina anti-inflamatoria,

especialmente a nivel cardiovascular. Los niveles altos de adiponectina encontrados en

plasma de pacientes con AR podrían explicarse como un mecanismo de compensación

ante la presencia de sustancias pro-inflamatorias. Numerosos estudios confirman la

presencia de niveles de adiponectina elevados en líquido sinovial y suero de pacientes

con AR en comparación con pacientes con OA (61, 62, 141, 146, 235). Al pensar en la

adiponectina como una adipoquina anti-inflamatoria cabría sospechar que el aumento de

adiponectina pueda representar un intento de antagonizar los efectos anorexigénicos y

pro-inflamatorios de la leptina, lo que sugiere que estas dos adipoquinas estarían

actuando en paralelo como partes opuestas en el metabolismo. La adiponectina puede

ser un modulador importante y selectivo de la respuesta inflamatoria en AR, podría

modular la respuesta inflamatoria mediante la inhibición de la expresión de moléculas

de adhesión en las células endoteliales, suprimiendo la función macrofágica e

inhibiendo la señalización de NFκB, como ha revisado G. Fantuzzi (136). La

adiponectina es estructuralmente homóloga a la familia del TNF y se piensa que puede

interaccionar con los efectos pro-inflamatorios del TNF-α afectando a la producción de

IL-6 y CRP en AR (131, 136). Estudios recientes han visto que el tratamiento con

terapias anti-TNF aumentan la concentración de adiponectina circulante en pacientes

con AR, lo que se asocia a una mejoría del perfil cardiovascular de los pacientes debido

al papel cardioprotector de esta adipoquina (135, 236-239). Sin embargo, existe una

tendencia que atribuye a la adiponectina una función pro-inflamatoria en el entorno

articular.

La adiponectina es capaz de inducir la síntesis de sustancias pro-inflamatorias, como

IL-6, IL-8, MMP-1, MCP-1, TIMP-1 y CRP, y se sugiere que pueda hacerlo a través del

NFκB y del TNF-α, en distintos tipos celulares (43, 136, 144-147, 240). En las

Discusión

85

patologías asociadas con exceso de grasa corporal, balance energético desregulado y

enfermedades con inflamación crónica o autoinmunes, la adiponectina se correlaciona

positivamente con los marcadores de inflamación y parece ejercer un papel pro-

inflamatorio en ellas (43). Parece que la adiponectina actúa de forma diferente en las

enfermedades inflamatorias asociadas a obesidad frente a las que no la presentan.

La visfatina es el enzima limitante en la síntesis de NAD, facilita la adipogénesis y tiene

propiedades similares a la insulina (insulina-mimética) (48, 148, 157, 160, 241, 242).

Los niveles de visfatina aumentan en presencia de ligandos de los TLR, citoquinas

como la IL-1β, IL-6 o TNF (45, 46, 153, 154, 165). La visfatina, a su vez, activa a un

amplio número de citoquinas pro-inflamatorias, tanto en monocitos/macrófagos como

en condrocitos, TNF, PGE2 y metaloproteasas a través de NFκB y AP-1, además de

inhibir la apoptosis de leucocitos en sepsis (45, 48, 152, 154, 165, 242). Los niveles

séricos de visfatina están elevados en pacientes con síndrome metabólico, enfermedad

de pulmón aguda, enfermedad de Crohn, se ha propuesto como biomarcador y parece

ser el nexo de unión entre obesidad y diabetes (157, 161, 163, 242). Los niveles

elevados de visfatina que hemos encontrado en pacientes con AR concuerdan con los

datos publicados hasta la fecha (45, 46, 162, 242). La visfatina se expresa en la

membrana sinovial y en las zonas invasivas y se correlaciona con el grado de

inflamación y actividad de la enfermedad (45). Los condrocitos artrósicos producen

visfatina y ésta aumenta en presencia de IL-1β (165). En modelos animales de AR, la

visfatina está aumentada a nivel sinovial y sérico y su inhibición disminuye la AR, la

concentración de NAD en células inflamatorias y de TNF-α (46, 242). La expresión de

visfatina se concentra en la superficie sinovial y en las zonas de invasión (45, 46). La

visfatina se correlaciona con los niveles de CRP de forma similar a nuestros resultados

y también han visto correlación con el índice de actividad de la enfermedad, la IL-6 y el

síndrome metabólico (45, 161, 162). La visfatina parece estar ejerciendo una función

pro-inflamatoria y se ha visto que es capaz de incrementar los niveles de IL-1β, IL-6,

MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, ADAMTS-4, ADAMTS-5, TNF y PGE2 (45, 48,

152, 165-167, 242). La visfatina estaría haciendo que, tanto los sinoviocitos, como los

macrófagos infiltrados en la membrana sinovial, como los condrocitos, aumentaran la

disponibilidad local de sustancias que fomentarían la destrucción del cartílago y un

agravamiento de la patología.

Discusión

86

Finalmente, la resistina, además de su papel metabólico en la resistencia a insulina y en

la inhibición de la diferenciación de adipocitos, se ha propuesto recientemente como

una nueva adipoquina pro-inflamatoria (93, 169, 172, 181, 243). Hemos observado que

los niveles de resistina en pacientes con AR no están modificados en comparación con

los controles de acuerdo con un trabajo publicado recientemente (44). En cambio, se ha

visto que los niveles de resistina están elevados en distintas enfermedades y que éstos

están correlacionados con marcadores de inflamación y con la severidad de la

enfermedad. La resistina está elevada en pacientes con asma, en pacientes con AR, en

pacientes con OA, en pacientes con lupus eritematoso sistémico, en pacientes con la

enfermedad de Bowel, en pacientes con la enfermedad de Crohn, en pacientes

sometidos a diálisis y en pacientes con síndrome metabólico (181, 244-248). En

pacientes con OA la concentración de resistina es mayor en plasma que en líquido

sinovial, y los pacientes con AR tienen una concentración de resistina más alta en

líquido sinovial que los pacientes con OA (61, 249). Bokarewa y col han visto que la

resistina es capaz de regular al alza la IL-6 y el TNF-α e inducir AR en articulaciones

de ratón (181). La resistina se acumula en articulaciones inflamadas y sus niveles se

correlacionan con marcadores de inflamación y destrucción articular como la IL-6 y el

TNF-α (42, 44, 181, 248, 249). La literatura apunta a que los niveles séricos de

adipoquinas no predicen los valores de las mismas en el líquido sinovial y que en la

cavidad articular están sometidas a una regulación específica para ejercer ahí sus

funciones. Así pues, el que no hayamos encontrado diferencias en la concentración de

resistina en el plasma de nuestros pacientes no quiere decir que suceda lo mismo a nivel

articular.

El tejido adiposo secreta una amplia variedad de sustancias altamente activas

incluyendo citoquinas, quemoquinas y factores similares a hormonas, como la leptina,

adiponectina, resistina y visfatina, de forma que está participando activamente en la

modulación de la respuesta inmune-inflamatoria. La tasa de mortalidad en la población

occidental ha aumentado asociada a una adiposidad alta. Escalante y col han mostrado

una relación inversa entre la masa corporal y la mortalidad en pacientes con AR (250).

Además, pacientes por debajo de su peso tienen más riesgo de muerte que aquellos con

un BMI mayor, confirmando la hipótesis de que el fenómeno de ayuno en AR es

perjudicial. Por otra parte, varios investigadores han publicado que en pacientes con

AR, participantes en estudios de intervención sobre la dieta de forma terapéutica, se han

visto mejoras acompañadas de pérdida de peso corporal. La eficacia de las estrategias de

Discusión

87

reducción de peso que implican una reducción prolongada de la ingesta energética tiene

poca o ninguna influencia sobre la inflamación en AR (251). Quizás, el potencial efecto

reductor de la dieta baja en energía y el ayuno no es sorprendente con respecto a lo que

ya se sabe sobre la fisiología de la leptina. Además, el ayuno se caracteriza por niveles

bajos de leptina. Así que, la mejora de los síntomas en la restricción calórica en

pacientes con AR podría deberse a una reducción significativa de los niveles circulantes

de leptina. En conclusión, en pacientes con AR hay un incremento significativo de los

niveles plasmáticos de leptina, adiponectina y visfatina mientras que los niveles de

resistina no se modifican. De forma conjunta, estos datos confirman un papel relevante

para las adipoquinas producidas por el tejido adiposo blanco en las alteraciones

metabólicas en las enfermedades articulares con componente autoinmune como la AR, y

sugiere importantes implicaciones terapéuticas que necesitan exploraciones más

profundas.

2. Efecto de la adiponectina sobre condrocitos.

Nuestros datos muestran que las células de ratón ATDC5 y también los condrocitos

humanos en cultivo y los inmortalizados expresan las dos isoformas de los receptores de

adiponectina, que son necesarios para interpretar las señales dependientes de

adiponectina y de los que se ha demostrado su expresión en cardiomiocitos,

sinoviocitos, monocitos y osteoblastos (146, 252, 253). Comprobamos que estos

receptores eran funcionales estudiando la activación de AMPK, enzima que regula un

amplio rango de rutas metabólicas entre las que están el metabolismo de ácidos grasos y

de la glucosa, ambas asociadas a la adiponectina (254). Este enzima está fosforilada en

el control, no sólo a causa del mantenimiento basal de la célula, sino porque AMPK se

activa cuando aumenta el ratio AMP:ATP y las células estaban privadas de suero,

condiciones en las que este ratio se modifica. La adiponectina aumenta la acumulación

de nitritos inducida por NOS tipo 2 vía PI3K y estimula la secreción de IL-6, MMP-3,

MMP-9 y MCP-1 en condrocitos.

Las discrepancias observadas entre nuestros resultados y los de otros autores pueden ser

debido a la diferencia de dosis utilizada en nuestros experimentos (0.1 y 1mg/ml, que

están dentro del rango fisiológico de los niveles de adiponectina), en comparación con

la dosis empleada por otros autores como Chen y col (30mg/ml) (141). Otra posibilidad

podría ser causada por la sensibilidad de la técnica empleada para la obtención de los

valores de estos parámetros. Los resultados distintos, en cuánto a concentraciones en

Discusión

88

medios de cultivo, se deben al empleo de líneas celulares y de cultivos primarios, ya que

las líneas celulares son normalmente más reactivas.

Los estudios endocrinológicos y cardiovasculares han tratado de delinear el papel

funcional de la adiponectina, proponiendo un papel protectivo a nivel cardiovascular

más que una función pro-inflamatoria o degenerativa. Un estudio previo postula un

posible papel de la adiponectina en el cartílago, sugiriendo que los tejidos articulares

puedan ser dianas para esta adipoquina, donde podría ejercer diferentes efectos

incluyendo el aumento de TIMP-2 y la disminución de MMP-13 inducida por IL-1β

(141). La adiponectina mitiga la AR inducida por colágeno en un modelo animal y

reduce la expresión de TNF-α, IL-1β y MMP-3 aunque incrementa la expresión de IL-6

inducida por IL-1β, sugiriendo un papel protector de adiponectina (255). Por el

contrario, nuestro estudio demuestra, por primera vez, que la adiponectina podría estar

ejerciendo un efecto pro-inflamatorio destacable en los condrocitos mediante la

activación de NOS tipo 2 y la estimulación de la secreción de IL-6, MMP-3, MMP-9 y

MCP-1. Estudios recientes confirman el papel pro-inflamatorio de la adiponectina que

estimula la producción de IL-8, IL-6 y MCP-1 vía activación del AdipoR1, AMPK, p38,

IKKαβ y NFκB (145, 147).

Para identificar el mecanismo molecular implicado en la inducción de NOS tipo 2 y la

producción de citoquinas en respuesta a la adiponectina, hemos examinado una ruta de

señalización clave en la señalización intracelular. Estudios previos para demostrar los

efectos intra-celulares de la adiponectina en el metabolismo energético, así como en las

enfermedades cardiovasculares, han revelado que uno de los intermediarios tras la unión

de la adiponectina a sus receptores correspondientes es PI3K (256, 257). Es destacable

el que PI3K ha sido descrita previamente como una molécula relevante en la

señalización intracelular implicada también en la inducción de NOS tipo 2 en los

condrocitos realizada por varias citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo la leptina

(258). De acuerdo con nuestra hipótesis, hemos demostrado que la inhibición

farmacológica de PI3K con LY294002 conduce a una marcada reducción de la

expresión de NOS tipo 2 inducida por adiponectina, así como en la disminución de la

producción de IL-6 y MMP-9 inducida por adiponectina. Sorprendentemente,

LY294002 fue capaz de atenuar de forma parcial la inducción de MCP-1 y MMP-3 por

adiponectina, lo que sugiere que hay alguna ruta de señalización alternativa y/o

convergente que está en juego y que utiliza, en parte, PI3K. Finalmente, LY294002 era

Discusión

89

capaz de disminuir fuertemente la producción basal de MMP-2 en condrocitos por si

mismo.

Recientemente se ha visto que LY294002 reduce de forma significativa la actividad de

NFκB inducido por adiponectina en las células monocitarias U937 donde la

adiponectina provocaba, entre otras acciones, la inducción de MCP-1 (240). Estudios

recientes han indicado que la producción de IL-6 mediada por adiponectina en

sinoviocitos ocurre a través de la activación de p38 y NFκB (147). Es destacable que la

activación de este factor de transcripción nuclear es un elemento clave para el

reclutamiento y la actividad de NOS tipo 2 en varios linajes celulares (259).

Con respecto a las articulaciones, resultados recientes han demostrado que el tejido

adiposo articular, los sinoviocitos tipo fibroblasto de pacientes con enfermedades

inflamatorias de la articulación y los osteoblastos son una fuente local de adiponectina

(144, 146, 252). Esto también se refleja en la presencia de adiponectina en el líquido

sinovial de pacientes con AR y OA (62, 146, 235). Además, los niveles en líquido

sinovial de adiponectina en pacientes con AR son significativamente más altos que en

pacientes con OA y en pacientes con OA los niveles séricos de adiponectina son

mayores que los niveles en líquido sinovial (61, 141, 235). Así pues, el objetivo de este

trabajo fue investigar el papel funcional de la adiponectina en condrocitos.

El óxido nítrico, producido en cantidades elevadas por la nitróxido sintasa inducible,

controla una gran variedad de funciones del cartílago, incluyendo la pérdida de fenotipo

del condrocito, la apoptosis del condrocito y la degradación de la matriz extracelular

(13). In vitro, el cartílago articular humano es capaz de producir grandes cantidades de

NO (68), que pueden verse aumentadas por citoquinas pro-inflamatorias. Además, la

producción de NO puede aumentar de forma significativa por la presencia de leptina,

como se muestra en algunos trabajos previos del grupo de investigación (16, 17). La

capacidad de los condrocitos de responder a la adiponectina, aumentando de forma

específica la expresión y actividad de NOS tipo 2, parece ser altamente selectiva.

Además, su inducción está bloqueada por la aminoguanidina, un inhibidor bien

conocido de la actividad de NOS tipo 2, y también por la dexametasona, un inhibidor de

la síntesis de novo de NOS tipo 2. Nuestros datos con respecto a la producción de

factores inducidos por la adiponectina en condrocitos están parcialmente de acuerdo con

los datos publicados por Chen y col., al menos en lo que respecta a MCP-1 y TIMP-1

(141). Al contrario que lo que dicen estos autores, la adiponectina, es capaz de inducir

fuertemente IL-6 y MMP-3.

Discusión

90

La capacidad de responder a la adiponectina no está restringida a los condrocitos. De

hecho, otros tipos celulares como los adipocitos y los fibroblastos muestran la capacidad

de secretar IL-6 tras la estimulación con adiponectina in vitro (144, 146, 147) y las

células del endotelio vascular son capaces de estimular la producción de NO activando

la NOS endotelial (142). Cabe destacar que todos los tipos celulares arriba mencionados

son de origen mesenquimal. Se puede pensar que la capacidad de desarrollar una

respuesta pro-inflamatoria cuando se estimula con adiponectina pueda ser una

característica común a las células derivadas de origen mesenquimal.

En conclusión, estos datos muestran por primera vez que la adiponectina es un

modulador de la respuesta inflamatoria en condrocitos. En estas células, la adiponectina

es capaz de inducir mediadores clave en la degeneración del cartílago como el NO, IL-

6, MCP-1 y metaloproteasas como MMP-3 y MMP-9, cuya inducción parece estar

modulada, al menos, por un mecanismo regulador en el que está implicado PI3K. Es

necesario el estudio en profundidad de esta adipoquina en relación con patologías

inflamatorias para conocer con detalle cada uno de los pasos clave de su cascada de

acción. El hallazgo de un punto susceptible de control farmacológico abriría la

posibilidad de minimizar los efectos dañinos de la adiponectina sobre patologías con

componente inflamatorio.

3. Efecto de la obestatina sobre condrocitos.

Hemos comprobado la capacidad de los condrocitos de secretar obestatina y su

capacidad de unión específica a las células. La obestatina reduce la actividad metabólica

de los condrocitos aunque se ha visto que no interfiere en la incorporación activa de

ácidos grasos y glucosa, ni modula la expresión de MMP-3 y MMP-9.

El origen de la obestatina con la que se han hecho los experimentos es sintético, lo cual

podría interferir en el resultado final de los experimentos analizados, aunque la mayoría

de los datos publicados hasta la fecha han sido obtenidos con proteínas del mismo

origen. A este hecho hay que sumar las limitaciones asociadas a trabajar con células y

de las técnicas, en las que tienen un marcaje radiactivo o con fluorocromos, pequeñas

variaciones podrían alterar el resultado final.

Hemos detectado la presencia de la obestatina, péptido que deriva del mismo gen que

codifica para ghrelina (199), en el sobrenadante de las células ATDC5, lo que sugiere

que los condrocitos están equipados con la maquinaria bioquímica encargada del

procesado postraduccional del péptido del pre-pro-ghrelina para generar tanto ghrelina

Discusión

91

como obestatina (217). Al contrario que ghrelina (217), la obestatina se une débilmente

a los condrocitos, y por análisis cuantitativo de puntos de unión de obestatina indica la

presencia de menos de 1000 puntos de unión por célula. Además, los condrocitos

estimulados con obestatina mostraron una disminución significativa de su actividad

metabólica. A la obestatina se le han atribuido efectos opuestos a los de la ghrelina en

términos de ingesta (199). Sorprendentemente, nuestros resultados muestran que este

efecto era similar, que no opuesto, al que ejerce ghrelina en condrocitos (217), lo que

sugiere que la obestatina es capaz de modular la cadena respiratoria mitocondrial de

forma similar a ghrelina, excluyendo así cualquier tipo de antagonismo entre ambas.

Con este resultado confirmamos el trabajo de Nogueiras y col (214) en el que no han

encontrado ningún efecto opuesto de obestatina a ghrelina.

La obestatina, al contrario que ghrelina (217), no ha modulado de forma significativa ni

la incorporación de ácidos grasos ni la de glucosa, ambos macronutrientes que sirven

como precursores de eicosanoides y glicoaminoglicanos. Además, la obestatina no tiene

efectos sobre la expresión cuantitativa de las metaloproteasas de matriz 3 y 9, de forma

que no interviene en las funciones normales del condrocito.

En conclusión, nuestro estudio sugiere que la obestatina, al contrario que ghrelina, juega

un papel marginal en la regulación del metabolismo del condrocito. No se puede excluir

la posibilidad de una única respuesta indicativa de la obestatina como inhibidor de la

tasa de respiración del condrocito que puede estar unido a la inducción o represión, de

genes cuyos papeles no están todavía definidos en la fisiopatología del condrocito.

Porque aunque no a nivel de ingesta, sí se ha visto que la obestatina tiene efectos sobre

el patrón de sueño en ratas (207), de forma que el efecto que la obestatina tiene sobre

los condrocitos no esté relacionado con la ingesta pero sí con algún otro efecto todavía

por determinar. La identificación de factores implicados en la respuesta de la obestatina

puede aportar las bases para estudios posteriores en los efectos moleculares de este

nuevo miembro obtenido mediante procesamiento postraduccional de un mismo péptido

antecesor que genera ghrelina.

4. Relación de las citoquinas en estudio y el tejido adiposo con las patologías

articulares.

Los resultados obtenidos en este trabajo apoyan el nuevo enfoque que se está otorgando

al tejido adiposo como órgano endocrino. No sólo libera adipoquinas necesarias para su

metabolismo normal, sino que muchas de ellas participan en la regulación metabólica

Discusión

92

corporal. Las funciones de estas adipoquinas son muy variadas, desde la participación

en la regulación de la ingesta y metabolismo energético, pasando por la regulación de la

actividad cardiovascular, hasta la intervención en distintos procesos inflamatorios (37,

112, 113, 134). El número de adipoquinas sigue aumentando, poniendo de manifiesto la

importancia del tejido adiposo y su implicación en todas y cada una de las funciones

corporales. El tejido adiposo además de liberar adipoquinas, también responde a los

estímulos pro-inflamatorios, por ejemplo, responde fuertemente al TNF-α modificando

el patrón de expresión de las adipoquinas (260).

La función que las adipoquinas desarrollan en el entramado del metabolismo normal y

patológico todavía no está completamente clara y hay que seguir profundizando en el

estudio de estas sustancias. La función de algunas adipoquinas está más clara que la de

otras, como la leptina, que ha sido la más estudiada y en la que se ha visto un claro

papel pro-inflamatorio. Otras, en cambio, están resultando más controvertidas, como la

adiponectina, que parece tener una fuerte dualidad, ejerciendo funciones pro-

inflamatorias en unos tejidos y funciones anti-inflamatorias en otros. Quizá la clave

resida en el tipo de tejido y entorno en el que se encuentra ejerciendo su función de

forma tejido-específica.

En cuanto a las enfermedades articulares, la AR y la OA, se está poniendo de manifiesto

que, antes o después, ambas cursan con inflamación. En la AR, la inflamación aparece

ya en los primeros momentos y el conjunto de citoquinas producidas durante el proceso

interactúan con las adipoquinas para ejercer su función. La AR no es necesariamente

una enfermedad asociada a obesidad, ya que además se ha visto que la tasa de

mortalidad en esta patología se correlaciona negativamente con el peso, en cambio, en

la OA, la obesidad está mucho más presente. Por esta razón se ha asociado el

componente mecánico del sobrepeso a la OA, aunque esto no explica la OA de

extremidades no sometidas al exceso de peso. En este caso, el papel de las adipoquinas

cobra importancia. La desregulación de los niveles de estos péptidos, con respecto a los

individuos normales, colabora en la creación de un ambiente pro-inflamatorio y la

activación de la síntesis de factores encargados de la degradación de la matriz

extracelular del cartílago y de citoquinas inflamatorias. La OA ya no sólo se trata de una

enfermedad mecánica y asociada al envejecimiento, sino de una enfermedad metabólica

que irá afectando cada vez a individuos más jóvenes dado que la obesidad y el síndrome

metabólico se están presentando a edades más tempranas.

Discusión

93

Con respecto a la obestatina, decir que parece no ejercer un papel relevante en el

metabolismo del cartílago. No se puede decir lo mismo de la ghrelina, que si ha

demostrado tener efecto en los condrocitos. Además, con esto se demuestra que la

ghrelina y la leptina no sólo interactúan a nivel de regulación de ingesta, sino que ambas

afectan a la actividad del condrocito.

Conclusiones

Conclusiones

97

VI. CONCLUSIONES

1. Los niveles plasmáticos de leptina, adiponectina y visfatina están aumentados en

pacientes con artritis reumatoide con respecto a sujetos sanos. Los niveles

plasmáticos de resistina no están modificados.

2. La adiponectina, sobre distintos tipos de condrocitos en cultivo, ejerce un papel

pro-inflamatorio activando la síntesis de óxido nítrico mediante la activación de

la nitróxido sintasa tipo 2 y estimula la producción de IL-6, MCP-1, MMP-3 y

MMP-9 vía PI3K. Por ello, parece estar ejerciendo un papel en el desarrollo de

las patologías articulares que cursan con un cierto componente inflamatorio

como son la AR y la OA.

3. La obestatina disminuye la actividad metabólica de los condrocitos sin ejercer

ningún otro efecto sobre el metabolismo de estas células.

Abreviaturas

Abreviaturas

101

VII. ABREVIATURAS

ACR Colegio americano de reumatología

ACRP Adipocyte complement related protein

ACTH Corticotropina

AdipoR1 Receptor de adiponectina 1

AdipoR2 Receptor de adiponectina 2

ADNc ADN complementario

AMPK Proteína quinasa AMP-activada

ANOVA Análisis de varianza

ANXA-1 Anexina-1

apM Adipose most abundant gene

AR Artritis Reumatoide

Bmax Capacidad de unión máxima

BMI Índice de masa corporal

BMP Proteínas morfogenéticas óseas

BODIPY Boron dipyrromethene

BSA Albúmina sérica bovina

COX Ciclooxigenasa

cpm Cuentas por minuto

CRP Proteína C reactiva

Abreviaturas

102

DEPC Dietilpirocarbonato

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

dNTPs Deoxinucleótidos trifosfato

ERK Extracellular regulated MAP kinase

ESR Índice de sedimentación eritrocitaria

FBS Suero Fetal Bovino

FIZZ Found in inflammatory zone

GAPDH Gliceraldehido-fosfato-deshidrogenasa

GBP Gelatin-binding protein

GH Hormona de crecimiento

GHS-R Receptor del secretagogo de la hormona de crecimiento

GOAT Ghrelin O-Acyltransferase

HBS Solución equilibrada de Hanks libre de glucosa

IFN Interferón

IGF Factor de crecimiento insulínico

IKK Quinasa de IκB (inhibidor de NF-κB)

IL Interleuquina

JAK Janus quinasas

Abreviaturas

103

Kd Constante de disociación

L-NAME N-nitro-L-arginín-metil-éster

LPS Lipopolisacárido

LTB4 Leukotriene B4

MAPKs Proteínas quinasas activadas por mitógenos

MCP Monocyte chemoattractant protein

MMLV-RT Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase

MMP Metaloproteasa de matriz

MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NAD Niconitamide adenine dinucleotide

Nampt Nicotinamide phosphoribosyltransferase

NF Factor nuclear

NO Óxido Nítrico

NOS Nitróxido sintasa

OA Artrosis

pb Pares de bases

PBS Tampón Fosfato Salino

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PEBF Pre-B cell colony-enhancing factor

PGE2 Prostaglandina E2

Abreviaturas

104

PI3K Fosfoinositol-3-quinasa

PRL Prolactina

RELMs Moléculas tipo-resistina

RNAseOutTM Inhibidor recombinante de las ribonucleasas

RT Retro-transcriptasa

RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

SCF Stem cell factor

S.E.M. Desviación estándar media

SOCS Suppressor of cytokine signalling

STATs Signal transducers and activators of transcription

TGF Factor transformador de crecimiento

TIMP Inhibidor tisular de metaloproteasas

TLR Receptores tipo Toll

TNF Factor de necrosis tumoral

TSH Tirotropina

TZD Tiazolidinedionas

VEGF Factor de crecimiento de endotelio vascular

Bibliografía

Bibliografía

107

VIII. BIBLIOGRAFÍA

1. Goldring SR, Goldring MB. Biology of the normal joint. In: Harris ED, Budd RC, Firestein GS, Genovese MC, Sergent JS, Ruddy S, Sledge CB, editor. Kelley's Textbook of Rheumatology. 7th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2005; p. 1-34.

2. Goldring MB. The role of the chondrocyte in osteoarthritis. Arthritis Rheum 2000;43:1916-26

3. Goldring MB, Goldring SR. Osteoarthritis. J Cell Physiol 2007;213(3):626-34.

4. Otero M, Goldring MB. Cells of the synovium in rheumatoid arthritis. Chondrocytes. Arthritis Res Ther 2007;9(5):220.

5. Stockwell RA, Meaching G. The chondrocytes. In: (ed) FM, editor. Adult Articular Cartilage. Tunbridge Wells, England: Pitman Medical; 1979; p. 69-114.

6. Hall BK, Miyake T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. Int J Dev Biol. 1995;39(6):881-93.

7. Hall BK, Miyake T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays 2000;22(2):138-47.

8. Aigner T, Dudhia J. Phenotypic modulation of chondrocytes as a potential therapeutic target in osteoarthritis: a hypothesis. Ann Rheum 1997;56:287-291.

9. Reddi AH. Cartilage morphogenetic proteins: role in joint development, homoeostasis, and regeneration. Ann Rheum Dis 2003;62 (Suppl 2): ii73-8.

10. Goldring MB. Chondrocytes. In: Harris ED, Budd RC, Firestein GS, Genovese MC, Sergent JS, Ruddy S, Sledge CB, editor. Kelley's Textbook of Rheumatology. 7th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2005; p. 203-234.

11. Goldring SR, Goldring MB. The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res 2004(427 Suppl):S27-36.

12. Goldring SR. Pathogenesis of bone and cartilage destruction in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 2003;42(Suppl 2):ii11-ii16.

13. Goldring MB, Berenbaum F. The regulation of chondrocyte function by proinflammatory mediators: prostaglandins and nitric oxide. Clin Orthop Relat Res 2004; 427 Suppl:S37-46.

14. Goldring MB. Anticytokine therapy for osteoarthritis. . Expert Opin Biol Ther 2001;1(5):817-29.

15. Otero M, Gomez-Reino JJ, Gualillo O. Synergistic induction of nitric oxide synthase type II: in vitro effect of leptin and interferon-gamma in human chondrocytes and ATDC5 chondrogenic cells. Arthritis Rheum 2003;48(2):404-9.

16. Otero M, Lago R, Lago F, Reino JJ, Gualillo O. Signalling pathway involved in nitric oxide synthase type II activation in chondrocytes: synergistic effect of leptin with interleukin-1. Arthritis Res Ther 2005;7(3):R581-91.

Bibliografía

108

17. Otero M, Lago R, Gomez R, Lago F, Gomez-Reino JJ, Gualillo O. Phosphatidylinositol 3-kinase, MEK-1 and p38 mediate leptin/interferon-gamma synergistic NOS type II induction in chondrocytes. Life Sci 2007;81(19-20):1452-60.

18. Rall LC, Roubenoff, R. Rheumatoid cachexia: metabolic abnormalities, mechanisms and interventions. Rheumatology (Oxford) 2004; 43(10):1219-23.

19. Roubenoff R, Freeman LM, Smith DE, Abad LW, Dinarello CA, Kehayias JJ. Adjuvant arthritis as a model of inflammatory cachexia. Arthritis Rheum 1997;40:534-9.

20. Roubenoff R. Inflammatory and hormonal mediators of cachexia. J Nutr 1997;127(5 Suppl):1014S-1016S.

21. Roubenoff R, Roubenoff RA, Cannon JG, Kehayias JJ, Zhuang H, Dawson-Hughes B, et al. Rheumatoid cachexia: cytokine-driven hypermetabolism accompanying reduced body cell mass in chronic inflammation. J Clin Invest 1994;93(6):2379-86.

22. Walsmith J, Roubenoff R. Cachexia in rheumatoid arthritis. Int J Cardiol 2002;85(1):89-99.

23. Faggioni R, Fantuzzi G, Fuller J, Dinarello CA, Feingold KR, Grunfeld C. IL-1 beta mediates leptin induction during inflammation. Am J Physiol 1998;274(1 Pt 2):R204-8.

24. Grunfeld C, Zhao C, Fuller J, Pollack A, Moser A, Friedman J, et al. Endotoxin and cytokines induce expression of leptin, the ob gene product, in hamsters. J Clin Invest 1996;97(9):2152-7.

25. Lopez-Calderon A, Soto L, Martin AI. Chronic inflammation inhibits GH secretion and alters the serum insulin-like growth factor system in rats. Life Sci 1999;65(20):2049-60.

26. Otero M, Nogueiras R, Lago F, Dieguez C, Gomez-Reino JJ, Gualillo O. Chronic inflammation modulates ghrelin levels in humans and rats. Rheumatology (Oxford) 2004;43(3):306-10.

27. Banning M. The principles of inflammation in the development of rheumatoid arthritis. Br J Nurs 2005;14(5):277-83.

28. Koch AE. Chemokines and their receptors in rheumatoid arthritis: future targets? Arthritis Rheum 2005;52(3):710-21.

29. Szekanecz Z, Koch, A. E. Endothelial cells in inflammation and angiogenesis Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2005;4(3):319-23.

30. McInnes IB, Schett G. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol 2007;7(6):429-42.

31. Fujiwara N, Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2005;4(3):281-6.

32. Kasama T, Miwa Y, Isozaki T, Odai T, Adachi M, Kunkel SL. Neutrophil-derived cytokines: potential therapeutic targets in inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2005;4(3):273-9.

Bibliografía

109

33. Ludewig B, Laman JD. The in and out of monocytes in atherosclerotic plaques: Balancing inflammation through migration. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(32):11529-30.

34. Piliponsky AM, Gleich GJ, Bar I, Levi-Schaffler F. Effects of eosinophils on mast cells: a new pathway for the perpetuation of allergic inflammation. Mol Immunol 2002;38(16-18):1369.

35. Firestein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis Nature 2003; 423(6937):356-61.

36. Gerli R, Pitzalis C, Lunardi C. The role of T cell cytokines in modulating joint inflammation in rheumatoid arthritis. Isr Med Assoc J 2002;4(11 Suppl):949-52.

37. Kofler S, Nickel T, Weis M. Role of cytokines in cardiovascular diseases: a focus on endothelial responses to inflammation. Clin Sci (Lond) 2005;108(3):205-13.

38. Ohsuzu F. The roles of cytokines, inflammation and immunity in vascular diseases. J Atheroscler Thromb 2004;11(6):313-21.

39. Playford RJ, Ghosh S. Cytokines and growth factor modulators in intestinal inflammation and repair. J Pathol 2005;205(4):417-25.

40. Romagnani S. Cytokines and chemoattractants in allergic inflammation. Mol Immunol 2002;38(12-13):881-5.

41. Trayhurn P, Wood IS. Signalling role of adipose tissue: adipokines and inflammation in obesity. Biochem Soc Trans 2005;33(Pt 5):1078-81.

42. Otero M, Lago R, Gomez R, Lago F, Dieguez C, Gomez-Reino JJ, et al. Changes in plasma levels of fat-derived hormones adiponectin, leptin, resistin and visfatin in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2006;65(9):1198-201.

43. Fantuzzi G. Adiponectin and inflammation: consensus and controversy. J Allergy Clin Immunol 2008;121(2):326-30.

44. d'Elia HF, Pullerits R, Carlsten H, Bokarewa M. Resistin in serum is associated with higher levels of IL-1Ra in post-menopausal women with rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 2008;47:1082-1087.

45. Brentano F, Schorr O, Ospelt C, Stanczyk J, Gay RE, Gay S, et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix-degrading activities. Arthritis Rheum 2007;56(9):2829-39.

46. Nowell MA, Richards PJ, Fielding CA, Ognjanovic S, Topley N, Williams AS, et al. Regulation of pre-B cell colony-enhancing factor by STAT-3-dependent interleukin-6 trans-signaling: implications in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2006;54(7):2084-95.

47. Otero M, Lago R, Gomez R, Dieguez C, Lago F, Gomez-Reino J, et al. Towards a pro-inflammatory and immunomodulatory emerging role of leptin. Rheumatology (Oxford) 2006;45(8):944-50.

48. Gabay O, Hall DJ, Berenbaum F, Henrotin Y, Sanchez C. Osteoarthritis and obesity: Experimental models. Joint Bone Spine 2008;75(6):675-9.

Bibliografía

110

49. Grotle M, Hagen KB, Natvig B, Dahl FA, Kvien TK. Obesity and osteoarthritis in knee, hip and/or hand: an epidemiological study in the general population with 10 years follow-up. BMC Musculoskelet Disord 2008;9:132.

50. Dumond H, Presle N, Terlain B, Mainard D, Loueille D, Netter P, Pottie P. Evidence for a key role of leptin in osteoarthritis. Arthritis Rheum 2003;48(11):3118-29.

51. Gosset M, Berenbaum F, Levy A, Pigenet A, Thirion S, Cavadias S, et al. Mechanical stress and prostaglandin E2 synthesis in cartilage. Biorheology 2008;45(3-4):301-20.

52. Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Abramson SB. Osteoarthritis, an inflammatory disease: potential implication for the selection of new therapeutic targets. Arthritis Rheum 2001;44(6):1237-47.

53. Teichtahl AJ, Wluka AE, Proietto J, Cicuttini FM. Obesity and the female sex, risk factors for knee osteoarthritis that may be attributable to systemic or local leptin biosynthesis and its cellular effects. Med Hypotheses 2005;65(2):312-5.

54. Zhang W, Doherty M. How important are genetic factors in osteoarthritis? Contributions from family studies. J Rheumatol 2005;32(6):1139-42.

55. Di Cesare PE, Abramson SB. Pathogenesis of osteoarthritis In: Harris ED, Budd RC, Firestein GS, Genovese MC, Sergent JS, Ruddy S, Sledge CB, editor. Kelley's Textbook of Rheumatology. 7th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2005; p. 1493-1513.

56. Felson DT. Relation of obesity and of vocational and avocational risk factors to osteoarthritis. J Rheumatol 2005;32(6):1133-5.

57. Hochberg MC. Risk factors for the development and progression of hip osteoarthritis. J Rheumatol 2005;32(6):1135-6.

58. Karlson EW, Mandl LA, Aweh GN, Sangha O, Liang MH, Grodstein F. Total hip replacement due to osteoarthritis: the importance of age, obesity an other modifiable risk factors. AM J Med 2003;114:93-8.

59. Griffin TM, Guilak F. Why is obesity associated with osteoarthritis? Insights from mouse models of obesity. Biorheology 2008;45(3-4):387-98.

60. Loeser RF. Systemic and local regulation of articular cartilage metabolism: where does leptin fit in the puzzle? Arthritis Rheum 2003;48(11):3009-12.

61. Presle N, Pottie P, Dumond H, Guillaume C, Lapicque F, Pallu S, et al. Differential distribution of adipokines between serum and synovial fluid in patients with osteoarthritis. Contribution of joint tissues to their articular production. Osteoarthritis Cartilage 2006;14(7):690-5.

62. Schaffler A, Ehling A, Neumann E, Herfarth H, Tarner I, Scholmerich J, et al. Adipocytokines in synovial fluid. JAMA 2003;290(13):1709-10.

63. Magliano M. Obesity and arthritis. Menopause Int 2008;14(4):149-54.

64. Simopoulou T, Malizos KN, Iliopoulos D, Stefanou N, Papatheodorou L, Ioannou M, et al. Differential expression of leptin and leptin's receptor isoform (Ob-Rb) mRNA between advanced and minimally affected osteoarthritic cartilage; effect on cartilage metabolism. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(8):872-83.

Bibliografía

111

65. Tong KM, Shieh DC, Chen CP, Tzeng CY, Wang SP, Huang KC, et al. Leptin induces IL-8 expression via leptin receptor, IRS-1, PI3K, Akt cascade and promotion of NF-kappaB/p300 binding in human synovial fibroblasts. Cell Signal 2008;20(8):1478-88.

66. Hayashi T, Abe E, Yamate T, Taguchi Y, Jasin HE. Nitric oxide production by superficial and deep articular chondrocytes. Arthritis Rheum 1997;40(2):261-9.

67. Stefanovic-Racic M, Stadler J, Georgescu HI, Evans CH. Nitric oxide and energy production in articular chondrocytes. J Cell Physiol 1994;159(2):274-80.

68. Vuolteenaho K, Moilanen T, Al-Saffar N, Knowles RG, Moilanen E. Regulation of the nitric oxide production resulting from the glucocorticoid-insensitive expression of iNOS in human osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage 2001;9(7):597-605.

69. Kim SJ, Ju JW, Oh CS, Yoon YM, Song WK, Kim JH, Yoo YJ, Bang OS, Kang SS, Chun JS. ERK-1/2 and p38 kinase oppositely regulate nitric oxide-induced apoptosis of chondrocytes in association with p53, caspase-3, and differentiation status. J Biol Chem 2002;277(2):1332-9.

70. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987;327(6122):524-6.

71. Higashi Y, Yoshizumi M. New methods to evaluate endothelial function: method for assessing endothelial function in humans using a strain-gauge plethysmography: nitric oxide-dependent and -independent vasodilation. J Pharmacol Sci 2003;93(4):399-404.

72. Joyner MJ, Dietz NM. Nitric oxide and vasodilation in human limbs. J Appl Physiol 1997;83(6):1785-96.

73. Guzik TJ, Korbut R, Adamek-Guzik T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol 2003;54(4):469-87.

74. Korhonen R, Lahti A, Kankaanranta H, Moilanen E. Nitric oxide production and signaling in inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2005;4(4):471-9.

75. Boeckxstaens GE, Pelckmans PA. Nitric oxide and the non-adrenergic non-cholinergic neurotransmission. Comp Biochem Physiol A Physiol 1997;118(4):925-37.

76. Sanders KM, Ward SM. Nitric oxide as a mediator of nonadrenergic noncholinergic neurotransmission. Am J Physiol 1992;262(3 Pt 1):G379-92.

77. Stegbauer J, Vonend O, Habbel S, Quack I, Sellin L, Gross V, et al. Angiotensin II modulates renal sympathetic neurotransmission through nitric oxide in AT2 receptor knockout mice. J Hypertens 2005;23(9):1691-8.

78. Kroncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V. Nitric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection--how, why, when, and where? Nitric Oxide 1997;1(2):107-20.

79. Wink DA, Miranda KM, Espey MG. Cytotoxicity related to oxidative and nitrosative stress by nitric oxide. Exp Biol Med (Maywood) 2001;226(7):621-3.

80. Moncada S. Nitric oxide. J Hypertens Suppl 1994;12(10):S35-9.

Bibliografía

112

81. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J 2001;357(Pt 3):593-615.

82. Aktan F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci 2004;75(6):639-53.

83. Moncada S, Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med 1993;329(27):2002-12.

84. Mungrue IN, Bredt DS. nNOS at a glance: implications for brain and brawn. J Cell Sci 2004;117(Pt 13):2627-9.

85. Fleming I, Busse R. Signal transduction of eNOS activation. Cardiovasc Res 1999;43(3):532-41.

86. Sessa WC. eNOS at a glance. J Cell Sci 2004;117(Pt 12):2427-9.

87. Chartrain NA, Geller DA, Koty PP, Sitrin NF, Nussler AK, Hoffman EP, et al. Molecular cloning, structure, and chromosomal localization of the human inducible nitric oxide synthase gene. J Biol Chem 1994;269(9):6765-72.

88. Lee JY, Je JH, Jung KJ, Yu BP, Chung HY. Induction of endothelial iNOS by 4-hydroxyhexenal through NF-kappaB activation. Free Radic Biol Med 2004;37(4):539-48.

89. Saldeen J, Welsh N. p38 MAPK inhibits JNK2 and mediates cytokine-activated iNOS induction and apoptosis independently of NF-KB translocation in insulin-producing cells. Eur Cytokine Netw 2004;15(1):47-52.

90. Teshima S, Nakanishi H, Nishizawa M, Kitagawa K, Kaibori M, Yamada M, et al. Up-regulation of IL-1 receptor through PI3K/Akt is essential for the induction of iNOS gene expression in hepatocytes. J Hepatol 2004;40(4):616-23.

91. Utaisincharoen P, Anuntagool N, Arjcharoen S, Limposuwan K, Chaisuriya P, Sirisinha S. Induction of iNOS expression and antimicrobial activity by interferon (IFN)-beta is distinct from IFN-gamma in Burkholderia pseudomallei-infected mouse macrophages. Clin Exp Immunol 2004;136(2):277-83.

92. Ischiropoulos H, Gow A. Pathophysiological functions of nitric oxide-mediated protein modifications. Toxicology 2005;208(2):299-303.

93. Kim KH, Lee K, Moon YS, Sul HS. A cysteine-rich adipose tissue-specific secretory factor inhibits adipocyte differentiation. J Biol Chem 2001;276(14):11252-6.

94. Salerno L, Sorrenti V, Di Giacomo C, Romeo G, Siracusa MA. Progress in the development of selective nitric oxide synthase (NOS) inhibitors. Curr Pharm Des 2002;8(3):177-200.

95. Blanchette J, Jaramillo M, Olivier M. Signalling events involved in interferon-gamma-inducible macrophage nitric oxide generation. Immunology 2003;108(4):513-22.

96. De Vera ME, Taylor BS, Wang Q, Shapiro RA, Billiar TR, Geller DA. Dexamethasone suppresses iNOS gene expression by upregulating I-kappa B alpha and inhibiting NF-kappa B. Am J Physiol 1997;273(6 Pt 1):G1290-6.

Bibliografía

113

97. Golde S, Coles A, Lindquist JA, Compston A. Decreased iNOS synthesis mediates dexamethasone-induced protection of neurons from inflammatory injury in vitro. Eur J Neurosci 2003;18(9):2527-37.

98. Matsumura M, Kakishita H, Suzuki M, Banba N, Hattori Y. Dexamethasone suppresses iNOS gene expression by inhibiting NF-kappaB in vascular smooth muscle cells. Life Sci 2001;69(9):1067-77.

99. Shinoda J, McLaughlin KE, Bell HS, Swaroop GR, Yamaguchi S, Holmes MC, et al. Molecular mechanisms underlying dexamethasone inhibition of iNOS expression and activity in C6 glioma cells. Glia 2003;42(1):68-76.

100. Skimming JW, Nasiroglu O, Huang CJ, Wood CE, Stevens BR, Haque IU, et al. Dexamethasone suppresses iNOS yet induces GTPCH and CAT-2 mRNA expression in rat lungs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003;285(2):L484-91.

101. Walker G, Pfeilschifter J, Kunz D. Mechanisms of suppression of inducible nitric-oxide synthase (iNOS) expression in interferon (IFN)-gamma-stimulated RAW 264.7 cells by dexamethasone. Evidence for glucocorticoid-induced degradation of iNOS protein by calpain as a key step in post-transcriptional regulation. J Biol Chem 1997;272(26):16679-87.

102. Smyth T, Harris HJ, Brown A, Totemeyer S, Farnfield BA, Maskell DJ, et al. Differential modulatory effects of annexin 1 on nitric oxide synthase induction by lipopolysaccharide in macrophages. Immunology 2006;117(3):340-9.

103. Fukao T, Koyasu S. PI3K and negative regulation of TLR signaling. Trends Immunol 2003;24(7):358-63.

104. Lahti A, Kankaanranta H, Moilanen E. P38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB203580 has a bi-directional effect on iNOS expression and NO production. Eur J Pharmacol 2002;454(2-3):115-23.

105. Xia YF, Liu LP, Zhong CP, Geng JG. NF-kappaB activation for constitutive expression of VCAM-1 and ICAM-1 on B lymphocytes and plasma cells. Biochem Biophys Res Commun 2001;289(4):851-6.

106. Kubo M, Hanada T, Yoshimura A. Suppressors of cytokine signaling and immunity. Nat Immunol 2003;4(12):1169-76.

107. Rao KM. Molecular mechanisms regulating iNOS expression in various cell types. J Toxicol Environ Health B Crit Rev 2000;3(1):27-58.

108. Dunne A, O'Neill LA. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: signal transduction during inflammation and host defense. Sci STKE 2003;2003(171):re3.

109. Marks-Konczalik J, Chu SC, Moss J. Cytokine-mediated transcriptional induction of the human inducible nitric oxide synthase gene requires both activator protein 1 and nuclear factor kappaB-binding sites. J Biol Chem 1998;273(35):22201-8.

110. Trayhurn P, Bing C, Wood IS. Adipose tissue and adipokines--energy regulation from the human perspective. J Nutr 2006;136(7 Suppl):1935S-1939S.

Bibliografía

114

111. Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L, Friedman JM. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 1994;372(6505):425-32.

112. Lago F, Dieguez C, Gomez-Reino J, Gualillo O. The emerging role of adipokines as mediators of inflammation and immune responses. Cytokine Growth Factor Rev 2007;18(3-4):313-25.

113. Lau DC, Dhillon B, Yan H, Szmitko PE, Verma S. Adipokines: molecular links between obesity and atheroslcerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288(5):H2031-41.

114. Bokarewa M, Bokarew D, Hultgren O, Tarkowski A. Leptin consumption in the inflamed joints of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2003;62(10):952-6.

115. Otero M, Lago R, Lago F, Casanueva FF, Dieguez C, Gomez-Reino JJ, et al. Leptin, from fat to inflammation: old questions and new insights. FEBS Lett 2005;579(2):295-301.

116. Sandoval DA, Davis SN. Leptin: metabolic control and regulation. J Diabetes Complications 2003;17(2):108-13.

117. Gualillo O, Eiras S, Lago F, Dieguez C, Casanueva FF. Elevated serum leptin concentrations induced by experimental acute inflammation. Life Sci 2000;67(20):2433-41.

118. Lord GM, Matarese G, Howard JK, Lechler RI. The bioenergetics of the immune system. Science 2001;292(5518):855-6.

119. Steppan CM, Crawford DT, Chidsey-Frink KL, Ke H, Swick AG. Leptin is a potent stimulator of bone growth in ob/ob mice. Regul Pept 2000;92(1-3):73-8.

120. La Cava A, Matarese G. The weight of leptin in immunity. Nat Rev Immunol 2004;4(5):371-9.

121. Fantuzzi G, Faggioni R. Leptin in the regulation of immunity, inflammation, and hematopoiesis. J Leukoc Biol 2000;68(4):437-46.

122. Matarese G, La Cava A. The intricate interface between immune system and metabolism. Trends Immunol 2004;25(4):193-200.

123. Felson DT, Anderson JJ, Naimark A, Walker AM, Meenan RF. Obesity and knee osteoarthritis: The Framingham Study. Ann Intern Med 1988;109:18-24.

124. Oliveria SA, Felson DT, Cirillo PA, Reed JI, Walker AM. Body weight, body mass index and incident symptomatic osteoarthritis of the hand, hip and knee. Epidemiology 1999;10:161-6.

125. Figenschau Y, Knutsen G, Shahazeydi S, Johansen O, Sveinbjornsson B. Human articular chondrocytes express functional leptin receptors. Biochem Biophys Res Commun 2001;287(1):190-7.

126. Gualillo O. Further evidence for leptin involvement in cartilage homeostases. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(8):857-60.

127. Hu E, Liang P, Spiegelman BM. AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated in obesity. J Biol Chem 1996;271(18):10697-703.

Bibliografía

115

128. Scherer PE, Williams S, Fogliano M, Baldini G, Lodish HF. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem 1995;270(45):26746-9.

129. Diez JJ, Iglesias P. The role of the novel adipocyte-derived hormone adiponectin in human disease. Eur J Endocrinol 2003;148(3):293-300.

130. Meier U, Gressner AM. Endocrine regulation of energy metabolism: review of pathobiochemical and clinical chemical aspects of leptin, ghrelin, adiponectin, and resistin. Clin Chem 2004;50(9):1511-25.

131. Shapiro L, Scherer PE. The crystal structure of a complement-1q family protein suggests an evolutionary link to tumor necrosis factor. Curr Biol 1998;8(6):335-8.

132. Trujillo ME, Scherer PE. Adiponectin--journey from an adipocyte secretory protein to biomarker of the metabolic syndrome. J Intern Med 2005;257(2):167-75.

133. Yamauchi T, Kamon J, Minokoshi Y, Ito Y, Waki H, Uchida S, et al. Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Nat Med 2002;8(11):1288-95.

134. Gualillo O, Gonzalez-Juanatey JR, Lago F. The emerging role of adipokines as mediators of cardiovascular function: physiologic and clinical perspectives. Trends Cardiovasc Med 2007;17(8):275-83.

135. Ouchi N, Shibata R, Walsh K. Cardioprotection by adiponectin. Trends Cardiovasc Med 2006;16(5):141-6.

136. Fantuzzi G. Adipose tissue, adipokines, and inflammation. J Allergy Clin Immunol 2005;115(5):911-9; quiz 920.

137. Yamauchi T, Kamon J, Waki H, Imai Y, Shimozawa N, Hioki K, et al. Globular adiponectin protected ob/ob mice from diabetes and ApoE-deficient mice from atherosclerosis. J Biol Chem 2003;278(4):2461-8.

138. Engeli S, Feldpausch M, Gorzelniak K, Hartwig F, Heintze U, Janke J, et al. Association between adiponectin and mediators of inflammation in obese women. Diabetes 2003;52(4):942-7.

139. Yamauchi T, Kamon J, Ito Y, Tsuchida A, Yokomizo T, Kita S, et al. Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects. Nature 2003;423(6941):762-9.

140. Tomas E, Tsao TS, Saha AK, Murrey HE, Zhang Cc C, Itani SI, et al. Enhanced muscle fat oxidation and glucose transport by ACRP30 globular domain: acetyl-CoA carboxylase inhibition and AMP-activated protein kinase activation. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(25):16309-13.

141. Chen TH, Chen L, Hsieh MS, Chang CP, Chou DT, Tsai SH. Evidence for a protective role for adiponectin in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta 2006;1762(8):711-8.

142. Chen H, Montagnani M, Funahashi T, Shimomura I, Quon MJ. Adiponectin stimulates production of nitric oxide in vascular endothelial cells. J Biol Chem 2003;278(45):45021-6.

Bibliografía

116

143. Kern PA, Di Gregorio GB, Lu T, Rassouli N, Ranganathan G. Adiponectin expression from human adipose tissue: relation to obesity, insulin resistance, and tumor necrosis factor-alpha expression. Diabetes 2003;52(7):1779-85.

144. Ehling A, Schaffler A, Herfarth H, Tarner IH, Anders S, Distler O, et al. The potential of adiponectin in driving arthritis. J Immunol 2006;176(7):4468-78.

145. Kitahara K, Kusunoki N, Kakiuchi T, Suguro T, Kawai S. Adiponectin stimulates IL-8 production by rheumatoid synovial fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun 2009;378(2):218-23.

146. Tan W, Wang F, Zhang M, Guo D, Zhang Q, He S. High Adiponectin and Adiponectin Receptor 1 Expression in Synovial Fluids and Synovial Tissues of Patients with Rheumatoid Arthritis. Semin Arthritis Rheum 2008. doi S0049-0172(08)00040-1 [pii]10.1016/j.semarthrit.2008.01.017

147. Tang CH, Chiu YC, Tan TW, Yang RS, Fu WM. Adiponectin enhances IL-6 production in human synovial fibroblast via an AdipoR1 receptor, AMPK, p38, and NF-kappa B pathway. J Immunol 2007;179(8):5483-92.

148. Fukuhara A, Matsuda M, Nishizawa M, Segawa K, Tanaka M, Kishimoto K, et al. Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin. Science 2005;307(5708):426-30.

149. Samal B, Sun Y, Stearns G, Xie C, Suggs S, McNiece I. Cloning and characterization of the cDNA encoding a novel human pre-B-cell colony-enhancing factor. Mol Cell Biol 1994;14(2):1431-7.

150. Patrone L, Damore MA, Lee MB, Malone CS, Wall R. Genes expressed during the IFN gamma-induced maturation of pre-B cells. Mol Immunol 2002;38(8):597-606.

151. Xu LG, Wu M, Hu J, Zhai Z, Shu HB. Identification of downstream genes up-regulated by the tumor necrosis factor family member TALL-1. J Leukoc Biol 2002;72(2):410-6.

152. Dahl TB, Yndestad A, Skjelland M, Oie E, Dahl A, Michelsen A, et al. Increased expression of visfatin in macrophages of human unstable carotid and coronary atherosclerosis: possible role in inflammation and plaque destabilization. Circulation 2007;115(8):972-80.

153. Iqbal J, Zaidi M. TNF regulates cellular NAD+ metabolism in primary macrophages. Biochem Biophys Res Commun 2006;342(4):1312-8.

154. Jia SH, Li Y, Parodo J, Kapus A, Fan L, Rotstein OD, et al. Pre-B cell colony-enhancing factor inhibits neutrophil apoptosis in experimental inflammation and clinical sepsis. J Clin Invest 2004;113(9):1318-27.

155. Ognjanovic S, Bao S, Yamamoto SY, Garibay-Tupas J, Samal B, Bryant-Greenwood GD. Genomic organization of the gene coding for human pre-B-cell colony enhancing factor and expression in human fetal membranes. J Mol Endocrinol 2001;26(2):107-17.

156. Ye SQ, Zhang LQ, Adyshev D, Usatyuk PV, Garcia AN, Lavoie TL, et al. Pre-B-cell-colony-enhancing factor is critically involved in thrombin-induced lung endothelial cell barrier dysregulation. Microvasc Res 2005;70(3):142-51.

Bibliografía

117

157. Sethi JK, Vidal-Puig A. Visfatin: the missing link between intra-abdominal obesity and diabetes? Trends Mol Med 2005;11(8):344-7.

158. Luk T, Malam Z, Marshall JC. Pre-B cell colony-enhancing factor (PBEF)/visfatin: a novel mediator of innate immunity. J Leukoc Biol 2008;83(4):804-16.

159. Pilz S, Mangge H, Obermayer-Pietsch B, Marz W. Visfatin/pre-B-cell colony-enhancing factor: a protein with various suggested functions. J Endocrinol Invest 2007;30(2):138-44.

160. Rongvaux A, Shea RJ, Mulks MH, Gigot D, Urbain J, Leo O, et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is up-regulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. Eur J Immunol 2002;32(11):3225-34.

161. Filippatos TD, Derdemezis CS, Gazi IF, Lagos K, Kiortsis DN, Tselepis AD, et al. Increased plasma visfatin levels in subjects with the metabolic syndrome. Eur J Clin Invest 2008;38(1):71-2.

162. Oki K, Yamane K, Kamei N, Nojima H, Kohno N. Circulating visfatin level is correlated with inflammation, but not with insulin resistance. Clin Endocrinol (Oxf) 2007;67(5):796-800.

163. Zhong M, Tan HW, Gong HP, Wang SF, Zhang Y, Zhang W. Increased serum visfatin in patients with metabolic syndrome and carotid atherosclerosis. Clin Endocrinol (Oxf) 2008.

164. Moschen AR, Kaser A, Enrich B, Mosheimer B, Theurl M, Niederegger H, et al. Visfatin, an adipocytokine with proinflammatory and immunomodulating properties. J Immunol 2007;178(3):1748-58.

165. Gosset M, Berenbaum F, Salvat C, Sautet A, Pigenet A, Tahiri K, et al. Crucial role of visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in matrix degradation and prostaglandin E2 synthesis in chondrocytes: possible influence on osteoarthritis. Arthritis Rheum 2008;58(5):1399-409.

166. Adya R, Tan BK, Chen J, Randeva HS. Nuclear factor-kappaB induction by visfatin in human vascular endothelial cells: its role in MMP-2/9 production and activation. Diabetes Care 2008;31(4):758-60.

167. Adya R, Tan BK, Punn A, Chen J, Randeva HS. Visfatin induces human endothelial VEGF and MMP-2/9 production via MAPK and PI3K/Akt signalling pathways: novel insights into visfatin-induced angiogenesis. Cardiovasc Res 2008;78(2):356-65.

168. Holcomb IN, Kabakoff RC, Chan B, Baker TW, Gurney A, Henzel W, et al. FIZZ1, a novel cysteine-rich secreted protein associated with pulmonary inflammation, defines a new gene family. EMBO J 2000;19(15):4046-55.

169. Steppan CM, Bailey ST, Bhat S, Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM, et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature 2001;409(6818):307-12.

170. Banerjee RR, Lazar MA. Dimerization of resistin and resistin-like molecules is determined by a single cysteine. J Biol Chem 2001;276(28):25970-3.

171. Banerjee RR, Lazar MA. Resistin: molecular history and prognosis. J Mol Med 2003;81(4):218-26.

Bibliografía

118

172. Steppan CM, Lazar MA. The current biology of resistin. J Intern Med 2004;255(4):439-47.

173. Fasshauer M, Klein J, Neumann S, Eszlinger M, Paschke R. Tumor necrosis factor alpha is a negative regulator of resistin gene expression and secretion in 3T3-L1 adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2001;288(4):1027-31.

174. Fasshauer M, Klein J, Neumann S, Eszlinger M, Paschke R. Isoproterenol inhibits resistin gene expression through a G(S)-protein-coupled pathway in 3T3-L1 adipocytes. FEBS Lett 2001;500(1-2):60-3.

175. Haugen F, Jorgensen A, Drevon CA, Trayhurn P. Inhibition by insulin of resistin gene expression in 3T3-L1 adipocytes. FEBS Lett 2001;507(1):105-8.

176. Lu SC, Shieh WY, Chen CY, Hsu SC, Chen HL. Lipopolysaccharide increases resistin gene expression in vivo and in vitro. FEBS Lett 2002;530(1-3):158-62.

177. Nogueiras R, Gualillo O, Caminos JE, Casanueva FF, Dieguez C. Regulation of resistin by gonadal, thyroid hormone, and nutritional status. Obes Res 2003;11(3):408-14.

178. Rajala MW, Lin Y, Ranalletta M, Yang XM, Qian H, Gingerich R, et al. Cell type-specific expression and coregulation of murine resistin and resistin-like molecule-alpha in adipose tissue. Mol Endocrinol 2002;16(8):1920-30.

179. Shojima N, Sakoda H, Ogihara T, Fujishiro M, Katagiri H, Anai M, et al. Humoral regulation of resistin expression in 3T3-L1 and mouse adipose cells. Diabetes 2002;51(6):1737-44.

180. Reilly MP, Lehrke M, Wolfe ML, Rohatgi A, Lazar MA, Rader DJ. Resistin is an inflammatory marker of atherosclerosis in humans. Circulation 2005;111(7):932-9.

181. Bokarewa M, Nagaev I, Dahlberg L, Smith U, Tarkowski A. Resistin, an adipokine with potent proinflammatory properties. J Immunol 2005;174(9):5789-95.

182. Lago R, Gomez R, Lago F, Gomez-Reino J, Gualillo O. Leptin beyond body weight regulation--current concepts concerning its role in immune function and inflammation. Cell Immunol 2008;252(1-2):139-45.

183. Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 1999;402(6762):656-60.

184. Bowers CY. Growth hormone-releasing peptide (GHRP). Cell Mol Life Sci 1998;54(12):1316-29.

185. Cummings DE, Shannon MH. Roles for ghrelin in the regulation of appetite and body weight. Arch Surg 2003;138(4):389-96.

186. Horvath TL, Diano S, Sotonyi P, Heiman M, Tschop M. Minireview: ghrelin and the regulation of energy balance--a hypothalamic perspective. Endocrinology 2001;142(10):4163-9.

187. Gualillo O, Lago F, Gomez-Reino J, Casanueva FF, Dieguez C. Ghrelin, a widespread hormone: insights into molecular and cellular regulation of its expression and mechanism of action. FEBS Lett 2003;552(2-3):105-9.

Bibliografía

119

188. Poole AR. Cartilage in health and disease. In: ed KWet, editor. Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. Philadelphia, Lippincort: Williams & Wilkins; 2001. p. 226-284.

189. Hosoda H, Kojima M, Mizushima T, Shimizu S, Kangawa K. Structural divergence of human ghrelin. Identification of multiple ghrelin-derived molecules produced by post-translational processing. J Biol Chem 2003;278(1):64-70.

190. Kojima M, Hosoda H, Matsuo H, Kangawa K. Ghrelin: discovery of the natural endogenous ligand for the growth hormone secretagogue receptor. Trends Endocrinol Metab 2001;12(3):118-22.

191. Gardiner J, Bloom S. Ghrelin gets its GOAT. Cell Metab 2008;7(3):193-4.

192. Yang J, Brown MS, Liang G, Grishin NV, Goldstein JL. Identification of the acyltransferase that octanoylates ghrelin, an appetite-stimulating peptide hormone. Cell 2008;132(3):387-96.

193. Resh MD. Fatty acylation of proteins: new insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochim Biophys Acta 1999;1451(1):1-16.

194. Hosoda H, Kojima M, Matsuo H, Kangawa K. Purification and characterization of rat des-Gln14-Ghrelin, a second endogenous ligand for the growth hormone secretagogue receptor. J Biol Chem 2000;275(29):21995-2000.

195. Nagaya N, Uematsu M, Kojima M, Date Y, Nakazato M, Okumura H, et al. Elevated circulating level of ghrelin in cachexia associated with chronic heart failure: relationships between ghrelin and anabolic/catabolic factors. Circulation 2001;104(17):2034-8.

196. Hanada T, Toshinai K, Date Y, Kajimura N, Tsukada T, Hayashi Y, et al. Upregulation of ghrelin expression in cachectic nude mice bearing human melanoma cells. Metabolism 2004;53(1):84-8.

197. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature 2000;407(6806):908-13.

198. Shintani M, Ogawa Y, Ebihara K, Aizawa-Abe M, Miyanaga F, Takaya K, et al. Ghrelin, an endogenous growth hormone secretagogue, is a novel orexigenic peptide that antagonizes leptin action through the activation of hypothalamic neuropeptide Y/Y1 receptor pathway. Diabetes 2001;50(2):227-32.

199. Zhang JV, Ren PG, Avsian-Kretchmer O, Luo CW, Rauch R, Klein C, et al. Obestatin, a peptide encoded by the ghrelin gene, opposes ghrelin's effects on food intake. Science 2005;310(5750):996-9.

200. Gualillo O, Lago F, Casanueva FF, Dieguez C. One ancestor, several peptides post-translational modifications of preproghrelin generate several peptides with antithetical effects. Mol Cell Endocrinol 2006;256(1-2):1-8.

201. McKee KK, Tan CP, Palyha OC, Liu J, Feighner SD, Hreniuk DL, et al. Cloning and characterization of two human G protein-coupled receptor genes (GPR38 and GPR39) related to the growth hormone secretagogue and neurotensin receptors. Genomics 1997;46(3):426-34.

Bibliografía

120

202. Holst B, Egerod KL, Schild E, Vickers SP, Cheetham S, Gerlach LO, et al. GPR39 signaling is stimulated by zinc ions but not by obestatin. Endocrinology 2007;148(1):13-20.

203. Lauwers E, Landuyt B, Arckens L, Schoofs L, Luyten W. Obestatin does not activate orphan G protein-coupled receptor GPR39. Biochem Biophys Res Commun 2006;351(1):21-5.

204. Samson WK, White MM, Price C, Ferguson AV. Obestatin acts in brain to inhibit thirst. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007;292(1):R637-43.

205. Ataka K, Inui A, Asakawa A, Kato I, Fujimiya M. Obestatin inhibits motor activity in the antrum and duodenum in the fed state of conscious rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294(5):G1210-8.

206. Ren AJ, Guo ZF, Wang YK, Wang LG, Wang WZ, Lin L, et al. Inhibitory effect of obestatin on glucose-induced insulin secretion in rats. Biochem Biophys Res Commun 2008;369(3):969-72.

207. Szentirmai E, Krueger JM. Obestatin alters sleep in rats. Neurosci Lett 2006;404(1-2):222-6.

208. Carlini VP, Schioth HB, Debarioglio SR. Obestatin improves memory performance and causes anxiolytic effects in rats. Biochem Biophys Res Commun 2007;352(4):907-12.

209. Kapica M, Zabielska M, Puzio I, Jankowska A, Kato I, Kuwahara A, et al. Obestatin stimulates the secretion of pancreatic juice enzymes through a vagal pathway in anaesthetized rats - preliminary results. J Physiol Pharmacol 2007;58 Suppl 3:123-30.

210. Tang SQ, Jiang QY, Zhang YL, Zhu XT, Shu G, Gao P, et al. Obestatin: its physicochemical characteristics and physiological functions. Peptides 2008;29(4):639-45.

211. Kobelt P, Wisser AS, Stengel A, Goebel M, Bannert N, Gourcerol G, et al. Peripheral obestatin has no effect on feeding behavior and brain Fos expression in rodents. Peptides 2008;29(6):1018-27.

212. Gourcerol G, Tache Y. Obestatin--a ghrelin-associated peptide that does not hold its promise to suppress food intake and motility. Neurogastroenterol Motil 2007;19(3):161-5.

213. De Smet B, Thijs T, Peeters TL, Depoortere I. Effect of peripheral obestatin on gastric emptying and intestinal contractility in rodents. Neurogastroenterol Motil 2007;19(3):211-7.

214. Nogueiras R, Pfluger P, Tovar S, Arnold M, Mitchell S, Morris A, et al. Effects of obestatin on energy balance and growth hormone secretion in rodents. Endocrinology 2007;148(1):21-6.

215. Yamamoto D, Ikeshita N, Daito R, Herningtyas EH, Toda K, Takahashi K, et al. Neither intravenous nor intracerebroventricular administration of obestatin affects the secretion of GH, PRL, TSH and ACTH in rats. Regul Pept 2007;138(2-3):141-4.

Bibliografía

121

216. Iglesias MJ, Salgado A, Pineiro R, Rodino BK, Otero MF, Grigorian L, et al. Lack of effect of the ghrelin gene-derived peptide obestatin on cardiomyocyte viability and metabolism. J Endocrinol Invest 2007;30(6):470-6.

217. Caminos JE, Gualillo O, Lago F, Otero M, Blanco M, Gallego R, et al. The endogenous growth hormone secretagogue (ghrelin) is synthesized and secreted by chondrocytes. Endocrinology 2005;146(3):1285-92.

218. Karsenty G. Convergence between bone and energy homeostases: leptin regulation of bone mass. Cell Metab 2006;4(5):341-8.

219. Fukushima N, Hanada R, Teranishi H, Fukue Y, Tachibana T, Ishikawa H, et al. Ghrelin directly regulates bone formation. J Bone Miner Res 2005;20(5):790-8.

220. Kim SW, Her SJ, Park SJ, Kim D, Park KS, Lee HK, et al. Ghrelin stimulates proliferation and differentiation and inhibits apoptosis in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Bone 2005;37(3):359-69.

221. Atsumi T, Miwa Y, Kimata K, Ikawa Y. A chondrogenic cell line derived from a differentiating culture of AT805 teratocarcinoma cells. Cell Differ Dev 1990;30(2):109-16.

222. Shukunami C, Ishizeki K, Atsumi T, Ohta Y, Suzuki F, Hiraki Y. Cellular hypertrophy and calcification of embryonal carcinoma-derived chondrogenic cell line ATDC5 in vitro. J Bone Miner Res 1997;12(8):1174-88.

223. Gori F, Demay MB. BIG-3, a novel WD-40 repeat protein, is expressed in the developing growth plate and accelerates chondrocyte differentiation in vitro. Endocrinology 2004;145(3):1050-4.

224. Shukunami C, Shigeno C, Atsumi T, Ishizeki K, Suzuki F, Hiraki Y. Chondrogenic differentiation of clonal mouse embryonic cell line ATDC5 in vitro: differentiation-dependent gene expression of parathyroid hormone (PTH)/PTH-related peptide receptor. J Cell Biol 1996;133(2):457-68.

225. Takahashi S, Abe T, Gotoh J, Fukuuchi Y. Substrate-dependence of reduction of MTT: a tetrazolium dye differs in cultured astroglia and neurons. Neurochem Int 2002;40(5):441-8.

226. Phillips T, Ferraz I, Bell S, Clegg PD, Carter SD, Mobasheri A. Differential regulation of the GLUT1 and GLUT3 glucose transporters by growth factors and pro-inflammatory cytokines in equine articular chondrocytes. Vet J 2005;169(2):216-22.

227. Lee SW, Park MC, Park YB, Lee SK. Measurement of the serum leptin level could assist disease activity monitoring in rheumatoid arthritis. Rheumatol Int 2007;27(6):537-40.

228. Seven A, Guzel S, Aslan M, Hamuryudan V. Serum and synovial fluid leptin levels and markers of inflammation in rheumatoid arthritis. Rheumatol Int 2008. doi: 10.1007/s00296-008-0764-8

229. Targonska-Stepniak B, Majdan M, Dryglewska M. Leptin serum levels in rheumatoid arthritis patients: relation to disease duration and activity. Rheumatol Int 2008;28(6):585-91.

Bibliografía

122

230. Popa C, Netea MG, Radstake TR, van Riel PL, Barrera P, van der Meer JW. Markers of inflammation are negatively correlated with serum leptin in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2005;64(8):1195-8.

231. Hizmetli S, Kisa M, Gokalp N, Bakici MZ. Are plasma and synovial fluid leptin levels correlated with disease activity in rheumatoid arthritis ? Rheumatol Int 2007;27(4):335-8.

232. Mantzoros CS, Moschos S, Avramopoulos I, Kaklamani V, Liolios A, Doulgerakis DE, et al. Leptin concentrations in relation to body mass index and the tumor necrosis factor-alpha system in humans. J Clin Endocrinol Metab 1997;82(10):3408-13.

233. De Vos P, Saladin R, Auwerx J, Staels B. Induction of ob gene expression by corticosteroids is accompanied by body weight loss and reduced food intake. J Biol Chem 1995;270(27):15958-61.

234. Elimam A, Knutsson U, Bronnegard M, Stierna P, Albertsson-Wikland K, Marcus C. Variations in glucocorticoid levels within the physiological range affect plasma leptin levels. Eur J Endocrinol 1998;139(6):615-20.

235. Senolt L, Pavelka K, Housa D, Haluzik M. Increased adiponectin is negatively linked to the local inflammatory process in patients with rheumatoid arthritis. Cytokine 2006;35(5-6):247-52.

236. Lewicki M, Kotyla P, Kucharz E. Etanercept increases adiponectin level in woman with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol 2008;27(10):1337-8.

237. Nagashima T, Okubo-Fornbacher H, Aoki Y, Kamata Y, Kimura H, Kamimura T, et al. Increase in plasma levels of adiponectin after administration of anti-tumor necrosis factor agents in patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2008;35(5):936-8.

238. Nishida H, Horio T, Suzuki Y, Iwashima Y, Kamide K, Kangawa K, et al. Plasma adrenomedullin as an independent predictor of future cardiovascular events in high-risk patients: comparison with C-reactive protein and adiponectin. Peptides 2008;29(4):599-605.

239. Serelis J, Kontogianni MD, Katsiougiannis S, Bletsa M, Tektonidou MG, Skopouli FN. Effect of anti-TNF treatment on body composition and serum adiponectin levels of women with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol 2008;27(6):795-7.

240. Haugen F, Drevon CA. Activation of nuclear factor-kappaB by high molecular weight and globular adiponectin. Endocrinology 2007;148(11):5478-86.

241. Xie H, Tang SY, Luo XH, Huang J, Cui RR, Yuan LQ, et al. Insulin-like effects of visfatin on human osteoblasts. Calcif Tissue Int 2007;80(3):201-10.

242. Busso N, Karababa M, Nobile M, Rolaz A, Van Gool F, Galli M, et al. Pharmacological inhibition of nicotinamide phosphoribosyltransferase/visfatin enzymatic activity identifies a new inflammatory pathway linked to NAD. PLoS ONE 2008;3(5):e2267.

243. Muse ED, Lam TK, Scherer PE, Rossetti L. Hypothalamic resistin induces hepatic insulin resistance. J Clin Invest 2007;117(6):1670-8.

Bibliografía

123

244. Almehed K, d'Elia HF, Bokarewa M, Carlsten H. Role of resistin as a marker of inflammation in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther 2008;10(1):R15.

245. Aquilante CL, Kosmiski LA, Knutsen SD, Zineh I. Relationship between plasma resistin concentrations, inflammatory chemokines, and components of the metabolic syndrome in adults. Metabolism 2008;57(4):494-501.

246. Konrad A, Lehrke M, Schachinger V, Seibold F, Stark R, Ochsenkuhn T, et al. Resistin is an inflammatory marker of inflammatory bowel disease in humans. Eur J Gastroenterol Hepatol 2007;19(12):1070-4.

247. Larochelle J, Freiler J, Dice J, Hagan L. Plasma resistin levels in asthmatics as a marker of disease state. J Asthma 2007;44(7):509-13.

248. Migita K, Maeda Y, Miyashita T, Kimura H, Nakamura M, Ishibashi H, et al. The serum levels of resistin in rheumatoid arthritis patients. Clin Exp Rheumatol 2006;24(6):698-701.

249. Senolt L, Housa D, Vernerova Z, Jirasek T, Svobodova R, Veigl D, et al. Resistin in rheumatoid arthritis synovial tissue, synovial fluid and serum. Ann Rheum Dis 2007;66(4):458-63.

250. Escalante A, Haas RW, del Rincon I. Paradoxical effect of body mass index on survival in rheumatoid arthritis: role of comorbidity and systemic inflammation. Arch Intern Med 2005;165(14):1624-9.

251. Skoldstam L, Brudin L, Hagfors L, Johansson G. Weight reduction is not a major reason for improvement in rheumatoid arthritis from lacto-vegetarian, vegan or Mediterranean diets. Nutr J 2005;4:15.

252. Berner HS, Lyngstadaas SP, Spahr A, Monjo M, Thommesen L, Drevon CA, et al. Adiponectin and its receptors are expressed in bone-forming cells. Bone 2004;35(4):842-9.

253. Pineiro R, Iglesias MJ, Gallego R, Raghay K, Eiras S, Rubio J, et al. Adiponectin is synthesized and secreted by human and murine cardiomyocytes. FEBS Lett 2005;579(23):5163-9.

254. Carling D. The role of the AMP-activated protein kinase in the regulation of energy homeostasis. Novartis Found Symp 2007;286:72-81; discussion 81-5, 162-3, 196-203.

255. Lee SW, Kim JH, Park MC, Park YB, Lee SK. Adiponectin mitigates the severity of arthritis in mice with collagen-induced arthritis. Scand J Rheumatol 2008;37(4):260-8.

256. Kobashi C, Urakaze M, Kishida M, Kibayashi E, Kobayashi H, Kihara S, et al. Adiponectin inhibits endothelial synthesis of interleukin-8. Circ Res 2005;97(12):1245-52.

257. Maeda N, Shimomura I, Kishida K, Nishizawa H, Matsuda M, Nagaretani H, et al. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30. Nat Med 2002;8(7):731-7.

258. Lago F, Dieguez C, Gomez-Reino J, Gualillo O. Adipokines as emerging mediators of immune response and inflammation. Nat Clin Pract Rheumatol 2007;3(12):716-24.

Bibliografía

124

259. D'Acquisto F, May MJ, Ghosh S. Inhibition of nuclear factor kappa B (NF-B): an emerging theme in anti-inflammatory therapies. Mol Interv 2002;2(1):22-35.

260. Hector J, Schwarzloh B, Goehring J, Strate TG, Hess UF, Deuretzbacher G, et al. TNF-alpha alters visfatin and adiponectin levels in human fat. Horm Metab Res 2007;39(4):250-5.