OBIECTIVUL GENERAL 5.: Managementul durabil al resurselor ... · Managementul durabil al resurselor genetice animale Obiectivul specific 5.1: Ameliorarea genetică a populaţiilor

OBIECTIVUL GENERAL 5. : Managementul durabil al resurselor genetice animaleObiectivul specific 5.1: Ameliorarea genetică a populaţiilor de animale (rase, linii) cu status normal

Numărul/codul proiectului : ADER 5.1.3.Denumirea proiectului: CUANTIFICAREA STATISTICO-INFORMAŢIONALĂ A

BIODIVERSITĂŢII LA RASELE DE OVINE CRESCUTE ÎN ROMÂNIACU AJUTORUL MARKERILOR GENETICI

PARTENERIContractor: Staţiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru Creşterea Ovinelor şi Caprinelor

Popăuţi-Botoşani – Conducător proiect (CP)Agent economic: Societatea Comercială AGRO IND COM SRL Botoşani – Partener 1 (P1)

Contract nr.: 5.1.3./22.10.2015

Anul începerii: 22.10.2015; Anul finalizării: 15.12.2018; Durata (luni): 38

Director de proiect: Dr. biolog Hrincă GheorgheDate de contactTel: 0742485444;E-mail: [email protected]

Proiect ADER 5.1.3. / Faza 3

Data începerii fazei 3: 01.07.2016;Data finalizării fazei 3: 25.10.2016

Buget: 93.750 lei (CP = 88.750 lei ; P1 = 5.000 lei)

Denumirea Fazei 3

IDENTIFICAREA ŞI ANALIZA UNOR MARKERI IMUNOGENETICI ŞI GENETICO-MOLECULARI LA OVINE

Denumirea proiectului

CUANTIFICAREA STATISTICO-INFORMAŢIONALĂ A BIODIVERSITĂŢII LA RASELE DE OVINE CRESCUTE ÎN ROMÂNIA CU AJUTORUL

MARKERILOR GENETICI

Obiectivele fazei: ● decelarea factorilor eritrocitari din sistemele de grupă sanguină la rasele româneşti de ovine;● descrierea structurii imunogenetice la locii determinanţi ai factorilor de grupă sanguină laovinele din România;● identificarea unor markeri moleculari - microsateliţi şi gene codificatoare pentru scrapie(PrP), sindromul Spider Lamb (FGFR3) şi fecunditate (BMPR-1B pentru mutaţia FecB şiBMP15 pentru mutaţia FecX) la rasele româneşti de ovine;● descrierea structurii genetico-moleculare la locii determinanţi ai unor markeri moleculari: PrP,FGFR3, BMPR-1B şi BMP15 la ovinele din România;● studiu tehnico-ştiinţific privind însuşirile de productivitate (trăsături morfo-productive, indici dereproducţie) în condiţiile de areal geografic şi tehnologice în care sunt crescute şi exploatateprincipalele rase de ovine româneşti;● diseminarea de cunoştinţe şi a rezultatelor experimentale realizate în faza a III-a aproiectului.

Obiectivul proiectului:Principală ţintă a proiectului constă în identificarea unor markeri genetici pentru

realizarea unui management sustenabil al patrimoniului genetic şi de conservare abiodiversităţii la specia ovină, utilizând concepte de statistică informaţională.

Implementarea sa presupune realizarea unor cercetări complexe multidisciplinare şiinterdisciplinare prin interconectarea domeniilor biologic (genetică şi biochimie), zootehnic(creşterea şi ameliorarea animalelor), veterinar (asigurarea vigorii animalelor), matematic(fundamentarea metodologică a proiectului) şi informatic (aplicarea precisă şi promptă ametodologiei şi pentru extrapolare experimentală) în activităţi de parteneriat între o unitate decercetare-dezvoltare şi un agent economic din domeniul creşterii animalelor.

Rezultate preconizate pentru atingerea obiectivelor fazei:♦ Buletin analitic de laborator,♦ Profil imunogenetic la rasele româneşti de ovine;♦ Profil genetico-molecular la rasele româneşti de ovine;♦ Profil morfo-productiv, reproductiv şi econogenic la rasele româneşti de ovine;♦ Articole ştiinţifice publicate în reviste de specialitate;♦ Comunicări susţinute la manifestări ştiinţifice naţionale şi internaţionale;♦ Raport de experimentare;♦ Raport de cercetare etapă.

Activităţi desfăşurate pentru atingerea obiectivelor fazei:Activitatea III.1 - Recoltarea probelor biologice de la ovine din ferme de elită, înmulţire şi

producţie şi prelucrarea lor primară (CP, P1);Activitatea III.2 - Determinarea şi analiza fenotipurilor factorilor de grupă sanguină la ovine

din ferme de elită, înmulţire şi producţie (CP);Activitatea III.3 - Determinarea şi analiza unor markeri moleculari la ovine din ferme de elită,

înmulţire şi producţie (CP);Activitatea III.4 - Urmărirea şi consemnarea unor însuşiri de producţie şi reproducţie la

diferite rase şi subpopuţii de ovine din ferme de elită, înmulţire şi producţie şi caracterizarea lorîn context econogenic (CP, P1);

Activitatea III.5 - Susţinerea de comunicări şi publicarea de articole (CP).

Motivaţia cercetăriiIdentificarea şi selecţia animalelor superioare din punct de vedere genetic este o etapă critică în

implementarea unui program de ameliorare. Unele structuri genetice, graţie formelor moleculare multiple subcare se prezintă, sunt instrumente de real folos în cuantificarea biodiversităţii şi în gestionarea resurselorgenetice la ovine. Printre aceste structuri se numără şi grupele sanguine şi unii markeri ADN.

Imunogenetica, datorită polimorfismului foarte accentuat al sistemelor de grupe sanguine, constituie uncapitol foarte important al practicii zootehnice. Bogăţia factorilor de grupă sanguină la animale, gruparea lor,ca şi modul acestora de ereditare conferă sistemelor imunogenetice calitatea de markeri imunogenetici, princare se pot stabili: filogenia raselor, gradul de homozigoţie sau heterozigoţie a populaţiilor, gradul desimilaritate şi diferenţiere genetică a raselor, populaţiilor sau liniilor zootehnice, tipul de gemelaritateidentitatea animalelor, certificarea paternităţii, diagnosticul eritroblastozei fetale sau bolii hemolitice la nou-născuţi, corelaţii sau asocieri ale factorilor sanguini cu însuşirile productive şi reproductive sau cu rezistenţaorganismului animal la anumite boli etc. Totodată, graţie acestui polimorfism accentuat, bogăţiei şiheterogenităţii structurilor antigenice, imunogenetica oferă instrumente reale pentru studiul biodiversităţii.

Genetica moleculară a pus la dispoziţia oamenilor de ştiinţă un instrument puternic pentru ameliorareapopulaţiilor de animale - markerii moleculari. Cercetările efectuate la nivel ADN sunt focalizate pe identificareagenelor responsabile de fenogeneza caracterelor cantitative şi detectarea locilor de interes, ca markeri utilipentru programele de selecţie şi ameliorare. Microsateliţii sunt unelte ale biologiei moleculare larg utilizate înstudii populaţionale şi în definirea relaţiilor evolutive între specii sau populaţii strâns asociate. În ultimii ani aexistat un interes deosebit în privinţa bolilor genetice la ovine. Encefalopatiile spongiforme transmisibile(TSEs) sunt boli degenerative fatale ale sistemului central nervos ca şi condrodisplazia moştenită a ovinelorla nivelul sistemului osos. Comunitatea Europeană a elaborat programe speciale pentru studiul acestormaladii teribile şi depune eforturi considerabile pentru a le eradica. Dar aceste măsuri conduc la restrângereafondului de gene la specia ovină. De aceea, conservarea şi chiar sporirea diversităţii vine în contradicţiefactuală cu reducerea fenomenului morbid. Actualmente, determinarea anumitor mutaţii cu efecte la nivelulgenelor implicate în prolificitatea ovinelor (FecB şi FecX ) reprezintă o prioritate pentru cercetători,polimorfismul genic fiind folosit în programe de selecţie pentru a creşte nivelul de expresie al acestora.

Scop

Investigaţiile imunogenetice şi genetico-moleculare s-au realizat laprincipalele rase de ovine din România [Merinos de Palas, Ţigaie, Ţurcană, Karakulde Botoşani (cu entităţile sale infrarasiale, varietăţi de culoare şi linii zootehnice),Rasa de Carne Palas şi Rasa de Lapte Palas].

Markerii luaţi în studiu, pe lângă aspectul lor corelaţional cu însuşirile deproductivitate animală, au o însemnată relevanţă pentru biodidiversitatea specieiovină. Aceşti markeri identificaţi în această fază, împreună cu markerii dinsistemele hemoglobinic, transferinic, albuminic, amilazic, potasic, calpastatinic, -lactoglobulinic şi αs1-cazeinic, analizaţi în faza anterioară, vor constitui elementeoperaţionale pentru algoritmii de calcul în vederea realizării unor modele pentrumanagementul sustenabil al resurselor genetice la rasele de ovine din România,dar şi cu extensie la întreaga specie ovină de pe întregul mapamond, graţiecaracterului său de inter- şi multidisplinaritate dintre genetică, zootehnie, medicinăveterinară, ecologie, etologie, matematică şi informatică.

În acest context, unul din obiectivele acestei faze este identificarea unormarkeri imunogenetici şi genetico-moleculari în vederea promovării ulterioare aunui program de selecţie pentru ameliorarea trăsăturilor de productivitate şisporirea rezistenţei la boli genetice, menţinând în acelaşi timp selecţia pentrucaractere care converg spre conservarea variabilităţii genetice şi sporireabiodiversităţii la specia ovină.

Metodologia cercetăriiMaterial biologic

Cercetările pentru atingerea obiectivelor acestei faze s-au efectuat pe populaţii de ovine dindiferite exploataţii zootehnice:

● Ferme de elită şi de înmulţire din staţiunile de cercetare-dezvoltare pentru creşterea ovinelor în funcţie despecificul lor rasial, precum:- Merinos de Palas, Rasa de Carne Palas, Rasa de Lapte Palas de la ICDCOC Palas-Constanţa în condiţiilegeografice din Dobrogea;- Ţigaie de la SCDCOC Secuieni-Bacău, dar şi de la SCDCOC Bilciureşti în condiţiile geografice din centrulMoldovei, respectiv din Dâmboviţa;- Țurcană de la SCDCOC Caransebeş, dar şi de la SCDCOC Popăuţi-Botoşani şi SCDCOC Reghin încondiţiile geografice din Caraş Severin, respectiv nord-estul Moldovei, respectiv centrul Transilvaniei;- Karakul de Botoşani de la SCDCOC Popăuţi Botoşani în condiţiile geografice din nord-estul Moldovei;

● Ferme de producţie din ferma de ovine a SC AGRO IND COM SRL Botoşani sau ferme particulare de tipindividual sau asociativ aflate în observaţia agentului economic pe ecotipuri de Karakul şi Ţurcană, în specialcele afiliate la ”Asociaţia Crescătorilor de Oi Karakul de Botoşani”.

Eşantionarea animalelor a fost făcută în funcţie de cerinţele experimentului pe criterii de vârstă,sex, varietate de culoare, linie zootehnică, tip morfo-productiv, ecotip, areal geografic, specific tehnologic etc.

Investigaţiile de laborator pentru decelarea structurilor imunogenetice şi genetico-moleculare s-aurealizat pe sânge din circulaţia periferică, prelevat prin venipuncţia jugulară a animalelor. Sângele a fostrecoltat în vacutainere în care se afla, ca anticoagulant, citrat de sodiu pentru decelarea factorilor de grupăsanguină şi EDTANa2 pentru identificarea markerilor moleculari (microsateliţi, proteina prion, factorulsindromului Spider Lamb, genele fecundităţii).

În contextul general al politicilor europene privind prezervarea resurselorgenetice şi sporirea biodiversităţii genetice la specia ovină în totalitatea sa, s-au făcutreferiri şi la structurile genetico-moleculare ale efectivelor de ovine crescute şiexploatate în spaţiul Uniunii Europene. Datele experimentale ale acestui studiu provindin trei surse informaţionale:

● o primă sursă o reprezintă populaţii de ovine din Comunitatea Europeanăîn 20 de ţări care au aderat la UE până în anul 2004 (Belgia, Cipru, Cehia,Danemarca, Estonia, Finlanda, Marea Britanie, Franţa, Islanda, Irlanda, Irlanda deNord, Italia, Lituania, Norvegia, Portugalia, Slovenia, Elveţia, Olanda, Spania,Suedia). Efectivele de ovine din aceste ţări au fost monitorizate timp de 10 ani, între2000 şi 2010; mărimea eşantioanelor analizate a variat între 4000 şi 13000 deanimale, în funcţie de anul de experimentare;

● o a doua sursă provine din genotipările efectuate pe aproximativ1000000 de ovine din Marea Britanie în perioada 1998-2006, deoarece MareaBritanie a făcut, şi în mod separat, astfel de analize, având precedentul encefalopatieispongiforme bovine;

● a treia sursă cuprinde rezultate experimentale efectuate pe 2038 deovine aparţinând tuturor raselor din România, după aderarea acesteia la UE; lucrărileexperimentale s-au desfăşurat între 2011 şi 2013, când şi România a intrat înProgramul European de Monitorizare a encefalopatiilor spongiforme la animalele defermă, conform Deciziei Consiliului Europei, 2009/470/EC.

Metode de cercetare

Tipizarea genetică a ovinelor s-a realizat prin metode specifice de laborator.

Metode de cercetare a sistemelor imunogenetice▪ identificarea fenotipurilor factorilor de grupă sanguină conform reacţiei imunoserologice

antigen-anticorp:– prin metoda testului hemolitic în sistemele de grupă sanguină A, B, C, M, R-O;– prin metoda hemaglutinării în sistemul de grupă sanguină D

Metode de cercetare a sistemelor genetico- moleculare▪ genotiparea ovinelor la locii determinanţi ai– microsateliţilor – prin tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) monoplex şi multiplex;– proteinei prion – prin tehnica Real Time PCR (Real Time - Polymerase Chain Reaction);– condrodisplaziei ereditare ovine – prin tehnica PCR-RFL (Polymerase Chain Reaction -

Restriction Fragment Lenght Polymorphism);– genelor fecundităţii - prin tehnica PCR-RFL (Polymerase Chain Reaction - Restriction

Fragment Lenght Polymorphism).

Metode de testare şi interpretare statistică a rezultatelor experimentaleIndicatori statistici.

Au fost calculate frecvenţele (f) alelice, fenotipice şi genotipice ale structurilor sistemelorpolimorfe:

- n = numărul indivizilor cu acelaşi fenotip al unui factor de grupă sanguină- N = numărul total de indivizi dintr-o populaţie.

● În cazul sistemelor de grupă sanguină cu dominanță incompletă▪ se porneşte de la calcularea frecvenţelor fenotipurilor factorilor de grupă sanguină

(atât manifeste, cât şi “silent”), conform formulei:

▪ pentru alelele determinante ale fenotipurilor factorilor de grupă sanguină se pleacă de la stabilirea frecvenţei genei recesive:

în care:

- q = frecvenţa genei recesive;- Q= frecvenţa fenotipului determinat de alela recesivă.

▪ frecvenţa genei dominante (p) se obţine prin diferenţa frecvenţei genei recesive dintr-o unitatep = 1-q

(p+q)2 = p2+2pq+p2,

▪ pentru calcularea frecvenţelor genotipurilor la nivelul factorilor de grupă sanguină se aplică o distribuţie binomială newtoniană:

- p2 = frecvenţa homozigoţilor dominanţi;- 2pq = frecvenţa heterozigoţilor;- q2 = frecvenţa homozigoţilor recesivi.

în care:

● În cazul sistemelor genetico-moleculare cu ereditare codominantă (proteina prion,factorul condrodisplaziei ereditare ovine, genele fecundităţii)▪ frecvenţele alelice s-au calculat după formula:

- n = numărul alelelor de acelaşi fel;- 2N = numărul total de alele din acelaşi sistem.

▪ frecvenţele fenotipurilor şi genotipurilor (identice ca exprimare) s-au calculat după formula:

- n = numărul indivizilor cu acelaşi genotip (fenotip);- N = numărul total de indivizi dintr-o populaţie.

▪ pentru analiza statistică a rezultatelor obţinute în urma amplificării şi identificării microsateliţilor au fost folosite programe de analiză populaţională (CERVUS v2.0, GENEPOP v4.0, FSTAT, GENETIX v4.0.4). Utilizând programul GENETIX 4.0.4 s-au calculat frecvenţele alelelor microsateliţilor şi numărul acestora per locus în fiecare populaţie.

în care:

fi - reprezintă frecvenţa observată (practică, empirică);i – reprezintă frecvenţa aşteptată (teoretică, estimată).

În cazul microsateliţilor, echilibrul genetic Hardy-Weinberg a fost testat utilizândprogramul GENEPOP 4.0; valoarea p (probabilitatea de abatere de la legea Hardy-Weinberg) a fost obţinută utilizând algoritmul Markov-Chain.

Pentru caracterele de productivitate s-au calculat mediile aritmetice, abaterilestandard şi coeficienţii de variabilitate (pentru trăsăturile cantitative) şi frecvenţele (pentruînsuşirile calitative ale pielicelelor şi indicii de reproducţie).

Testare statistică.În sistemele deschise (grupe sanguine cu dominanţă incompletă) se porneşte de la

premisa că populaţiile se află axiomatic în echilibru genetic Hardy-Wienberg.În sistemele închise (proteinele polimorfe cu ereditare codominantă), testarea stării

de echilibru genetic Hardy-Weinberg în populaţii se face cu ajutorul testului Hi pătrat (2).

Rezultate şi Discuţii

A. Caracterizarea genetică a raselor de ovine din România

A.1. Caracterizare imunogenetică a raselor de ovine din România

Sistemele de grupă sanguină la rasele de ovine din România

Prin metoda testului hemolitic au fost utilizaţi 12 reagenţi monovalenţi specifici:▪ 10 reagenţi sunt izoimuni: anti-Aa, anti-Bb, anti-Bc, anti-Bd, anti-Be, anti-Bf, anti-Bg,anti-Ca, anti-Cb şi anti-Ma:▪ 2 sunt heteroimuni, obţinuţi prin imunizări pe taurine: anti-R şi anti-O.

Un singur factor a fost identificat prin metoda hemaglutinării, folosindu-se▪ 1 antiser izoimun anti-Da.

Testele hemolitic şi hemaglutinării au relevat că:▪ grupele sanguine de la rasele româneşti de ovine se caracterizează printr-un polimorfismextrem de pronunţat al factorilor eritrocitari, concretizat prin mozaicul foarte bogat şiheterogen de structuri antigenice ale hematiilor ovinelor aparţinând tuturor raselor de ovinedin ţara noastră.▪ bogăţia şi polimorfismul structurilor antigenice sunt elemente de similaritate a raselor deovine, dar mai mult decât aceasta, ele relevă, în mod pregnant, că rasele româneşti deovine se diferenţiază între ele, atât sub aspectul distribuţiilor structurilor genetice alegrupelor sanguine, cât şi în ceea ce priveşte profilurile imunogenetice în cadrul fiecărei rase.

0

102030405060708090

Aa Bb Bc Bd Bf Bg Bi Ca Cb Da M a R O M edia

Fenotip sanguin manifest "silent"

0

102030405060708090



0102030405060708090

100



0

10

20

30

40

50

60

70

80



Frecvenţele factorilor eritrocitari la rasa Merinos de Palas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Aa Bb Bc Bd Bf Bg Bi Ca Cb Da M a R O M ediagenerală

Fenotip sanguin (medii pe specie) manifest "silent"

Structură fenotipică

Frecvenţele factorilor eritrocitari la rasa Ţigaie

Frecvenţele factorilor eritrocitari la rasa Ţurcană Frecvenţele factorilor eritrocitari la rasa Karakul de Botoşani

Mediile factorilor eritrocitari la rasele de ovine din România

Structură genică

0102030405060708090

100


Gena factorului sanguin Dominantă Recesivă

0102030405060708090

100



0

1020

3040

5060

7080

90



0

10

20

30

40

50

60

70



0

10

20

30

40

50

60

70

80


Gena factorului sanguin (medii pe specie) Dominantă Recesivă

Frecvenţele genelor factorilor eritrocitari la rasa Merinos de Palas Frecvenţele genelor factorilor eritrocitari la rasa Ţigaie

Frecvenţele genielor factorilor eritrocitari la rasa Ţurcană Frecvenţele genelor factorilor eritrocitari la rasa Karakul de Botoşani

Mediile genelor factorilor eritrocitari la rasele de ovine din România

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Genotip sanguin Homozigot dominant Heterozigot Homozigot recesiv

Structură genotipică

0102030405060708090



0

10

20

30

40

50

60

70



05

101520253035404550



0

10

20

30

40

50

60


Genotip sanguin (medii pe specie) Homozigot dominant Heterozigot Homozigot recesiv

Frecvenţele genotipurilor sanguine la rasa Merinos de Palas Frecvenţele genotipurilor sanguine la rasa Ţigaie

Frecvenţele genotipurilor sanguine la rasa Ţurcană Frecvenţele genotipurilor sanguine la rasa Karakul de Botoşani

Mediile genotipurilor sanguine la rasele de ovine din România

01020304050607080

%

M erino s Ţig aie Ţurcană Karakul M ed ia g enerală

Fenotip sanguin (medii pe rase) manifest "silent"

0

20

40

60

80

%

M erinos Ţigaie Ţurcană Karakul M ed ia generală

Gena factorului sanguin (medii pe rase) dominantă recesivă

0

10

20

30

40

50

60

70

%

M erinos Ţig aie Ţurcană Karakul M ed ia g enerala

Genotip sanguin (medii pe rase) homozigot dominant heterozigot homozigot recesiv

Distribuţiile medii ale fenotipurilor de grupă sanguină la rasele de ovine din România

Distribuţiile medii ale genelor factorilor de grupă sanguină la rasele de ovine din România

Distribuţiile medii ale genotipurilor de grupă sanguină la rasele de ovine din România

0

10

20

30

40

50

60

70

80

%

Aa Bb Bc Bd Bf Bi Ca Ma Media


0

10

20

30

40

50

60

70

80

%



0

10

20

30

40

50

60

70

80

%



Sistemele de grupă sanguină la creaţiile biologice derivate din Karakul de Botoşani

Incidenţele factorilor de grupă sanguină la varietăţile de culoare ale rasei Karakul de Botoşani

Varietatea neagră

Varietatea brumărie

Varietăţile colorate

Incidenţele factorilor de grupă sanguină la liniile zootehnice de varietate neagră a rasei Karakul de Botoşani

0

10

20

30

40

50

60

70

80

%



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%



0

10

20

3040

50

60

7080

90

100

%



0

10

20

30

40

50

60

70

80

%



Linia 5Linia 528

Linia 1578 Linia 2000

Linia cross

Structura genetică la locii unor microsateliţi la rasele de ovine din România

A2. Caracterizare genetico-moleculară a raselor de ovine din România

BM143, FCB11, FCB20, HSC, MAF33, MAF70, MAF214, McM42, OarCP20, MAF65, Oar CP34

Primerii utilizaţi, specifici regiunii care flanchează repetiţiile, au prezentat cea maibună temperatură de hibridizare în jurul temperaturii de 59oC.

Prin marcarea microsateliţilor şi a standardului de masă moleculară cu cinci coloranţifluorescenţi diferiţi a fost posibilă vizualizarea tuturor acestora în cadrul aceleiaşi migrări.

După migrarea probelor şi analiza rezultatelor s-au obţinut profilurile pentru fiecaremicrosatelit.

Pentru a caracteriza din punct de vedere genetico-molecular rasele de ovineautohtone crescute şi exploatate în ţara noastră au fost analizaţi 11 microsateliţi caresunt recomandaţi de Econogene Project să fie utilizaţi în studii de biodiversitate laspecia ovină (htpp://www.econogene.eu/list_of_msmarkers.html):

Electroforeza în gel de agaroză 2% pentru evidenţierea produşilor de amplificare la diferite temperaturi utilizând microsateliţi:A: BM143; B: FCB11; C: FCB20; D: HSC; E: MAF33; F: MAF70;G: MAF214; H:McM42; I: OarCP20; J: MAF65; K: OarCP34;

1: 52oC; 2: 52,8oC; 3:54,1oC; 4: 55,9oC; 5: 58,4oC; 6: 60,3oC; 7: 62oC;8: Marker de masă moleculară 50bp.

Profilele obţinute pentru fiecare microsatelit în electroforeza capilară cu detecţie în fluorescenţă

Loci analizaţi şi mărimile obţinute (pb) pentru rasele româneşti de ovine

Număr de alele per locus la rasele româneşti de ovine

Număr mediu de alele (NMA) şi indicele de polimorfism (PIC) per locus la rasele româneşti de ovine

Număr mediu de alele NMA la rasele româneşti de ovine

Structura genetică la locii unor microsateliţi la creaţiile biologice derivate din Merinos de Palas

Loci analizaţi şi mărimile obţinute (pb) pentru creaţiile biologice derivate din Merinos de Palas

Număr de alele per locus la creaţiile biologice derivate din Merinos de Palas

Număr mediu de alele NMA la creaţiile biologice derivate din Merinos de Palas

Structura genetică la locus-ul PrP la rasele de ovine din România

Scopul acestei analize a fost identificarea posibilelor polimorfisme ale genei carecodifică pentru proteina prion la nivelul codonilor 136, 154 şi 171 implicaţi în declanşareamaladiei scrapie la ovine.

Electroforegramă cu ADN genomic de ovine pentru analiza genei PrP

Expresie fenotipică

Identificarea variantelor genetice specifice ale proteinei prion pentru fiecare animaltestat a fost realizată pe baza curbelor de topire obţinute, generate de produşii deamplificare, în funcţie de numărul, poziţia şi alura peak-urilor pe care le conţin, respectiv înfuncţie temperatura de topire a probelor complementare cu situs mutagenic în comparaţiecu kiturile standard.

Analiza curbelor de topire pentru identificarea fenotipurilor prionice

Configuraţia peak-urilor este dată de temperatura la care au loc transformările mediului de reacţie PCR (produşilor de amplificare) în funcţie de care sunt detectate genotipurile prionice.

▪ homozigoţii sunt caracterizaţi printr-un singur peak:▪ heterozigoţilor le sunt caracteristice două peak-uri

Curba de topire pentru genotip ARR/ARR Curba de topire pentru genotip ARQ/ARQ

Curba de topire pentru genotip ARR/ARQ Curba de topire pentru genotip ARR/ARH

Analiza genei prion prin tehnica de secvenţiere

Alinierea BioEdit dintre secvenţa genei PrP şi secvenţa obţinută pentru proba analizată (confirmarea absenţei polimorfismului)

Alinierea BioEdit dintre secvenţa genei PrP şi secvenţa obţinută pentru proba analizată (confirmarea existenţei polimorfismului)

La specia ovină există 5 alelele la locus-ul PrP care au implicaţii înpatogenitatea acestei encefalopatii spongiforme (forme de encefalopatie).Aceste alele sunt: ARR, AHQ, ARH, ARQ şi VRQ, aceasta fiind ordinea lor înraport cu nivelul crescător al rezistenţei / susceptibilităţii la scrapie.

05

101520253035404550556065

%

Merinos de Palas Tigaie Turcana Karakul de Botosani

Allele PrP ARR ARQ AHQ ARH VRQ

Frecvenţele alelice la locus-ul PrP la rasele româneşti de ovine

Structură alelică

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

ARR/ ARR ARQ/ ARQ AHQ/ AHQ ARH/ ARH VRQ/ VRQ ARR/ ARQ ARR/ AHQ ARR/ ARH ARR/ VRQ ARQ/ AHQ ARQ/ ARH ARQ/ VRQ AHQ/ ARH AHQ/ VRQ ARH/ VRQ

Frecventa observata Frecventa asteptata

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50



Structură genotipică

Structura genotipică la locus-ul PrP la ovinele rasei Merinos de Palas

Structura genotipică la locus-ul PrP la ovinele rasei Ţigaie

2 = 4.93

2 = 5,12

0

5

10

15

20

25

30

35

40



0

5

10

15

20

25

30

35

40

45



Structura genotipică la locus-ul PrP la ovinele rasei Ţurcană

Structura genotipică la locus-ul PrP la ovinele rasei Karakul de Botoşani

2 = 29,73***

2 = 10,29

Structura genetică la locus-ul PrP la creaţiile biologice derivate din Merinos de Palas

05

101520253035404550556065

%

Rasa de Carne Palas Rasa de Lapte Palas


0

5

10

15

20

25

30

35

40



0

5

10

15

20

25

30

35

40

45



Frecvenţele alelice la locus-ul PrP la Rasa de Carne Palas şi Rasa de Lapte Palas

2 = 1,09

Structura genotipică la locus-ul PrP la ovinele din Rasa de Carne Palas

Structura genotipică la locus-ul PrP la ovinele din Rasa de Lapte Palas

2 = 9,28

Structura genetică la locus-ul PrP la ovinele din Uniunea Europeană

Datorită conotaţiilor sale patogenetice, scrapia este abordată ca un sistemintegrat de studii biomedicale, ecologice şi economice intense şi profunde.

Din aceste motive, scrapia a fost inclusă în Programul European deSupraveghere a ESsT animale şi umane. În prezent, scrapia este o boală aflată învizorul tuturor Statelor Membre ale Comunităţii Europene.

În esenţa sa, programul de eradicare a scrapiei la ovine s-a axat pe :▪ fixarea tot mai accentuată a alelei ARR în genotipuri care conferă rezistenţă laaceastă maladie;▪ eliminarea cât mai mult posibilă a genotipurilor prionice care conţin alela VRQ carese asociază cu o mare susceptibilitate a ovinelor de a se contamina cu agentulpatogen al scrapiei,▪ scăderea incidenţei alelei ARQ, care, la rândul ei determină o rezistenţă scăzută laaceastă boală.

În funcţie de incidenţele alelice de-a lungul anilor, are loc în consecinţă ostructurare a lor în genotipuri prionice, ale căror distribuţii cunosc o dinamicăcorespunzătoare.

05

101520253035404550556065

%

2002 2006 2007 2008 2009 2010


05

101520253035404550556065

%

1998 2002 2004


05

101520253035404550556065

%

2013


Frecvenţele alelice la locus-ul PrP la ovinele din Uniunea Europeană

în perioada 2002-2010

Frecvenţele alelice la locus-ul PrP la ovinele din Marea Britanie

în perioada 1998-2006

Frecvenţele alelice la locus-ul PrP la ovinele din România în anul 2013

Structura genetică la locus-ul FGFR3 la rasele de ovine din RomâniaScopul acestui studiu a fost de a identifica animalele purtătoare ale sindromului Spider

Lamb la rasele de ovine româneşti.Optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor specifici pentru o anumită zonă din

gena FGFR3 s-a realizat printr-o reacţie PCR în gradient de temperatură, temperatura optimăde hibridizare fiind de 58oC.

Produşii de amplificare au fost supuşi digestiei cu enzima de restricţie Btg I, carerecunoaşte situs-ul palindromic CCRYGG, nivel la care se identifică mutaţia punctiformă (T/A)

Gradient de temperatură pentru optimizarea condiţiilor de amplificare a unui fragment din gena FGFR3.

1: 51°C; 2: 51,9°C; 3: 54,6°C; 4: 55,4°C; 5: 56,3°C; 6: 58,1°C; 7: 60°C;8: marker de masă moleculară 50 pb (Promega)

Electroforeza în gel de agaroză 3% pentru produşii de restricţie obţinuţi pentru gena FGFR3:

1: Ţigaie; 2: Ţurcană; 3: Karakul de Botoşani; 4: Merinos de Palas; 5: Rasa de Lapte Palas; 6:Rasa de Carne Palas;

7: fragment netăiat;8: marker de masă moleculară 50 pb

Analiza genei FGFR3 prin tehnica de secvenţiere

Aliniamentul BioEdit dintre secvenţa genei ovine FGFR3 (număr acces baza de date GenBank AY737275) şi secvenţa obţinută pentru un animal genotipat (confirmarea absenţei polimorfismului)

În urma digestiei cu enzima de restricţie BtgI şi a secvenţierii ampliconilor s-au obţinut doarexemplare ce prezintă varianta sălbatică (fenotipul T), care nu posedă mutaţia responsabilăpentru apariţia sindromului Spider Lamb.

Structura genetică la locii genelor fecundităţii la rasele de ovine din RomâniaStructura genetică la locus-ul genei BMPR-1B-mutaţia FecB la rasele de ovine din România

Pentru a identifica posibilele animale care prezintă mutaţia punctiformă de la nivelul geneiBMPR-1B a fost amplificat un fragment de 190pb.

Optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor specifici pentru o anumită zonă dingena de fecunditate FecB s-a realizat printr-o reacţie PCR în gradient de temperatură,temperatura optimă de hibridizare fiind de 56oC.

Produşii de amplificare au fost supuşi digestiei cu enzima de restricţie AvaII. ce poateevidenţia polimorfismul mononucleotidic de la nivelul secvenţei palindromice GGACC.

Gradient de temperatură pentru optimizarea condiţiilor de amplificare a unui fragment din gena de fecunditate FecB.

1: 51°C; 2: 51,8°C; 3: 53,1°C; 4: 54,9°C; 5: 57,4°C; 6: 59,3°C; 7: 60,5°C;8: marker de masă moleculară 50 bp.

Electroforeza în gel de agaroză 3% pentru produşii obţinuţi în urma reacţiei de restricţie pentru gena Fec B;1: Ţigaie; 2: Ţurcană; 3: Karakul de Botoşani; 4: Merinos de

Palas; 5: Rasa de Lapte Palas; 6: Rasa de Carne Palas;7: fragment netăiat;

8: marker de masă moleculară 50bp.

Analiza genei FecB prin tehnica de secvenţiere

În urma digestiei cu enzima de restricţie AvaII, a fost relevat doar fragmentul de 190bpnetăiat, deci animalele analizate sunt doar exemplare nepurtătoare (FecB/FecB - tipul sălbatic).

În urma reacţiei de secvenţiere s-a evidenţiat lipsa situs-ului de restricţie pentru enzimaAvaII confirmându-se rezultatele obţinute în reacţia PCR-RFLP.

Situs-ul enzimei este GGACC, iar secvenţa obţinută a fost AGACG

Poziţia la nivelul căreia ar fi trebuit să existe situsul de recunoaştere al enzimei de restricţie

AvaII. (Confirmarea genotipului sălbatic prin secvenţiere la nivelul genei BMPR-1B)

Alinierea BioEdit dintre secvenţa de referinţă a genei BMPR-1B şi secvenţa aceleiaşi gene obţinută pentru un animal genotipat

(confirmarea absenţei polimorfismului

Structura genetică la locus-ul BMP15 - mutaţia FecX la rasele de ovine din RomâniaPentru determinarea prezenţei polimorfismului pentru mutaţia FecX au fost desemnaţi

primeri cu ajutorul cărora a fost amplificat un fragment de 154pb de la nivelul genei BMP15care conţine secvenţa palindromică TCTAGA.

Optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor specifici pentru o anumită zonă dingena FecX s-a realizat printr-o reacţie PCR în gradient de temperatură, temperatura optimă dehibridizare fiind de 58oC.

Produşii de amplificare au fost supuşi digestiei cu enzima de restricţie XbaI pentru a seevidenţia diferenţia între animalele purtătoare şi cele nepurtătoare.

Gradient de temperatură pentru optimizarea condiţiilor de amplificare a unui fragment din gena FecX.

1: 51°C; 2: 51.8°C; 3: 53.1°C; 4: 54.9°C; 5: 57.4°C; 6: 59.3°C; 7: 60.5°C;8: marker de masă moleculară 50bp

Profilele de restricţie pentru genotiparea locus-ului FecX.1: Merinos de Palas; 2: Ţigaie; 3: Ţurcană; 4: Karakul de

Botoşani; 5: Rasa de Lapte Palas; 6: Rasa de Carne Palas;7: fragment netăiat;

8: marker de masă moleculară 50bp

Analiza genei FecX prin tehnica de secvenţiere

În urma digestiei cu enzima de restricţie XbaI a fost evidenţiat doar fragmentul de 154 pbnetăiat, relevându-se doar exemplare nepurtătoare ale genei FecX (tipul sălbatic)

În urma reacţiei de secvenţiere s-a evidenţiat lipsa situs-ului de restricţie pentru enzimaXbaI şi s-au confirmat rezultatele obţinute în reacţia PCR-RFLP.

Situs-ul enzimei este AGATCT, iar secvenţa obţinută a fost AGATCA.

Poziţia la nivelul căreia ar fi trebuit să existe situsul de recunoaştere al

enzimei de restricţie XbaI(Confirmarea genotipului sălbatic prin secvenţiere la nivelul genei BMP15)

Alinierea BioEdit dintre secvenţa genei BMP15 şi secvenţa obţinută pentru aceeaşi genă pentru un animal din Rasa de lapte Palas

(confirmarea absenţei polimorfismului)

B. Caracterizarea performanţelor de productivitate a raselor de ovine din România în context econogenic

Trăsăturile morfo-productive şi reproductive la ovinele rasei Merinos de Palas

Parametrii de producţie la berbecii rasei Merinos de Palas

Parametrii de producţie la mieii rasei Merinos de Palas

Parametrii de producţie la oile rasei Merinos de Palas

Indicii de reproducţie la rasa Merinos de Palas

Trăsăturile morfo-productive şi reproductive la ovinele Rasei de Carne Palas

Parametrii de producţie la mieii Rasei de Carne Palas

Parametrii de producţie la berbecii Rasei de Carne Palas

Parametrii de producţie la oile Rasei de Carne Palas

Indicii de reproducţie la Rasa de Carne Palas

Trăsăturile morfo-productive şi reproductive la ovinele Rasei de Lapte Palas

Parametrii de producţie la mieii Rasei de Lapte Palas

Parametrii de producţie la berbecii Rasei de Lapte Palas

Parametrii de producţie la oile Rasei de Lapte Palas

Indicii de reproducţie la Rasa de Carne Palas

Trăsăturile morfo-productive şi reproductive la ovinele rasei Ţigaie

Parametrii de producţie la mieii rasei Ţigaie

Parametrii de producţie la berbecii rasei Ţigaie

Parametrii de producţie la oile rasei Ţigaie

Indicii de reproducţie la rasa Ţigaie

Trăsăturile morfo-productive şi reproductive la ovinele rasei Ţurcană

Parametrii de producţie la mieii rasei Ţurcană

Parametrii de producţie la berbecii rasei Ţurcană

Parametrii de producţie la oile rasei Ţurcană

19.27

50.08

19.32

11.33

05

10152025303540455055

%

Clasa comerciala

Clasa I Clasa II Clasa III Clasa IV

Încadrarea pielicelelor de Ţurcană în clase comerciale

Indicii de reproducţie la rasa Ţurcană

Trăsăturile morfo-productive şi reproductive la ovinele rasei Karakul de Botoşani

Varietatea neagră Varietatea brumărie Varietatea maro

Varietatea sur Varietatea roz Varietatea albă

Varietăţile de culoare ale rasei Karakul de Botoşani

35.2

10.814.8

29.1

3.76.4

0

5

10

15

20

25

30

35

40

%

Va rie ta te a d e cu lo a re

N e a g ră B ru m ă rie Ma ro S u r R o z Alb ă

Structura rasei Karakul de Botoşani pe varietăţi de culoare la SCDCOC Popăuţi

Pielicică cu bucle în formă de „tub cilindic” Pielicică cu bucle în formă de „bob”

Pielicică cu bucle în formă de „tub+bob” Pielicică cu bucle în formă de „tub plat”

Pielicică cu bucle de tip „breitschwanz” Pielicică cu bucle heterogene

0

10

20

30

40

50

60

%

Neagra Brumarie Maro Sur Roz Alba

Forma buclei Tub Tub+bob Bob Aplatizat Alte tipuri

0

10

20

30

40

50

60

%


Marimea buclajului Mijlocie Mijlocie-mica Mica Mare Mijlocie-mare

01020304050607080

%


Calitatea fibrei de păr Matasoasa Normala Aspra Moale

0102030405060708090

%


Luciul buclajului Intens Foarte bun-bun Satisfacator Slab

Incidenţele tipurilor de bucle la pielicelele mieilor Karakul de Botoşani în funcţie de

varietăţile de culoare

Incidenţele mărimii buclajului la pielicelele mieilor Karakul de Botoşani

în funcţie de varietăţile de culoare

Incidenţele calităţii fibrelor de păr la pielicelele mieilor Karakul de Botoşani


Incidenţele luciului buclajului la pielicelele mieilor Karakul de Botoşani


0102030405060708090

%


Clasa zootehnica Record Elita a I-a

34

21

28

12

5

0

5

10

15

20

25

30

35

%

Linia zootehnică

Linia 5 Linia 528 Linia 1557 Linia 2000 Linia cross

22

45

33

05

1015202530354045

%

Linia zootehnică

Linia 420 Linia 7864 Alte nuanţe

Încadrarea mieilor Karakul de Botoşani în clase zootehnice în funcţie de varietăţile de culoare

Structura varietăţii neagră a rasei Karakul de Botoşani pe linii zootehnice la SCDCOC Popăuţi

Structura varietăţii brumărie a rasei Karakul de Botoşani pe linii zootehnice la SCDCOC Popăuţi

Parametrii de producţie la mieii rasei Karakul de Botoşani

Parametrii de producţie la berbecii rasei Karakul de Botoşani

Parametrii de producţie la oile rasei Karakul de Botosani

Indicii de reproducţie la rasa Karakul de Botoşani

Concluzii1. Faza a treia a proiectului a avut două obiective majore focusate pe rasele de

ovine crescute şi exploatate în România (Merinos de Palas, Ţigaie, Ţurcană, Karakulde Botoşani, precum şi la creaţiile biologice derivate din Merinos de Palas - Rasa deCarne Palas şi Rasa de Lapte Palas şi la entităţile infrarasiale ale Karakului deBotoşani - varietăţi de culoare şi linii zootehnice):1) determinarea structurilor geneticela locii sistemelor de grupă sanguină şi ai unor markeri moleculari (microsateliţi,proteina prion, locus-ul sindromului Spider Lamb, genele fecundităţii) şi 2)caracterizarea morfo-productivă şi reproductivă în context econogenic.

2. În subsidiar, această fază a analizat şi evoluţia structurii genetice la locus-ul PrPla efectivele de ovine din spaţiul european în contextul politicilor comunitare deeradicare a encefalopatiilor spongiforme de la animale, dar şi al prezervării resurselorgenetice şi al sporirii biodiversităţii.

3. Caracterizarea imunogenetică a raselor autohtone de ovine a avut în vederestructurile fenotipice, alelice şi genotipice la locii determinanţi ai factorilor de grupăsanguină din cadrul a şase sisteme: A, B, C, M, D şi R-O.

4. Tipizarea imunogenetică la locii determinanţi ai factorilor eritrocitari s-a realizatprin metoda imunoserologică de test hemolitic în majoritatea sistemelor de grupăsanguină (A, B, C, M şi R-O); numai pentru sistemul D tipizarea imunogenetică s-arealizat prin metoda hemaglutinării.

5. Identificarea factorilor de grupă sanguină s-a realizat cu ajutorul a 13 serurimonovalente specifice: 11 reagenţi izoimuni (anti-Aa, anti-Bb, anti-Bc, anti-Bd, anti-Be,anti-Bf, anti-Bg, anti-Ca, anti-Cb, anti-Da şi anti-Ma) şi doi heteroimuni, obţinuţi prinimunizări pe taurine: anti-R şi anti-O.

6. Prin reacţia antigen-anticorp între cele 13 seruri antigenice monospecifice şieritrocitele ovinelor supuse testului hemolitic, în prezenţa complementului de iepure, au fostdecelaţi la toate rasele indigene de ovine 13 factori eritrocitari aparţinând la şase sisteme degrupă sanguină: Aa (sistemul A), Bb, Bc, Bd, Bf, Bg, Bi (sistemul B), Ca, Cb (sistemul C), Da(sistemul D), Ma (sistemul M), R şi O (sistemul R-O).

7. Toate rasele de ovine crescute şi exploatate în România se caracterizează printr-unpolimorfism extrem de pronunţat la locii sistemelor de grupă sanguine datorită atât bogăţiei,dar şi heterogenităţii structurilor antigenice de pe suprafaţa hematiilor animalelor.

8. Sistemul B este cel mai polimorf sistem de grupă sanguină la ovinele româneşti. Lafiecare rasă, în cadrul acestui sistem se găsesc şase factori antigenici. Dintre aceştia,factorul Bf are cea mai mare răspândire la toate rasele, dar şi ceilalţi factori din sistem suntbine reprezentaţi. În cadrul sistemelor C şi R-O polimorfismul imunogenetic este ceva mairestrâns, fiecare sistem posedând câte doi factori. În sistemul C factorul Cb are oreprezentare mai bună decât factorul Ca. În cadrul sistemului R-O, frecvenţa factorului Oeste mai înaltă decât cea a factorului R. În cadrul sistemelor A, D şi M s-a decelat câte unsingur factor de grupă sanguină.

9. În general, pe toate rasele de ovine, pentru majoritatea factorilor sanguini plaja devariabilitate distribuţională a frecvenţelor lor este destul de amplă. Cel mai larg interval devariabilitate a distribuţiilor factorilor eritrocitari se găseşte la nivelul factorului Ca, de la14,08% la Merinos de Palas la 77,92% la Ţurcană. La ceilalţi factori limitele de variaţie semai îngustează, creându-se un echilibru, uneori mai stabil, alteori mai fragil, între reacţiilepozitive şi cele negative. La nivelul locus-ului Bi, întâlnim cea mai strânsă grupare afactorilor sanguini, variind între 46,85% la Merinosul de Palas şi 58,37% la Ţurcană. Ceamai înaltă incidenţă o realizează factorul Bf de la Ţurcană (97,13%), iar cel mai puţinfrecvent este factorul Ca de la Merinos de Palas (14,08%).

10. Mediile tuturor factorilor de grupă sanguină la toate cele patru rase de ovineromâneşti, consemnează o distribuţie echlibrată între fenotipurile manifeste şi cele „silent”,ovinele seropozitive (53,13%) fiind nesemnificativ mai des întâlnite, doar cu 2-3% decâtovinele seronegative (46,87%).

11. Mediile celor două categorii de gene calculate pe toţi factorii de grupă sanguină latoate cele patru rase româneşti de ovine arată că alelele recesive (66,06%) sunt deaproape două ori mai răspândite decât alelele dominante (33,94%).

12. Configuraţia mediilor celor trei categorii de genotipuri imunogenetice la toate celepatru rase de ovine din România reliefează frecvenţa scăzută a homozigoţiei dominante(14,73%), mai redusă cu 22% decât heterozigoţia (38,40%) şi cu 32% decât homozigoţiarecesivă (46,87%), homozigoţia recesivă fiind cu 8% mai frecventă decât heterozigoţia. Înconsecinţă, aproape jumătate din tabloul distribuţional al structurilor genotipice sanguineeste ocupat de indivizi ale căror expresii fenotipice sunt controlate de combinaţia reciprocăa alelelor recesive; cealaltă jumătate este reprezentată de indivizi în a căror structurăgenotipică se află alela dominantă în stare dublă (într-o proporţie redusă) sau în combinaţiecu alela recesivă (într-o mai mare măsură).

13. Există diferenţieri importante între rasele româneşti de ovine sub aspectulînzestrării lor imunogenetice. Rasa Ţurcană este cea mai dotată cu determinanţi antigenici(70,64 %), iar rasa Merinos de Palas are cea mai săracă înzestrare cu structuri antigenice(39,68%); structura imunogenetică a rasei Karakul de Botoşani (59.69%) este maiapropiată de cea a Ţurcanei, în timp ce zestrea ereditară a rasei Ţigaie (42,50%)esteaproape asemănătoare cu cea a Merinosului de Palas. În consecinţă, rasele de oi cu lânăfină (Merinos de Palas) şi semifină (Ţigaie) se asociază cu o zestre imunogenetică maiscăzută, iar rasele cu lână grosieră (Ţurcană, Karakul de Botoşani) sunt asociate cu ungrad mai înalt de înzestrare cu factori sanguini. Gradul de înzestrare a animalelor cu factorisanguini determină distribuţii genice şi genotipice adecvate la fiecare rasă.

14. Plaja de variabilitate a distribuţiilor structurilor genetice de grupă sanguină esteinvers proporţională cu gradul de dotare cu factori eritrocitari. Cu cât zestreaimunogenetică este mai bogată, cu atât gruparea factorilor este mai compactă şi cu câtaceastă dotare este mai slabă, cu atât dispersia factorilor eritrocitari este mai amplă.Astfel, la rasele Karakul de Botoşani şi Ţurcană se întâlneşte cea mai restrânsădistribuţie a factorilor eritrocitari. Dimpotrivă, la rasele Merinos de Palas şi Ţigaie limiteledistribuţionale ale factorilor eritrocitari sunt foarte îndepărtate.

15. La varietăţile de culoare ale rasei Karakul de Botoşani cei mai frecvenţideterminanţi antigenici sunt factorii Bf şi Ma la varietatea neagră, Bc, Bd, Bf, Ca şi Ma lavarietatea brumărie şi Aa, Bd, Bf, Ca şi Ma la varietăţile colorate; prin urmare cea maiînzestrată imunogenetic este varietatea brumărie, iar varietatea neagră este cel mai slabdotată cu antigene eritrocitare; varietăţile colorate se asociază cu o zestre imunogeneticăintermediară, care este însă mai apropiată de cea a varietăţii brumărie în ceea cepriveşte distribuţiile factorilor sanguini.

16. Toate varietăţile de culoare se asociază mai evident cu heterozigoţia, la nivelmediu cu homozigoţia recesivă, iar cu homozigoţia dominantă asocierea este mairedusă; între varietăţile de culoare există diferenţe privind asocierea lor cu stările dezigoţie imunogenetică în concordanţă cu înzestrarea acestora cu determinanţi antigenici.

17. Există un raport de inversproporţionalitate între înzestrarea imunogenetică avarietăţilor de culoare şi intensitatea fenomenului de consanguinizare a cestora.

18. La liniile zootehnice ale varietăţii neagră a rasei Karakul de Botoşani cei maifrecvenţi determinanţi antigenici sunt factorii Bf şi Ca la linia 5, Bf la linia 528, Ma şi Bf lalinia 1557, Bb şi Bf la linia 2000, Ma şi Aa la linia cross.

19. Între vechimea liniilor zootehnice şi înzestrarea lor imunogenetică există orelaţie de liniaritate, liniile mai vechi create asociindu-se cu o zestre mai bogată îndeterminanţi antigenici, iar cele mai nou-create sunt mai slab înzestrate imunogenetic.

20. Homozigoţia dominantă este mai dezvoltată la liniile mai vechi-create, iar la celemai nou-create cu mult mai frecventă este homozigoţia recesivă; heterozigoţia este maifrecventă la liniile mai vechi şi scade progresiv cu cât liniile sunt mai apropiate cronologicde fondatorii lor.

21.Configuraţia formulelor sanguine arată că între vechimea liniilor şi fenomenulconsanguinizării există un raport de invers proporţionalitate, consanguinizarea fiind maiaccentuată la iniţierea liniilor şi mai moderată în etapele finale ale consolidării lor.

22. Utilizând reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction) monoplex şi multiplex aufost genotipate rasele româneşti de ovine pentru 11 microsateliţi (BM143, FCB11,FCB20, HSC, MAF33, MAF70, MAF214, McM42, OarCP20, Oar CP34 şi MAF65).

23. Markerii microsateliţi au prezentat un polimorfism extrem de accentuat, valoareamedia a conţinutului polimorfic informatic (PIC) fiind 0,703. Cea mai polimorfă rasăpentru setul de 11 microsateliţi analizaţi este Karakul de Botoşani. De asemenea, rasaŢurcană prezintă un polimorfism considerabil. Cea mai puţin polimorfă este rasa Ţigaie.Oile Merinos de Palas posedă şi ele un polimorfism bogat încadrat între cel al Ţigăii şiŢurcanei, însă este mai apropiat de cel al Ţurcanei.

24. Caracteristicele polimorfice ale celor 11 microsateliţi confirmă participareaplenară a rasei Merinos de Palas la crearea liniilor de producţie, Rasa de Carne Palas şiRasa de Lapte Palas, precum şi vechimea mare a raselor Karakul şi Ţurcană.

25. Prin tehnica Real-Time PCR (Real Time - Polymerase Chain Reaction) a fostinvestigat polimorfismul la nivelul genei PrP (asociată cu susceptibilitatea la scrapie) carecodifică pentru proteina prion la nivelul codonilor 136, 154 şi 171; polimorfismul prioniceste datorat de cele 5 alele de la locus-ul PrP (ARR, AHQ, ARH, ARQ şi VRQ), prin acăror capacitate combinatorie rezultă 15 genotipuri, cinci homozigote şi 10 heterozigote.

26. Cea mai polimorfă rasă este Rasa de Carne Palas (15 genotipuri), iar rasaKarakul de Botoşani are cele mai puţine structuri prionice (trei alele şi şase genotipuri).

27. Între rasele de ovine din România există diferenţieri privind structura genetică lalocus-ul PrP în funcţie de care se determină gradul de rezistenţă/susceptibilitate lascrapie al fiecărei rase, Karakulul de Botoşani fiind cea mai avantajată din acest punct devedere.

28. Analiza Programului European de Monitorizare, Control şi Eradicare a Scrapieirelevă că, prin selecţie foarte riguroasă a efectivelor de ovine, s-a reuşit fixarea tot maiaccentuată a alelei ARR în genotipuri care conferă rezistenţă la această maladie, pe de oparte, şi eliminarea cât mai mult posibilă a genotipurilor prionice care conţin alela VRQcare se asociază cu o mare susceptibilitate a ovinelor de a se contamina cu agentulpatogen al scrapiei; de asemenea, s-a realizat şi scăderea incidenţei alelei ARQ, care, larândul ei, determină o rezistenţă scăzută la această boală.

29. Majoritatea raselor sunt în echilibru genetic la locus-ul PrP, Karakulul deBotoşani fiind singura rasă care se abate de la aşteptările legii Hardy-Weinberg.

30. Posibila implicare a genei FGFR3 în apariţia sindromului „Spider Lamb” la ovinea fost investigată cu ajutorul tehnicii PCR-RFL (Polymerase Chain Reaction - RestrictionFragment Lenght Polymorphism) pentru a putea detecta polimorfismul ce poate apăreaîn poziţia 69 la nivelul exonului 17 al a genei ovine prin transversia TA, ce determinăsubstituţia non-conservativă valinăglutamat.

31. Prin digestia produşilor de amplificare cu enzima de restricţie Btg I, animalelegenotipate au prezentat doar varianta sălbatică (care nu prezintă mutaţia responsabilăpentru apariţia sindromului Spider Lamb), deci ovinele supuse acestui test nu suntsusceptibile a contracta această maladie.

32. Identificarea polimorfismului la locii fecundităţii, în poziţia 896 de la nivelul geneiBMPR-1B şi în poziţia 92 de la nivelul genei BMP15 pentru mutaţiile FecB şi respectivFecX, la ovinele din România a fost posibilă utilizând tehnica PCR-RFLP (PolymeraseChain Reaction - Restriction Fragment Lenght Polymorphism).

33. Realizând digestia produşilor de amplificare cu ajutorul enzimelor derestricţie AvaII pentru gena BMPR-1B şi respectiv XbaI pentru gena BMP15, s-aconstatat lipsa situs-urilor de restricţie pentru aceste enzime, astfel că animalelegenotipate nu sunt purtătoare ale mutaţiilor FecB şi FecX.

34. Diferenţierea imunogenetică şi genetico-moleculară a raselor de ovine dinţara noastră la locii unor sisteme polimorfe este datorată în principal presiunii deselecţie la care sunt supuse rasele pentru realizarea specificului lor productiv şi maipuţin factorilor mediali şi tehnologici din arealele de existenţă caracteristice raselorrespective.

35. Polimorfismul imunogenetic şi genetico-molecular este o precondiţieesenţială pentru înfăptuirea selecţiei asistate de markeri genetici, dar şi pentrudiferenţierea raselor între ele în vederea sporirii biodiversităţii, reprezentând câmpulde acţiune al selecţiei în cadrul speciei ovină.

36. Profilul morfo-productiv şi reproductiv al raselor de ovine din România a fostdescris în context econogenic pentru relevarea biodiversităţii la nivel macroscopic.

37. Popularizarea rezultatelor acestui studiu s-a realizat prin participarea cucomunicări la manifestări ştiinţifice naţionale şi internaţionale şi la work shop-uri, prinpublicarea de lucrări ştiinţifice în reviste de circulaţie naţională şi internaţională şi prinorganizarea de consfătuiri de lucru cu crescătorii de animale.

Documents

OBIECTIVUL GENERAL 5.: Managementul durabil al resurselor ... · Managementul durabil al resurselor genetice animale Obiectivul specific 5.1: Ameliorarea genetică a populaţiilor