A SÚLYOSSÁGÉRTÉKELÉS KERETRENDSZERE

2010/63/EUIRÁNYELV A TUDOMÁNYOS CÉLOKRA FELHASZNÁLT ÁLLATOK VÉDELMÉRŐL

Humánus állatkísérletekkel a tudomány szolgálatában

© N

ovo

Nor

disk

Környezetvédelmi

Tartalomjegyzék:

Munkadokumentum a súlyosságértékelés keretrendszeréről 1-21

A súlyossági besorolás, napi értékelés és a tényleges súlyosságértékelési 22-76

folyamatának bemutatására szolgáló példák

1

A tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU

irányelv végrehajtásában hatáskörrel rendelkező nemzeti hatóságok

Munkadokumentum a súlyosságértékelés keretrendszeréről

Brüsszel, 2012. július 11-12.

A Bizottság a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU irányelv

végrehajtását elősegítő eljárások súlyossági szempontból történő értékelésére egy szakértői

munkacsoportot hozott létre. Valamennyi tagállam és a legfontosabb érdekelt szervezetek

jelölhettek szakértőt a feladatra.

A súlyosságértékeléssel foglalkozó szakértői munkacsoport kétszer ülésezett: 2011

decemberében a géntechnológiával módosított állatokkal foglalkozott, majd 2012 májusában

az állatokon végzett eljárások tényleges súlyossága értékelésének általános keretrendszerét

vitatta meg.

E dokumentum a két szakértői munkacsoport-ülés munkájának, a tagállamokkal folytatott

megbeszéléseknek, valamint a Bizottságnak a súlyosságértékelési-keretrendszer

értelmezésével, összetevőivel, résztvevőivel és munkaeszközeivel kapcsolatos jogi

hozzájárulásának eredményeként jött létre. A szöveget a 2010/63/EU irányelv

végrehajtásában hatáskörrel rendelkező nemzeti hatóságok is jóváhagyták 2012. július 11-12-

én tartott ülésükön.

Felelősségkizárás:

Az alábbi dokumentum célja, hogy útmutatást nyújtson a tagállamok és az ezen irányelv

által érintett egyéb felek számára az irányelvben foglalt rendelkezések megértéséhez. A

benne foglaltak a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU

irányelvvel összefüggésben értelmezendők.

Kizárólag az Európai Unió Bírósága jogosult az uniós jog jogilag kötelező érvényű

értelmezésére.

2

Tartalomjegyzék:

A 2010/63/EU irányelv vonatkozó cikkei .................................................................................. 3

Általános háttér .......................................................................................................................... 3

A súlyosságértékelés általános szempontjai ............................................................................... 4

A vizsgálatot megelőző szempontok .......................................................................................... 6

A súlyossági fok mutatói ............................................................................................................ 7

Magas szintű kategóriák ......................................................................................................... 7

A tényleges súlyosság értékelésében szerepet játszó tényezők ............................................... 8

Hogyan biztosítható a tényleges súlyosság értékelésének és besorolásának következetessége?

.................................................................................................................................................. 10

Eljárás-specifikus értékelőlap kialakítása ............................................................................ 11

A tényleges súlyosság értékelésének következetessége ......................................................... 12

Ki járuljon hozzá a tényleges súlyossági értékelés elvégzéséhez? .......................................... 13

A nyomon követés eszközei, közege és egyéb szempontok .................................................... 13

I. függelék ................................................................................................................................ 15

Klinikai megfigyelések glosszáriuma ...................................................................................... 15

II. függelék .............................................................................................................................. 18

Háttéranyagok, iránymutatások és online források a tudományos eljárásokban részt vevő

állatok jóléti értékeléséhez ....................................................................................................... 18

3

A 2010/63/EU irányelv vonatkozó cikkei

4. cikk (3) bekezdés: „A tagállamok biztosítják a tenyésztés, elhelyezés és gondozás,

valamint az eljárások során alkalmazott módszerek tökéletesítését az állati fájdalom,

szenvedés, félelem vagy maradandó egészségkárosodás elkerülése, illetve lehető

legkisebb mértékűre csökkentése érdekében.”

15. cikk (1) bekezdés: „A tagállamok biztosítják, hogy az összes eljárást eseti alapon,

a VIII. mellékletben foglalt besorolási kritériumok alapján besorolják az

„érzéstelenítéses-túlaltatásos”, „enyhe”, „mérsékelt” vagy „súlyos” kategóriába.”

16. cikk (1) bekezdés d) pont: „az ismételt felhasználás összhangban áll az

állatorvosi javaslattal, amely figyelembe veszi az állatot teljes életútja során érő

hatásokat.”

54. cikk (2) bekezdés: „A tagállamok évente összegyűjtik és közzéteszik az állatok

eljárásokban történt felhasználására vonatkozó statisztikai adatokat, köztük az

alkalmazott eljárások tényleges súlyosságára, valamint a felhasznált főemlős állatok

eredetére és fajaira vonatkozó információkat is. ...”

Általános háttér

A tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU irányelv előírja, hogy

egy adott projektnél előrevetített módon el kell végezni az egyes eljárások súlyosságának

értékelését (15. cikk), és az eljárást „érzéstelenítéses-túlaltatásos”, „enyhe”, „mérsékelt” vagy

„súlyos” súlyossági besorolás alapján minősíteni. A VIII. melléklet ahhoz nyújt útmutatást,

hogy milyen tényezők alapján kell az előrevetített súlyosságot meghatározni, valamint

példákat is tartalmaz az egyes súlyossági kategóriákra.

A jelentéstételről szóló 54. cikk előírja, hogy statisztikai információnyújtás céljából készített

jelentésnek az állat által elszenvedett fájdalom, szenvedés, félelem vagy maradandó károsodás

tényleges súlyosságára kell vonatkoznia (a projektértékelés folyamán előrevetített súlyossági

fok helyett). Ezenkívül a korábbi eljárások tényleges súlyossága kiemelkedően fontos

szempont annak meghatározásában, hogy az állat ismételten felhasználható-e további

eljárások során (16. cikk).

Ezen intézkedések a projektjavaslatok előzetes vizsgálata révén lehetőséget nyújtanak a

tudományos minőség és állatjólét javítására, az állat tényleges szenvedésének

figyelembevételével pedig a nagyobb átláthatóságot és a tudományos eljárások állatjólétre

gyakorolt hatásának jobb megértését biztosítják.

Az előzetes értékelés, valamint a tényleges súlyosság nyomon követésének, értékelésének

és nyilvántartásba vételének fő előnyei közé sorolhatók az alábbiak:

Főként a tökéletesítés végrehajtásának és a szenvedés csökkentésének lehetősége,

jóllehet, a viták a jövőben annak átgondolására is lehetőséget nyújtanak, hogy szükség

van-e egyáltalán az állatok felhasználására (helyettesítés), és hogy a vizsgálati

módszer alkalmas-e az állatok felhasználásának minimalizálására;

Javuló állatjólét; pl. ha így a szenvedés hamarabb felismerhető és enyhíthető;

4

Jobb átláthatóság, mivel a statisztikák jobban tükrözik az állatok jólétére gyakorolt

hatásokat;

Javuló kommunikáció az állatok felhasználásáért, gondozásáért és állapotuk nyomon

követéséért felelős személyek között;

Hozzájárulás a visszaható hatályú projektértékeléshez annak elvégzése esetén (39.

cikk);

A megnövekedett jóléti szint következtében a tudományos adatok minőségének

javulása;

Bővülő ismeretek a súlyosság és a klinikai tünetek értékeléséről, ami az értékelések

nagyobb következetességének előmozdításához vezet – feltéve, hogy a

megközelítéseket és eredményeket megosztják, pl. szakmai lapokban,

vitacsoportokban és találkozókon;

Az eredmények példák formájában történő felhasználása hozzájárulást jelenthet a

kutatók, állategészségügyi technikusok és laboratóriumi állatorvosok képzési

anyagaihoz;

Kutatási eredményeken alapuló információ, amelyet az ártalom és haszon

értékeléséhez később hasonló projektekben is fel lehet használni.

A súlyosságértékelés általános szempontjai

Az eljárás során a súlyosság figyelembe vételét folyamatosan kell végezni, kezdve az eredeti

vizsgálati módszerrel, az állatok állapotának a projekt során történő, vizsgálatspecifikus napi

nyomon követésén át egészen a tényleges súlyosság értékeléséig a vizsgálat lezárultakor, ami

lehetőséget biztosít a következő vizsgálatok további tökéletesítésére.

5

Ha így közelítjük meg, nagyobb az esélye annak, hogy a három R-t (refinement, replacement,

reduction) a teljes folyamat során figyelembe veszik és végre is hajtják, valamint hogy az

érintett felek közötti kommunikáció javul, és erősödik a következetesség.

6

Az eredményes súlyosságértékeléshez az alábbiak teljesülésére van szükség:

• „Csapatszellem”, amely összehozza a különböző szaktudással, tapasztalattal és

prioritásokkal rendelkező szakembereket, pl. állategészségügyi technikusokat,

gondozókat és az állatot ellátó állatorvosokat;

• Jó tervezés;

• Az érintett dolgozók megfelelő továbbképzése és szakképzése;

• Az adott fajhoz, törzshöz és projekthez igazított, napi súlyosságértékelési

rendszerek működtetése, beleértve az állatok megfelelő időközönként (pl. az

eljárás alatt és után gyakrabban) történő, információn alapuló és strukturált

megfigyelését;

• A viselkedés és a klinikai tünetek értékelésére szolgáló, megfelelő

tájékoztatáson alapuló hatékony protokollok;

• A megfigyelések elemzése a szenvedés jellegének és szintjének a megfelelő

információkon alapuló megítéléséhez;

• Az egyes eljárások súlyosságának, valamint annak tudatosítása, hogy mi a

teendő az adott súlyossági szint elérése vagy túllépése esetén;

• A statisztikai jelentéshez a tényleges szenvedéssel kapcsolatos általános

megítélés (enyhe, mérsékelt, súlyos) következetes kialakítása;

• Annak figyelembe vétele, hogy mennyire hatékonyan sikerült a három R-t

megvalósítani, illetve hogy milyen javításokra van lehetőség jövőbeni

vizsgálatok esetén.

A vizsgálatot megelőző szempontok

A tudományos eljárások súlyosságának minimalizálást biztosító folyamat a tervezési

szakaszban kezdődik, amikor azt kell mérlegelni, hogy a tudományos célok eléréséhez

szükséges és indokolt-e élő állatok felhasználása.

Amennyiben szükséges és indokolt az élő állatok felhasználása, fontos gondoskodni a

megfelelő modell kiválasztásáról, illetve stabil vizsgálati tervről;

Azonosítani kell a vizsgálat minden olyan részét, amely fájdalmat, szenvedést, kínt

vagy tartós egészségkárosodást okozhat, és meg kell vizsgálni, hogy ezeket a

hatásokat hogyan lehet minimalizálni, például szakirodalom, munkatársak,

állategészségügyi szakemberek, állatorvos és adott esetben az állatjóléti testület

segítségével;

Az egyes eljárásokhoz társított ajánlott lehetséges súlyossági besorolást a vizsgálatban

résztvevő bármely állat által elszenvedett legnagyobb súlyosság alapján kell

kialakítani;

A vizsgálathoz alkalmas és ahhoz illeszkedő állatmegfigyelési tervet kell kidolgozni.

A vizsgálatban részt vevők számára érthető egységesített terminológia javítja a

beszámolók és az értelmezés konzisztenciáját;

7

Gondoskodni kell arról, hogy a vizsgálatot, valamint az állatok megfigyelését és

gondozását megfelelően képzett, hozzáértő munkatársak végezzék.

A súlyossági fok mutatói

Vannak viselkedésbeli és klinikai tünetek, amelyek alapján megítélhető az eljárások

súlyossága a „ketrec (vagy medence, ól stb.) mellől”. Az ezek leírására szolgáló terminológia

az állatok felhasználásban, megfigyelésében és gondozásában érintett valamennyi személy

számára legyen érthető. Valamennyi súlyosságértékelési rendszernél alapvető fontosságú a

megfigyelt faj (vagy adott esetben törzs) rendes egészségi, viselkedésbeli és jóléti állapotának

alapos ismerete.

A következő célokat kell betartani:

az állat számára a lehető legjobb életminőséget kell biztosítani;

gondoskodni kell arról, hogy az eljárás során tapasztalt szenvedésüket felismerjék, és

minimalizálják, de

ugyanakkor a tudományos célokat is be kell tartani.

Az értékelési rendszernek eredményesen kell kimutatnia a rendes egészségi és jóléti állapottól

való eltérést, a megfigyelést végző személy számára pedig lehetővé kell tennie, hogy az egyes

állatokat világosan és következetesen tudja értékelni, illetve az értékelés eredményét

rögzíteni.

Egyszerű, hierarchikus megközelítés alkalmazásával olyan súlyosságértékelési protokoll

határozható meg, amely megfelelően illeszkedik az adott fajhoz, törzshöz, egyedhez és

eljáráshoz. A ketrec mellett végzett értékelési eljárás meghatározásának folyamata során

azonosítani kell azokat a lehetséges káros hatásokat, amelyek az állat teljes életútja (azaz

elhelyezése, tenyésztése, gondozása és kezelése) során következhetnek be, valamint a

tudományos eljárások okozta káros hatásokat, és azok következményeit. E káros hatások

figyelembe vételével olyan mutatókat lehet kialakítani, amelyek segítségével a ketrec mellett

eredményesen értékelhető az állat jólléte. E mutatókat az adott fajhoz, törzshöz és az

alkalmazott kísérleti eljárásokhoz kell igazítani. A mutatók legyenek könnyen értelmezhetők,

azonosíthatók, valamint következetesen rögzíthetők. Fontos azonban lehetőséget biztosítani

az esetleges váratlan mellékhatások rögzítésére is, például folyó szövegben.

Magas szintű kategóriák

Az alábbiakban olyan átfogó, „magas szintű” kategóriák felsorolása található, amelyek

minden fajra alkalmazhatók, és kiinduló pontként szolgálhatnak az egyes eljárásokra vagy

állatgondozási programokra vonatkozó konkrét mutatók átfogó listájának kidolgozásához. A

cél a megfelelő mutatók vizsgálatspecifikus listájának létrehozása, így minimalizálható annak

kockázata, hogy a személyzet figyelmen kívül hagyja a szenvedés valamely jelét, ugyanakkor

nem jön létre olyan túlzottan bonyolult rendszer, amely szükségtelenül bürokratikus és

időigényes.

8

A magas szintű kategóriák az alábbiak:

Külső megjelenés

Testfunkciók

Környezet

Viselkedés

Eljárás-specifikus mutatók

Saját észrevételek (egyéb fontos észrevételek)

Az e kategóriákba tartozó mutatókat bármely fajhoz hozzá lehet igazítani. Ezeket kell

felhasználni azon megfigyelhető jellemzők listájának kialakításához, amelyeket a megfelelően

képzett személy értékelni tud annak érdekében, hogy megítélhesse az állat általános egészségi

és jóléti állapotát.

E mutatókat az állatok jólétének ellenőrzéséért felelős személlyel/személyekkel, adott esetben

pedig az állatjóléti testülettel kell megbeszélni és közösen kiválasztani. Ezeket végül

vizsgálatspecifikus ketrec melletti nyilvántartási rendszerek kialakítására lehet használni a

napi megfigyelési, nyomon követési és értékelési tevékenységek során.

Az I. függelékben egy példa olvasható arra, hogy e magas szintű kategóriákat hogyan lehet

alkategóriákra osztani, és közös leíró terminológia használatával megfelelő megfigyelési

kritériumok kialakítására felhasználni.

A II. függelék tájékoztatást nyújt azokról az iránymutatásokról és internetes forrásokról,

amelyek segíthetnek a tudományos eljárásokban részt vevő állatok megfelelő jóléti

értékelésének kialakításában.

A tényleges súlyosság értékelésében szerepet játszó tényezők

Fontos megjegyezni, hogy az adott helyzettől függően számos tényező lehet pozitív vagy

negatív hatással a súlyosságra, és a fajok közötti különbségeket is figyelembe kell venni.

A tényleges súlyosság értékelését egyedi, eseti alapon kell végezni, a napi nyomon követés

során az állattal kapcsolatban tett megfigyelések felhasználásával. Adott esetben a vizsgálati

célokhoz szükséges további paramétereket is lehet használni, ha léteznek ilyenek. Például a

vizsgálathoz szükség lehet szabad szemmel nem megfigyelhető mutatókra is (mint például a

testhőmérséklet, a testsúly, biokémiai paraméterek vagy biotelemetriai adatok, pl. szívverés),

és ezeket is figyelembe kell venni a súlyosságértékelés során, amennyiben releváns kiegészítő

információkat hordoznak.

Az adott állat esetében rögzítendő tényleges súlyosság az eljárás során tapasztalt legmagasabb

szintű súlyosság, nem pedig az eljárás végén tapasztalt súlyosság. Az értékelést nem szabad

egyszerűen az egyes folyamatok összeadására alapozni, pl. több enyhe hatással járó eljárás =

enyhe súlyosság. Az értékelésnek az állat által az eljárás elejétől a végéig eltelt idő során

tapasztalt szenvedés átfogó értékelésén kell alapulnia.

9

Az alábbi lista azon elemekre ad példát, amelyeket a tényleges súlyosság értékeléséhez

súlyozottan figyelembe kell venni.

Eljárás, technológia

Sebészeti / nem sebészeti

A korlátozás szintje és időtartama;

Fájdalomcsillapítás/anesztézia megvonása, amikor legalább az egyikre szükség lenne;

Új modell vagy eljárás;

Környezeti elemek (az elhelyezést és a táplálék/ivóvíz korlátozását is beleértve);

Stressz /félelem;

Ismételt eljárások és az ezek között eltelt idő (figyelembe kell venni továbbá a

„küszöbérték alatti” beavatkozások gyakoriságát és kombinációját);

Újbóli vagy folytonos felhasználás.

Faj, törzs, fejlettségi szint, korábbi tapasztalat

Ez rendkívül fontos szempont: a súlyosság hatékony előrejelzéséhez és

értékeléséhez ismerni kell a faj és a törzs (sőt, időnként az egyed) biológiáját és

viselkedését;

Faj és törzs;

Az állat eredete, pl. adott célra tenyésztett, elvadult vagy vad;

Beszerzés (beleértve a korábbi elhelyezési körülményeket) és szállítás;

Genotípus, fenotípus, nem, kor, immunállapot;

Természetes viselkedés és biológia (pl. a különböző érzékek relatív fontossága, mint

például a főemlősöknél a látás, rágcsálóknál pedig a szaglás, illetve hogy ezeket

hogyan befolyásolják a laboratóriumi körülmények);

Elkülönített/csoportos elhelyezés - a társas állatok rövid vagy hosszú távon történő

elkülönített elhelyezését, vagy a kialakult közösségtől elkülönítve történő elhelyezését

meg kell indokolni;

Napi ritmus, pl. a tudományos vagy tenyésztési eljárásoknak az éjszakai állatokra a

világos napszakban gyakorolt hatása;

Az anyaállattól való elválasztás minden fajnál, a rágcsálókat is beleértve;

Kognitív képességek, tudatosság, memória, az eljárások hatásainak érzékelése.

Gyakoriság, intenzitás

Nincs közvetlen kapcsolat a gyakoriság és a súlyosság között, azaz a megnövekedett

gyakoriság nem jelent feltétlenül fokozott súlyosságot. Ez azért van így, mert az

ismétlődő eljárások vagy technológiák súlyosságra gyakorolt hatása számos tényezőtől

függ, pl. az egyes beavatkozások intenzitásától, időtartamától, az adott fajtól és az

adott egyed által tapasztaltaktól;

10

Ismétlődő beavatkozások esetén fennáll az akklimatizálódás esélye, ami csökkentheti

a súlyosságot, pl. enyhe súlyosságú eljárásoknak alávetett főemlősöknél. Ezzel

szemben az ismétlődés akár fokozhatja is a súlyosságot, pl. egy stresszel járó eljárás

anticipálása, vagy sebészeti beavatkozás esetén hiperalgézia kialakulása miatt;

Pozitív megerősítéses betanítás vagy az eljárást követő jutalmazás;

A legmagasabb súlyossági szintet kell rögzíteni, nem a gyógyulásit.

A hatás időtartama

Az időtartam befolyásolja az intenzitást (következésképpen a súlyosságot is);

Lehetséges-e korai kíméletes vagy csak tudományos végpont alkalmazása.

A tökéletesítés eredményessége

Megfelelő fájdalomcsillapítás, anesztézia és műtét utáni ellátás;

Környezetgazdagítás – ingergazdag környezet és a társas állatok csoportos

elhelyezése;

Elhelyezés, tenyésztés és gondozás – lehetséges-e ezeket az aktuális legjobb gyakorlat

szerint tökéletesíteni, vagy az eljárás során szükség van-e korlátozásokra, mint például

kisméretű tartási helyen (pl. anyagcsere-vizsgáló ketrecben) történő elzárás, rácsos

padló vagy stressz okozására alkalmas környezeti körülményeknek való kitettség;

Az állat együttműködésre történő betanítása vagy az eljárásokhoz való

hozzászoktatása;

A ketrec mellett végzett értékelési protokollok eredményessége.

Halmozódó súlyosság

Több lépésből/beavatkozásból álló eljárás során figyelembe kell venni az egyes állatok

teljes életútját, amely során az elhelyezés tökéletesítése korlátokba ütközik vagy a

gyakori befogás, érintkezés és korlátozás stb. hatással lehet a súlyosságra;

Újbóli felhasználás esetén figyelemmel kell lenni a korábbi eljárásokra.

Az újbóli felhasználás mérlegelése esetén figyelembe kell venni az állat teljes

életútját, beleértve az olyan elemeket, mint például a beszerzés (pl. korai elválasztás)

és szállítás.

Hogyan biztosítható a tényleges súlyosság értékelésének és besorolásának

következetessége?

A tervezési szakaszban általában szükség van az illetékes tudósok, állategészségügyi

technikusok, állatorvosok és a gondozást végző személyzet hozzájárulására annak

biztosításához, hogy rendelkezésre álljanak a megfelelő adatok az eljárás végén a tényleges

súlyosságra vonatkozó, információkon alapuló döntés meghozatalához. A tényleges

súlyossági kategóriába történő végső besorolás a viselkedés, a klinikai tünetek és egyéb

11

vonatkozó paraméterek ketrec melletti, nyilvántartásba vett megfigyeléseinek elemzése

alapján történik.

A következetességet elősegítő elemek közé tartoznak az alábbiak:

- Több személy szakértelmének, tapasztalatának és prioritásainak figyelembe vétele –

csapatszellem;

- A napi értékelési protokoll használatára vonatkozó képzés (beleértve a megfigyelések

leírására használt közös terminológiát);

- Állategészségügyi, állatjóléti és -viselkedési szaktudás;

- Az eredmények rendszeres felülvizsgálata;

- A vizsgálat lefolytatásáért és az állatok állapotának nyomon követéséért felelős

személyek közötti kommunikáció (felülről lefelé, alulról felfelé, személyek között és

csoporton belül);

- Felügyelet (helyi (pl. állatjóléti testület), regionális, nemzeti, uniós szinten).

A tényleges súlyosság értékelésének következetessége érdekében elsősorban az alábbi

kérdéseket kell figyelembe venni:

Eljárás-specifikus értékelőlap kialakítása

A projekt megkezdése előtt ki kell dolgozni és el kell fogadni a fajra, törzsre és

vizsgálatra szabott értékelőlapokat;

Minden rendelkezésre álló releváns információt fel kell használni a vizsgálat-

specifikus értékelőlapok kialakításához, például korábbi tapasztalatokat, in

vitro vagy in silico eljárások eredményeit, szakirodalmi kutatásokat, kísérleti

vizsgálatokból származó információkat és az embereknél vagy más állatoknál

megfigyelt klinikai tüneteket;

A ketrec melletti megfigyeléshez rendelkezésre kell állnia a megfigyelendő

paraméterekre, valamint a nyomon követés módjára vonatkozó

információknak;

Az előrevetített súlyossági besorolás részben meghatározza az operatív szinten

szükséges szerepvállalás szintjét, valamint azt, hogy a nyomon követést

csapatban kell-e végezni, illetve hogy ki vegyen részt a tényleges megfigyelési

és nyilvántartásba vételi folyamatban. A vizsgálat-specifikus értékelési

protokollt kidolgozó személyeknek kell a tényleges súlyossági kategóriába

történő végleges besorolást elvégezni és/vagy igazolni;

A vizsgálat összetettségétől függően érdemes lehet külön értékelőlapokat

kidolgozni az egyes részelemekhez, pl. az egységes sebészeti/perioperatív

ellátási lapokat a vizsgálathoz igazított protokoll-értékeléssel kombináltan

használni.

Egyes esetekben a vizsgálat-specifikus értékelőlapnak kolóniakezelésre

vonatkozó információkat is kell tartalmaznia, pl. GA állattenyésztési és

növekedési adatokat.

12

A tényleges súlyosság értékelésének következetessége

A tényleges súlyosság értékelését az eljárás végén kell elvégezni, ehhez az állat által

ténylegesen megtapasztalt szenvedés súlyosságának a naponta végzett értékeléseken

alapuló, a lefolytatott eljárások figyelembe vételével történő megítélése szükséges.

Ennek egy szokásos módja az „enyhe”, „mérsékelt” és „súlyos” szint

meghatározása a napi értékelések során használt mutatókkal, majd ezek

súlyosságának eseti alapon történő megítélése;

A napi nyomon követéshez hasonlóan alapvető fontosságú, hogy a

tényleges értékelési kritériumok illeszkedjenek az adott eljáráshoz, fajhoz

és törzshöz; pl. a 10 %-os testsúlycsökkenés egészen más hatással lehet egy

fiatal, fejlődő patkány, egy gyorsan növekvő tumorral rendelkező kifejlett

patkány vagy egy kifejlett kutya egészségére és jólétére.

Alapvető fontosságú annak figyelembe vétele, hogy e mutatók mely

időtartamon belül következnek be, főként a testsúlycsökkenés és a táplálék-

/vízfogyasztás tekintetében.

A végső értékelés a napi értékelőlapok használatával történik, figyelembe véve az állaton

elvégzett eljárást, a káros mellékhatások időtartamát, illetve hogy az állatot újból

felhasználták-e vagy sem. Habár bizonyos fokú szubjektivitás elkerülhetetlen, a

megfigyelést végző személy megfelelő képzésével e szubjektivitás csökkenthető.

A tényleges súlyosság megállapítása elhullott állat esetén

Ha az állat elpusztul, és a halál nem eutanázia útján következett be, ez történhet a

kísérleti eljárás következtében, vagy egyéb, attól független okból1;

Az elpusztult állatok esetében a tényleges súlyosság kategóriája „súlyos”, kivéve, ha a

rendelkezésre álló információk alapján eldönthető, hogy az állat a halál beálltát

megelőzően nem élt meg súlyos szenvedést;

Ha nem valószínű, hogy a halált súlyos szenvedés előzte meg, a tényleges súlyossági

besorolásnak a halál beálltát megelőzően az állat által megtapasztalt szenvedés ismert

fokát kell tükröznie. Kellő súlyt kell kapniuk olyan tényezőknek, mint például a

nyomon követés gyakorisága, fájdalomcsillapító használata stb.;

„(tartós) egészségkárosodás” csak élő állat esetében állapítható meg.

Példákat kell kidolgozni a súlyossági besorolás, a napi értékelés és a tényleges súlyosság

végső értékelésének bemutatására, és ezeket a tudományos közösség számára elérhetővé

tenni.

1 Statisztikai jelentéskészítés céljából a tényleges súlyosság elsősorban a kísérleti eljárások súlyosságára

vonatkozik, nem pedig az azoktól független incidensekre, mint például a betegség kialakulása vagy a ketrec

elárasztása. Ezen incidens-típusok az egészségi problémákhoz vagy állattenyésztési és gondozási gyakorlatokhoz

kapcsolódnak, nem pedig az eljárás miatt bekövetkezett károsodásokhoz, azonban ezeket is rögzíteni kell, majd

később kivizsgálni és nyomon követni, hogy újbóli bekövetkezésük elkerülhető legyen.

13

Ki járuljon hozzá a tényleges súlyossági értékelés elvégzéséhez?

A hatások megfigyelése és rögzítése gyakran a tényleges súlyossági

értékeléstől különálló folyamatok;

Világosan el kell különíteni a felelősségi köröket, így biztosítva az állatok

állapotának megfelelő támogatás és felügyelet mellett történő napi szintű

nyomon követését;

A következetesség biztosítására ellenőrzési folyamatot kell megvalósítani, pl. a

különböző személyek által végzett értékelések eredményeinek

összehasonlításával;

Az állatok megfigyelésével és állapotuk nyomon követésével, valamint a

tényleges súlyosságértékelés elvégzésével kapcsolatos szerepkörök a kérdéses

vizsgálat összetettsége és súlyossága alapján legyenek rugalmasak és

kiigazíthatók – jóllehet a szenvedés kimutatásának és minimalizálásának

biztosítására irányuló jogi felelősség a projektengedélyezésben szereplő

személyt illeti;

Az állatjóléti testületeknek szintén szerepet kell játszaniuk kidolgozási szinten

a következetesség biztosításában;

A nemzeti bizottságok és illetékes hatóságok szintén hozzájárulhatnak a

következetesség érvényesítéséhez.

A nyomon követés eszközei, közege és egyéb szempontok

Már a projekttervezés szakaszában érdemes figyelembe venni a pontozólapok

használatát;

A pontozólap legyen a lehető legegyszerűbb, de kellően részletes és igazodjon

a vizsgálat típusához;

A korábban kidolgozott értékelőlapokat is lehet használni, ha megfelelnek az

adott vizsgálat, faj és törzs szempontjából;

Az elektronikus adatnyilvántartás segítheti a következetesség biztosítását, és

megkönnyíti a releváns információkhoz való hozzáférést;

Ajánlatos az egységes nyelvezet és terminológia használata;

A rögzített adatoknak a lehető legtárgyilagosabbaknak kell lenniük;

A (i) pontszámokon alapuló és (ii) a bináris (ahol a mutatók mellett a

„van/igen” vagy „nincs/nem” megjelölés szerepel) megfigyelési rendszerek

használatának előnyeit és hátrányait eseti alapon kell megvizsgálni;

A megfigyelési nyilvántartások valamennyi típusánál biztosítani kell

lehetőséget a nem várt észrevételek rögzítésére folyószöveg, valamint előre

meghatározott mutatók formájában;

Alapvető fontosságú, hogy az érintett dolgozók megfelelő képzésben

részesüljenek, főként a súlyosság- és jólétértékelések, valamint nyomon

követési technikák alkalmazása terén;

14

Kommunikációs tervet kell létrehozni, amely minden érintett dolgozóra

kiterjed; e terv tartalmazzon egy, a váratlan eredmények minden érintett

személy, valamint adott esetben az illetékes hatóság részére történő gyors

kommunikálására szolgáló mechanizmust;

A nyomon követés legyen arányos az előre látható hatásokkal – a várhatóan

„súlyos” szenvedést okozó eljárások általában gyakoribb és részletesebb

nyomon követést igényelnek;

Világos közbelépési kritériumokat kell meghatározni, például bizonyos

paraméterek észlelése esetén, vagy ha az eljárás során a szenvedés egy

meghatározott szintjét közelítik meg. Az érintett dolgozóknak tudniuk kell,

melyek ezek a kritériumok, és hogy mit kell tenni, illetve kit kell értesíteni

ilyen esetben.

Ha a súlyosságértékelési folyamatot hatékonyan valósítják meg, az állatok, valamint a

gondozásukban és felhasználásukban érintett valamennyi dolgozó élvezheti a fokozott

állatjólét, tudományos hitelesség és átláthatóság előnyeit.

A súlyosságértékelési eljárással, valamint a három R alkalmazásával kapcsolatos jó

belső és külső kommunikáció még szélesebb körű előnyöket hozhat.

15

I. Függelék

Klinikai megfigyelések glosszáriuma

A súlyosságértékelési programok sikeressége olyan jóléti mutatók kiválasztásától függ, amelyek:

• könnyen és megbízhatóan felismerhetők;

• hatékonyan biztosítják a jólét helyes mérését;

• a tudományos vizsgálat, faj és (adott esetben) törzs szempontjából relevánsak;

• praktikusan megvalósíthatóak és nem zavarják meg túlzottan az állatot, valamint

• következetes mérésre, értelmezésre és elemzésre adnak lehetőséget.

Tehát a klinikai megfigyelések rögzítéséhez közös megközelítés kidolgozása kívánatos, hiszen ez elősegíti a súlyossági besorolások

következetes megközelítéseinek kidolgozását. Ez pedig megkönnyíti a klinikai megállapítások vizsgálatok közötti összehasonlítását, illetve

tájékoztatásul szolgál a súlyosságértékelésben résztvevők számára.

A megfigyeléseket a következő hat magas szintű kategóriába lehet besorolni:

Külső megjelenés / Testműködés / Környezet / Viselkedés / Eljárás-specifikus mutatók / Saját megfigyelések

Magas szintű

kategóriák

Mely területekre kell

összpontosítani az állatok

megfigyelésekor?

Megfigyelendő mutatók

Külső megjelenés Fizikai állapot Testsúlycsökkenés/hízás

Túlsúly

16

Alultápláltság

Testi kondícióra vonatkozó eredmény (adott esetben)

Bunda és bőr állapota

Piloerekció

Gondozatlan/nem tisztálkodik

Zsíros szőrzet

Szőrhullás

Kiszáradás – feszülő bőr

Bőrsérülések – duzzanat; heg; fekély; sérülés/seb

Széklet- vagy vizelettartás hiánya

Váladékozás Szem; orr; húgyúti-genitális; porfirin-foltok egyes fajoknál, pl. patkányok

esetében

Szem

Beesett vagy üveges

Csukott/félig csukott

Szem károsodása/sérülése (pl. szaruhártya fekélyesedése)

Száj

Nyálzás

Malokklúzió/túlnőtt fogak

Egyéb

Fájdalmas arckifejezés – pl. egerek esetében félig csukott szem és

kidudorodó orrnyereg

Hasi görcsök

Duzzadt testrész, pl. felfújódott has

Testfunkciók Légzés

Gyors légzés (tachypnoea)

Nehézlégzés (hyperpnoea)

Súlyos nehézlégzés (dyspnoea)

Zihálás vagy légzéskor kiadott egyéb hang

Táplálék-/vízbevitel Fokozott/csökkent

Testhőmérséklet

Emelkedett/csökkent; adott esetben a mért testhőmérséklet (pl. mikrochip

vagy telemetriás eszköz segítségével, érintéses vagy érintés nélküli

hőmérés); rágcsálóknál a végtagok bőrszíne

Érzékek Csökkent látás, hallás vagy egyensúly-érzék

17

Környezet Az állat tartási környezete, beleértve

az almot, fészeképítéshez szükséges

anyagokat és a környezetgazdagítást

szolgáló tárgyakat

Ürülék jelenléte és állaga

Nedves alom, pl. polyuria következtében

Hányadék vagy vér jelenléte

Használja-e az állat a környezetgazdagítást szolgáló tárgyakat, pl.

fészeképítéshez szükséges anyagokat, rágótömböket

Viselkedés Társas kapcsolatok

A normál viselkedés helyett félénken/agresszíven kezd viselkedni más

állatokkal; szorong (pl. markáns meneküléses reakciók, rejtőzködés)

Társas állatok esetében elszigetelődés, háttérbe vonulás

Nem kívánatos viselkedés

Ismétlődő/ sztereotíp viselkedés

Túlzott tisztálkodás (rágcsálóknál), trichotillomania

Fokozott agresszió emberek vagy más állatok felé

Testhelyzet és mozgékonyság

Abnormális testhelyzet

Abnormális testtartás; sántaság; mozgáshiány/levertség/stimulálásra sem

hajlandó megmozdulni

Mozgáskoordináció hiánya

Görnyedt testtartás; félrebillentett fej

Egyéb

Tremor

Roham/rángás /izomgörcs

Vokalizáció; spontán vagy provokált (Megjegyzés - Egyes fajok, pl.

rágcsálók, általában az ultrahang-tartományban vokalizálnak, így a

hallható vokalizáció különös figyelmet érdemel.) A nyulak vokalizációja

általában emberek számára csak akkor hallható, ha az állat fél.

Eljárás-specifikus

mutatók

Ezeket az adott projekt, annak lehetséges

mellékhatásai és e mellékhatások várható

mutatói alapján kell meghatározni.

Például EAE-modell esetében a következő mutatók tartozhatnak ide:

csökkent faroktónus, gyenge hátsó végtag, gyenge mellső végtag, paralízis,

csökkent hólyagműködés

Saját megfigyelések A súlyosságértékelési programnak mindig tartalmaznia kell lehetőséget a jólétre gyakorolt váratlan negatív hatások

feljegyzésére.

18

II. függelék

Háttéranyagok, iránymutatások és online források a tudományos eljárásokban részt

vevő állatok jóléti értékeléséhez

American College of Laboratory Animal Medicine (ACLAM) (2006) Guidelines for the

Assessment and Management of Pain in Rodents and Rabbits (Iránymutatások a rágcsálók és

nyulak által tapasztalt fájdalom értékeléséhez és kezeléséhez), letölhető itt

http://www.tinyurl.com/65ez5vh

Assessing the Health and Welfare of Laboratory Animals (AHWLA –a laboratóriumi állatok

egészségének és jólétének értékelése) képzési anyag. Lásd:

http://www.ahwla.org.uk/index.html

Canadian Council on Animal Care (CCAC –Kanadai Állatgondozási Tanács) Welfare

assessment (Jóléti értékelés). Lásd:http://www.ccac.ca/ majd kattintson a Three Rs (Három

R) aloldalra, ahol keresse a „welfare assessment” kifejezést (angolul vagy franciául)

Categorising the severity of scientific procedures on animals - Summary and reports from

three round-table discussions (Az állatokon végzett tudományos eljárások súlyosságának

besorolása - Összefoglaló és három kerekasztal-beszélgetés eredménye) szerkesztette Jane A.

Smith és Maggy Jennings a Boyd Group és az RSPCA megbízásából, 2004. július

Kiadó: RSPCA Research Animals Department

FELASA Working Group on the Reporting of Clinical Signs in Laboratory Animals

(Laboratóriumi állatokon megfigyelt klinikai tünetek bejelentésével foglalkozó

munkacsoport) (2012) – (nyomdában)

Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) (2008) Recognition and Alleviation of

Distress in Laboratory Animals (A félelem felismerése és enyhítése Laboratóriumi állatok

esetében) Washington, DC: National Academies Press

Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) (2009) Recognition and Alleviation of

Distress in Laboratory Animals (A félelem felismerése és enyhítése laboratóriumi állatok

esetében) Washington, DC: National Academies Press. Lásd http://dels.nas.edu/animal_pain/

Johansen R, Needham JR, Colquhoun DJ, et al. (2006) Guidelines for health and welfare

monitoring of fish used in research. (Útmutató a kutatások során használt halak egészségének

és jólétének nyomon követéséhez) Laboratory Animals (Laboratóriumi állatok) 40: 323–340

Joint Working Group on Refinement (2011) A guide to defining and implementing protocols

for the welfare assessment of laboratory animals. (Tökéletesítéssel foglalkozó közös

munkacsoport: Útmutató a laboratóriumi állatok jólétének értékeléséhez használt protokollok

végrehajtásához) Laboratory Animals (Laboratóriumi állatok) 45: 1-13

19

Leach MC et al. (2008) Identification of appropriate measures for the assessment of

laboratory mouse welfare. (Laboratóriumi egerek jólétének értékelését szolgáló megfelelő

intézkedések azonosítása) Animal Welfare 17: 161-170

National Centre for the Three Rs (NC3Rs) Welfare assessment. (A három R-rel foglalkozó

nemzeti központ: Jóléti értékelés) Lásd http://www.nc3rs.org.uk/welfareassessment

National Health and Medical Research Council (2008) Guidelines to Promote the Wellbeing

of Animals Used for Scientific Purposes: The Assessment and Alleviation of Pain and

Distress in Research Animals. (Útmutató a tudományos célokra használt állatok jóllétének

javításához: A kísérleti állatok által tapasztalt fájdalom és félelem értékelése és enyhítése)

Canberra: Ausztrál kormány Lásd: http://www.nhmrc.gov.au és keresse a „pain and distress”

(fájdalom és félelem) kulcsszavakat

Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) (2000) Guidance

Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical signs as humane endpoints

for experimental animals used in safety evaluation. (Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési

Szervezet: Útmutató - a klinikai tünetek felismerése, értékelése és kíméletes végponthoz

történő felhasználása kísérleti állatoknál, biztonsági értékelések során) OECD

Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 19.

(Környezetvédelmi, egészségügyi és biztonsági kiadványsorozat – Vizsgálat és értékelés, 19.

szám) Párizs: OECD

Wells DJ, Playle LC, Enser WEJ, et al. Assessing the welfare of genetically altered mice. (A

géntechnológiával módosított egerek jólétének értékelése) A teljes változat itt olvasható:

http://www.nc3rs.org.uk/gamice. Összefoglaló itt: Laboratory Animals (Laboratóriumi

állatok) 40: 111–114

Workman P et al. (2010) Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research.

(Iránymutatások a rákkutatásban használt állatok jólétéhez) British Journal of Cancer 102:

1555-1577, letölthető itt:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2883160/?tool=pubmed

1.2 Javasolt hasznos tudományos lapok további tájékozódáshoz

Applied Animal Behaviour Science http://www.applied-

ethology.org/applied_animal_behaviour_science.html

Animal Technology and Welfare http://www.iat.org.uk/publications/atw.htm

Animal Welfare http://www.ufaw.org.uk/animal.php

20

Contemporary Topics in

Laboratory Animal Science and

Journal of the American Association

for Laboratory Animal Science

http://www.aalas.org/publications/index.aspx#ct

Lab Animal and Lab Animal

Europe

http://www.labanimal.com/laban/index.html

http://www.labanimaleurope.eu/

Laboratory Animals http://la.rsmjournals.com/

1.3 Javasolt kulcsszavak szakirodalomi kereséshez

A következő kulcsszavak hasznosak lehetnek a súlyosságértékeléssel kapcsolatos

információk keresésében.

affect harm benefit

assessment positive indicators severity scale

animal welfare humane endpoints positive welfare sickness

behavio(u)r

animal suffering Needs

qualitative

behavio(u)r

assessment

stress

assessment objective

assessment quality of life suffering

discomfort Pain refinement welfare assessment

distress pain assessment score sheets welfare indicator

harm assessment pain measurement scoring system welfare outcomes

A tényleges súlyossági besorolásra vonatkozó referenciák

CCAC (1998) Guidelines on: Choosing an Appropriate Endpoint in Experiments Using

Animals for Research, Teaching and Testing. (Iránymutatás: a megfelelő végpont

megválasztása a kutatási, oktatási és vizsgálati célokat szolgáló kísérletekben használt

állatoknál) Canadian Council on Animal Care (Kanadai Állatgondozási Tanács), elérhető itt:

21

http://www.ccac.ca/en_/standards/guidelines (angol nyelven) és

http://www.ccac.ca/fr_/normes/lignes_directrices (francia nyelven)

FELASA Working Group on Pain and Distress (1994) Pain and distress in laboratory rodents

and lagomorphs (Fájdalom és félelem laboratóriumi rágcsálóknál és nyúlalakúaknál).

Laboratory Animals 28: 97-112

Jones HRP, Oates J ésTrussell BA (1999) An applied approach to the assessment of severity

(A súlyosság értékelésének alkalmazott megközelítése) Itt: Hendriksen CFM. & Morton DB

(szerkesztők), Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research

(Kíméletes végpont az orvosbiológiai kutatásokhoz használt állatkísérletekben) A nemzetközi

konferencia jegyzőkönyve, 1998. november 22-25. Zeist (Hollandia) Royal Society for

Medicine Press Ltd., London pp 40-47

LASA /APC (2008) Final Report of a LASA/APC Working Group to Examine the Feasibility

of Reporting Data on the Severity of Scientific Procedures on Animals (A LASA/APC

munkacsoport végleges jelentése – az állatokon végzett tudományos eljárások súlyosságára

vonatkozó adatok bejelentésének megvalósíthatósága) Elérhető itt:

http://www.lasa.co.uk/publications.html

Morton, DB és Hau J (2011) 18. fejezet: Welfare assessment and humane endpoints. (Jólét-

értékelés és kíméletes végpontok) Itt: Handbook of Laboratory Animal Science, 3rd

Edition,

Volume 1 Essential Principles and Practices. (Laboratóriumi állat-tudomány kézikönyve, 3.

kiadás, 1. kötet: Alapelvek és gyakorlatok) Hau J és Schapiro, SJ (szerkesztők), CRC Press

LLC, USA, pp 535-572

Prescott MJ, Morton DB, Anderson D, Buckwell A, Heath S, Hubrecht R, Jennings M, Robb

D, Ruane B, Swallow J and Thompson P (2004) Refining dog husbandry and care, Eighth

report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.

(Kutyatenyésztés és -gondozás tökéletesítése, a BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW

tökéletesítéssel foglalkozó munkacsoportjának nyolcadik jelentése) Laboratory Animals 38

Suppl 1: S1:1-S1:94

Wolfensohn S and Lloyd M (2003) Handbook of Laboratory Animal Management and

Welfare, 3rd

Edition. (Laboratóriumi állatok kezelésének és jólétének kézikönyve, 3. kiadása)

Blackwell Publishing Ltd, Oxford (4. kiadás előkészületben)

(Utolsó ellenőrzés időpontja: 2012. május 24.)

22

A súlyossági besorolás, napi értékelés és a tényleges súlyosságértékelési

folyamatának bemutatására szolgáló példák

Brüsszel, 2013. január 11.

Az Európai Bizottság szakértői munkacsoportja által készített, és a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU

irányelv végrehajtásában illetékes nemzeti hatóságok által 2012. júliusi ülésükön jóváhagyott, a súlyosságértékelés keretrendszeréről szóló

munkadokumentum ajánlása szerint példákkal kell bemutatni a „súlyossági besorolás, napi értékelés és a tényleges súlyosság végső

értékelésének folyamatát”, és e példákat a tudományos közösség számára elérhetővé kell tenni.

Ezt követően a szakértői munkacsoport számos példát kidolgozott annak bemutatására, hogy az egyes eljárások során hogyan kell alkalmazni

a munkadokumentumban leírt folyamatokat. E példák célja, hogy segítsék az illetékes hatóságokat, felhasználókat, állategészségügyi

technikusokat, állatorvosokat és egyéb érintett munkatársakat annak biztosításában, hogy a fájdalmat, szenvedést és félelmet eredményesen

megelőzzék, előrejelezzék, felismerjék, enyhítsék és adott esetben az eljárások során következetesen értékeljék. Ezt a dokumentumot a

2010/63/EU irányelv végrehajtásában illetékes nemzeti hatóságok is jóváhagyták 2013. január 23-24-én tartott ülésükön.

Kiemelkedően fontos, hogy e példák használatakor néhány tényezőt figyelembe vegyünk:

Feltételezhető, hogy a helyes gyakorlat elvét a teljes folyamat során alkalmazzák a következő részelemek tekintetében: elhelyezés,

tenyésztés és gondozás, tökéletesítési folyamatok; oktatás és képzés, kompetencia-értékelés; a helyettesítés, csökkentés és

tökéletesítés módjairól szóló aktuális információ letöltése és alkalmazása; valamint kísérleti terv.

A példákhoz tartozó pontozólapok arra szolgálnak, hogy kiegészítsék – nem pedig helyettesítsék – a képzett, hozzáértő és

empatikus munkatársak véleményét. A cél a szenvedés rendszerszerű és objektív megfigyelésének, nyilvántartásának és

értékelésének elősegítése, ami ugyanakkor nem írja felül a megfigyelést végző személy szakmai véleményét.

23

Minden egyes példa elméleti, de valósághű helyzetre vonatkozik. Nem lenne tanácsos a gyakorlatban egyébként rendelkezésre álló

összes információt rendelkezésre bocsátani, mégis elegendő információt kell biztosítani a folyamat alkalmazásának

bemutatásához.

Ahogyan az a munkadokumentumban is szerepelt, alapvető fontosságú, hogy a súlyosságértékelést átgondoltan, és mindig az adott

faj, törzs és eljárás figyelembevételével végezzük. Ennek alapján a szakértői csoport határozott javaslata, hogy módosítás nélkül

még az azonos eljárásokban se használják ugyanazokat a táblázatokat és pontozólap-rendszereket. A súlyosságértékelési

protokollokat eredményesség szempontjából rendszeresen felül kell vizsgálni, és szükség esetén kiigazítani.

A jelen dokumentumban foglalt példák is kiigazításra szorulhatnak, hiszen egyre bővülnek a fájdalom, szenvedés és félelem

mutatóira vonatkozó ismeretek, és változnak a súlyosság értékelésére és besorolására vonatkozó megközelítések. Minden példánál

szerepel egy dátumcímke; a legfrissebb változatért látogasson el az EB honlapjára

http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/interpretation_en.htm.

Várjuk a visszajelzéseket a példák használhatóságával kapcsolatban, illetve az arra vonatkozó javaslatokat, hogy a jövőben milyen

további eljárásokkal foglalkozzunk. A megjegyzéseket a következő emailcímre küldhetik:env-laboratory-animals@ec.europa.eu

24

Tartalomjegyzék:

1. modell – Onkológiai vizsgálatok …………...………………………………………………………………………..................................25

1(a) modell - Emberi tumorsejt-vonalak fenntartása csökkent immunrendszerű csupasz egereknél ……………………………26

1(b) modell - Az új gyógyszerészeti hatóanyagok hatásossága a daganat növekedése szempontjából………………………......29

2. modell – Kísérletes autoimmun encephalitis (EAE) egereknél …………………………………………………………………………...36

3. modell – Arthritis …………………………….……………………………………………………………….…………………………...43

4. modell – Stroke …………………………….……………………………………………………………….……………………………..52

5. modell – Poliklonális antitestek előállítása nyulaknál …...………………………………………………………………………..………62

6. modell - Géntechnológiával módosított (GA) állatok létrehozása és fenntartása ……..………………………………………………….67

Modell – A géntm1a(Funding)Lab

………………….………………….……………………………………………………………….68

Modell –Tg(B gén)Labcode

………………………………………………………………………………………………………....73

Modell – C géntm1a(Funding)Lab

………………….…………..…….……….……………………………………………………….75

25

A súlyosságértékelési folyamatot bemutató példák

1. modell – Onkológiai vizsgálatok (1a és 1b) Utolsó frissítés: 2013 február 5.

1. Állatmodellek felhasználása onkológiai vizsgálatok során (1a és 1b) Általános kontextus: Új rákellenes szerek in vivo értékelése A rák a fejlett világban a vezető halálokok között szerepel, és az emberiség elöregedésével elkerülhetetlenné válik a betegség okozta terhek megnövekedése. 2010-ben az EU-ban a hetven év alatti népesség körében a daganatos betegségek okozta elhalálozás valószínűsége egy a héthez volt. A rák kezeléséhez tehát új, eredményesebb gyógyszerek kifejlesztésére van szükség. Ez egyebek mellett a daganatos megbetegedések okozta halálozási arány csökkentéséhez, és a jövőben rákban megbetegedő személyek életminőségének javulásához is hozzájárulhat. Állatmodelleket jelenleg a daganatos betegségek kezelését szolgáló új gyógyszerek kifejlesztésére használnak, a számítógépes modellezés és in vitro módszerek, például sejtkultúra-vizsgálatok mellett. Amint a vegyületek szelektivitása és aktivitása in vitro megerősítést nyert, csak a kedvező tulajdonságokkal rendelkező vegyületeket tesztelik az állatokon. A toleranciavizsgálatokat állatok kis csoportjain végzik, így nagyobb hatékonysági vizsgálatok előtt megállapítható a maximálisan tolerálható dózis (MTD) és az adagolási séma megfelelősége. Az állatokra gyakorolt hatások súlyossága a vizsgálati modelltől és a vizsgálat céljától is függ. Például a daganatsejt-vonalak fenntartása nem befolyásolhatja jelentősen a jólétet, feltéve, hogy a helyes gyakorlatot végig megfelelően alkalmazzák; ide tartozik például az állat állapotának nyomon követése és a korai kíméletes végpont alkalmazása. Az új kezelési módok metasztázis-modelleken történő értékelésére irányuló vizsgálatok azonban a daganatos áttétek kialakulása, valamint a citotoxikus gyógyszerek valószínű mellékhatásai miatt vélhetően jelentősebb aggályokat is felvetnek. Számos iránymutatás jelent meg a rákkutatásban felhasznált állatok jólétének témájában, például a British Journal of Cancer című szaklapban (Workman et al. 2010). Ezen iránymutatások részletes áttekintést tartalmaznak a rendelkezésre álló különböző állati daganatmodellekről, valamint arról, hogy ezek hogyan hatnak az állatokra és hogyan csökkenthető minimálisra szenvedésük. Az alábbi két példa a különböző súlyossági besorolású onkológiai állatmodelleket mutatja be. Referenciaanyagok Workman et al. (2010) Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. British Journal of Cancer (2010) 102(11), 1555 – 1577; ingyen letölthető itt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2883160/pdf/6605642a.pdf

26

1 (a) modell - Emberi daganatsejt-vonalak fenntartása csökkent immunrendszerű csupasz egereknél Egyes emberi daganatsejt-vonalak tenyészetben nem szaporodnak megfelelően, és alkalmanként szükség lehet az emberi sejtvonalak xenogén in vivo modellben történő karakterizálására és fenntartására. Vizsgálat 30 db BALB/C csupasz hím egér kap 10³ HCT 116 sejtszuszpenziót 0,1 ml sóoldatban, a bal lágyékba beadott szubkután injekció formájában. Az állatok csoportosan, egyedileg szellőztetett, alommal és fészeképítéshez szükséges anyagokkal ellátott ketrecekben kerülnek elhelyezésre. Az állatok jólétét naponta értékelik, súlyukat négynaponta mérik. Az egyedeken minden második nap tapintásos vizsgálatot végeznek a daganat kimutatása céljából, és a kimutatható daganatokat minden második nap tolómérővel lemérik. A daganat eltávolítása céljából az állatokat a 15. napon elaltatják.

Kezdeti előrevetített értékelés, valamint a konkrét tökéletesítési lehetőségek és kíméletes végpontok figyelembe vétele

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

Csökkent immunrendszerű egerek fenntartása

Az állatok hajlamosak a fertőzésre Elhelyezés egyedileg szellőztetett ketrecekben; a szennyezés kockázatának minimálisra csökkentését célzó tenyésztési gyakorlatok Az állatok csoportosan kerülnek elhelyezésre, a stressz csökkentését környezetgazdagítást szolgáló tárgyak biztosítják Félelem, agresszió vagy rendellenes viselkedés bármely jelének előfordulása esetén felül kell vizsgálni a tenyésztési és gondozási gyakorlatokat

A rossz egészségi állapot jeleit mutató állatokat le kell ölni

Daganatsejtek szubkután Az injekciót követő átmeneti kellemetlen Az injekciót csak egyszer kell beadni Az állatokat kíméletesen leölik, ha az

27

Elemzés Az állatok várhatóan csak ENYHE kényelmetlenséget tapasztalnak, és az e szint feletti egészségügyi vagy jóléti problémák esetén az állatot le kell ölni. A helyes előrevetített súlyossági besorolás: ENYHE. A modell végén példa található egy kitöltött megfigyelőlapra Klinikai megfigyelések Készült egy, a daganat méretére, testsúlyra, testhelyzetre és testtartásra vonatkozó alap pontozólap, ugyanis kevés egyéb klinikai tünet kialakulása volt várható. A váratlan klinikai tünetek folyó szöveg formájában feljegyzésére külön rész szolgál. A NAD bejegyzés (nincs kimutatható rendellenesség) azt igazolja, hogy az állatok állapotát ellenőrizték, rendellenesség nem mutatkozott. Példa az alábbiakban olvasható. Eredmények

Egyik állatnál sem jegyeztek fel jelentős testsúly-csökkenést.

5 állatnál nem volt megfigyelhető a daganat kialakulása.

25 állatnál a daganat a lágyékon alakult ki. A daganat nem zavarta meg az állat normál viselkedését, és a 14. napon legfeljebb 1 cm-es volt, amikor az állatot a vizsgálati protokollnak megfelelően, a daganat eltávolítása céljából elaltatták.

Némi agresszív viselkedés és verekedés volt tapasztalható az egyik ketrecben; az egyik állat farkán és hátán harapásnyomok találhatók, így külön ketrecben került elhelyezésre, sérüléseit gyógyulásig naponta fertőtlenítették, és az állatot az eljárás végéig életben tartották.

injekció formájában történő bejuttatása

érzés Megfelelő mennyiséget kell beadni (legfeljebb 0,2 ml) Az állatokat közvetlenül az injekció beadása után megfigyelés alatt kell tartani

enyhénél erősebb kínt vagy kényelmetlenséget tapasztalnak, és állapotuk rövid időn belül nem javul (nagyon ritkán)

A daganat növekedése Kényelmetlenséget okozhat, vagy befolyásolhatja a normál viselkedést vagy mozgást A daganat elfertőződhet vagy elfekélyesedhet (metasztázis nem következhet be)

A daganat növekedését minden második nap mérni kell A nyomon követési terv kiterjed a testhelyzet, testtartás, valamint a tumor méretének és állapotának gondos megfigyelésére

Az állatot le kell ölni, ha a daganat elfekélyesedik, vagy zavarja az állat normál viselkedését, testhelyzetét vagy mozgását, illetve ha a daganat átmérője meghaladja az 1,2 cm-t (Workman et al. 2010).

28

A tényleges súlyosság értékelése

A teljes vizsgálatban 29 állat vett részt. A daganatok bejuttatása és növekedése következtében enyhe szenvedést tapasztaltak. Ezen állatok esetében a tényleges súlyossági besorolás ENYHE. 1 állaton harapásnyomok voltak, amelyeket sikeresen elláttak. Ennél az állatnál további enyhe szenvedés volt megfigyelhető az agresszió következtében, de ez az eljárástól függetlenül alakult ki. Ezeket az incidenseket sikerült hatékonyan kezelni, és a szenvedést a minimálisra csökkenteni. Habár az állat által tapasztalt szenvedés szintje mérsékelt volt, hiszen ez az incidens nem függött össze az eljárással, a jelentésben feltüntetett tényleges eljárás-specifikus súlyosság ENYHE volt

Példa – megfigyelőlap (elméleti esetre vonatkozik)

Daganat növekedése csupasz egereknél – Eljárás és megfigyelőlap

1. ketrec – 1-5. számú egér

Dátum: Eljárás Daganat mérete (cm)

Súly (g) Klinikai megfigyelések - gondosan ellenőrizze az állat testhelyzetét és testtartását

02/28 szubkután injekció

1- 21 2- 22 3- 21 4-22 5- 22

Az injekció beadása után nem mutatkoztak jóléti problémára utaló jelek.

01/03 Nincs kimutatható rendellenesség (NAD)

03/02 Tapintásos vizsgálat

NAD

03/03 NAD

03/04 Tapintásos vizsgálat

1- 21 2- 22 3- 21 4-22 5- 22

NAD

03/05 NAD

03/06 Tapintásos vizsgálat

NAD

29

03/07 Némileg agresszív viselkedés; sérülés nem látható

03/08 Daganat mérése

1 – 0,1 2 – 0,1 3 – 0,1 4 – nincs daganat 5 – 0,2

1- 21 2- 22 3- 21 4-22 5- 22

Az 1. számú egér farkán és hátán harapásnyomok láthatók – helyi kezelésben részesült; elkülönítve. Fészkelődoboz biztosítása az elkülönített állat számára, de a ketrecben maradt négy egértől a további agresszió elkerülése érdekében eltávolításra kerül

03/09 1. számú egér sérülései fertőtlenítve, szépen gyógyul; a többi állat körében nem tapasztalhatók agresszió jelei

03/10 Daganat mérése

1 – 0,2 2 – 0,1 3 – 0,1 4 – nincs daganat 5 – 0,2

1. számú egér sérülései fertőtlenítve

03/11 1. számú egér sérülései fertőtlenítve

03/12 Daganat mérése

1- 0,4 2 – 0,3 3 – 0,3 4 – nincs daganat 5 – 0,5

1- 22 2- 22 3- 21 4-21 5- 23

1. számú egér sérülései begyógyultak, nincs szükség további fertőtlenítésre.

03/13 NAD

03/14 Eutanázia és daganat eltávolítása.

1(b) modell Az új gyógyszerészeti hatóanyagok hatásossága a daganat növekedése szempontjából - Több lépésből álló eljárás A vizsgálat célja, hogy értékelje az új hatóanyagoknak a daganatsejtek növekedésének csökkentésére vagy leállítására vonatkozó hatásosságát. A daganatnak kellően kifejlettnek kell lennie a kezelés megkezdése előtt (általában a 0,5 cm-es átmérő elegendő) – a vizsgálat időtartama következtében

30

egyes daganatok akár 1,2 cm-es maximális átmérőjűre is fejlődhetnek, ez általában a vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportban jellemző. A citotixikus gyógyszerek valószínűsíthetően káros hatással lesznek az állat jólétére. 30 db BALB/C csupasz hím egér kap lassú növekedésű daganatsejteket injekció formájában (0,1 ml). Az állatok jólétét naponta ellenőrzik, súlyukat pedig három egymást követő héten hetente mérik. A daganat növekedését a 7. és 14. napon tolómérővel megmérik; majd a 20. napon újabb mérés következik, az állatokat véletlenszerűen kiválasztják és napi kétszer intraperitoneális injekcióval kezelik 7 napon át.

Kezdeti előrevetített értékelés, valamint a konkrét tökéletesítési lehetőségek és kíméletes végpontok figyelembe vétele

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

Csökkent immunrendszerű egerek fenntartása

Az állatok hajlamosak a fertőzésre Elhelyezés egyedileg szellőztetett ketrecekben; a szennyezés kockázatának minimálisra csökkentését célzó tenyésztési gyakorlatok Az állatok csoportosan kerülnek elhelyezésre, a stressz csökkentését környezetgazdagítást szolgáló tárgyak biztosítják Félelem, agresszió vagy rendellenes viselkedés bármely jelének előfordulása esetén felül kell vizsgálni a tenyésztési és gondozási gyakorlatokat

A társult betegség jeleit mutató állatokat le kell ölni

Daganatsejtek szubkután injekció formájában történő bejuttatása

Az injekciót követő átmeneti kellemetlen érzés

Az injekciót csak egyszer kell beadni Megfelelő mennyiséget kell beadni (legfeljebb 0,2 ml) Az állatokat közvetlenül az injekció beadása után megfigyelés alatt kell

Az állatokat kíméletesen leölik, ha az enyhénél erősebb kínt vagy kényelmetlenséget tapasztalnak, és állapotuk rövid időn belül nem javul (nagyon ritkán)

31

Elemzés A daganat méretének következményeként az elfekélyesedés megnövekedett valószínűsége miatt, az injekciók gyakorisága és a beadott gyógyszerek káros hatásainak következtében ebben az esetben a MÉRSÉKELT előrevetített súlyossági besorolás indokolt. Lehet a súlyossági határ ENYHE?

Ez igen valószínűtlen, hacsak a tudományos célokat nem lehet a korábbi végpontok alkalmazásával, például a daganat maximális méretének csökkentésével elérni. Ez olyan gyógyszer-dózis beadásával járna, amelynek nincs ismert jelentős káros klinikai hatása. E körülmények fennállása esetén az ENYHE súlyossági besorolás indokolt lehet.

tartani

A daganat növekedése Kényelmetlenséget okozhat, vagy befolyásolhatja a normál viselkedést vagy mozgást A felhasznált daganat elfertőződhet vagy elfekélyesedhet (metasztázis nem következhet be)

Az állatok napi megfigyelése, általános egészségi állapotuk és a daganat növekedésének rendszeres nyomon követése A nyomon követési terv kiterjed a testhelyzet, testtartás, valamint a daganat méretének és állapotának gondos megfigyelésére Gyógyszeres beavatkozás megkezdése, ha a daganat elérte a 0,5 cm-es átmérőt (mérés tolómérővel)

Az állatot le kell ölni, ha a daganat elfekélyesedik, vagy zavarja az állat normál viselkedését, testhelyzetét vagy mozgását, illetve ha a daganat átmérője meghaladja az 1,2 cm-t (Workman et al. 2010).

Új gyógyszerészeti hatóanyag beadása intraperitoneális injekció formájában

Az injekciót követő átmeneti kellemetlen érzés A citotoxikus gyógyszerek hasmenést, testsúlycsökkenést, anorexiát vagy letargiát okozhatnak.

Az állatokat közvetlenül az injekció beadása után megfigyelés alatt kell tartani Maximális mennyiség napi 10 ml/kg, 7 napon át Minimális dózisszint alkalmazása (amelyet dózistartomány-vizsgálatok után állapítanak meg) Klinikai pontrendszer használata a jólét értékelésének céljából

Ha a testsúlycsökkenés meghaladja az eredeti testsúly 20%-át, az állatot le kell ölni Ha az állat több mint 48 órán át nem eszik vagy hasmenése van, le kell ölni Kíméletes végpontként a klinikai pontrendszer felső határát kell meghatározni

32

Klinikai megfigyelések A modell végén példa található egy megfigyelőlapra és pontozólap-mintára Eredmények

A 30 hím BALB/C egér közül 25 egyedet hatásosság-értékeléshez használnak; 10 egyed kapott H dózisú B gyógyszert, 10 egyed X dózisú B gyógyszert, 5 egyed pedig Y dózisú C gyógyszert; A tényleges súlyosság értékelése

3 állat esetében nem fejlődött ki a daganat, és mivel a kísérlet szempontjából nem voltak felhasználhatóak, elaltatásra kerültek – ENYHE

2 állat esetében az daganat befecskendezésének helye még a kezelés megkezdése előtt elfekélyesedett, így ezek az állatok elaltatásra kerültek – MÉRSÉKELT

10, H dózisú B gyógyszerrel kezelt állat esetében viszonylag kisméretű daganat fejlődött ki, nem volt jelentős testsúlycsökkenés és klinikai tünetek sem mutatkoztak – ENYHE

7, X dózisú B gyógyszerrel kezelt állat esetében a daganat mérete csökkent, a testsúlycsökkenés 15%-os volt, és némi laza széklet mutatkozott, de a kísérlet végéig életben tartották őket – MÉRSÉKELT

3, X dózisú B gyógyszerrel kezelt állat esetében a daganat mérete csökkent, a testsúlycsökkenés 15%-os volt, laza széklet, anorexia és súlyos letargia jelei mutatkoztak; ezeket az állatokat a 25. napon kíméletesen leölték – SÚLYOS

5, Y dózisú C gyógyszerrel kezelt állat esetében a daganat folyamatosan nőtt, nőtt a testsúly, a daganat növekedésén kívül más klinikai tünetek nem mutatkoztak. Ezeket az állatokat elaltatták, amikor a daganat mérete meghaladta az 1,2 cm-t – MÉRSÉKELT

33

Példa pontozólapra

Állat sorszáma

Dátum: 06/01 06/02 06/03 06/04

Külső megjelenés

Testsúly

Szőrzet állapota

Testfunkció

Dyspnoea és/vagy tachypnoea

Táplálékbevitel

Környezet

Laza széklet vagy hasmenés

Véres hasmenés

Viselkedés

Kezelés

Agresszió

Abnormális testtartás

Abnormális testhelyzet

Nem hajlandó a mozgásra

Eljárás-specifikus mutatók

Daganat mérete

Daganat elfekélyesedése

Mozgást akadályozó daganat

Teljes pontszám

Egyéb megfigyelések

34

Intézkedések

Pontszám: 1

A nyomon követés gyakoriságának ellenőrzése

2 Szükség lehet kiegészítő gondozásra, pl. extra folyadékra

4 Állatorvosi konzultáció

6 Kíméletes végpont alkalmazása

Példák klinikai pontszámokra

Külső megjelenés Pontszám

Testsúly

5-10%-os testsúlycsökkenés 1

11-15%-os testsúlycsökkenés 2

16-20%-os testsúlycsökkenés 3

20% feletti testsúlycsökkenés Kíméletes végpont

Szőrzet állapota

Szőrzete enyhén gondozatlan 1

Enyhe piloerekció 2

Markáns piloerekció 3

Testfunkció

Tachypnoea (szapora légzés) 1

Dyspnoea (nehéz légzés) 3

Környezet

Laza széklet vagy hasmenés 1

Véres hasmenés Kíméletes végpont

Viselkedés

Kezeléskor feszült és nyugtalan 1

Kezeléskor a félelem észlelhető jeleit mutatja, pl. reszket, vokalizál, agresszív

3

Mozgás

Enyhén rendellenes testtartás/testhelyzet 1

Markánsan rendellenes testtartás/testhelyzet 2

Jelentős mozgásproblémák / nem hajlandó mozgásra

3

24 óránál tovább tartó mozdulatlanság Kíméletes végpont

Eljárás-specifikus mutatók

35

Daganat mérete >1,2 cm Kíméletes végpont

Elfekélyesedett daganat Kíméletes végpont

Mozgást akadályozó daganat Kíméletes végpont

36

A súlyosságértékelési folyamatot bemutató példák

2. modell – Kísérletes autoimmun encephalitis (EAE) egereknél Utolsó frissítés: 2013. február 5.

Általános kontextus A kísérletes autoimmun encephalomyelitis (EAE) a sclerosis multiplex (SM) különböző aspektusainak rágcsálókon és főemlősökön történő modellezésére szolgál. Az SM több tünettel rendelkező, összetett neurológiai rendellenesség, amely fiatal felnőtteknél jelentkezik. Tünetei között szerepel a gyulladás, demyelinizáció (velőshüvely megbomlása) és az axonális károsodás. A betegség kórélettanának kutatására, valamint a lehetséges védekezési vagy gyógyítási stratégiák értékelésére – mint például az immunmoduláció, immunvédelem, axonális regeneráció és velőshüvely helyreállítása – állatmodelleket használnak. A több tünettel rendelkező, több fázisból álló SM esetében szükséges, hogy a betegség különböző szakaszaira jellemző konkrét problémák kezelésére a megfelelő modellt használják. Az EAE lényege a myelint célzó immunrendszer-aktivitás generálása, amely gyulladást okoz a központi idegrendszerben és megnyitja a vér-agy gátat. Ez pedig súlyos neurológiai tüneteket okozhat az állatmodellben, amelyet az első krónikus javuló-visszaeső szakasz során részleges felépülés követ. Ezt a szakaszt a gyulladás és a visszafordítható demielinizáció (velőshüvely felbomlása) jellemzi. 9-10 hét elteltével az állat a progresszív szakaszba lép, amelyet a krónikus demielinizáció és az axonális károsodás jellemez. E szakasz során érdemes értékelni a különböző terápiás stratégiákat. A kíméletes és tudományos végpontot gondosan kell kiválasztani, a vizsgálat céljainak figyelembe vételével. Referenciaanyagok Emerson MR et al. (2009) Enhancing the ability of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of Multiple Sclerosis through refinement of the experimental design. Comparative Medicine 59: 112-128 Miller SD et al. (2010) Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 88: 15.1.1 – 15.1.20 Weissert R (ed) (2012) Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - Models, Disease Biology and Experimental Therapy. Kiadó: In Tech, DOI: 10.5772/1190, http://www.intechopen.com Wolfensohn S et al. (előkészületben) Reducing suffering in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Vizsgálat E példában az SM lehetséges kezelésének értékelése céljából az EAE kiváltása négy hím és négy nőstény Biozzi ABH egérben történik (ezt a törzset magas transzlációs értéke miatt széles körben használják). Az eredeti projekttervezési szakaszban a felhasználó az állat szempontjából minden lehetséges

37

nemkívánatos eseményt figyelembe vesz, és az állategészségügyi technikussal és gondozókkal, valamint az állatot ellátó állatorvossal tanácskozva azonosítja a szenvedés lehetséges okait. Vizsgálták a tökéletesítés módjait, amelyeket a projekt során meg is valósítanak. Az egereket társasan, négy egyedből álló egynemű csoportokban helyezik el. Különösen nagy figyelmet fordítanak a helyi környezet kialakítására, hiszen az EAE-ben szenvedő állatoknál jelentős motoros deficit alakul ki. A ketrecek szilárd padlózattal rendelkeznek, fűrészpor alommal, megfelelő menedékekkel és fészeképítéshez szükséges anyagokkal, valamint rágótömbökkel vannak felszerelve. Az állatokat az EAE kiváltásának céljából gyulladáskeltő adjuvánssal kezelik, a felépülés és a krónikus javuló-visszaeső szakasz (9-10 hét) során pedig állapotukat nyomon követik. Amint kialakult a betegség progresszív formája, a terápiás vegyületjelölteket az egérnél egy háromhetes vizsgálat során értékelik. Kezdeti előrevetített értékelés, valamint a konkrét tökéletesítési lehetőségek és kíméletes végpontok figyelembe vétele

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

Gyulladáskeltő adjuvánst tartalmazó injekciók beadása

Az injekció beadása következtében tapasztalt kényelmetlenség vagy fájdalom Az injekció helyén reakció alakulhat ki, ami irritációt vagy kellemetlen érzést okozhat

A gyógyszert kis adagokban, több ponton (de nem a talppárnába vagy faroktőbe) szubkután kell beadni. Az adjuvánst és a vivőanyagot úgy kell kialakítani, hogy a lehető legkevesebb irritációt okozza Az injekció beadását követően az állatokat megfigyelés alá kell helyezni

Ha az injekciót követően az átmeneti mérsékeltnél erősebb fájdalom vagy félelem figyelhető meg, az állatot kíméletesen le kell ölni.

Az EAE kiváltása – az első súlyos neurológiai tünetet felépülési szakasz követi.

Bénulás, ami félelmet vagy nyugtalanságot okozhat: faroktónus elvesztése, hátsó végtag gyengesége, hipomotilitás, végtagbénulás, vizelési zavarok (inkontinencia vagy retenció)

A vizelési funkciót a húgyhólyag naponta történő ellenőrzésével követik nyomon. A hólyagot retenció esetén, amennyiben szükséges, kézzel kell kiüríteni (a hólyag ürítését követően nagy figyelmet kell fordítani a fájdalom vagy félelem esetleges tüneteire) Ha az állat inkontinens, a ketrecet gyakran kell ellenőrizni, hogy

Az alábbi kritériumok bármelyikének fennállása esetén kíméletes végpont alkalmazása:

Több mint 24 órán át tartó kétoldali mellsővégtag-bénulás

Akár 5 napig tartó kétoldali hátsóvégtag-bénulás

Öncsonkítás

Tartós

38

átnedvesedett-e az alom és a fészeképítéshez szükséges anyag; ezeket szükség esetén friss, száraz anyaggal kell pótolni Megfelelő menedék és fészeképítéshez szükséges anyag biztosítása

vizeletretenció/Hólyagürítési képesség hiánya

Parézis (izomerő-csökkenés; enyhe bénulás)

35%-os testúlycsökkenés*

A betegség kialakulását követően több mint 24 órán át nem eszik/iszik

A klinikai betegség kialakulását követő 3 héten belül nincs felépülés az EAE-ből

Társult betegség klinikai tünetei, pl. görnyedtség

Jelentős testsúlycsökkenés (pl. akár 35%)

Állandó hozzáférést kell biztosítani a ketrec padlóján elhelyezett vízhez és táplálékhoz A testsúlyt és általános állapotot naponta ellenőrzik, és a testsúlycsökkenés beindulása után (szükség szerint) gyakrabban pontozzák Nedves táplálék és folyadéktömbök biztosítása, szükség esetén szubkután folyadékpótlással

Javuló-visszaeső klinikai folyamat

Krónikus neurológiai zavarok Minden stresszt kiváltó tényezőt csökkenteni kell, a zajszintet is beleértve A környezeti hőmérséklet szükség szerint történő emelése, melegítőpárnák, plusz alom és fészeképítéshez szükséges anyag biztosításával

Új terápiás szer beadása (a progresszív szakasz során)

Az injekció okozta kényelmetlenség Hatóanyag mellékhatásai vagy hatásosság hiánya

Az állatokat a hatóanyag-jelölt befecskendezését követően gondosan megfigyelik

Az állatokat a fenti mutatók bármelyikének megfigyelése esetén kíméletesen leölik, vagy ha az új terápiás szer súlyos mellékhatásokat vált ki

39

* A 35%-os testsúlycsökkenés olyan szélsőséges végpont, amelynél megalapozott tudományos indoklás szükséges. Ebben az esetben a jelentős testsúlycsökkenés elkerülhetetlen, az állat ebből a megfelelő támogatással felépülhet, pl. kiegészítő hőérzet-növelés és táplálékpótlás, szükség esetén akár kézi etetéssel. A 35%-os végpont megállapítása e vizsgálatnál az EAE további naiv állatoknál történő kiváltására irányuló követelmény csökkentését szolgálja, ami „szokványosabb” végpont (pl. 20%) esetén lényegesen magasabb lenne. Elemzés A SÚLYOS előrevetített súlyossági besorolás megfelelőnek tűnik, hiszen az eljárás az állat általános jóllétében és állapotában súlyos károsodást okoz. Lehet a súlyosság MÉRSÉKELT?

Jóllehet e modellnél az előrevetített súlyosság a fentiekben említett okoknál fogva mindig SÚLYOS, a visszamenőleges súlyossági besorolás lehet MÉRSÉKELT, a vizsgálat időtartamától és a korai kíméletes végpont alkalmazásától függően. Klinikai megfigyelések A vizsgálat során az egereket állategészségügyi technikusok és gondozók figyelték meg klinikai pontozólap-rendszer segítségével, amelyet a felhasználókkal, állategészségügyi technikusokkal és gondozókkal, valamint az állatorvossal folytatott megbeszélések után a protokollhoz igazítottak. A pontozólap a következő paramétereket tartalmazta: testsúly, szőrzet állapota, faroktónus, hólyagkontroll, kiegyenesedés, testtartás, parézis és előrehaladott tünetek (oldalfekvés; szinte teljes bénulás; gyors, lassú vagy mély lélegzés). Mivel a projekt súlyos eljárásokat is tartalmazott, az állatokat szorosan figyelemmel kísérték, a felhasználó pedig rendszeres súlyossági felülvizsgálatokat végzett, az állatjóléti szervvel, állategészségügyi technikussal és a kinevezett állatorvossal folytatott megbeszélések során. Az alábbiakban példát mutatunk a megfelelően kitöltött pontozólapra. Példa a megfelelő pontozólapra Táblázat. Klinikai pontozólap EAE-egereknél

Dátum:

Külső megjelenés

Testsúly

Szőrzet állapota

Testfunkció

40

Hólyagkontroll

Faroktónus

Légzés

Környezet

A fészek állapota

Viselkedés

Társas viselkedés

Testtartás

Eljárás-specifikus mutatók

Oldalfekvő testhelyzet

Felegyenesedés ideje

Parézis

Bénulás

Egyéb megfigyelések

(Folyó szöveg)

Megjegyzések: Minden mutatót az alábbi táblázatban foglalt rendszer szerint értékeltek, amelyben (például) az „1” szerepelhet a „faroktónus” mellett, ha csökkent farokemelés tapasztalható, és „2” a „fészek állapota” mellett, ha a fészek rendezetlen. Táblázat. Az EAE klinikai pontozólapon használt mutatók értékelési rendszere

Pontszám: 1 = Enyhe 2 = Mérsékelt 3 = Súlyos

Testsúlycsökkenés 10%-ig 10-20% között 20-35% között

Szőrzet állapota Enyhén gondozatlan Nem tisztálkodik Markáns/elhúzódó piloerekció

Hólyagkontroll - inkontinencia

A hólyagkontroll részleges csökkenésére utaló jelek, pl. kis mennyiségű vizelet a fészekben

Hangsúlyosabb vizeletszivárgás Inkontinencia

Hólyagkontroll - retenció A hólyag kitapintható, de kezeléskor ürül

A hólyag kiürítéséhez kissé több erőfeszítés szükséges

Segítség nélkül képtelen a vizelésre; kényelmetlenség/zaklatottság jeleit mutatja a kézzel történő ürítés

41

közben vagy után

Faroktónus Farok csökkent emelése vagy görbülete

Tónusvesztés a farok külső felén Tónusvesztés a farok teljes hosszán

Légzés: gyors, lassú vagy mély légzés

Enyhe Mérsékelt Markáns

A fészek állapota Kissé rendezetlen Fészekrakási kísérlet, de rendezetlen Nincs fészek

Társas viselkedés Enyhe szenvedésnél nem várható változás; a pontszám 2-nél kezdődik

Csökkent érintkezés más állatokkal Jelentősen csökkent érintkezés; passzív

Testtartás Esetlen Egyik hátsó végtagját húzza Mindkét hátsó végtagját húzza

Oldalfekvő testhelyzet Enyhe vagy mérsékelt szenvedésnél nem várható változás; a pontszám 3-nál kezdődik

Enyhe vagy mérsékelt szenvedésnél nem várható változás; a pontszám 3-nál kezdődik

Megfigyelhető

Felegyenesedés ideje Hátára fordítva lassan egyenesedik fel

Észlelhető nehézségei vannak a felegyenesedésnél

Hátára fordítva 5 másodperc után sem képes felegyenesedni

Parézis Hátára fordítva lassú első végtag-abdukció

Hátára fordítva csökkent tartományú hátsó végtag-abdukció

Nincs első végtag-abdukció

Szinte teljes vagy teljes bénulás

Enyhe vagy mérsékelt szenvedésnél nem várható változás; a pontszám 3-nál kezdődik

Enyhe vagy mérsékelt szenvedésnél nem várható változás; a pontszám 3-nál kezdődik

Megfigyelhető

A tényleges súlyosság értékelése Az eljárás végén a pontozólapot minden egyednél felülvizsgálták annak megállapítására, hogy milyen magasak voltak a pontszámok, és hogy ez idővel hogyan változott.

Az EAE kiváltását követően két egér testsúlya 8%-kal csökkent, szőrzetük kissé gondozatlan volt, első végtag-abdukciójuk pedig kissé lassú, de minden más mutató esetében „2”-es pontszámot kaptak a projekt első 5 napja során Pontszámaik a javuló-visszaeső szakaszban és a gyógyszerkísérlet során minden egyes mutató esetében „1”-re vagy „0”-ra estek vissza. Súlyosság = MÉRSÉKELT

Három egér testsúlya 22-32%-kal csökkent, pontszámaik „3”, „2” és „1” között szóródtak a javuló-visszaeső szakasz és a gyógyszerkísérlet során. Súlyosság = SÚLYOS

Egy egér testsúlya 37%-kal csökkent a posztindukciós szakaszban, ezért kíméletesen leölték. Súlyosság = SÚLYOS

42

Két egér testsúlya 15 illetve 18%-kal csökkent, pontszámuk pedig „2” és „3” között szóródott minden más mutató esetében a vizsgálat első 4 napján. Majd a javuló-visszaeső szakaszban és a gyógyszerkísérlet során pontszámuk „1” és „2” között szóródott. Súlyosság = SÚLYOS

Bénulás nem volt megfigyelhető, a ketrec mellől pedig túl nehéz volt a légzést értékelni, úgyhogy mindkét mutatót törölték a megfigyelőlapról. Gyakran jegyezték meg a folyószöveges részen a menedékhelyen eltöltött megnövekedett időt, ami a szenvedés korai jele, úgyhogy ezt a későbbi projektekhez felvették a pontozólapra. 6 állat esetében a súlyosság SÚLYOS, 2 állat esetében pedig MÉRSÉKELT A 3R további alkalmazásának lehetőségei A tényleges súlyosság értékelését követően a felhasználók konzultáltak munkatársaikkal, és megvizsgálták a szakirodalmat további tökéletesítési lehetőségek szempontjából. A következő további tökéletesítési lehetőségeket állapították meg:

Az állatokat az adjuváns beadása előtt nagy energiatartalmú kiegészítő táplálékkal (mint például a zselé vagy a sűrített tej) kell etetni

Alacsonyabb dózisú adjuváns használata

Alternatív vizsgálati protokoll használata, így csökkenthető a projekt időtartama Ezeket későbbi vizsgálatokhoz a tényleges súlyossági szintek összehasonlításának céljából hozzáadták a protokollhoz, hogy megvizsgálhassák a tökéletesítési módok hatékonyságát.

43

A súlyosságértékelési folyamatot bemutató példák

3. modell – Arthritis

Utolsó frissítés: 2013. február 5.

Általános kontextus Az arthritis (ízületi gyulladás) állatmodelljeit a betegség patogenezisének vizsgálatára és az arthritis elleni lehetséges gyógyszerek klinikai használat céljából történő értékelésére használják. A modell kiválasztásának fontos kritériumai között szerepel az emberi betegséggel való morfológiai hasonlóság és a modell azon képessége, hogy előrejelezze a terápiás vegyületjelölt hatásosságát embereknél. A rheumatoid arthritis (reumás ízületi gyulladás) gyakran használt állatmodelljei: patkány adjuváns arthritis, patkány II-es típusú kollagén arthritis, egér II-es típusú kollagén arthritis, és antigénnel kiváltott arthritis különböző fajoknál (Bendele, 2001). A faroktőnél történő befecskendezés széles körben használt, hiszen jó immunogén választ vált ki, jóllehet a szakirodalomban az injekció beadási helyére más példák is találhatók. Az arthritis-re való hajlam, a betegség súlyossága és az arthritis kialakulásának latenciája tekintetében jelentős eltérések tapasztalhatók az egyes törzsek között. Például a géntechnológiával módosított vonalaknak az arthritis kialakulására való hajlamát módosítani lehet (fokozni vagy elnyomni), a génmódosítás hatásaitól függően. Gyakran használt, így alaposan validált állati arthritis-modelleknél a betegség kialakulása előrejelezhető, az értékelési technikákat pedig vélhetően jól körülhatárolták és leírták. Ilyen modellek esetében az egységes megfigyelési módszerek helyett többszörös értékelés is alkalmazható, beleértve a testtartás elemzését és a Von Frey-szálak használatát. Figyelem: fontos rendszeresen ellenőrizni a rendelkezésre álló törzseket, protokollokat és tökéletesítési lehetőségeket, hogy eseti alapon a legjobbakat válasszuk ki az adott tudományos kérdés megválaszolásához (Joe et al, 1999). Ebben a példában a II-es típusú kollagén arthritist mutatjuk be patkányokon, amely súlyos szenvedést okozhat. Ezért a megalapozott tudományos indokolás elengedhetetlenül szükséges a modell használatához. A patkányokat a humán rheumatoid arthritis-hez hasonló lesiók kiváltásával immunizálják a heterológ II-es típusú kollagén ellen (Bendele, 2001). Az ennek eredményeként kialakult poliarthritis jellemzője a porcok jelentős pusztulása, amely az ízületi felületeken immunkomplex-lerakódással, csontfelszívódással és a csonthártya megvastagodásával, illetve az ízületi hártya mérsékelt-hangsúlyos gyulladásával és periarticularis gyulladással társul. Referenciaanyagok

Bendele, A.M. Animal models of rheumatoid arthritis, J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4):377-385

44

Jasemian Y et al. (2011) Refinement of the collagen induced arthritis model in rats by infrared thermography. Br. J. Med. & Med. Res.1(4): 469-477

Joe, B., Griffiths, M.M., Remmers, E.F., Wilder,R.L. Animal models of rheumatoid arthritis, Current Rheumatology Reports 1999 ; 1 139-149 Vizsgálat Ebben a példában az arthritis kiváltása 18 hím és 18 nőstény Lewis-patkánynál FIA (inkomplett Freund-adjuváns) és kollagén ismételt befecskendezésével történik. Az injekció beadásának helye a faroktőnél található. A napi kezelés 10 nap elteltével kezdődik (a 10. napon), amikor az arthritis már kialakult, és 14 napig tart (a 24. napig). A vizsgálat célja a vélt (putatív) terápiás szerek vizsgálata. A kapcsolódó vegyületekre vonatkozó, korábban közzétett adatokat felülvizsgálták annak megállapítása céljából, hogy a fájdalomcsillapítás alkalmazása megzavarja-e a tudományos célokat, és azt állapították meg, hogy ennek eredményeként kísérleti vegyületeket jönnének létre. Ezért az arthritis kifejlődése során, valamint a kontrollcsoportnál nem adnak be fájdalomcsillapítót, viszont a szenvedés csökkentése céljából nagy figyelmet fordítanak a fájdalom enyhítésének nem gyógyszeres módjaira (pl. tenyésztés tökéletesítése). Minden állatot naponta megfigyelnek és lemérnek, valamint általános klinikai pontozólapon értékelik állapotukat, a 0. (az első injekció előtti) és a 10. napon (a kezelés megkezdése előtt), valamint a 13., 16., 20. és 24. napon megvizsgálják őket. A vizsgálat a következőkből áll: a fizikai funkciók romlásának közvetett mérései, mint például az ízületi átmérő mérése (tolómérővel), valamint az arthritis pontrendszere alapján végzett klinikai pontozás. A klinikai pontszámok alapján döntenek a kíméletes végpont alkalmazásáról (lásd lent).

45

Új gyógyszerészeti hatóanyagok értékelése az arthritis patkánymodellnél (II-es típusú kollagén) SÚLYOS súlyosság

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

II-es típusú szarvasmarha-kollagén faroktőbe, szubkután injekcióban történő beadása inkomplett Freund-adjuvánssal (FIA) legfeljebb három alkalommal

Korlátozáskor tapasztalt stressz Múló fájdalom, az injekció beadásának helyén mérsékelt 1-2 napig tartó duzzanat és kellemetlen érzés

Bőr fekélyesedése előfordulhat, de a FIA használatával nagyon valószínűtlen

Az eljárás során együttérző magatartás és szakavatott kezelés Egységes dózis és összetétel alkalmazása a duzzanat és fájdalom minimalizálása érdekében

A bőrfekély fennmaradása vagy elfertőződése esetén az állatot kíméletesen leölik

Arthritis kialakulása (0-10. nap)

Kellemetlenség, fájdalom, mozgásképtelenség és kín; az állat rossz egészségi állapot jeleit mutatja, tompa, étvágytalan, nem hajlandó mozgásra, testsúlycsökkenés, ízületi duzzanat, kezeléskor hallható vokalizáció

Általános klinikai pontozólap használatával gondos klinikai nyomon követés, a klinikai tünetek kialakulását követően a nyomon követés gyakoriságát fokozni kell (általában a 8-10. nap körül)

A vizsgálat során puha alom és fészeképítéshez szükséges további anyagok biztosítása

A vizsgálat során könnyen elérhető víz és táplálék (pl. a ketrec padlóján)

Az arthritis klinikai pontozórendszerének használata, amely a duzzanat mértékét és az érintett ízületek számát értékeli

A kíméletes végponthoz előre meghatározott klinikai pontszámok elérésekor az állatokat kíméletesen leölik (lásd az alábbi táblázatot)

Gyógyszerészeti hatóanyagok beadása (vizsgálat és ellenőrzés, naponta kétszer)

Az injekciót követő átmeneti kellemetlen érzés

A korábbi állati adatok alapján a

Gondos napi klinikai nyomon követés, általános klinikai pontozólap használatával

Jelentős mellékhatások esetén kíméletes végpontok alkalmazása

46

szubkután vagy intreperitoneális úton (10-24. nap között)

gyógyszerészeti hatóanyagok várhatóan nem rendelkeznek káros hatásokkal

A gyógyszerészeti hatóanyagoknak az arthritis súlyosságára gyakorolt hatásának értékelése (a 0., 10., 13., 16., 20. és 24. napon)

A használt módszerektől függően kialakulhat további átmeneti fájdalom vagy kellemetlenség, pl. Von Frey-szálak vagy tolómérő használatakor, kezelés szükséges

Gondos klinikai nyomon követés A nyomon követés gyakoriságának (a tudományos céloknak megfelelő minimumra történő) csökkentése az állat felépüléséig

Lásd az alábbi táblázatot

Megjegyzés A kutatóval, állatorvos-sebésszel, valamint az állategészségügyi technikussal és gondozókkal meg kell beszélni a klinikai és arthritisre vonatkozó pontozórendszert, és abban még a vizsgálat megkezdése előtt megállapodni. Elemzés Az állatra gyakorolt jelentős klinikai hatás valószínűségének következtében, amely akár több hétig is tarthat, a SÚLYOS előrevetített súlyossági besorolás a megfelelő. Lehet a súlyosság MÉRSÉKELT?

A vizsgálat céljától függ, hogy a súlyosságot lehet-e mérsékelt szintre csökkenteni. Például az állatok gyakori, részletes nyomon követésével, és szükség esetén (pl. az erőtlenség kialakulásakor, vagy az egyik végtagon bizonyos ideig tapasztalt enyhe erőtlenség után, vagy az ízületi pathológia korai változásainak kimutatására szolgáló in vivo leképezési módszerek használatával) korai végpontok alkalmazásával lehetséges az eljárás besorolását MÉRSÉKELT-re módosítani. E korai végpontokat (pl. a leképezést követő 6. napon befejezni a vizsgálatot) a korai gyulladásos változások kutatására szolgáló projektekben lehet alkalmazni. (Az arthritis teljes kifejlődése előtt történő) profilaktikus kezeléssel, erős gyulladáscsökkentő hatással rendelkező új gyógyszerészeti hatóanyagoknak még az arthritis teljes kifejlődése előtt történő alkalmazásával szintén MÉRSÉKELT-re csökkenthető a súlyosság. Azonban az itt bemutatott vizsgálat célja a teljesen kialakult arthritis kezelési módjainak értékelése, ezért a súlyossági besorolás mindenképpen SÚLYOS. Meghaladhatja-e a súlyosság a felső határt?

Az irányelv 15. cikkének (2) bekezdése értelmében „a tagállamok biztosítják, hogy ne kerüljön sor olyan eljárás lefolytatására, amely súlyos, várhatóan hosszú ideig tartó és nem enyhíthető fájdalommal, szenvedéssel vagy kínnal/nélkülözéssel jár”. Ez a vizsgálat valószínűleg több héten át, tehát hosszú ideig

47

tartó, súlyos szenvedést okoz. Ha a súlyos arthritis mind a négy végtagon kialakul, és az állat szenvedése nem enyhíthető, a vizsgálat túllépi a súlyosság felső határát, így azt jelentősen tökéletesíteni kell, vagy alkalmazni a „védzáradékot” (irányelv 55. cikke), és a Bizottsághoz fordulni engedélyezésért.

Ebben a példában azonban láthatók a szenvedés – a tudományos cél figyelembe vételével történő – csökkentését célzó intézkedések, mint például az adjuváns összetételének, beadásának és kiválasztásának tökéletesítése, amivel az arthritis csak a hátsó lábakon alakul ki, kényelmes környezet és a vízhez és táplálékhoz való könnyített hozzáférés biztosítása, átfogó nyomon követési rendszer és kíméletes végpont alkalmazása. Ez a projekt tehát nem lépi túl a felső határt, így az egyébként pozitív projektértékelés függvényében engedélyezhető, beleértve az okozott kár és haszon vizsgálatát.

Az alábbiakban példát mutatunk be az arthritises patkányok napi megfigyeléséhez használt klinikai pontozólapra vonatkozóan.

Dátum: 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap

Külső megjelenés

Testsúly

Nem tisztálkodik

Kiszáradás

Testfunkciók

Dyspnoea

Tachypnoea

Viselkedés

Nem hajlandó a mozgásra

Letargia/apátia

Mozdulatlanság

Vokalizáció

Eljárás-specifikus mutató

Arthritises mancs pontszáma (lásd 2. táblázat)

Egyéb megfigyelések

(Folyó szöveg)

Teljes pontszám

Megjegyzés: Minden mutatót az alábbi 1. és 2. táblázatban található rendszer alapján értékeltek. Például a pontozólapon a „gondozatlan” mellé az 1-est kell beírni (1. táblázat), az „eljárás-specifikus mutató” mellé pedig az 5-öst, amennyiben a két hátsó végtagra vonatkozó pontszám 3 illetve 2 (2. táblázat). Az

48

alábbiakban leírt intézkedések és végpontok figyelembe veszik a súlyos szenvedés lehetőségek szerinti elkerülésének követelményét, ami azonban arra is kiterjed, hogy az állatot addig nem szabad kíméletesen leölni, amíg elegendő adat nem áll rendelkezésre, ellenkező esetben újabb, naiv állatok használatára lenne szükség.

49

1. táblázat A klinikai pontozólapon használt mutatók pontozási rendszere

Pontszám

Külső megjelenés

Elfogadható, 5%-nál kevesebb testsúlycsökkenés

0

5-10%-os testsúlycsökkenés 1

11-15%-os testsúlycsökkenés 2

16-20%-os testsúlycsökkenés 3

20% feletti testsúlycsökkenés Kíméletes végpont

Nem tisztálkodik 1

Feszes bőr/kiszáradás 1

Testfunkciók

Dyspnoea 2

Tachypnoea 1

Viselkedés

Nem hajlandó mozogni 1

Letargia/apátia 2

Akár 24 órás tartós mozdulatlanság

3

24 óránál tovább tartó mozdulatlanság

Kíméletes végpont

Kezeléskor vokalizál 1

Kezeléskor vokalizál, feszült és nyugtalan

2

Mozgáskor/spontán vokalizál 3

Eljárás-specifikus mutató

2. táblázat Eljárás-specifikus mutató – arthritises mancs pontszáma

0 Normál

1 Erythema és az egyik boka duzzanata

2 Erythema, bokaduzzanat és a tarsalis ízületek proximális részének duzzanata

3 Erythema, bokaduzzanat és az összes tarsalis ízület duzzanata, egészen a metatarsalis ízületekig

4 Erythema és az egész mancs duzzanata, az ujjakat is beleértve

Ez az arthritisre vonatkozó pontozási rendszer eljárás-specifikus mutatóként működik, alapjául pedig a fokozódó duzzanat és ízületek mentén megjelenő erythema szolgál. A pontszámok fizikai és vizuális vizsgálaton alapulnak, és az „arthritis-index“ kiszámításához szolgáltatnak alapot, amely a két hátsó végtag pontszámának összegéből adódik.

50

Arthritises mancs pontszáma (2. táblázat)

0-8

HEP: kíméletes végpont alkalmazása az egyéb klinikai tünetek meglététől vagy hiányától függetlenül A klinikai összpontszámok eredményeként alkalmazott megfelelő beavatkozások példái

Szükséges intézkedések Teljes pontszám

A nyomon követés gyakoriságának növelése; folyadékpótlás/kiegészítő gondozás ≥4

A betegség előrehaladásának ellenőrzése az állatorvossal 5-15

Kíméletes végpont 16

Megjegyzés: Az összesített pontszámot az 1. és 2. táblázatban található pontozási rendszernek megfelelően kitöltött klinikai pontozólapról kell átvenni. Például ha egy állat testsúlycsökkenése 12%-os, bizonyíthatóan csökkent a tisztálkodási hajlandósága, és mindkét hátsó bokája duzzadt, az összesített pontszáma 5.

Visszamenőleges értékelés:

36 patkányt immunizáltak II-es típusú szarvasmarha-kollagénnel inkomplett Freund-adjuvánsban (FIA) Az ízületi gyulladás mindegyik állatnál kialakult: az arthritises mancs pontszáma a 10. napon: 6 Mindegyik állatnál kialakult 5-10%-os testsúlycsökkenés Az ízületátmérő mérései az alapadatokhoz képest jelentős változást mutatnak. A napi klinikai megfigyelés kiterjedt a következőkre: tisztálkodás hiánya, mozgáshajlandóság hiánya, apátia, vokalizáció kezeléskor (megfigyelés és ketrec-csere során), csökkent táplálékbevitel, és mozdulatlanságban töltött időszakok.

51

12 állatot használtak a sóoldattal kezelt csoportban. Az arthritises mancsra adott pontszámok 6 és 8 között voltak minden mérésnél (16., 16., 20. és 24. nap). Az ízületátmérő mérései szintén jelentős növekedést mutattak minden időpontban az alapadatokhoz képest. A klinikai pontszámok 4 és 8 között szóródtak, a testsúlycsökkenés 5-15%-os volt, egy állat kivételével, amelynek testsúlycsökkenése a 17. napon elérte a 21%-ot, ezért kíméletesen le kellett ölni. Visszamenőleges értékelés: SÚLYOS

12 állat kapott Alacsony dózisú kezelést az A gyógyszerrel. Az arthritises mancsra vonatkozó pontszámok a 16. napig minden állat esetében megegyeztek a sóoldattal kezelt csoport tagjainak pontszámával. A 20. napon egy állatnál a mancsra vonatkozó pontszám 8-as volt, a többi állat esetében 6-7. A 24. napon 5 állat némileg csökkent arthritises mancs-pontszámot ért el (5-7). Ennél az öt állatnál a klinikai tünetek némi javulást mutattak, a testsúly tovább csökkent ugyan 5-10%-kal; és a ketrecen belüli mobilitásuk továbbra is korlátozott volt. Szemben a sóoldattal kezelt csoporttal, a másik hét állatnál nem mutatkoztak csökkent arthritises és klinikai tünetek. Visszamenőleges értékelés: SÚLYOS

12 állat kapott Magas dózisú kezelést az A gyógyszerrel. A 13. napon az arthritises mancs-pontszám 4 és 6 között volt; az ízületek átmérője jelentéktelen mértékű csökkenést mutatott. A klinikai tünetek között szerepelt a tisztálkodás hiánya és a 10%-ot meghaladó testsúlycsökkenés. A 16. napon az arthritises mancs-pontszám 4-re csökkent, az ízületek átmérője pedig jelentős csökkenést mutatott. A testsúly a 16. napon stabilizálódott. A mozgáshajlandóság hiánya egyes állatoknál azonban fennmaradt. A 20. naptól kezdve az ízületek duzzanata 2 és 4 közé csökkent. Az állatok a ketrecben normál viselkedést mutattak. A testsúly visszaállt az eljárás előtti szintre. Visszamenőleges értékelés: SÚLYOS

Megjegyzés: A vizsgálat végére a tizenkét állatból álló harmadik csoportban a Magas dózisban beadott „A GYÓGYSZER” elnevezésű vizsgálati szer hatásosnak bizonyult, és a tényleges súlyosságot Mérsékelt szintre csökkentette. Azonban mivel a modellnél a kezelés megkezdése előtt az arthritisnek teljesen ki kellett fejlődnie minden állatnál, amikor is az állatok a „súlyos” besorolásnak megfelelő klinikai tüneteket mutattak, a tényleges súlyossági besorolás ezen állatok esetében Súlyos maradt.

Mivel a projekt során súlyos eljárásokat kell elvégezni, a felhasználó az állatjóléti szervvel, az állategészségügyi technikussal és a kijelölt állatorvossal együttműködve rendszeresen ellenőrzi a súlyosságot, hogy így biztosítsa a 3R folyamatos alkalmazását.

52

A súlyosságértékelési folyamatot bemutató példák

4. modell – Stroke

Utolsó frissítés: 2013. február 5.

Általános kontextus A stroke definíciója szerint a normál testfunkciók elvesztésével vagy módosulásával járó állapot, amelynek kiváltó oka az agy egy részének elégtelen vérellátása. Bár ma már sokkal több információval rendelkezünk a vaszkuláris agykárosodás patofiziológiáját illetően, még mindig nem teljesül a stroke hatásos kezelése iránti igény, folynak a kutatások a megfelelő megelőző és terápiás módszerek feltárása érdekében. Humán betegeknél a stroke három fajtája jelentkezhet: ischaemiás, intracerebrális vérzés és subarachnoidealis vérzés, de a jelenleg rendelkezésre álló legtöbb állatmodell az ischaemiás típuson alapul. A stroke-modellek természetüknél fogva nagy kihívást jelentenek az állatjólét szempontjából. A tudományos eljárásokban részt vevő valamennyi személy (állatorvosok, kutatók, állategészségügyi technikusok és gondozók) közötti jó kapcsolat és kommunikáció kritikus fontosságú annak biztosításához, hogy megfelelő egyensúly alakuljon ki az érvényes modell e kutatási területen történő megvalósítása és az állatok szenvedésének minimalizálása között. Rágcsálók esetében a stroke kiváltása általában a középső agyi artéria átmeneti vagy tartós elzárásával (Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO-modell) történik. Az MCAO-modell célja a stroke esetében előforduló fokális agyi ischaemia kísérleti úton történő kiváltása, amelyet széles körben használnak a károsodás mechanizmusainak vizsgálatára, a lehetséges célok azonosítására és az esetleges idegvédő szerek vizsgálatára. Azonosításra kerültek az egerek és patkányok adott törzsei közötti különbségek, valamint az életkor, nem és a társult betegségek, mint például a cukorbetegség, magas vérnyomás és érelmeszesedés összetett és jelentős hatása. Míg a preklinikai stroke-kutatás gyakran egészséges fiatal hím rágcsálókat használ, a fent említett tényezők hatását jobban lehet vizsgálni társult betegségekben szenvedő egyedeken (pl. spontán hipertenzív patkányok, streptozotocinnal (STZ) kiváltott cukorbetegség patkányoknál). A társult betegséges esetekben a klinikai tünetek gondosabb megfigyelésére és korábbi kíméletes végpont alkalmazására lehet szükség. Szabványos vizsgálati terv esetében az állatokat betanítják, hogy az MCAO-eljárást megelőzően bizonyos viselkedésteszteket végezhessenek rajtuk. A gyógyszer hatásmechanizmusa és a vizsgálat célja alapján megállapított terápiás időablak során az állatoknak beadják a vizsgált vegyületet. Az eredményanalízisnek tartalmaznia kell az infarktus méretére, halálozási arányára, komplikációk (pl. subarachnoidalis vérzés) gyakoriságára vonatkozó információkat, valamint a betegség előrehaladásának nyomon követéséhez szükséges funkcionális és neurológiai értékelést. A sorozatos mágneses rezonanciavizsgálat (MRI) hasznos eszköznek bizonyult az infarktus méretének az idő elteltével kialakult változására vonatkozó információkat illetően, de a véráramlásra és metabolikus állapotra vonatkozóan is nyújthat információkat. Hisztológiai, biokémiai és molekurális végpontok is tartozhatnak ide.

53

Számos viselkedésteszt alkalmazható a stroke-modelleknél. A legegyszerűbb tesztek neurológiai pontrendszereket tartalmaznak, amelyek az általános neurológiai státuszt értékelik, valamint a végtag elhelyezkedésére vonatkozó vizsgálatokat, amelyek a motoros reflexek mérésére irányulnak. Ezeket általában arra használják, hogy a stroke utáni akut szakaszban értékeljék az állatokat. A hosszú távú vizsgálatoknál bonyolultabb teszteket is lehet használni a szenzoros és motoros funkciók (pl. kétoldalú ragasztószalagos teszt, beam walking (az állatnak egy felfüggesztett fapálcán kell végigmennie), rotarod vagy lépcsőzés), valamint a kognitív funkciók, mint például a memória értékelésére (pl. passzív elkerüléses tesztek, vagy a tanulási stratégiák értékelése). Ajánlatos különböző viselkedésteszteket csoportban elvégezni, (akut és hosszú távú) szakaszonként legalább egyet, hogy így átfogó információ gyűljön össze a szenzoros, motoros és kognitív funkcióra gyakorolt hatásokról. Ezeket a teszteket gondosan kell kiválasztani, hogy a putatív terápiás stratégiák bármely hatását rögzíteni lehessen. A viselkedéstesztek részletes leírása, valamint a betanítás ütemezése nem szerepel ebben a szövegben, de a tesztek átfogó felülvizsgálatáért és használatuk megvitatásáért lásd: Schaar et al. (2010). Referenciaanyagok

Braeuninger S and Kleinschnitz C. Recent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental & Translational Stroke Medicine, 2009 Nov; 1:8.

Freret T and Bouet V. Improvements of the Stroke Model Guidelines – Animal body weight and long-term functional concerns. Experimental & Translational Stroke Medicine, 2009; 2(2): 28-31

Graham SM et al. Animal models of ischemic stroke: balancing experimental aims and animal care. Comparative Medicine, 2004 Oct; 54(5): 486-496

Yanamoto H et al. Evaluation of MCAo stroke models in normotensive rats: standardized neocortical infarction by the 3VO technique.ExpNeurol, 2003 Aug; 182(2):261-74

Liu S et al. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1. kiadás). Journal of experimental stroke and translational medicine, 2009 Jan 1;2(2):2-27.

Schaar KL et al. Functional assessments in the rodent stroke model. Experimental &Translatinal Stroke Medicine, 2010; 2: 13; hozzáférhető itt http://www.etsmjournal.com/content/2/1/13

Virley et al. A temporal MRI assessment of neuropathology after transient middle cerebral artery occlusion in the rat: correlations with behaviour. J Cereb Blood Flow Metab, 2000;20: 563-582.

Vizsgálat Új terápiás szer hatásossága a patkányokon alkalmazott, a középső agyi artéria elzárását célzó (MCAO), intraluminális fonal-modell esetében Ebben a példában 40 fiatal hím Sprague-Dawley patkánynál (300-350 g) alkalmazzák a tartós MCAO-t, az intraluminális fonal-technikával, általános anesztézia mellett. A patkányokat véletlenszerűen választják ki (n=10/csoport), így vagy vivőanyagot kapnak (10 ml/kg) vagy egy új vizsgálati szert (A vegyület) 1, 3 vagy 10 mg/kg dózisban, amelyet intravénásan a farokvénába adnak be, az MCAO-t követő 30. perctől számított 1 órán keresztül. Az ezt

54

követő dózisokat (akár a vivőanyagból, akár az A vegyület 1, 3 vagy10 mg/kg-os dózisából) intraperitoneálisan, az MCAO után 6 és 24 órával kell beadni. A patkányokat eleinte párban helyezik el, szilárd padlózatú, mélyalmos, fészeképítéshez szükséges anyagokkal felszerelt ketrecekben. A betanítás előtti időszakban korlátozzák a táplálékbevitelt, hogy így javítsák a lépcsőzéses teszt eredményét, amely éhség-motivációs feladat. Az állatokat ad libitum (tetszés szerint) látják el táplálékkal a műtét előtt 6 órával kezdődő és az MCAO után 6 nappal végződő időszakban, hogy így javítsák a posztoperatív felépülést és a testsúly visszaállítását. A funkcionális eredményeket naponta értékelik neurológiai pontozórendszer (Bederson-skála; lásd Schaar et al. 2010) és viselkedéstesztek segítségével (kétoldalú ragasztószalagos teszt, beam walking); Az MCAO utáni 7. naptól kezdve lépcsőzéses tesztet is naponta végeznek, így elegendő idő áll rendelkezésre a műtét utáni felépüléshez, mielőtt újra bevezetik a táplálékkorlátozást. Várhatóan egyik viselkedési teszt sem jár jelentős kínnal/nélkülözéssel. A lézió mértékének értékeléséhez a patkányokon az 1., 7., 14. és 28. napon anesztézisben mágneses rezonanciavizsgálatot (MRI) végeznek. Az MCAO után 28 nappal az összes állatot leölik. Kezdeti előrevetített értékelés, valamint a konkrét tökéletesítési lehetőségek és kíméletes végpontok figyelembe vétele

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

Műtét előtti 2-3 hetes betanítási időszak viselkedési tesztek elvégzéséhez: kétoldali ragasztószalagos teszt (kontralaterális neglekt kimutatására), beam walking (a hátsóvégtag-koordináció értékeléséhez) és lépcsőzéses teszt (mellső végtag betanításos kinyújtása)

Mielőtt az állatok hozzászoknak a tesztekhez, csak minimális stressz/szorongás okozása javasolt, hiszen a teszt során új termekbe/futtatókba helyezik őket.

A tesztberendezéshez való fokozatos hozzászoktatás Nyugodt, empatikus kezelés .

Kín jelei esetén a foglalkozásból történő eltávolítás Az előre meghatározott határidőn belül alapteljesítményt nem nyújtó állatokat kizárják a vizsgálatból

Táplálékkorlátozás (a szabad táplálósúly 85-90%-a) a műtét előtt és az MCAO után 7 napon át, a lépcsőzéses teszten való teljesítmény

Enyhe éhség; lehetséges frusztráció és szorongás

A testsúlycsökkenés nem haladhatja meg a 10%-ot, ellenkező esetben a táplálékmegvonást fel kell függeszteni

Ha a táplálékbevitel hiánya miatt viselkedési problémák merülnek fel, az állatot ki kell venni a vizsgálatból

55

elősegítése céljából

Általános anesztézia mellett, a középső agyi artéria időszakos (90 percig tartó) elzárása a fő nyaki ütőéren át bevezetett intraluminális fonal használatával

A műtét következtében fájdalom és kellemetlenség Váratlan műtéti komplikációk előfordulhatnak, pl. subarachnoidalis vérzés, ipszilaterális retinakárosodás, intraluminális vérrögképződés, agyödéma hypothalamus érintettséggel, ebből következő hyperthermia vagy átmeneti izomelhalás. Ezek számos formában jelenhetnek meg, mint például hirtelen összeomlás, bénulás, súlyos fejoldaltartás, rohamok Averzivitás és az érzéstelenítés lehetséges hatásai a pszichológiai változókra (mint például hyphothermia, alacsony vérnyomás, hypoxia) A csökkent tudatossági szint miatt elégtelen tápanyag-bevitel, elégtelen rágás és csökkent mozgékonyság, általában a MCAO-t követő első 48 órában jelentkezik Lokomotoros deficit foka, ami stresszt és/vagy frusztrációt válthat ki

Megfelelő és minimálisan averzív anesztézia használata, megfelelő (azaz hatásos, de minimális idegvédő jellemzőkkel rendelkező) fájdalomcsillapítással Megfelelő aszeptikus műtéti megoldást alkalmazó, jól képzett sebész (rendszeresen felülvizsgált sikerességi rátával) Homeosztázis fenntartása az érzéstelenítés során Az eltérések és a túl nagy kiterjedésű lesiók következtében kialakult komplikációk csökkentése érdekében szabványos monofilamentumok és műtéti megoldások használata Intenzív poszt-operatív gondozás 3-5 napon keresztül, külső hőforrások használatával. Rendszeres testsúly-ellenőrzés; napi megfigyelés és a sebek ellátása Könnyen elérhető táplálék és víz biztosítása a felépülés ideje alatt, vagy kiegészítő táplálék (püré, folyadék) és szükség esetén az állat

Az állatot az alábbi események bármelyikének előfordulása esetén kíméletesen le kell ölni –

Jelentős műszaki probléma a műtét során.

Altatásból nem tér magához teljesen

váratlan műtéti komplikációkra utaló jelek

Ha az állat testsúlycsökkenése a táplálékkiegészítés és/vagy rehidratálás ellenére meghaladja a műtét előtti testsúly 20%-át vagy ha az állat több mint 24 órán át mozdulatlan marad

56

etetése; szükség esetén rehidratálás (pl. sóoldatos injekcióval)

Viselkedési tesztek (kétoldali ragasztószalagos teszt és beam walking teszt) végzése naponta az MCAO utáni 1-28. napon; az MCAO utáni 7. naptól kezdve naponta végzett lépcsőzéses teszt

Csökkent motoros képességek esetén az állatok a feladatok végzésekor stresszt érezhetnek

Szorongás vagy félelem viselkedési mutatóinak nyomon követése Az állatokat tapasztalt munkatársak folyamatos megfigyelés alatt tartják

Általában meghatározzák az adott feladat végrehajtására szükséges időt, majd pontozzák a teljesítményt

Az új terápiás szer beadása szubkután/intravénás/intraperitoneális úton a műtét előtt és/vagy után (profilaktikus/terápiás)

A beadási úthoz kapcsolódó átmeneti kellemetlenség A beadott dózisszinteknél nem várható káros hatás

A helyes gyakorlat szerint történő gyógyszerbeadás, a legkevesebb fájdalmat/kínt okozó útvonal kiválasztásával, és lehetőleg a tudományos céloknak megfelelő technikák használatával Az állatokat a vizsgálati anyagok káros hatásai szempontjából gondos megfigyelés alatt tartják

Az új terápiás szerek által okozott súlyos mellékhatások mutatkozása esetén az állatokat kíméletesen le kell ölni

Az MCAO utáni 1., 7., 14. és 28. napon altatásban végzett longitudinális MRI

Ismételt anesztézia Averzivitás és az anesztézia lehetséges hatásai a pszichológiai változókra (mint például hyphothermia, alacsony vérnyomás, hypoxia)

Megfelelő és minimálisan averzív anesztézia használata Homeosztázis fenntartása az anesztézia során, például a beavatkozás előtt vagy alatt végzett folyadékterápiával dehidratációs problémák esetén és a normothermia fenntartása érdekében melegítés alkalmazása

Ha az állat nem tér magához az altatásból, végleg el kell altatni Ha ébredés után nem tartható fenn a homeosztázis, az állatot kíméletesen le kell ölni

57

Elemzés Ez a modell SÚLYOSnak tekinthető a következő okok miatt: műtéti eljárás, az MCAO-nak az állat jólétére gyakorolt káros (bár többnyire átmeneti) hatása, és a jelentős perioperatív komplikációk lehetősége. Az állatjólétre gyakorolt negatív hatás azonban csökkenthető az intenzív posztoperatív ellátással legalább az első 48 órában, és az azt követő szakasz során biztosított gondos megfigyeléssel – problémák esetén pedig azonnali intézkedésekkel. Kísérleti szempontból az egyes eljárások tökéletesítésére és szabványosítására fordított figyelem a komplikációk és eltérések előfordulását csökkentheti, így hozzájárulhat az adatok jobb minőségéhez és a felhasznált állatok számának csökkentéséhez. A helyes előrevetített súlyossági besorolás: SÚLYOS. Lehet a súlyosság MÉRSÉKELT?

Jóllehet e modell esetében az előrevetített súlyosság a fent említett okoknál fogva mindig SÚLYOS, a súlyos hatások előfordulása tapasztalt személyzet segítségével, szakavatott állatorvosi felügyelettel és állatgondozással, valamint a komplikációk felmerülése esetén elfogadott korai beavatkozásokkal csökkenthető. Bizonyos esetekben elfogadható a MÉRSÉKELT súlyosság is, de csupán eseti alapon, olyan kutatócsoportoknál, amelyek az adott modellnél bizonyítható tapasztalattal rendelkeznek, és köztudott, hogy a modellt legfeljebb mérsékelt szenvedés okozásával tudják alkalmazni. Klinikai megfigyelések Az állatokat a műtét utáni időszakban gondos megfigyelés alá helyezik. Szükség esetén fájdalomcsillapítás és helyi támogató terápia alkalmazása. E példa végén olvasható a kombinált neurológiai/klinikai pontozási rendszer egy példája, amely az állatok klinikai állapotát az egész eljárás során segít nyomon követni. Eredmények Az intenzív perioperatív támogatásnak köszönhetően valamennyi állat – a vivőanyaggal kezelt csoportot kivéve – váratlan komplikációk nélkül magához tért a műtét után.

- A vizsgálat során a 10 vivőanyaggal kezelt állat a legalacsonyabb neurológiai pontszámot mutatta, és a kezelt állatokhoz képest a viselkedésteszten is rosszabb teljesítményt nyújtott. A közvetlenül az MCAO-t követő (első 48 órás) időszakban a klinikai pontszám hasonló volt a kezelt állatokéhoz, később azonban a vivőanyaggal kezelt csoportban különbségek mutatkoztak:

A 10-ből 1 állatot el kellett altatni a 2. napon, mert testsúlycsökkenése meghaladta a 20%-ot (a kiegészítő táplálás és rehidratálás ellenére).

58

Értékelés: SÚLYOS

A 10-ből 6 állat mérsékelt neurológiai károsodást szenvedett, de klinikai pontszámaik később is csak minimálisan javultak Értékelés: SÚLYOS

A 10-ből 3 állatnál mérsékelt neurológiai károsodás alakult ki, a későbbiekben klinikai pontszámaik fokozatosan csökkentek, vélhetően a hosszú távú neurológiai deficithez való alkalmazkodási és kompenzálási képességük miatt.

Értékelés: MÉRSÉKELT

- A kis dózisú (1 és 3 mg/kg) A vegyülettel kezelt 20 állat az MCAO után 48 órával javuló neurológiai pontszámokat ért el, és klinikai pontszámaik is javultak.

Értékelés: MÉRSÉKELT

- A legmagasabb dózisú (10 mg/kg) A vegyülettel kezelt 10 állat az MCAO után 24 órával javuló neurológiai pontszámokat ért el (szemben a vivőanyaggal kezelt csoporttal), testsúlycsökkenésük a műtét után 24 órával minimális volt (5%), az MCAO utáni 48. órától kezdve pedig klinikai pontszámaik jelentősen javultak.

Értékelés: MÉRSÉKELT A tényleges súlyosság értékelése 7 állat esetében a súlyosság SÚLYOS, 33 állat esetében pedig MÉRSÉKELT

59

Intézkedések

Pontszám: 1

A nyomon követés gyakoriságának ellenőrzése

4 Kiegészítő gondozás, pl. extra folyadék és vizes pépek biztosítása

5 Az előrehaladás ellenőrzése az állatorvossal

12 Kíméletes végpont alkalmazása

Pontrendszer A súlyosságértékelés az általános klinikai megfigyelések (testsúly, külső megjelenés, viselkedés, ketrec környezete) és az eljárás-specifikus neurológiai értékelés kombinációjával történik. A Bederson-féle skála olyan globális neurológiai értékelés, amelyet a stroke utáni neurológiai károsodások felmérésére dolgoztak ki. 0-tól 3-ig tartó fokozati skálát alkalmaz, amelynél a 0=normál, a 3=legmagasabb fokú fogyatékosság. A tesztek a következőkre térnek ki: mellső végtag kinyújtása, oldalra lökéskor ellenállás és forgás. 0: nincs megfigyelhető deficit 1: mellső láb kinyújtása 2: oldalra lökéskor csökkent ellenállás (és mellső végtag kinyújtása), forgás nélkül 3: ugyanaz, mint a 2. fokozatnál, plusz forgás Kíméletes végpont

Pontszám

Külső megjelenés

5-10%-os testsúlycsökkenés 1

11-15%-os testsúlycsökkenés 2

16-20%-os testsúlycsökkenés 3

20% feletti testsúlycsökkenés Kíméletes végpont

Szőrzete enyhén gondozatlan 1

Enyhe piloerekció 2

Markáns piloerekció 3

Viselkedés

Enyhén rendellenes testtartás 1

Markánsan rendellenes testtartás 2

Jelentős mozgásproblémák 3

24 óránál tovább tartó mozdulatlanság Kíméletes végpont

Kezeléskor feszült és nyugtalan 2

Kezeléskor a félelem markáns jeleit mutatja, pl. reszket, vokalizál, agresszív

3

60

Intézkedések – Mivel a közvetlenül a műtét utáni időszakban általános a műtéti komplikációk előfordulása, az első 24 órában alapvető fontosságú a szigorú megfigyelés és a szakavatott, empatikus megítélés, így biztosítható, hogy a káros hatásokat észreveszik és meghozzák a megfelelő intézkedéseket azok enyhítésére, az állatokat pedig kíméletesen leölik, ha szenvedés meghaladja a súlyos kategóriát.

Környezet

A fészek kissé rendezetlen 1

A fészek alig felismerhető 2

Nincs fészek 3

Neurológiai pontszám

Mellső végtag kinyújtása 1

Oldalra lökéskor csökkent ellenállás (és mellső végtag kinyújtása), forgás nélkül

2

Ugyanaz, mint a 2. fokozatnál, plusz forgás 3

61

Egyedi megfigyelőlap példája (0-4. nap)

Nap 0 1 2 3 4

Külső megjelenés

Testsúly (g) (pontszám) 320 (0) 292 (1) 285 (2) 287 (1) 292 (1)

Szőrzet állapota

Szőrzet gondozatlan/piloerekció 1 1 0 1 0

Viselkedés

Testtartás 3 2 2 2 1

A kezelésre adott válasz 0 0 2 0 0

Környezet

A fészek állapota 3 2 1 0 0

Eljárás-specifikus neurológiai pontszám 2 2 1 1 1

Teljes pontszám 9 8 8 5 3

Lézió térfogata (MRI értékelés)* 11%

Egyéb megfigyelések A műtétből való ébredés eseménytelenül, komplikációk nélkül zajlott Dózis beadása 30 percnél és 6 óránál

Mozog a ketrecben, és megpróbál fészket rakni

Viselkedési tesztek, először szorong, végül teljesíti a feladatokat, a fészek szerkezete jobban látható

Ma kevésbé gondozott a szőrzete, de a súlya stabil, a fészek állapota jó

Viselkedési tesztek elvégezve, kevésbé szorong, testtartása jelentősen javult

* „lézió mértéke” (értékelése az MRI során): ezt a részt a kutató a vizsgálat végén tölti ki. Ezeket az adatokat később össze lehet vetni a klinikai és viselkedésre vonatkozó megfigyelésekkel, így biztosítva a nyomon követés, állatgondozás és eljárások további tökéletesítését.

62

A súlyosságértékelési folyamatot bemutató példák

5. modell – Poliklonális antitestek előállítása nyulaknál Utolsó frissítés: 2013. február 5.

Általános kontextus Az antitestek laboratóriumi állatokban történő előállításának elsődleges célja magas titerű, magas affinitású antiszérum kinyerése, amelyet kísérletek vagy diagnosztikai tesztek során használnak fel. A modern biológia és biokémia nagy része a magas specifikusságú antitestek elérhetőségére támaszkodik, amelyeket számos technológiában alkalmaznak, mint például az immunohisztokémia, ELISA, immunprecipitáció és immunblottolás. Ezért a fontos proteineket vagy peptideket célzó specifikus antitestek nagy mennyiségben történő előállítása alapvető fontosságú számos alap- és alkalmazott kutatási program szempontjából. Ebben a példában nyulat használnak fel kis peptid-antitestek termeléséhez, amelyeket a sejtosztódás szabályozása szempontjából tartanak fontosnak; mindez az emlősök sejtosztódásának biokémiai vizsgálatát is tartalmazó kutatási program részeként történik. Referenciaanyagok

A Kanadai Állatgondozási Tanács iránymutatások az antitestek előállításáról (2002). Letölthető itt http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Antibody_production.pdf

EFPIA/ECVAM (Diehl K-H et al.) (2001) A good practice guide to the administration of substances and the removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15-23

JWGR (2001) Refining procedures for the administration of substances. Laboratory Animals35: 1-41

Keating SCJ, Thomas AA, Flecknell PA & Leach MC (2012) Evaluation of EMLA cream for preventing pain during tattooing of rabbits: changes in physiological, behavioural and facial expression responses. PLOS ONE7(9): e44437 (hozzáférhető itt http://www.plosone.org)

Leenars M, Hendriksen CFM (2005) Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendation. ILAR Journal46:269-279

Stills HF (2005) Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund’s complete and other adjuvants. ILAR Journal46:280-293

UFAW/RSPCA (2008) Refining Rabbit Care: A Resource for Those Working With Rabbits in Research.Southwater, UK: RSPCA (ingyenesen letölthető itt http://www.rspca.org.uk/researchrabbits)

63

Vizsgálat Korábbi tapasztalatokból az volt leszűrhető, hogy egyetlen nyúl elegendő anyagot termel minden egyes fontos peptidhez. A nyulat kifutóban, egymással összeférhető nyulak stabil csoportjában helyezik el (amelyeket szintén antitest előállításához használnak fel), ahol a környezetgazdagításhoz, testmozgáshoz és normál társas viselkedéshez elegendő helyet biztosítanak számukra (UFAW/RSPCA 2008). Az állatot antigén/adjuváns keverékével immunizálják. Előre meghatározott időpontokban kis mennyiségű vérminta kerül levételre az immunizálás sikerességének meghatározására. Ha sikerül megfelelő antitest-titert kinyerni, az állatot ébresztés nélküli mélyaltatásban kivéreztetik, a vérben található antitestek begyűjtése céljából. A nyulak kezelése stresszt okozhat, ezért azt csak hozzáértő, empatikus munkatársak végezhetik. A nyulak viselkedése nehezen értelmezhető, ezért ajánlott tanulmányozni a nyulak viselkedésével és jólétével foglalkozó szakirodalmat. Például az újabb szakirodalomban megállapították, hogy a nyulak bizonyos körülmények között „fájdalmas arckifejezést” mutatnak (Keating et al. 2012); ezen információnak a jóléti értékelésben történő felhasználásának lehetőségét eseti alapon kell megvizsgálni. A rövidláncú peptidek gyenge immunogén hatása miatt adjuvánssal együtt kell azokat beadni. Korábban komplett Freund-adjuvánst használtak, de most már szintetikus adjuvánsok is léteznek, amelyek szintén jól működnek ebben az eljárásban, és irritáló hatásuk minimális. Kezdeti előrevetített értékelés, valamint a konkrét tökéletesítési lehetőségek és kíméletes végpontok figyelembe vétele

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

Immunizálás antigénnel és adjuvánssal; három szubkután injekció a 8., 22. és 37. napon

Az injekciót követő kellemetlen érzés Az adjuváns következtében kisméretű, fájdalommentes csomók alakulhatnak ki Az injekció helye elfekélyesedhet (ritkán)

Az injekció mennyisége, összetétele és gyakorisága megfelel a helyes gyakorlatokra vonatkozó iránymutatásoknak (pl. EFPIA/ECVAM vagy JWGR), azaz jellemzően négy helyre adható be injekció, helyenként 0,25 ml-es mennyiségben. Az esetleges fekélyeket megfelelő

Az elhúzódó kellemetlenség, fájdalom vagy kín jeleit mutató állatot (pl. ha tartós figyelmet fordít az injekció beadásának helyére) kíméletesen le kell ölni, vagy ha nem gyógyuló fekély alakul ki

64

Elemzés A következő tényezők miatt csupán enyhe súlyosság várható: a tenyésztés és gondozás tökéletesítése, helyes gyógyszerbeadási és mintavételezési gyakorlatok, és választási lehetőség több, minimális irritáló adjuváns közül. A helyes előrevetített súlyossági besorolás: ENYHE. Lehet-e tovább tökéletesíteni az eljárást? A minimális irritációt okozó adjuvánsok és kevésbé averzív altatószerek használatának lehetőségét rendszeresen felül kell vizsgálni, a szakirodalom nyomon követésével, és a kollégákkal folytatott megbeszélések során. A stressz további csökkentése céljából a növendék nyulak kezeléshez történő hozzászoktatására programot lehet kidolgozni (UFAW/RSPCA, 2008). Klinikai megfigyelések Mivel e vizsgálat során csak enyhén káros hatások várhatók, alap nyomon követési rendszert alkalmaztak, azaz az állatot naponta ellenőrizték és a megfigyeléseket rögzítették, de nem volt szükség strukturált megfigyelőlapra. E példa végén egy kitöltött megfigyelőlap példája olvasható.

azonnali állatorvosi ellátásban kell részesíteni.

Vérminta levétele az antitest-válaszok értékeléséhez (legfeljebb 5 alkalommal)

Befogás, kezelés és korlátozás, ami stresszt okozhat Tűszúrás okozta kisebb kellemetlenség Alacsony a vérzés vagy hematóma kialakulásának kockázata

Mintavétel felületes vénából (fül) Kis mennyiségű vér (legfeljebb 5 ml), csak az antitest-titerek ellenőrzése céljából A mintavétel helyén nyomást kell gyakorolni

Ha az állatot az eljárás túlzott mértékben felzaklatja, a mintavételezést el kell halasztani olyan időpontra, amikor a viselkedése normalizálódott

Általános anesztéziában végzett kivéreztetés

Az anesztézia alkalmazása során kisebb kellemetlenség és a szerrel kapcsolatos lehetséges averzió

Minimálisan averzív altatószer használata

Az állatot a kimúlásig altatásban tartják

65

A tényleges súlyosság értékelése Az egyik injekció beadási helyén átmeneti, enyhe duzzanat volt megfigyelhető, de kezelésre nem volt szükség. A nyúl rövid ideig nagyobb figyelmet fordított az injekció beadásának helyére, de ez vélhetően csak enyhe kellemetlenséget jelentett. Nem volt megfigyelhető „fájdalmas arckifejezés”. A fülvénából történő vérvétel nem járt semmilyen káros hatással. Ezen állat esetében a helyes tényleges súlyosság: ENYHE. Példa megfigyelőlapra

Antitest-termelés nyulaknál – Eljárás és megfigyelőlap

Dátum: Testsúly (kg) Megjegyzések

03/01 3,5 Elő-vérvétel – 5 ml a fülvénából; nincs káros hatás

03/02 Nincs kimutatható elváltozás (NAD)

03/06 NAD

03/07 NAD

03/08 3,6 Immunizálva – 0,25 ml, 2 helyen, szubkután, az injekció helyére néhány percig odafigyel (nyalogatja), majd viselkedése normalizálódik

03/09 NAD

03/10 NAD

03/11 NAD

03/12 Kismértékű, puha, fájdalommentes duzzanat a bal oldalra adott injekció helyén

03/13 Némi duzzanat a bal oldalra adott injekció helyén, nem romlott

03/14 A bal oldalra adott injekció helye még mindig duzzadt, de tapintásra nem fájdalmas

03/15 3,6 Duzzanat megszűnt, helyreállt a normál állapot

03/21 NAD

03/22 3,6 Immunizálva – 0,25 ml, 2 helyen, szubkután, az injekció helyére rövid ideig odafigyel

66

09/28 NAD

03/29 3,7 NAD

03/30 Vizsgálati vérvétel – 2 ml a fülvénából; nincs káros hatás

04/05 NAD

04/06 3,6 Immunizálva – 0,25 ml, 2 helyre beadva

04/14 3,6 NAD

04/15 Vizsgálati vérvétel – 2 ml a fülvénából; nincs káros hatás

04/26 NAD

04/27 3,6 Általános anesztéziában végzett kivéreztetés, nincs káros hatás

Igazolni kell, hogy az állatot legalább naponta ellenőrizték – pl. vagy az állat saját nyilvántartási lapján (lásd fent) vagy a szobához tartozó nyilvántartási lapon.

67

A súlyosságértékelési folyamatot bemutató példák

6. modell – Géntechnológiailag módosított (GA) állatok létrehozása és fenntartása

Utolsó frissítés: 2013. február 5.

1. Általános kontextus A géntechnológiával módosított állatok kutatásokban történő felhasználása hozzájárult a gének és a hozzájuk tartozó proteinek működésének megértéséhez. A különböző fenotípusok különböző hatással lehet az állatjólétre, okozhatnak akár fájdalmat, szenvedést vagy kínt is. Míg egyes fenotípusok és eredményeik előrejelezhetők, sok váratlan vagy másodlagos jellemző merülhet fel a géntechnológiával módosított vonalak létrehozása során, ezért nem mindig lehetséges a súlyosságot előre jelezni. A gyakorlatban számos, géntechnológiával módosított vonal esetében nem érintett a fenotípus, így ki lehet alakítani értékelési protokollokat a káros hatásokkal rendelkező fenotípusok kimutatására. Másik lehetőség, hogy a várható fenotípus gyakran társítható valamely előre nem látható másodlagos fenotípussal, amely különböző időpontokban jelentkezik és különböző környezeti tényezők is befolyásolhatják. Az állatnál okozott tényleges károsodás értékelésekor számos tényezőt kell figyelembe venni, mint például a mutáció fajtája, genotípus, fenotípus és tenyésztési stratégia (pl. a heterozigóta x vad típus keresztezésével elkerülni a káros homozigóta-fenotípusokat), bármely további tudományos vagy tenyésztési eljárás jellegével és mindezek lehetséges hatásaival együtt. Az állatok jóléti állapotának hatékony értékeléséhez szükség van rendszerszerű és kellően időzített megfigyelésekre, úgy a kolónia fejlődése során, mint a kolónia kísérleti szakaszában. Az új vonalakat körültekintően, egységes jóléti értékelés alapján kell nyomon követni. A megfelelően képzett és hozzáértő munkatársnak a vonalakat egyenként kell értékelnie a kolónia kifejlődése és fenntartása során, a megfigyelt káros hatásokra vonatkozó információkat pedig össze kell vetni és bejelenteni. Csak a kellő engedélyekkel rendelkező munkatársak végezhetnek bármilyen tudományos eljárást, valamint – a gondozókkal együttműködve – az állatok nyomon követését, és a náluk észlelt hatások rögzítését. A kíméletes végpontokat előrevetítve kell megállapítani a különböző paraméterek, mint például a testsúlycsökkenés, fizikai állapot és aggasztó viselkedés, valamint konkrét fejlődési tulajdonságok figyelembe vételével. Az előrejelzett súlyossági szint felett az állatokat nem szabad életben tartani, hacsak az nem szolgál sürgető tudományos érdekeket, de akkor is csak az illetékes hatóság engedélyével. A megfigyelések jellege, időzítése és időtartama az alkalmazott mutáción túl számos tényezőtől függ. Például a genetikai háttér és az állatok tartásának környezeti körülményei jelentősen módosíthatják a fenotípus kifejeződését. A létesítmények közötti összehasonlítások megkönnyítése és általában a géntechnológiával módosított állatok nyomon követése érdekében e tényezőket pontosan fel kell jegyezni. Az adott létesítményen belül minden egyes vonal életútját is figyelembe kell venni, hiszen vannak későn jelentkező fenotípusok, amelyeket csak hosszabb ideig tartott állatoknál lehet megfigyelni.

68

Referenciaanyagok RSPCA GA Passport Working Group (2010) GA Passports: The Key to Consistent Animal Care. Southwater, UK: RSPCA (letölthető itt: http://www.rspca.org.uk/sciencegroup/researchanimals/implementing3rs/gapassport) Wells DJ et al (2006) Assessing the welfare of genetically altered miceLaboratory Animals40(2): 111-114 (letölthető itt: http://www.nc3rs.org.uk/downloaddoc.asp?id=356&page=231&skin=0) 2 Példák Az alábbi 2.1-2.3. szakaszokban olvasható három példa azt mutatja be, hogy a géntechnológiával módosított egerek esetében hogyan lehet értékelni a súlyosságot, beleértve a fejlődési mérföldkövek, az eljárás kihatásának és a kolónia-fejlődésének ellenőrzését. Minden egyes példa inkább a súlyosságértékelés elveire vonatkozik, és nem veszi figyelembe a kolónia fejlődése során felmerülő összes lehetséges forgatókönyvet. Az egyes modellek kialakítása során szabványos eljárásokat kell követni, amelyekhez szükség van a vasectomián átesett fedezőhímek műtéti úton történő előkészítésére, az embriók manipulálására és az embriók befogadó álvemhes nőstényekbe történő műtéti beültetésére. A helyes gyakorlat az aszepszis, fájdalomkezelés és a sebész hozzáértése terén is megmutatkozik. Az alapító vagy csíravonalból származó ivadékban való jelenlét megerősítését szövetmintákkal lehet igazolni, amelyeket az azonosítás (fülmetszés) melléktermékeként vagy a genotípus értékeléséhez elegendő szövetet biztosító legkevésbé invazív módszerrel lehet kinyerni. Minden vonal esetében a fenotipizáló stratégia a géntől, kutatási területtől és az előrejelzett hatásoktól függ. A súlyosságértékelést egy sor egységes észrevétel határozza meg.

2.1 Géntechnológiával módosított egér-modell – A géntm1a(Funding)Lab 2.1.1 Általános kontextus Az A gén új mutációjával létrejött egy egérkolónia, amelyet a C57BL/6N háttértörzsből kinyert embrióőssejt-vonalhoz kötöttek, ismeretlen fenotípusos potenciállal. A modell fenntartását meghatározott háttérrel végezték (C57BL/6N). Amint a G1 egerek csíravonal-átvitele megtörtént, alap jólét-értékelési vizsgálatot végeztek 3-5 alomból kinyert, független pároztatásból származó 30 ivadékon. Az ivadékokat a kolónia fejlődésének meghatározott mérföldköveinél nyomon követték, azaz születéskor, születés után 14 nappal (az ivadékok azonosításával és a genotipizáláshoz szükséges szövet kinyerésével összefüggésben) és elválasztáskor. A megfelelő pontozólap a GA Jólét-értékelési Program (Wells et al. 2006) alapján került kialakításra. A kölykök megfigyelését állategészségügyi technikusok végezték a ketrec mellől, a genotípusos arány nyomon követése a kolóniavezetők feladata. Az egerek elválasztás után lehetőség szerint csoportosan kerültek elhelyezésre, egyedileg szellőztetett, almot, fészeképítéshez szükséges anyagokat és adott esetben környezetgazdagító elemeket tartalmazó ketrecekben. Az állategészségügyi technikusok az állatokkal való napi érintkezésük során ketrec melletti értékelést

69

végeztek, amíg az egerek el nem érték az ivarérettséget. A jólétre gyakorolt, életkorral összefüggő káros hatások hosszú távú értékelését a törzstenyészet állatai és leendő tenyészállatok esetében nyomon követték és rögzítették. A megfigyeléseket a háttértörzzsel való összehasonlításban végezték, és értékelték azok relevanciáját. 2.1.2 Előrevetített értékelés

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

A géntechológiai módosítás alaphatásai

A géntechnológiai módosítás káros klinikai hatásokkal is járhat. Amennyiben e hatások előre nem jelezhetőek, bármely arra utaló jel, hogy a mutációval rendelkező állatok eltávolodtak a normál fizikai vagy viselkedési paraméterektől (azaz olyan paraméterek, amelyek a genetikai háttérrel kapcsolatos fenotípus és/vagy vad kontrollcsoportok esetében fordulnak elő), jóléti problémára utalhat.

Folyamatban lévő ketrec melletti nyomon követés Jólét értékelése meghatározott fejlődési időpontokban; születés, elválasztás és ivarérettség A kimutatható káros hatások jellegétől függően lehetőség szerint megfelelő enyhítő tényezőket kell alkalmazni, mint például módosított tenyésztési stratégiák vagy a tenyésztés tökéletesítése (pl. megnövelt mennyiségű, fészeképítéshez szükséges anyag a sérült hőszabályozás pótlására)

Mérsékelt súlyosság túllépése esetén az állatot le kell ölni

Szövetminta vétele genotípus megállapításához

Lehetséges, hogy a szövetminta vételezésének módja fájdalommal és/vagy kínnal jár, pl. fül kilyukasztása/bemetszése, vagy a farok lecsippentése A farokbiopszia használata széles körben elterjedt, amikor nagy mennyiségű DNS-re

Állatoknak a fül bemetszésével történő azonosítása esetén ajánlott a fülszövetet lehetőség szerint genotípus megállapítására is felhasználni A farok lecsippentésénél a lehető legkisebb mennyiségű szövet

Nem alkalmazandó, hiszen az eljárás csak egyszeri eset, és nem valószínű, hogy az okozott fájdalom vagy kín olyan szintet ér el, amelynél kíméletes leölésre lenne szükség

70

A vizsgált gén új mutáns, amelynek nincsenek ismert káros hatásai. A létesítményben szerzett tapasztalatok azt mutatták, hogy a hasonló modellek nagy többsége enyhe fenotípust mutat. Alkalmanként azonban az adott modell váratlanul mérsékelt klinikai tüneteket mutathat, ezért ennek alapján e példa előrevetített besorolása MÉRSÉKELT. 2.1.3 Eredmények Újszülött állatok első értékelése (születéskor):

van szükség, de rövid és hosszú távú fájdalommal is járhat (ez utóbbi neurómaképződés miatt)

eltávolítására kell törekedni (figyelembe véve, hogy az ismételt mintavételezést mindenképpen el kell kerülni), megfelelő érzéstelenítés és fájdalomcsillapítás használata szükséges, és azonnal kezelni kell a túlzott vérzést A kevésbé invazív technológiákkal kapcsolatos fejleményeket nyomon kell követni, helyileg értékelni és amikor csak lehetséges, alkalmazni

Fenotipizálás A kezelés vagy fenotípusos próba alkalmazása által okozott stressz, pl. az ismeretlen környezet által okozott stressz, a kísérleti vegyület válaszreakció kiváltása érdekében történő beadása, fertőzés nyomon követése, leképezési eljárás céljából történő anesztézia és korlátozás stb.

A fenotipizálást végző munkatársak képzése hozzáértő, empatikus és egységes kezelés és megfigyelések érdekében Anesztézia használata leképezés vagy fájdalmas eljárások alatt Fenotípus-tesztek strukturálása: a kevésbé invazív eljárástól (pl. viselkedés megfigyelése nyitott térben) haladni a leginvazívabb eljárás (pl. anesztéziát igénylő eljárások) felé

Amennyiben a mutáció súlyos válaszreakciót vált ki egy fenotípus-próba esetében, bekövetkezik a kíméletes végpont és az állatot kíméletesen leölik

71

Az ivadékok színe (csak újszülötteknél)

Normál

Az ivadékok aktivitása (csak újszülötteknél)

Normál

Tejkiütés (csak újszülötteknél)

Megfigyelhető

Alom Az alom méretét, homogenitását, fejlődését és az ivadékok növekedését illetően minden ivadék megfelel a háttérparamétereknek

Az alábbi mutatókat a születés és elválasztás után 14 nappal figyelték meg:

Általános külső megjelenés

Morfológiai szempontból minden ivadék „normál” állapotú Nem figyelhető meg fejlődési rendellenesség

Méret, felépítés és növekedés

Normál, a háttértörzs szabványos növekedési görbéjének megfelelő növekedés

Szőrzet állapota Normál

Viselkedés – testhelyzet, testtartás, aktivitás és a környezethez való viszonyulás

Normál viselkedés és kapcsolat a ketrecbeli társakkal; nem figyelhető meg hiperaktivitás vagy agresszió

Klinikai tünetek Nem kimutatható

Relatív méret A háttértörzzsel összehasonlítva normál méret

Szám A háttértörzzsel összevetve normális elválasztás előtti mortalitás

Klinikai megfigyelések Az újszülött ivadékokon az elválasztásig végzett megfigyelések és arányok normálisnak minősültek a genetikai háttérhez (C57BL/6N) viszonyítva, a normál mendeli arányok mellett született homozigóta, heterozigóta és vad típusú egereknél.

72

4 hetes korukban a homozigóta és a vad típusú kontrollegereken (7+7 egyed) számos megfigyelési és enyhe eljárásos tesztet végeztek 16 héten át, mint például a SHIRPA, diszmorfológiai, nyitottmezős, vér klinikai kémiai vizsgálata, DEXA és Faxitron képalkotás. A kísérlet végén a fenotípus-elemzés az intraperitoneális glükóztolerancia-teszt (ipGTT) elvégzését követően csökkent glükózlebontást mutatott a homozigóta egerekben. Jóllehet a vizsgálat során csökkent a glükózlebontás, az eljárás után minden állat visszatért az alapállapothoz és nem jelentkezett egyéb káros hatás. 2.1.4 Az eredmények elemzése Tényleges súlyosságértékelés A kolónia létrehozása után a kolónia fenntartásához és fejlődéséhez heterozigóta egereket és vad típusú alomtársaikat használták fel. A tenyésztéshez és fenntartáshoz felhasznált egereknél nem volt megfigyelhető káros fenotípus, így ezek nem rendelkeztek káros hatásokkal. Mivel nem várható káros fenotípus kialakulása, a vonalat homozigótává lehet minősíteni és projektengedélyezés nélkül fenntartani. A fenti heterozigóta egerek heterozigóta egérrel történő pároztatása homozigóta egereket eredményezett. Ezen egerek egy csoportját standard fenotipizáló szűréshez használták fel, amely enyhe protokollok sorából áll, mint például az intraperitoneális glükóztolerancia-teszt során tűvel történő vérvétel. A vad típusú kontrolloknál ugyanakkor végezték el a teszteket. Az egerekre gyakorolt kumulatív hatás lehetett volna enyhe, a vérvétel és az azt követő fenotipizáló eljárások következtében, szemben a géntechnológiával történő módosítás átfogó hatásával. Összefoglaló Tenyésztés és fenntartás – nincs káros hatás Homozigóta + kontroll egerek – ENYHE – a szűrővizsgálatok alapján (nem a géntechnológiai módosítás hatása miatt) Összefoglalva: ez a géntechnológiával módosított egérvonal nem káros fenotípusúnak tekinthető. A kialakult vonalak tenyésztéséhez az irányelv értelmében nincs szükség projektengedélyezésre.

73

2.2 Géntechnológiával módosított egérmodell – Tg(B gén)Labor kódja 2.2.1 Általános kontextus Egy transzgén túlexpresszióját okozó mutációval rendelkező egérkolónia létrehozása, amely modellként szolgál a rák egy fajtájának vizsgálatához. A vonalat C57BL/6N háttérrel hozzák létre. Azonban a daganat kialakulását és fejlődésének ütemét nem lehet előre meghatározni, ez a modell karakterizálásának részeként került értékelésre. Amint az alapvonalakat létrehozták, jólét-értékelési alapszűrést végeznek a 2.1. szakaszban leírtak szerint. A leghasznosabb vonalat továbbfejlesztik a leukémia e típusának vizsgálata céljából. 2.2.2 Előrevetített értékelés

Mivel jár a vizsgálat az állatok számára?

Mit fognak az állatok tapasztalni? Mekkora szenvedéssel jár? Mi ronthatna az okozott szenvedésen?

Hogyan lehet a szenvedést a minimálisra csökkenteni?

Káros hatások Módszertan és beavatkozások Végpontok

A daganat fejlődésének értékelése és jellemzése

A rák előrehaladtával fokozódó súlycsökkenés és állapotromlás figyelhető meg. A szubkután duzzanatok kényelmetlenséget okozhatnak, és befolyásolhatják a normál viselkedést, testhelyzetet vagy lokomotoros készségeket. Az állatok csökkent immunrendszerük következtében hajlamosabbak a megbetegedésre

A beavatkozásokat a következő kritériumok szerint végzett napi megfigyelésekre alapozzák: testsúlycsökkenés, fizikai állapot romlása, letargia stb. Napi megfigyelés, az általános egészségi állapot és a daganat növekedésének nyomon követése

Kíméletesen le kell ölni azokat a törzstenyészethez tartozó állatokat és tenyészállatokat, amelyek nem vesznek részt kísérleti eljárásban és olyan klinikai tüneteket mutatnak, mint például a 15%-ot meghaladó testsúlycsökkenés, elhanyagolt szőrzet, letargia Az állatot le kell ölni, ha a daganat elfekélyesedik, vagy zavarja az állat normál viselkedését, testhelyzetét vagy mozgását, illetve ha a daganat átmérője meghaladja az 1,2 cm-t A társult betegség jeleit mutató állatokat kíméletesen le kell ölni

74

Az előrejelzett genetikai rendellenesség létrehozásához mutálni kell a vizsgált modellt. A betegség kialakulását nem könnyű előrejelezni, de a klinikai tüneteket előre meg lehet határozni, ami lehetővé teszi a betegség kialakulásának karakterizálását. A már karakterizált modellt fenn kell tartani, hogy fel lehessen azt használni a vizsgált ráktípus lehetséges kezelési módjainak későbbi kísérleti tanulmányozása során. Mindezek alapján jelen példa előrevetített besorolása: MÉRSÉKELT. 2.2.3 Eredmények A jóléti értékeléseket a fenti 2.2. szakasznak megfelelően végezték. A fejlődési mérföldkövekben, ivarérettségig tartó növekedésben nem mutatkoztak rendellenességek. A kolóniát bővítették a tenyésztörzshöz tartozó és később tenyészállatokkal, amelyeket 10 hetes koruktól kezdve pároztatták a kolónia fenntartása és új kísérleti állatok létrehozása céljából. Az állatokat ez idő alatt megfigyelték, a daganat fejlődése a mutációval rendelkező állatok 60%-ánál 18 hetes kortól megfigyelhető volt. A betegség klinikai lefolyása 4-6 hét, ekkor az állatokat elaltatták. 2.2.4 Az eredmények elemzése Tényleges súlyosságértékelés A daganat kifejlődése a mutációval rendelkező állatok 60%-ánál 18 hetes kortól megfigyelhető volt. A tenyésztési stratégia szerint az állatokat 10 hetes koruktól kezdve pároztatták. A tenyészpárok esetében a daganat kialakulásának esélye elegendő volt a tenyésztés és fenntartás módosításához. A tenyészpárokat ezután 6 hetes koruktól kezdve pároztatták, a párokat 12 hetes korukban szétválasztották, a fedezőhímeket ekkor leölték. A tenyésztörzshöz tartozó nőstényeket és tenyésznőstényeket naponta nyomon követték, hogy kimutassák náluk a daganat kifejlődésének korai jeleit. A nem felhasznált vagy nem szükséges állatokat a klinikai tünetek kialakulása előtt kíméletesen leölték. Összefoglaló 18 hétnél fiatalabb állatok – nincs mellékhatás 18 hetes vagy annál idősebb állatok, amelyeknél kialakult a daganat – a korai klinikai végpontok következtében ENYHE 18 hetes kortól kifejlődött daganattal rendelkező, felhasználásra kiadott állatok – ENYHE vagy MÉRSÉKELT, a klinikai végpontok alkalmazásától függően

75

2.3 Géntechnológiával módosított egérmodell – C géntm1a(Funding)Lab 2.3.1 Általános kontextus A viselkedés és memória vizsgálata céljából a C gén mutációjával létrehoztak egy egérkolóniát, amelyet a C57BL/6N háttértörzsből kinyert embrióőssejt-vonalhoz kötöttek, ismert fenotípusos potenciállal. A modell fenntartását meghatározott háttérrel végezték (C57BL/6N). Amint a G1 egerek csíravonal-továbbítása megtörtént, alap jólét-értékelési szűrővizsgálatot végeztek. 2.3.2 Előrevetített értékelés A 2.1. szakaszhoz hasonlóan, a vizsgált gén új mutáns. A cél, hogy a modellt az új gyógyszerészeti vegyületek hatásosságának vizsgálatára szolgáló viselkedési tesztekben használják. A létesítményben szerzett tapasztalatok azt mutatták, hogy a hasonló modellek nagy többsége enyhe fenotípust mutat. Alkalmanként azonban az adott modell váratlanul mérsékelt klinikai tüneteket mutathat, ezért ennek alapján e példa előrevetített besorolása MÉRSÉKELT. 2.3.3 Eredmények E modellnél a megfigyelések és arányok normálisnak minősültek a genetikai háttérhez (C57BL/6N) viszonyítva, a normál mendeli arányok mellett született homozigóta, heterozigóta és vad típusú egereknél. 4 hetes korban a homozigóta és vad típusú kontrollegereket számos megfigyelésnek vetették alá, és a tanulás valamint memória értékelése céljából megfigyelték. E teszteket 10 héten át végezték. E fenotípusos elemzés végeztével nem figyeltek meg káros fenotípusokat. Ekkor a modellt új gyógyszerészeti vegyületek hatásosságának vizsgálatára használták. A heterozigóta egerek tenyésztése egészséges homozigóta állatokat eredményezett, amelyek a háttértörzshöz hasonló szaporodási teljesítményt mutattak. Az állatok számának csökkentéséhez homozigóta pároztatás tenyésztési stratégiáját alkalmazták. Szemben az eredeti pároztatással, ahol homozigóta egerek születtek a heterozigóta-heterozigóta pároztatásból, a homozigóta állatok új csoportja homozigóta szülők pároztatásából jött létre, itt azonban a runting-szindróma jelei mutatkoztak, és az állatok testvéreikhez képest nem tudták méretüket és súlyukat visszanyerni. Jóllehet a vonal eredeti célja viselkedési és memóriamodell szolgáltatása volt, az állatokból kinyert szövet- és vérmintán további elemzéseket végeztek. A vér biokémiai eredményeinek elemzése és az azt követő szakirodalmi felülvizsgálat során, a C génről megállapították, hogy az alapvető fontosságú, B12

76

vitaminhoz kötődő transzportfehérje. A C gén kitörlésének eredményeként megtört a sejten kívüli transzportmechanizmus, ez pedig a DNS-szintézis, valamint a zsír és protein metabolizmusának károsodásához vezetett. E mutáció hatása heterozigóta nősténytől született egereknél nem jött volna elő, hiszen az anyaállat B12-vitaminforrása méhen belül eljut a méhlepényen keresztül a fejlődő magzathoz. E gén eredeti kiütései tehát elegendő B12 vitamint tároltak ahhoz, hogy az állatok legalább 16 hetes korig életben maradjanak és gyarapodjanak, ez a háttértörzshöz viszonyítva normál tenyésztést és termékenységet biztosít. 2.3.4 Az eredmények elemzése Tényleges súlyosságértékelés E példa azt mutatja, hogy a kolónia fenntartása komoly, és gyakran váratlan hatással lehet az egerekre. A korábban rendelkezésre álló információ és az elsődleges tenyésztés és fenotipizálás alapján e kolónia jelentéktelennek tűnhetett volna. Logikus módon a homozigóta pároztatási stratégiával fenntartott kolónia általában biztosítja, hogy minimális létszámú állat jöjjön létre, ami az állatok felhasználásának minimalizálása szempontjából kívánatos. Előre nem látható káros fenotípusok előfordulhatnak korábban normál állatokként, projektengedélyezés nélkül fenntartott vonalakban. E példában az állatokra gyakorolt káros jóléti hatás következtében a modellt újra projektengedélyezés alá kell helyezni, ha ugyanezt a tenyésztési programot kívánják alkalmazni. Összefoglaló Heterozigóta párok tenyésztése és fenntartása – nincs káros hatás Homozigóta párok tenyésztése és fenntartása – MÉRSÉKELT súlyosság e generáció ivadékai esetében, a runting-szindróma és a gyarapodás hiánya miatt 2.3. példa - Kiemeli, hogy mennyire fontos a pontos és hasznos jóléti adatok cseréje az intézmények között, amikor a káros fenotípusok továbbra is megjelenhetnek, például „egérútlevél” formájábani. i RSPCA GA Passport Working Group (2010) GA Passports: The Key to Consistent Animal Care. Southwater, UK: RSPCA (letölthető itt: http://www.rspca.org.uk/sciencegroup/researchanimals/implementing3rs/gapassport)