Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ÂNGELA CRISTINA DE CARLI PETREANU
OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOMONITORAMENTO DA
ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE EXTRATOS DE Marrubium
vulgare L. (Lamiaceae)
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ÂNGELA CRISTINA DE CARLI PETREANU
OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOMONITORAMENTO DA
ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE EXTRATOS DE Marrubium
vulgare L. (Lamiaceae)
Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Angélica Garcia Couto Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade
Itajaí, março de 2015
OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOMONITORAMENTO DA
ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE EXTRATOS DE Marrubium
vulgare L. (Lamiaceae)
Ângela Cristina De Carli Petreanu
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
__________________________________________________________
Clóvis Antônio Rodrigues, Doutor Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Profa. Dra. Angélica Garcia Couto (UNIVALI) – Presidente
______________________________________
Prof. Dr. Sergio Faloni de Andrade (UNIVALI) - Co-orientador
______________________________________
Profa. Dra. Márcia Maria de Souza (UNIVALI) – Membro Interno
______________________________________
Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda (UNIVALI) – Membro Interno
____________________________________
Prof. Dr. Ricardo Andrade Rebelo (FURB) - Membro Externo
Itajaí (SC), 31 de março de 2015
À minha família...
AGRADECIMENTOS
À minha família, especialmente meus pais Cintia e Élcio, pela educação que me
proporcionaram, pelos valores incutidos em mim quando criança, pelas palavras de
incentivo quando pensei em desistir. Enfim, por todo esforço que fizeram e que com
certeza contribuiu para me fazer ser quem sou e chegar onde cheguei.
À minha irmã Júlia pelo companheirismo e dedicação, você é, com certeza, minha
melhor metade, irmãs de sangue e de alma... te amo!
Aos meus sogros Dagmar e Eugênio pelo carinho e palavras de incentivo, pela
torcida a cada conquista, por terem me acolhido como filha... obrigada.
Ao meu esposo Marcel, primeiramente pela enorme ajuda na realização deste
trabalho, sem você não teria conseguido, mas principalmente pelo companheirismo,
pelo incentivo, pelas muitas broncas necessárias que me colocaram no caminho,
pelo amor sincero e pelo abraço acolhedor que me fazem querer ser melhor... te
amo infinitamente e mais.
À minha tia Roseni, por ter me apresentado a oportunidade de voltar aos estudos e
pelo incentivo na conclusão deste mestrado.
À Prof.ª Dra. Angélica Garcia Couto pela orientação e amizade, por estar sempre
disposta e paciente todas as vezes que precisei... Obrigada!
Ao Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade pela co-orientação, e à sua equipe pela
excelente ajuda na realização dos testes farmacológicos.
Ao Prof. M.e Theodoro Marcel Wagner pela paciência e enorme colaboração nas
análises em CG.
Ao Eng. Agrônomo Renê Artur Ferreira pela coleta do material vegetal.
À Prof.ª Dra. Christiane Meyre pela cedência dos materiais bibliográficos e do
padrão marrubiina e suporte técnico para a purificação e isolamento do marcador.
À Prof. ª Dra. Joana Silveira e à equipe técnica do Centro de Microscopia Eletrônica
da Universidade Federal do Paraná pelo auxilio nas análises por MEV.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, em
especial às professoras Ruth e Márcia pela correção e contribuição para melhor
qualidade deste trabalho.
Aos técnicos de todos os laboratórios onde trabalhei.
Às alunas da graduação Akeane e Thais, pela contribuição na realização dos testes
tecnológicos.
Ao meu amigo Hugo pela grande ajuda no início desta caminhada.
Aos colegas de mestrado e às amigas que fiz nesses dois anos, pelas palavras de
incentivo, pelos cafés e pela companhia.
À UNIVALI e ao suporte financeiro cedido pela CAPES, CNPq e FAPESC – Edital
PronEx.
Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho,
serão eternamente lembrados.
Muito obrigada!!!
“Foi o tempo que dedicaste à tua rosa que fez tua rosa tão
importante”
(Antoine de Saint-Exupéry).
OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOMONITORAMENTO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE EXTRATOS DE Marrubium
vulgare L. (Lamiaceae)
Ângela Cristina De Carli Petreanu
Março, 2015
Orientadora: Profa. Dra. Angélica Garcia Couto. Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 85
Marrubium vulgare é uma planta europeia, que ocorre no planalto serrano catarinense do Brasil, popularmente conhecida como "marrroio" e com atividade gastroprotetora comprovada para o extrato metanólico das partes aéreas. O composto presente em maior concentração na planta foi identificado como a furanolactona diterpênica marrubiina. Para a produção do fitoterápico, o conhecimento da viabilidade tecnológica e dos fatores que interferem na estabilidade química e manutenção da atividade farmacológica dos seus derivados vegetais, é primordial para a garantia da qualidade do produto final. Assim, o presente trabalho teve como objetivo a obtenção, a caracterização e o biomonitoramento da atividade gastroprotetora de extratos moles e secos de M. vulgare derivados das soluções extrativas etanólicas e metanólicas. As soluções extrativas (SE) foram obtidas por maceração dinâmica empregando-se a mistura (1:1) de folhas e caules moídos, com os solventes metanol (MeOH) e etanol 70% (EtOH70) na razão de 5% (m/v). O extrato mole
(EM) foi obtido por evaporação da SE a 50 C, e os extratos secos (ESs) foram obtidos no spray-dryer pela dispersão aquosa a 10% de sólidos, contendo EM e dióxido de silício coloidal na proporção de 7:3 (m/m). Os derivados vegetais foram caracterizados pelo resíduo seco (RS), teor de marrubiina (TM) por cromatografia gasosa (CG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG), e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para avaliação da atividade gastroprotetora, os EMs e ESs (MeOH e EtOH70) foram empregados como tratamento em modelos de indução de úlcera aguda por etanol e indometacina. O resíduo seco, bem como o TM das SEs foram independentes do solvente usado na extração. No entanto, o TM reduziu de 9,61 mg/g nas SEs para 0,19 mg/g nos EMs, indicando problemas de estabilidade na etapa de concentração parcial do solvente. A secagem por spray-dryer resultou em ESs com até 5% de umidade, rendimento maior que 70%, e recuperação maior que 90% do TM em relação ao EM. A análise por MEV dos ESs evidenciou partículas esféricas, com cerca de 2,4 µm. As análises de DSC e TG indicaram interação do EM com o dióxido de silício coloidal. O teste farmacológico de indução de úlcera aguda por etanol mostrou que ambos os EMs e ESs (MeOH e EtOH70) reduziram significativamente (p<0,001) a área total de lesão e a área lesada (%) quando comparados ao grupo controle. A inibição de úlcera (%) foi maior que 60% para os grupos tratados com os extratos, independente do solvente usado na extração, ou do produto (EM ou ES). Entretanto, no modelo de indução de úlcera por indometacina, apenas os grupos tratados com os EMs reduziram significativamente a área total de lesão e a área lesada (%), inibindo 84,04% (MeOH) e 74,49% (EtOH70) da lesão, enquanto nos grupos tratados com o dióxido de silício coloidal e com os ESs houve a formação de lesões ulcerativas. Os resultados da obtenção e caracterização dos derivados vegetais, sobretudo da sua relação com o marcador químico e a atividade biológica, apontam para a necessidade de validação de processo e a padronização do extrato, como ferramentas para a garantia da sua eficácia. Palavras-chave: Marrubium vulgare. Marrubiina. Spray-dryer. Extratos moles. Extratos secos. Gastroproteção.
OBTAINING, CHARACTERIZATION AND BIOMONITORING OF THE GASTROPROTECTIVE ACTIVITY OF EXTRACTS OF Marrubium
vulgare L. (Lamiaceae)
Ângela Cristina De Carli Petreanu
March, 2015
Supervisor: Angélica Garcia Couto, Doctor. Co-supervisor: Sérgio Faloni de Andrade, PhD. Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances Number of Pages: 85 Marrubium vulgare is a European plant that occurs in the mountainous plateau of Santa Catarina, Brazil, where it is popularly known as "marrroio". It has proven gastroprotective activity for the methanol extract of the aerial parts. The compound present in higher concentration in the plant was identified as the furanolactone diterpene marrubiin. For the production of herbal medicine, knowledge of technological feasibility and of the factors that interfere with the chemical stability, and maintenance of the pharmacological activity of the plant derivative, are essential to guarantee the quality of the final product. The present study aimed to obtain, characterize and biomonitor the gastroprotective activity of soft and dry extracts of M. vulgare derived from ethanolic and methanolic extraction solutions. The extraction solutions (ES) were obtained by dynamic maceration, using a mixture (1: 1) of crushed leaves and stems with the solvents methanol (MeOH) and 70% ethanol (EtOH70) at
a ratio of 5% (w/v). The soft extract (SE) was obtained by evaporation at 50C. The dried extracts (DEs) were obtained by in the spray-dryer by aqueous dispersion at 10% of solids, containing SE and colloidal silicon dioxide at a ratio of 7:3 (w/w). The plant derivatives were characterized by dry residue (DR), marrubiin content (MC) through gas chromatography (GC), differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG) and scanning electron microscopy (SEM). To evaluate the gastroprotective activity, the SE and DE (MeOH and EtOH70) were used as treatment in models of acute ulcer induction by ethanol and indomethacin. The dry residue and the TM of the SEs were independent of the solvent used in the extraction. However, the MC was reduced from 9.61 mg/g in the ES to 0.19 mg/g in the SEs, indicating stability problems in the partial concentration of the solvent phase. The spray drying resulted in DEs with up to 5% moisture, yield of more than 70%, and recovery of MC of more than 90% in relation to the SE. SEM analysis of the DEs revealed spherical particles of about 2.4 µm. DSC and TG analyzes indicated interaction of the SE with the colloidal silicon dioxide. Pharmacological testing of acute ulcer induction by ethanol showed that both SE and DE (MeOH and EtOH70) significantly decreased (p <0.001) the total area of injury and the injured area (%), compared with the control group. Ulcer inhibition (%) was greater than 60% for the groups treated with the extracts, regardless of the solvent used in the extraction, or the product (SE or DE). However, in the indomethacin induced ulcer model, only the groups treated with the SE significantly reduced the total area of injury and the injured area (%), inhibiting 84.04% (MeOH) and 74.49% (EtOH) of the lesion, while in the groups treated with the colloidal silicon dioxide and the DE, there was formation of ulcerative lesions. The results of the obtaining and characterization of plant products, particularly its relationship with the chemical and biological marker activity, indicate a need for process validation and standardization of the extract, as tools for ensuring its effectiveness.
Keywords: Marrubium vulgare. Marrubiina. Spray-drying. Soft extracts. Dried extracts.
Gastroprotection.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mercado global de medicamentos fitoterápicos em 2011 e sua distribuição de acordo com as diversas regiões geográficas...............................................................
20
Figura 2 – Fotografia das folhas de M. vulgare L. ........................................................... 22
Figura 3 – Fotografia das partes aéreas (A) e das flores (B) de M. vulgare..................... 22
Figura 4 – Medicamentos a base da M. vulgare comercializados em diferentes países, (A) México (Herbs of Mexico), (B) Espanha (Marroio Branco – Arkocápsulas), (C) Inglaterra (Cough Elixir – Welleda), (D) Canadá (Marrubium vulgare – Naturtech) e (E) Austrália (Horehound Herb – Nature´s Wonderland) ........................................................
24
Figura 5 – Estrutura química dos esteróides stigmasterol (A) e β-sitosterol (B) presentes na M. vulgare ...................................................................................................
25
Figura 6 – Estruturas químicas dos diterpenos vulgarol (A), peregrinol (B) e marrubenol (C) presentes na M. vulgare...........................................................................
25
Figura 7 – Estrutura química do ácido ursólico presente na M. vulgare .......................... 26
Figura 8 – Estrutura química da pré-marrubiina (A) e do seu derivado marrubiina (B)... 27
Figura 9 – Análise granulométrica das folhas e caules moídos de M. vulgare................. 54
Figura 10 – Aspecto macroscópico das folhas (A) e caules (B) secos e moídos de M. vulgare …………………………………………………………………………………….........
54
Figura 11 – Curva analítica da marrubiina (Área X Concentração mg/mL) ..................... 57
Figura 12 – Perfis cromatográficos dos derivados etanólicos de M. vulgare obtidos por cromatografia gasosa........................................................................................................
59
Figura 13 – Perfis cromatográficos dos derivados metanólicos de M. vulgare obtidos por cromatografia gasosa..................................................................................................
60
Figura 14 – Microscopia eletrônica de varredura dos extratos secos metanólico (A) e etanólico 70 °GL (B) em aumento de 2.500x ....................................................................
60
Figura 15 - Microscopia eletrônica de varredura dos extratos secos metanólico (A) e etanólico 70 °GL (B) em aumento de 10.000x...................................................................
61
Figura 16 - Microscopia eletrônica de varredura dos extratos secos metanólico (A) e etanólico 70 °GL (B) em aumento de 1.000x.....................................................................
61
Figura 17 – Gráfico de distribuição do tamanho de partícula do extrato seco metanólico..........................................................................................................................
62
Figura 18 - Gráfico de distribuição do tamanho de partícula do extrato seco etanólico 70% ...................................................................................................................................
62
Figura 19 – Perfil de análise de DSC e TG para o adjuvante de secagem dióxido de silício coloidal.....................................................................................................................
63
Figura 20 – Curvas de DSC e TG para extrato mole (A) etanólico e extrato seco (B) etanólico de M. vulgare. Faixa de temperatura: 25-500 °C. ATM N, 10 °C/min …............
64
Figura 21 – Curvas de DSC e TG para extrato mole (A) metanólico e extrato seco (B) metanólico de M. vulgare. Faixa de temperatura: 25-500 °C. ATM N, 10 °C/min…..........
65
Figura 22 – Perfis cromatográficos por CG da solução de marrubiina após estresse térmico de 8 horas.............................................................................................................
67
Figura 23 – Porcentagem de inibição obtida pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/Kg) e dos diferentes extratos moles e secos das partes aéreas de M. vulgare (100 mg/Kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol em ratos......
70
Figura 24 – Imagens dos estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos, utilizando tratamento com os extratos moles e secos de M. vulgare (100 mg/Kg), Aerosil e o fármaco omeprazol ………..............................................................................
70
Figura 25 – Porcentagem de inibição obtida pelo efeito da administração oral de ranitidina (100 mg/Kg) e dos diferentes extratos moles e secos das partes aéreas de M. vulgare (100 mg/Kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em ratos………………………………………………………………………………………………
73
Figura 26 – Imagens dos estômagos após indução de úlcera por indometacina em ratos, utilizando tratamento com os extratos moles e secos de M. vulgare (100 mg/Kg), Aerosil e o fármaco omeprazol..........................................................................................
73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Rendimento e perda por secagem (PPS) das partes aéreas de M. vulgare (caules e folhas frescos e secos) da estação do inverno de 2013……………………….
53
Tabela 2 – Valores de pH e resíduo seco (RS) para os derivados extrativos das partes aéreas de M. vulgare. Resultados representam a média e o desvio padrão relativo entre parênteses………………………………………………………………………
56
Tabela 3 – Determinação da variação da quantificação da marrubiina em solução etanólica 96% no ensaio de repetibilidade………………………………………………......
58
Tabela 4 – Teor de marrubiina (mg/g) nas soluções extrativas, extratos moles e extratos secos de M. vulgare (5% de droga vegetal, etanol 70% (v/v) e metanol P.A.). Resultados representam a média e o desvio padrão relativo entre parênteses…….......
58
Tabela 5 – Determinação da concentração de marrubiina em solução etanólica 96% antes e após ensaio de estabilidade térmica (T=50 °C) por 8 horas ………………........
66
Tabela 6 – Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/Kg) e dos diferentes extratos metanólico e etanólico 70% das partes aéreas de M. vulgare em úlceras agudas induzidas por etanol em ratos ………………………………………………………
69
Tabela 7 – Efeitos da administração oral de ranitidina (100 mg/Kg) e dos diferentes extratos (moles e secos) metanólico e etanólico 70% das partes aéreas de M. vulgare em úlceras agudas induzidas por AINEs em ratos………………….................................
72
LISTA DE ABREVIATURAS
AINEs = Anti-inflamatórios não esteroidais
CG = Cromatografia Gasosa
COX-1 = Ciclooxigenase 1
COX-2 = Ciclooxigenase 2
DPR = Desvio padrão relativo
CED = Calorimetria Exploratória Diferencial
EM = Extrato mole
EME = Extrato mole etanólico
EMM = Extrato mole metanólico
ES = Extrato seco
ESE = Extrato seco etanólico
ESM = Extrato seco metanólico
DIC = Detector de Ionização de Chama
MEV = Microscopia Eletrônica de Varredura
NIQFAR = Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
PGs = Prostaglandinas
PPS = Perda por secagem
PTFE = Polietrafluoretileno
RS = Resíduo seco
SE = Solução extrativa
TG = Termogravimetria
TM = Teor de marrubiina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO………………………………………………………….. 15
2 OBJETIVOS…………………………………………………………….. 17
2.1 Objetivo Geral…………………………………………………………………….. 17 2.2 Objetivos Específicos ..……………………………………………………….... 17
3 REVISÃO DA LITERATURA………………………………………….. 19
3.1 Plantas medicinais……………………………………………………………….. 19 3.2 Marrubium vulgare……………………………………………………………….. 21 3.2.1 Aspectos botânicos……………………………………………………….. 21 3.2.2 Etnofarmacologia………………………………………………………….. 23 3.2.3 Estudos fitoquímicos……………………………………………………… 24 3.2.4 Estudos tecnológicos…………………………………………………….. 28 3.3 Úlcera……………………………………………………………………………….. 29 3.4 Importância dos extratos secos na produção de fitoterápicos………….. 33 3.5 Secagem por Spray drying……………………………………………………… 35
4 MATERIAL E MÉTODOS……………………………………………… 41
4.1 Materiais e reagentes…………………………………………………………..... 41 4.2 Equipamentos……………………………………………………………………... 41 4.3 Obtenção do marcador químico marrubiina……………..………………….. 42 4.4 Obtenção da droga vegetal……………………………………………………... 43 4.4.1 Determinação da perda por dessecação………………………………. 43 4.4.2 Análise granulométrica…………………………………………………… 43 4.5 Obtenção dos derivados extrativos…………………………………………… 44 4.5.1 Soluções extrativas……………………………………………………….. 44 4.5.2 Extratos moles……………………………………………………………… 44 4.5.3 Extratos secos……………………………………………………………… 45 4.6 Caracterização dos derivados vegetais (soluções extrativas, extratos moles e extratos secos)………………………………………………………………
45
4.6.1 Determinação do pH dos derivados extrativos……………………..... 45 4.6.2 Determinação do resíduo seco dos derivados extrativos………….. 45 4.6.3 Análises cromatográficas por CG para determinação do teor de marrubiina……………………………………………………………………………….
46
4.6.4 Análise do tamanho de partículas e morfologia dos extratos secos……………………………………………………………………………………...
47
4.6.5 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Análise Termogravimetrica (TG) dos extratos moles, extratos secos e adjuvante de secagem………………………………………………………………………………….
48
4.6.6 Estudo do estresse térmico do marcador marrubiina……………….. 48 4.7 Avaliação da atividade gastroprotetora dos extratos………………………. 49 4.7.1 Modelo de úlcera induzida por etanol…………………………………... 49 4.7.2 Modelo de úlcera induzida por anti-inflamatório não esteroidal…... 50 4.8 Análise estatística………………………………………………………………… 51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO……………………………………….. 53
5.1 Tratamento e caracterização da droga vegetal……………………………… 53 5.2 Obtenção e caracterização físico-química dos derivados extrativos…… 55 5.2.1 Análise cromatográfica por cromatografia gasosa………………….. 56 5.2.1.1 Linearidade………………………………………………………………. 56
5.2.1.2 Precisão………………………………………………………………….. 57 5.2.1.3 Análises cromatográficas dos derivados vegetais…………………... 58 5.3 Análise do tamanho de partícula e morfologia dos extratos secos…… 60 5.4 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Análise Termogravimétrica (TG) dos extratos moles, extratos secos e adjuvante de secagem dióxido de silício coloidal………………………………………………...
62
5.5 Estudo do estresse térmico do marcador marrubiina.........……………….. 65 5.6 Avaliação da atividade gastroprotetora dos extratos………………………. 68
6. CONCLUSÕES…………………………………………………………. 75
REFERÊNCIAS……………………………………………………………. 77
ANEXO A…………………………………………………………………… 85
15
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais representam um dos mais importantes e antigos
recursos para a prevenção e manutenção das condições de saúde da humanidade,
e, há milhares de anos o homem vem utilizando os recursos da flora no tratamento
de diversas patologias. Apesar do extenso uso das plantas na medicina tradicional e
da sua importância para a saúde pública moderna, seu potencial como fonte de
novos medicamentos, com novos mecanismos de ação, alta seletividade e atividade,
é, ainda, pouco estudado, uma vez que, das 500 mil espécies de plantas existentes
no planeta, estima-se que, apenas 6% tenham sido investigadas
farmacologicamente, e cerca de 15% fitoquimicamente (CRAGG, NEWMAN, 2013).
Neste contexto, o Brasil é um país privilegiado, em virtude das boas
condições climáticas e potencial hídrico, o que contribui para a grande diversidade
de espécies nativas, assim como uma boa adaptação de várias espécies
estrangeiras, facilitando a obtenção de inúmeras espécies com potencial atividade
biológica (GOBBO NETO; LOPES, 2007; ZUANAZZI; MAYORGA, 2010).
Por esta razão, e pelo fato de que a fitoterapia possa ser uma alternativa
economicamente mais vantajosa e muito mais acessível para o tratamento de
diversas enfermidades, ainda há muito o que se explorar nesta área, incluindo o
estudo de novas plantas e isolamento de compostos com propriedades terapêuticas
e potencial de medicamento fitoterápico. No intuito de contribuir para o futuro
desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos, a espécie Marrubium vulgare
tem sido amplamente estudada.
M. vulgare é uma planta herbácea, nativa do planalto oeste europeu, com boa
adaptação no planalto serrano catarinense. É amplamente utilizada pela
comunidade rural do Brasil e de outras partes do mundo para o tratamento de
diversas enfermidades, incluindo problemas gastrointestinais, doenças respiratórias,
doenças renais, febre, entre outras (CECHINEL FILHO, 2000).
Como um dos principais marcadores químicos da M. vulgare, tem-se a
marrubiina, um diterpeno estável naturalmente presente na planta com diversas
ações terapêuticas já comprovadas, como atividade antinociceptiva (JESUS et al.,
1999), cardioprotetora (EL BARDAI et al., 2003), antidiabética (LAONIGRO et al.,
1979), atividade antiespasmódica (HUSSAIN et al., 2011), dentre outras.
16
Há relatos quanto ao uso popular de M. vulgare para o tratamento de
dispepsias (WHITE HOREHOUND, 2008) já comprovados na literatura científica em
modelos de úlcera induzida em camundongos (OLIVEIRA et al., 2011; TOSO et al.,
2007). Toso e colaboradores (2007) avaliaram o extrato hidroalcoólico (álcool 50%)
das partes aéreas de M. vulgare, administrado via i.p., sob a forma de solução
contendo extrato mole, carboximetilcelulose 0,1% e Tween® 80 0,05%, enquanto
Oliveira e colaboradores (2011) avaliaram o extrato mole metanólico e o marcador
químico marrubiina administrados via oral.
A partir destes estudos, fez-se necessário buscar alternativas tecnológicas
para o desenvolvimento de extratos mais viáveis, já que extratos moles são de difícil
padronização, conservação e manuseio, e o metanol é um solvente tóxico, fato que
justifica a escolha do etanol e suas misturas com água como solvente extrator e
alternativa mais inócua, tanto para o processo de extração como para o produto
final.
Frente aos extratos moles, os extratos secos representam uma alternativa
mais viável do ponto de vista industrial, pois oferecem maior estabilidade física e
microbiológica, e facilidade de transporte, armazenamento, padronização e
incorporação em diversas formas farmacêuticas (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010). A
secagem por spray-drying é uma das técnicas mais utilizadas para a obtenção de
extratos secos, e depende da escolha de adjuvantes que possam veicular os
compostos extraídos da espécie vegetal, e melhorar o rendimento e a estabilidade
do produto frente à umidade (OLIVEIRA, PETROVICK, 2010).
A obtenção de extratos secos prescende de etapas anteriores, de extração e
de eliminação parcial do solvente, que resultam na solução extrativa e extrato mole,
respectivamente. Cada etapa requer o controle de qualidade para identificar quais os
pontos críticos do processo para assegurar o rendimento e a qualidade pretendida.
A seleção de marcadores químicos e o biomonitoramento constituem os principais
parâmetros de controle de qualidade. Entretanto, nem sempre é possível reconhecer
os potenciais marcadores, devido em parte à complexidade química da matriz
vegetal e suas transformações ao longo do processo de produção.
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a
viabilidade de obtenção de extratos hidroalcoólicos, moles e secos, alternativamente
aos extratos metanólicos, tendo-se como principais parâmetros o teor de marrubiina
e a atividade gastroprotetora.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Obter, caracterizar e biomonitorar a atividade gastroprotetora de extratos de
Marrubium vulgare L. (Lamiaceae).
2.2 Objetivos Específicos
- Obter e caracterizar a droga vegetal (folhas e caules secos e moídos da
Marrubium vulgare) quanto ao rendimento do material fresco e seco, perda por
dessecação, caracterização macroscópica, moagem e granulometria;
- Obter e caracterizar as soluções extrativas a partir de 5% da droga vegetal,
em diferentes sistemas solventes (etanol 70 °GL e metanol P.A.), através de
determinação do pH, resíduo seco e teor de marrubiina por cromatografia gasosa
(CG).
- Obter e caracterizar os extratos moles de cada sistema solvente quanto ao
teor de marrubiina por CG, resíduo seco, análise termogravimétrica por DSC;
- Obter e caracterizar os respectivos extratos secos por spray-dryer, quanto
ao teor de marrubiina, análise termogravimétrica por DSC, resíduo seco, tamanho e
morfologia das partículas por MEV;
- Avaliar a estabilidade do marcador marrubiina frente ao estresse térmico;
- Avaliar o potencial gastroprotetor dos extratos moles de cada sistema
solvente e respectivos extratos secos, em modelos farmacológicos de úlcera
induzida em ratos.
18
19
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Plantas medicinais
Ao longo dos anos, os seres humanos têm encontrado na natureza um meio
de atender às suas necessidades básicas, inclusive com o fornecimento de fontes de
medicamentos para o tratamento de um amplo espectro de doenças (CRAGG;
NEWMAN, 2013).
Dentre todas as fontes de produtos naturais, as plantas medicinais
desempenham um papel muito importante, principalmente no tratamento de saúde
primário, sendo estimado que a medicina tradicional é utilizada em
aproximadamente 60% da população mundial, e crescentemente incorporada no
sistema público de saúde em alguns países (WHO, 2015).
Historicamente, as plantas medicinais foram utilizadas como única fonte de
medicamentos durante séculos pela humanidade (MISHRA; TIWARI, 2011). Há
inúmeras evidências históricas e arqueológicas, de que as propriedades curativas
das plantas medicinais já são conhecidas desde o período Neolítico, cerca de
10.000 anos atrás (BHATTARAM et al., 2002).
Os egípcios, há mais de 4.000 anos já conheciam as propriedades do ópio. A
Índia também teve um papel importante na descrição de plantas medicinais,
principalmente devido à medicina Ayurvédica, baseada no Vedas, o livro sagrado
dos hindus. Os gregos e os romanos absorveram e ampliaram o conhecimento na
utilização das plantas medicinais. Pendamius Dioscorides, médico de Nero,
escreveu um texto de botânica e medicina, denominado De Materia Medica, dividido
em 5 tomos, que foi utilizado durante mais de15 séculos pelos gregos, romanos,
árabes e turcos, e, das 1.000 drogas descritas, cerca de 600 eram plantas, como o
cânhamo, a cicuta e anestésicos a base de ópio e mandrágora (BHATTARAM et al.,
2002).
Avanços nas pesquisas científicas em meados de 1800, levaram a
descobertas de muitos compostos bioativos. Entre os primeiros exemplos de
descoberta e isolamento de compostos bioativos estão a estricnina, morfina,
atropina, quinina e colchicina. Estes isolamentos foram seguidos por aquilo que
pode ser considerado como o desenvolvimento do primeiro produto natural
comercial, a morfina, em 1817, isolada a partir do ópio, e o primeiro fármaco semi-
20
sintético baseado num produto natural, a aspirina. Esse foi o começo de uma nova
era na medicina, na qual os medicamentos poderiam ser obtidas de plantas e
administradas em doses precisas, independente da origem ou da idade do material
vegetal (CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2014; OGBOURNE; PARSONS, 2014).
Apesar do extenso uso de plantas medicinais como tratamento de patologias
ao longo da história da humanidade e sua importância para a saúde pública
moderna, o potencial das plantas como fonte de pesquisa na busca de novos
medicamentos, com novos mecanismos de ação, alta seletividade e atividade, é
ainda pouco estudado, uma vez que, das 500 mil espécies de plantas existentes no
planeta, estima-se que apenas 6% tenham sido investigadas farmacologicamente
(CRAGG; NEWMAN, 2013).
Em 2011, o mercado global de medicamentos (sintéticos e naturais) alcançou
a cifra de U$ 800 bilhões, enquanto que o mercado para fitoterápicos atingiu o
patamar de U$ 26 bilhões. O maior mercado para fitoterápicos encontra-se na
Europa (Fig. 1), sendo que cerca de 50% deste encontra-se na Alemanha, no
entanto, a América Latina, com 7 países considerados megabiodiversos (Brasil,
Colômbia, Costa Rica, Equador, México, Panamá e Peru) participa apenas com 5%
desse total. No mesmo período em 2011, o mercado de fitoterápicos movimentou
cerca de R$ 1,1 bilhão no Brasil, quando foram comercializados 43 milhões de
unidades desse tipo de medicamento, representando um aumento de 13% em
relação ao ano anterior (ALVES, 2013).
Figura 1 - Mercado global de medicamentos fitoterápicos em 2011 e sua distribuição de acordo com as diversas regiões geográficas.
Fonte: ALVES (2013).
21
Esses dados mostram que apesar da sua imensa biodiversidade, da
capacidade de seus cientistas, do parque industrial e dos numerosos centros de
pesquisa dedicados ao estudo das plantas medicinais espalhados pelo país, o
desenvolvimento e a produção, em todas as suas fases, de um medicamento de
origem vegetal no Brasil, ainda é muito pequeno.
Nesse contexto, desde 1995, o Núcleo de Investigações Químico-
Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI, destaca-se
pelo histórico de pesquisas na área química e atividade biológica de várias plantas
medicinais, provenientes da flora brasileira ou não, e usadas na medicina popular
com finalidades terapêuticas, especialmente das espécies nativas ou adaptadas à
flora catarinense. As pesquisas visam a obtenção de substâncias com potencial
terapêutico, ou que, sirvam como protótipos para a síntese de moléculas de
interesse medicinal, dentre eles, muitos compostos com diferentes ações biológicas
já foram determinados, incluindo terpenoides, lactonas, flavonoides, entre outros
(CEQUINEL FILHO, 1999).
Dentre as plantas investigadas pelo NIQFAR, encontra-se a Marrubium
vulgare. Esta planta pertence a um dos gêneros com promissora diversidade
química e atividade biológica que tem grande interesse da comunidade científica
devido aos seus efeitos farmacológicos.
3.2 Marrubium vulgare
3.2.1 Aspectos botânicos
O gênero Marrubium pertence a família Lamiaceae e consiste de arbustos ou
árvores largas e tropicais, com aproximadamente quarenta espécies nativas de
regiões temperadas da Europa e Ásia. Algumas espécies crescem no Brasil, como a
Marrubium vulgare, encontrada principalmente em áreas de floresta atlântica e
savanas (MEYRE SILVA; CECHINEL FILHO, 2010).
A Marrubium vulgare L. (Fig. 2) é uma planta nativa do planalto oeste
europeu, trazida para o Brasil por colonizadores e adaptada ao planalto serrano
catarinense (DE SOUZA et al., 1998). É uma planta herbácea perene, cuja altura
não ultrapassa os 50 cm, tem caule lenhoso quadrangular, ereto e robusto e
densamente albo-lanoso. As folhas são oval-arredondadas de 4,5 cm de
22
comprimento, com base estreita e ápice obtuso, pecíolo de 1-2 cm de comprimento e
flores pseudo verticiladas de 20 a 50 flores de cor clara (Fig. 3) localizadas nas
axilas das folhas superiores (CIRILO, 1993; CORRÊA, 1984; DE SOUZA et al.,
1998). Toda a planta tem cor esbranquiçada por sua abundante velosidade e
desprende um odor característico (QUER, 1992).
Figura 2 - Fotografia das folhas da M. vulgare L.
Fonte: OLIVEIRA (2011).
Figura 3 - Fotografia das partes aéreas (A) e das flores (B) da M. vulgare L.
Fonte: OLIVEIRA (2011).
23
3.2.2 Etnofarmacologia
No Brasil, a M. vulgare é popularmente conhecida como maromba, marroio,
marroio-branco, marrubio, erva-virgem, bom-homem, marroio-comum ou erva de
sapo (BALMÉ, 1982; CIRILO, 1993; CORRÊA, 1984).
Consiste de uma planta melífera que é usada pelas comunidades rurais do
Brasil e de outras partes do mundo na forma de chás, como um agente terapêutico
para o tratamento de diversas enfermidades (CIRILO, 1993; KNÖSS, 1999),
incluindo desordens gastrointestinais (MORENO-SALAZAR, ROBLES-ZEPEDA,
JOHNSON, 2008), doenças respiratórias, como expectorante, estimulante, no
tratamento de tosses e bronquite crônica (RAHMAN et al., 2004), metabólicas, como
hipoglicemiante (NOVAES et al., 1998; HERRERA-ARELLANO, et al., 2004), como
analgésico (SOUZA et al., 1998), anti-inflamatório (MOLINARI et al., 1997),
antiespasmódico (SCHLEMPER et al., 1996), sedativo (MASCOLO et al., 1987) e
antioxidante (WEEL et al., 1999). Suas raízes são indicadas como diuréticas e nas
doenças hepáticas e renais (BALMÉ, 1982; CIRILO, 1993; CORRÊA, 1984).
Os extratos hidroalcoólico e metanólico das partes aéreas (folhas e caules) da
M. vulgare vem sendo estudados pelo Núcleo de Investigações Químico-
Farmacêuticas da UNIVALI (NIQFAR/UNIVALI) devido ao seu uso na medicina
popular. Testes laboratoriais vem confirmando as propriedades antinociceptivas do
extrato hidroetanólico das partes aéreas (DE SOUZA et al., 1998), atividade
antiespasmódica do extrato hidroalcoólico das folhas, caules e raízes (SCHLEMPER
et al., 1996), hipoglicemiante do extrato aquoso das folhas (HERRERA-ARELLANO
et al., 2004), hipolipidêmica do extrato metanólico das partes aéreas (ELBERRY et
al., 2011), gastroprotetora do extrato metanólico das partes aéreas (OLIVEIRA et al.,
2011), vasorelaxante e anti-hipertensiva de extratos liofilizados das partes aéreas
(EL-BARDAI et al., 2001), bem como anti-inflamatória do extrato hidroalcoólico das
partes aéreas (MOLINARI et al., 1997). O extrato hidroalcoólico também apresentou
atividade broncodilatadora não específica in vitro (MOLINARI et al., 1997).
Em países onde o uso de M. vulgare é mais difundido, é possível encontrar
medicamentos comercializados a partir desta planta, ou em associação com outras
plantas medicinais. É o caso de países como a Espanha (Marroio Branco® -
Arkocápsulas), Venezuela (Marrubiina® - Vitaplant), Portugal (Sambukid® xarope
infantil – Farmadiética®), Canadá (Marrubium vulgare® – NaturTech) e Austrália
24
(Horehound Herb® – Nature´s Wonderland), nos quais, os usos mais populares dos
medicamentos são para casos de tosse e bronquite. No México (Control de Azúcar®
– Herbs of Mexico) (Fig. 4), entretanto, é possível encontrar medicamentos à base
de M. vulgare para o controle de diabetes.
Figura 4 - Medicamentos a base de M. vulgare comercializados em diferentes países, (A) México (Herbs of Mexico
®), (B) Espanha (Marroio Branco
® – Arkocápsulas), (C) Inglaterra (Cough Elixir
® –
Welleda), (D) Canadá (Marrubium vulgare® – NaturTech) e (E) Austrália (Horehound Herb
® – Nature´s
Wonderland)
3.2.3 Estudos fitoquímicos
Em relação à constituição química, foi evidenciada nas partes aéreas da M.
vulgare a presença de alguns compostos de interesse medicinal, como os esteróides
estigmasterol e β-sitosterol (Fig. 5) (CECHINEL FILHO, 1999).
25
Figura 5 - Estrutura química dos esteróides stigmasterol (A) e β-sitosterol (B) presentes na M. vulgare.
Fonte: MEYRE-SILVA; CECHINEL FILHO (2010).
Outros diterpenos presentes na planta são o vulgarol, peregrinol e marrubenol
(Fig. 6). O ácido ursólico (Fig. 7) também está presente nas partes aéreas da planta
(AMER, 1993).
Figura 6 - Estruturas químicas dos diterpenos vulgarol (A), peregrinol (B) e marrubenol (C) presentes na M. vulgare.
Fonte: MEYRE-SILVA; CECHINEL FILHO (2010).
26
Figura 7 - Estrutura química do ácido ursólico presente na M. vulgare.
Fonte: MEYRE-SILVA; CECHINEL FILHO (2010).
O composto presente em maior concentração na planta foi identificado como
a furanolactona diterpênica marrubiina. Sua ação antinociceptiva é muito mais
pronunciada do que a da aspirina, indometacina e diclofenaco, quando analisado em
alguns modelos de dor aguda em camundongos (JESUS et al., 2000). Meyre-Silva e
colaboradores (2005) demostraram que alguns derivados da marrubiina, como o
ácido marrubiínico, também apresentam efeito antinociceptivo em modelos de dor
induzida em ratos.
A marrubiina foi primeiramente isolada e identificada em 1842 a partir da M.
vulgare, e após em muitas outras plantas pertencentes ao mesmo gênero e à
mesma família Lamiaceae (POPOOLA et al., 2013). A marrubiina e seu precursor
pré-marrubiina são largamente encontrados nesta família (Fig. 8).
Existem algumas controvérsias sobre a origem natural das furanolactonas que
possuem um grupo hidroxila no carbono 9 e um anel de furano na cadeia lateral
como a marrubiina, que são considerados por alguns autores como os produtos
finais da via de biossíntese, enquanto alguns outros autores sugerem que eles são
artefatos provenientes de seus precursores correspondentes labdanoides pré-
furânicos, durante ou após o processo de extração e isolamento (POPOOLA et al.,
2013).
27
Figura 8 - Estrutura química da pré-marrubiina (A) e do seu derivado marrubiina (B).
Fonte: KNÖSS; REUTER; ZAPP (1997).
De acordo com literatura recente, foi detectado marrubiina em material fresco
de planta, juntamente com seu precursor pré-marrubiina. Estes dados apontam a
existência de marrubiina como um composto natural no interior do organismo vivo e
também como um produto final de uma via biossintética. A transformação de pré-
marrubiina em marrubiina é indicativo da instabilidade do precursor que tende a se
transformar numa forma furânica mais estável (POPOOLA et al., 2013).
A marrubiina é sabidamente um dos principais compostos ativos da M.
vulgare. De acordo com o SciFinder Scholar, existem aproximadamente 130 artigos
publicados recentemente sobre a marrubiina que abrangem os aspectos químicos e
biológicos associados ao composto (POPOOLA et al., 2013). É um composto estável
e mostra baixo catabolismo, uma característica economicamente relevante para
compostos terapêuticos (MEYRE-SILVA; CECHINEL-FILHO, 2010).
Estudos apontam diversas ações terapêuticas associadas à marrubiina, como
atividade antinociceptiva (JESUS et al., 2000), atividade cardioprotetora (EL BARDAI
et al., 2003a), atividade gastroprotetora (OLIVEIRA et al., 2011), antidiabética
(LAONIGRO et al., 1979), atividade antiespasmódica (HUSSAIN et al., 2011), dentre
outras.
O extrato metanólico da M. vulgare e o diterpeno marrubiina mostraram
atividade anti-úlcera, e esse efeito pode ser atribuído particularmente à marrubiina
isolada. Estudo conduzido por Oliveira e colaboradores (2011), sugere que a
gastroproteção apresentada pela M. vulgare e pela marrubiina está relacionada à
capacidade de estimulação da produção de muco, um importante fator
28
gastroprotetor, e na capacidade também de diminuição da secreção de suco
gástrico, importante fator de agressividade estomacal.
3.2.4 Estudos tecnológicos
Há relatos de estudos tecnológicos feitos com a Marrubium vulgare que
datam da década de 60. Pesquisadores europeus patentearam a produção de
extratos secos das folhas e/ou flores da M. vulgare a partir de soluções aquosas
obtidas por decocção por 6 horas à temperatura de 100 °C. Neste mesmo estudo
foram propostas formulações farmacêuticas em comprimidos revestidos que
continham o extrato seco por spray-drying da M. vulgare (POLLAK; MERCER;
TENCH, 1968).
As pesquisas tecnológicas, com a M. vulgare realizadas pelo NIQFAR,
tiveram início com Oliveira (2010), que fez o desenvolvimento de preparações
extrativas das partes aéreas da planta. Nesse estudo foi determinado que o metanol
e o álcool 70% são solventes eficazes na extração do marcador marrubiina. Foi
determinado também que o tempo de 5 dias, numa proporção planta:solvente de 5%
foram as melhores condições para o processo de maceração estática, no que se
refere ao teor de marrubiina.
De Souza (2012) realizou um estudo sobre o efeito da variação sazonal sobre
as características físico-químicas das partes aéreas da M. vulgare. Foi utilizado o
metanol como solvente extrativo por ser um solvente eficaz na extração de
marrubiina como demonstrado em estudos anteriores (MEYRE-SILVA, 2003;
OLIVEIRA, 2011). Nesse estudo foi possível constatar, através de cromatografia
gasosa, que o maior teor da marrubiina é encontrado nas folhas nas estações de
verão, outono e inverno, e nos caules o teor de marrubiina é maior no outono,
apontando a estação do outono como a mais favorável para a obtenção de
marrubiina em maior quantidade nas partes aéreas.
Casagrande (2012) realizou estudo de desenvolvimento de soluções
extrativas hidroetanólicas, com álcool 70%, a partir das partes aéreas da M. vulgare,
em processo de maceração a quente, com agitação, buscando a otimização, através
de planejamento multifatorial com três fatores, razão entre massa de planta e
solvente, temperatura e tempo de extração. Os resultados demonstraram a
viabilidade do álcool 70%, e maior teor de marrubiina utilizando-se a temperatura de
29
60 °C, sugerindo que a extração da marrubiina pode ser otimizada pelo aumento da
temperatura.
Em 2014, os estudos prosseguiram com o desenvolvimento tecnológico de
extratos secos por spray-drying das partes aéreas da M. vulgare, variando-se o
material de partida, de diferentes estações do ano, e a concentração do adjuvante
tecnológico dióxido de silício coloidal (30% e 50%), assim como a temperatura de
secagem (120 °C e 170 °C) (BUENO (2014). O melhor rendimento e teor de
marrubiina foi obtido com 30% de dióxido de silício coloidal à 120 °C, para a amostra
de outono. Porém, observou-se um decréscimo acentuado do teor de marrubiina em
relação às soluções extrativas de origem, motivando a continuidade das pesquisas,
por KRACHINSKI (2014), que iniciou os estudos de estabilidade dos extratos secos
em estufa a 30 e 40 °C, encontrando comportamento semelhante. Este mesmo
problema foi encontrado no estudo de estabilidade de 3 meses.
Estes resultados, ainda recentes, sobretudo da variação do teor de
marrubiina, incentivam a busca pelos fatores críticos do processo, como as
condições de extração, concentração e secagem. Dado a natureza química
complexa de todo extrato vegetal, em comparação aos fármacos puros, é
fundamental que a qualidade seja também monitorada, dando subsídios mais
consistentes para a padronização do extrato.
3.3 Úlcera
Entre as doenças que afetam o ser humano e provocam alterações em sua
vida individual e social está a úlcera péptica, afeção benigna que tem aumentando
com o desenvolvimento da civilização (VELOZ et al., 2012).
Úlcera é o termo genérico que se refere à perda proteção de qualquer parte
da superfície do corpo, e úlceras pépticas são aquelas que ocorrem em áreas do
sistema digestivo, mais especificamente na região do estômago ou duodeno.
Historicamente, apesar da descrição de sangramento do estômago, com sua
eliminação pela boca e pelas fezes, no papiro de Ebers e nos livros do legado de
Hipócrates, a expressão “ulkus pepticus” para definição de úlcera péptica foi usada
por Heinrich Irenãus Quincke somente em 1892. Contudo, o conhecimento da úlcera
gástrica como patologia já vinha de longo tempo, sendo seus sintomas descritos por
Bailie em 1793 e a distinção entre úlceras benignas e malignas relatadas com
30
precisão por Jean Curveilhier em 1829, motivo pelo qual as ulcerações gástricas
ainda são chamadas, na França, pelo epônimo de doença de Curveilhier (TONETO
et al., 2011).
Somente durante as últimas décadas do século passado ocorreram avanços
científicos que modificaram profundamente a compreensão e o melhor entendimento
da doença e possibilitaram seu tratamento de maneira adequada (TONETO et al.,
2011).
Não há dados precisos sobre os casos de úlcera no Brasil, mas estima-se a
incidência de úlcera péptica está entre 2-10/100.000 pessoas, o que a torna um
grande problema de saúde pública. Nos EUA, estima-se que aproximadamente
500.000 pessoas desenvolvam úlcera péptica a cada ano e que esta é uma
patologia preferencialmente adulta, já que 70% dos pacientes acometidos
encontram-se entre 25 e 65 anos (CASALI et al., 2012).
Por mais que os números da doença estejam anualmente abaixando, a úlcera
péptica ainda é responsável por aproximadamente um gasto de US$ 10 bilhões em
tratamentos de saúde no âmbito da saúde mundial, e já garantiu 3 prêmios nobels
em medicina a pesquisadores que ajudaram na elucidação dessa patologia
(TONETO et al., 2011).
As formas mais comuns de úlceras pépticas são as causadas pelo consumo
de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), pelo consumo de álcool e associadas
à infecção por Helicobacter pylori (VELOZ et al., 2012).
Nas últimas duas décadas, a úlcera péptica foi considerada uma doença
multifatorial. Pode-se dizer que provavelmente seja associada com uma pré-
disposição individual e como consequência de um desequilíbrio entre os fatores de
agressão e proteção da mucosa gastroduodenal. Úlceras duodenais são
desenvolvidas pela prevalência de agentes agressivos, enquanto que úlceras
gástricas são resultantes da falha nos fatores de proteção. Pesquisas
epidemiológicas apontam uma prevalência maior de úlceras duodenais do que
úlceras gástricas, numa proporção de 3:1, e são mais frequentes em homens
(ARAUJO et al., 2014).
Sob condições normais, a integridade da mucosa é mantida pelos
mecanismos de defesa, que incluem componentes pré-epiteliais, epiteliais e pós-
epiteliais. A barreira fosfolipídica de muco e bicarbonato constitui a primeira defesa
da mucosa gástrica, é o componente pré-epitelial. O componente epitelial consiste
31
de uma camada contínua de células epiteliais de superfície, ligadas por fortes
junções que formam a chamada barreira epitelial, essas células produzem e
secretam bicarbonato, muco, fosfolipídeos, peptídeos e prostaglandinas (PGs). A
integridade dessa camada de células é mantida pela renovação celular contínua,
que acontece pela proliferação de células progenitoras reguladas pela
prostaglandina E2, fatores de crescimento, proteínas anti-apoptóticas e proteínas
promotoras da mitose. O componente de defesa da mucosa pós-epitelial inclui o
fluxo de sangue contínuo através de micro vasos formados por células endoteliais,
nervos sensoriais que liberam calcitonina e regulam o fluxo sanguíneo para a
mucosa, geração de óxido nítrico e prostaglandinas (TARNAWSKI et al., 2014).
Vários agentes agressores já foram identificados como potenciais causadores
do desequilíbrio fisiológico levando à formação de lesões ulcerativas. Primeiramente
o stress pode desencadear um desequilíbrio em várias funções fisiológicas do trato
gastrointestinal, como secreção gástrica, motilidade, permeabilidade da mucosa,
sensibilidade visceral e alteração de fluxo sanguíneo (KONTUREK et al., 1998).
Além disso, maus hábitos alimentares também podem influenciar no aparecimento
de úlceras gástricas, bem como o tabagismo e o alcoolismo (BARROS et al., 2008;
KLEIN-JR et al., 2010).
Em 1994, o Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos reconheceu que
o Helicobacter pylori está diretamente envolvido no aparecimento de úlceras
pépticas, baseado no fato de que a maioria dessas úlceras estão associadas com a
presença desta bactéria, portanto, a erradicação desta bactéria leva à reduções
significativas da reinstalação da doença (ARAÚJO et al., 2014).
O H. pylori é uma bactéria gram-negativa que tem como habitat específico a
mucosa gástrica, contribuindo diretamente para a destruição de células gástricas
(FALCÃO et al., 2008; SIQUEIRA et al., 2007) e para um aumento na liberação de
suco gástrico (SHMUELY et al., 2012).
O constante esforço para a erradicação do H. pylori é um dos principais
motivos para um declínio nos números mundiais da úlcera péptica, porém essa
bactéria ainda apresenta uma taxa de prevalência de 40% em países desenvolvidos
e de 80% em países subdesenvolvidos (SOUZA et al., 2009).
A recorrências das úlceras pépticas é alta em pacientes infectados pela
bactéria, aproximadamente 13,4% ao ano, enquanto que em paciente submetidos à
terapia de erradicação do H. pylori a recorrência é baixa, aproximadamente 2,5% ao
32
ano. É válido afirmar que o tratamento para a erradicação do H. pylori significa a
cura da doença (ARAÚJO; BORINI; GUIMARÃES, 2014).
Outro fator que é alvo de vários estudos é a instauração de úlcera pelo uso de
anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) como por exemplo a aspirina e o
ibuprofeno (WALLACE, 2006). Estima-se que o risco de complicações
gastrointestinais associado ao consumo de AINEs seja 4 a 5 vezes superior ao da
população que não consome esses fármacos e ainda mais elevado em idosos e/ou
indivíduos com antecedentes de úlceras pépticas (COUTO et al., 2010).
Essa classe de medicamentos inibe a enzima ciclooxigenase do tipo 1 (COOX
1) e do tipo 2 (COOX 2), responsáveis pela produção de prostaglandinas (PGs)
atuando nos processos inflamatórios, porém, a inibição não é seletiva, pois ao inibir
a COOX 1 ocorre o comprometimento da homeostase gástrica levando ao
aparecimento de lesões quando o tratamento com AINES é de longa duração
(TAKEUCHI, 2012). Outros fatores também estão envolvidos no processo, como
ativação de neutrófilos, diminuição da produção de muco e produção de radicais
livres (SEO et al., 2012).
Fatores genéticos também podem atuar no aparecimento de lesões gástricas.
Polimorfismos específicos podem alterar níveis de secreção, diminuir as defesas
gástricas, assim como aumentar a suscetibilidade a vários agentes agressivos
facilitando a instauração da úlcera (FUMOTO et al., 2008).
O tratamento para as úlceras gastrointestinais é feito geralmente eliminando-
se a infecção por H. pylori e reduzindo ou inibindo a produção de suco gástrico,
responsável pela erosão da mucosa protetora do trato gastrointestinal (DAJANI;
KLAMUT, 2000; TYTGAT, 1998). É preciso reestabelecer o equilíbrio entre os
fatores agressivos e os fatores de defesa da mucosa, ou seja, proteção da mucosa
da ação do suco gástrico (AIHARA et al., 2003).
Os tratamentos dos problemas gástricos foram, por muito tempo, baseados
na supressão da secreção ácida fundamentados na afirmativa de Karl Schwarz em
1910 de “sem ácido, sem úlcera” (TONETO et al., 2011), e durante muitos séculos
eram utilizados antiácidos para neutralizar essa secreção, bem como restrições
alimentares e procedimentos cirúrgicos (YUHONG et al., 2006), porém hoje já se
sabe que os fatores envolvidos na defesa gástrica participam também do controle da
acidez, levantando um grande interesse nos mecanismos reguladores e cicatrizantes
do quadro ulcerativo (WALLACE, 2006).
33
Os fármacos utilizados no tratamento das úlceras pépticas agem por dois
mecanismos distintos. No primeiro mecanismo têm-se os medicamentos que inibem
ou neutralizam a secreção do ácido gástrico. Nesta classe de fármacos estão os
antagonistas de receptors H2 da histamina (cimetidina, ranitidina), que agem
diretamente sobre as células parietais, provocando uma diminuição na liberação da
secreção gástrica (YUHONG et al., 2006); os inibidores da bomba de prótons (H+-
K+)-ATPase (omeprazol, pantoprazol), que atuam inibindo a secreção de ácido
gástrico através da inativação da bomba, pela formação de ligações dissulfeto entre
as moléculas reagentes do omeprazol com a estrutura da bomba de prótons
(AIHARA et a., 2003).; e os antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de
magnésio, trissilicato de magnésio, bicarbonato de sódio).
No segundo mecanismo têm-se os medicamentos que agem como protetores
da mucosa, como o quelato de bismuto e o sucralfato (BRUNTON; LAZO; PARKER,
2006).
Vários efeitos colaterais causados pelo uso prolongado desses medicamentos
sintéticos têm sido relatados, além do mais, medicamentos anti-inflamatórios e anti-
ulcerogênicos são comumente usados para aliviar os sintomas da doença, sem
realmente tratar ou prevenir o processo inflamatório e ulcerogênico. Ainda não há
um tratamento que seja totalmente eficaz e que produza 100% de cura das úlceras
pépticas, e devido à grande incidência desses efeitos colaterais, estudos científicos
estão sendo direcionados para o descobrimento de novos fármacos derivados de
plantas medicinais, que podem apresentar bons resultados e uso seguro (SHU et al.,
2013).
3.4 Importância dos extratos secos na produção de fitoterápicos
Nas últimas décadas, a produção de fitoterápicos tem explorado novas
possibilidades tecnológicas para a obtenção de extratos secos. Isso decorre das
vantagens apresentadas pelos extratos secos quando comparados aos extratos
fluidos. Os extratos secos vegetais são muito mais adaptados às necessidades da
terapêutica moderna, devido à facilidade de padronização e manuseio, o que
contribui para a garantia da homogeneidade de preparações farmacêuticas (SILVA
et al., 2012; DA SILVA; COUTO; BRESOLIM, 2012).
34
Por definição, extratos secos são preparações sólidas, pulverulentas ou
granuladas obtidas por evaporação de extratos de plantas medicinais adicionadas
ou não de adjuvantes, apresentando o teor de substâncias ativas indicado na
respectiva monografia (BRASIL, 2010).
Na indústria, o extrato seco desperta grande interesse devido às suas
próprias características e da elevada capacidade de transformação em formas
farmacêuticas sólidas, visto que estas representam mais de 70% dos fitoterápicos
registrados no Brasil (CARVALHO; BALBINO; MACIEL, 2008). Dentre as suas
vantagens intrínsecas, destacam-se a sua estabilidade física, química e
microbiológica (SILVA et al., 2012), facilidade na administração (VASCONCELOS et
al., 2005), facilidade de padronização e maior concentração de compostos ativos
(OLIVEIRA; PETROVICK, 2010). Na indústria farmacêutica de fitoterápicos, o extrato
seco é aplicado na preparação de comprimidos, cápsulas, granulados, pomadas e
outras formas farmacêuticas, como produto intermediário.
Durante a preparação de extratos secos, a adição de adjuvantes à solução
extrativa melhora o rendimento e as características farmacotécnicas do pó obtido
durante a secagem, sendo a adição indispensável para a maioria dos produtos
desenvolvidos. Os adjuvantes devem caracterizar-se pela inércia química,
inocuidade e termo estabilidade (SILVA et al., 2012; DA SILVA; COUTO;
BRESOLIM, 2012).
O uso de adjuvantes tecnológicos influencia de maneira decisiva no aumento
do rendimento do processo de secagem, além de contribuir positivamente sobre a
recomposição em água do produto. Um dos adjuvantes tecnológicos mais utilizados
e citados na literatura é o dióxido de silício coloidal, conhecido também como
Aerosil® (VASCONCELOS et al., 2005). Apresenta elevada superfície específica e
alto poder sorvente, é uma sílica coloidal submicroscópica com tamanho de partícula
em torno de 15 nm. Esse pequeno tamanho de partícula e a grande superfície de
contato, fazem com que o dióxido de silício coloidal forneça boa propriedade de fluxo
aos pós (ROWE; SHESKEY; OWEN, 2006). Tem sido amplamente empregado,
apresentando excelentes resultados na obtenção de produtos secos a partir de
soluções extrativas de diferentes espécies (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
Vasconcelos e colaboradores (2005) realizaram um estudo no qual foi
avaliado a influência do dióxido de silício coloidal na obtenção de extratos secos por
aspersão da Schinus terebintifolius Raddi. O dióxido de silício coloidal (Aerosil®)
35
adicionado aos extratos proporcionou uma boa estabilidade física, mantendo o
aspecto de pó fino e solto além de conferir maior rendimento ao processo. Esta
estabilidade pode ser atribuída a uma possível microencapsulação das partículas do
pó pelo Aerosil®. Os extratos que tiveram adição do dióxido de silício coloidal foram
comparados com outros extratos adicionados do adjuvante de secagem kleptose® e
extratos sem adição de adjuvantes. Os extratos adicionados de kleptose®
apresentaram tendência à formação de aglomerados, enquanto que os extratos
produzidos sem adição de adjuvantes adquiriram forma semi-sólida e coloração
enegrecida após 24 horas de exposição à umidade relativa de 60 e 90%. Portanto o
extrato produzido com o Aerosil® foi o que apresentou melhores características
tecnológicas.
Além da seleção do adjuvante que será utilizado na produção dos extratos, a
escolha do método de secagem é de suma importância, e é motivada pela
potencialidade dos diferentes equipamentos secadores, pela qualidade do produto
final e pelo investimento que precisa ser baixo (DA SILVA; COUTO; BRESOLIM,
2012; SILVA et al., 2012).
Vários métodos de obtenção de extratos secos vegetais são utilizados na
indústria, que vão desde a estufa (oven drying), aos métodos mais sofisticados como
a secagem por aspersão (Spray drying), secagem em leito de jorro (Spouted bed
drying), secagem em cintos à vácuo (Vacuum Belt drying), liofização (Freeze drying),
secagem em leito fluidizado (Fluid bed drying), secagem em tambor (Drum drying),
fluído supercrítico (Supercritical fluid spray). Porém, a maioria das citações configura
o método de spray drying como o mais utilizado. Dentre as suas vantagens ressalta-
se a sua eficiência, rapidez e menor custo relativo (DA SILVA; COUTO; BRESOLIM,
2012).
3.5 Secagem por aspersão ou Spray drying
Um dos métodos de secagem amplamente utilizados é a técnica de secagem
por aspersão ou spray-drying. É uma técnica que tem se mostrado eficiente e tem
sido bastante empregada com o intuito de se obter produtos intermediários com
maior concentração de constituintes químicos e com melhores características
tecnológicas (VASCONCELOS et al., 2005). As primeiras descrições do uso de
36
secadores por atomização datam de 1860, com o primeiro desenho de aparelho
patenteado em 1872 (WESTERGAARD, 2004).
O desenvolvimento de equipamentos de secagem por spray-drying evoluiu ao
longo de várias décadas, desde 1870 até o início de 1900. A secagem por aspersão
passou a ser requisitada durante a segunda guerra mundial, pela necessidade de
reduzir o peso do transporte de alimentos e outros materiais. Esta técnica permite a
transformação de produtos de um estado líquido em forma de partículas secas por
pulverização em meio de secagem a quente. É um processo de secagem de
partículas contínuo, a alimentação do aparelho pode ser feita por uma solução,
suspensão, dispersão ou emulsão. O produto seco resultante pode estar na forma
de pós, grânulos ou aglomerados, dependendo das propriedades físico-químicas da
alimentação, propriedades do aparelho e as propriedades desejadas para o produto
final (PATEL; PATEL; SUTHAR, 2009; DA SILVA; COUTO; BRESOLIM, 2012).
O princípio da secagem por atomização é promover a mistura dentro de um
recipiente (câmara de secagem) entre um gás aquecido (ar) e uma massa fluida,
pulverizada em forma de gotículas com grande proporção de superfície, para
provocar pelo contato direto a evaporação do solvente (sobretudo água) de forma
rápida e uniforme (CARVALHO, 2012).
Embora seja uma tecnologia cara que necessita de altos investimentos em
instalações e operações, muitas são as razões pelas quais é amplamente utilizada.
Essas razões incluem a produção de materiais com propriedades físicas desejadas,
capacidade de processar diferentes tipos de matérias-primas e a flexibilidade da
operação. O tempo de residência do material no interior da câmara de secagem é
relativamente pequeno, o que torna esse equipamento adequado para a secagem
de produtos termo-sensíveis, como os extratos vegetais (DA SILVA; COUTO;
BRESOLIM, 2012).
O processo de secagem por aspersão consiste de cinco etapas principais:
1. Concentração: a matéria prima normalmente é concentrada antes de
entrar no secador;
2. Atomização: a etapa da atomização cria condições ótimas para a
evaporação do solvente, o que resulta num produto com as características
desejadas;
3. Contato da gota com o ar: na câmara de secagem o líquido atomizado é
colocado em contato com o ar quente, o que resulta na evaporação de
37
aproximadamente 95% do solvente contido nas gotículas, isso acontece
em questão de segundos;
4. Secagem da gota: a evaporação da umidade acontece em duas etapas.
Durante o primeiro estágio, existe umidade suficiente na gota para
substituir o liquido evaporado sob a superfície, e a evaporação acontece a
uma velocidade relativamente constante. A segunda fase inicia quando
não há umidade suficiente para manter condições saturadas na superfície
das gotículas, formando uma casca seca na superfície da partícula. A
evaporação então depende da difusão da umidade através da casca, que
está a aumentar em espessura;
5. Separação: ciclones, filtros e precipitadores eletrostáticos podem ser
utilizados no final do estágio da separação. Depuradores úmidos são
frequentemente utilizados para purificar e arrefecer o ar de modo que
possa ser liberado para o meio ambiente (PATEL; PATEL; SUTHAR,
2009).
Com a transferência de calor do ar aquecido às gotículas, o líquido da
superfície evapora-se rapidamente. As partículas solidificadas geralmente
apresentam o mesmo tamanho e forma da gotícula que a originou. Na última etapa,
o produto de secagem é transportado por uma corrente de ar sendo posteriormente
coletado (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
Os pós produzidos por spray-drying reúnem padrões elevados de qualidade
com respeito à granulometria do produto, umidade final, homogeneidade, densidade
e forma, sendo que estas características podem ser alteradas por modificações nos
parâmetros do processo. O pó obtido por esta tecnologia é particularmente
apreciado devido à alta fluidez, sendo que esta propriedade pode ser atribuída à
forma esférica das partículas obtidas (SILVA et al., 2012).
Uma vantagem do processo spray-drying é que a secagem ocorre em
condições assépticas, evitando possíveis contaminações durante o processamento,
podendo-se assumir que a contaminação bacteriana final procede essencialmente
da planta original ou após o processamento, pela manipulação humana (SILVA et
al., 2012).
O produto resultante do processo de secagem por aspersão pode sofrer
influência de alguns fatores relacionados às características do material de entrada e
do processamento. Essas variáveis devem ser controladas para que se obtenha um
38
produto com rendimento, teor de umidade adequado, estabilidade química,
minimização da aderência de partículas na câmara de secagem (sticking) e
características tecnológicas específicas (OLIVEIRA, PETROVICK, 2010).
Como fator relacionado às características do material de entrada, destaca-se
o uso de adjuvantes no processo de secagem por aspersão, o que é uma prática
muito comum. São utilizados como adjuvantes no processo o amido, ciclodextrinas,
dióxido de silício coloidal (Aerosil), fosfato tricálcico, gelatina, goma arábica, lactose,
maltodextrina entre outros (SILVA JÚNIOR et al., 2006; VASCONCELOS et al.,
2005). O uso adequado de adjuvantes no processo de spray-drying é fundamental
visto que determina a estabilidade e a qualidade do produto final. O dióxido de silício
coloidal tem sido amplamente empregado, apresentando excelentes resultados a
partir de soluções extrativas de diferentes espécies vegetais (OLIVEIRA;
PETROVICK, 2010).
Em relação a influência do processo, destaca-se a temperatura do ar de
entrada como sendo determinante na qualidade do produto final. O aumento na
temperatura do material de entrada facilita o processo de secagem, pois
normalmente reduz a tensão superficial e a viscosidade, facilitando a formação de
gotículas. A temperatura de entrada deve estar acima do ponto de ebulição do
solvente utilizado. Ainda que a temperatura de entrada possa ser consideravelmente
elevada, os sólidos em cada partícula nunca são aquecidos acima da temperatura
de saída. A umidade do produto final de secagem é determinada pela temperatura
de saída, que por sua vez é dependente da temperatura de entrada. A temperatura
do produto aspergido estará aproximadamente 20 C abaixo da temperatura de
saída. O melhor ajuste da temperatura de entrada e saída necessita ser
estabelecido para otimização das características físicas do produto (OLIVEIRA;
PETROVICK, 2010).
O processo de secagem é muito rápido (alguns segundos) o que permite um
alto rendimento. O aquecimento e a transferência de massa durante a secagem
ocorrem com filmes de ar e vapor ao redor das gotículas. A evaporação da água livre
nas partículas as refrigera, permitindo o uso de altas temperaturas do ar de
secagem, se afetar a qualidade do produto. Essa evaporação do vapor mantém a
partícula na temperatura de saturação. Como a partícula não se torna seca, a
evaporação continua acontecendo e a temperatura dos sólidos se aproxima da
39
temperatura de saída. Devido a isso, produtos sensíveis podem ser secos em
temperaturas relativamente altas (CARVALHO, 2012).
Existem no mercado vários tipos de secadores por aspersão, a escolha de
qual será usado no processo de secagem vai depender do material a ser seco e das
características pretendidas para o produto final.
Os aspersores são classificados em três tipos básicos: de pressão,
pneumáticos e de disco giratório, sendo os dois últimos os mais utilizados, e o
processo de secagem por aspersão apresenta diversas vantagens como (OLIVEIRA;
PETROVICK, 2010):
1. Seleção adequada do equipamento com base nas características
pretendidas para o produto final;
2. Controle da uniformidade e do tamanho das partículas e do produto pela
manipulação das variáveis do processo;
3. Processo contínuo, podendo ser alteradas as condições de operação sem
a necessidade de interrupção;
4. Rapidez e rendimento. A evaporação ocorre em frações de segundos, em
virtude da formação de inúmeras gotículas que proporcionam uma grande
área superficial para trocas térmicas e transferência de massa;
5. Baixa agressividade ao produto, o que a faz apropriada para produtos
termossensíveis devido ao curto tempo de contato com a fonte de calor,
podendo assim, ser empregada com sucesso na produção de produtos
intermediários para fitomedicamentos;
6. As partículas resultantes apresentam forma esférica uniforme e uma
rápida dissolução, devido à grande área específica;
7. Os custos do processo são baixos.
Devido a todas as vantagens anteriomente apresentadas, a técnica de
secagem por aspersão é uma excelente escolha para a indústria farmacêutica para a
produção de extratos secos derivados de soluções extrativas vegetais, entretanto, é
necessário determinar as condições do processo e da formulação que sejam mais
adequadas para a estabilidade e rendimento do processo (VASCONCELOS et al.,
2005; OLIVEIRA, PETROVICK, 2010)
40
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais, solventes e padrões químicos
Acetato de etila P.A.
Álcool Etílico 95% (Vetec®);
Clorofórmio P.A. (Vetec®)
Cromatoplacas de gel de sílica (Merck® GF254);
Diclorometano (Vetec®)
Dióxido de silício coloidal (Via Pharma®)
Hexano P.A. (Vetec®)
Indometacina (Sigma-Aldrich®)
Filtros de membrana de PTFE de 0,45 µm
Metanol P.A. (Vetec®)
Omeprazol suspensão 3 mg/mL (Drogaria Catarinense);
Ranitidina (Via Pharma®)
4.2 Equipamentos
Agitador magnético (Vertex®);
Agitador mecânico 713D (Fisatom®);
Analisador DSC/TG Netzsch STA 449 F3 (Júpiter®);
Balança analítica (Denver®);
Balança de secagem IV (Metler Toledo® HB13);
Câmara reveladora de UV (Dist® GRC-O3) dotada de lâmpadas GE® de
254/365 nm;
Cromatógrafo gasoso Shimadzu® modelo QP 2010S, com detector de
ionização de chama (CG/FID), coluna RTX-1;
Estufa com renovação e circulação de ar (Marconi® MA 037);
Evaporador rotativo (Fisatom®);
Evaporador rotativo (Tecnal® TE-211);
Microscópio Eletrônico de Varredura (Philips® XL30);
Mini Spray-Dryer (Buchi® 290);
42
Moinho de facas (Cemar®);
Moinho de martelos (Marconi® 600);
pHmetro (AJX-512 Micronal®);
Tamisador (Bertel®);
Tamises (2000, 1700, 1180, 600, 250, 150 µm);
Ultrasson (Q8-6/40A Eco-Sonics®).
4.3 Obtenção do marcador químico marrubiina
O padrão de marrubiina foi obtido por isolamento no laboratório de
Fitoquímica do NIQFAR, uma parte gentilmente cedido pela Profa. Dra. Christiane
Meyre da Silva Bittencourt, para os ensaios de cromatografia em camada delgada
(CCD), e suplementarmente, obtida no presente trabalho, para a sua utilização como
padrão para as análises por cromatografia gasosa (CG).
Para o isolamento, extratos hidroetanólicos e metanólicos das partes áereas
da M. vulgare foram reunidos, constituindo um pool de extrato, denominado de
extrato bruto alcoólico.
A purificação do extrato bruto se iniciou pelo processo de partição líquido-
líquido sob agitação com clorofórmio, obtendo a respectiva fração semi–purificada.
Essa fração foi, em seguida, submetida a cromatografia em coluna (CC) aberta
utilizando sílica gel como fase estacionária, eluída com uma mistura de
CHCl3:Metanol em gradiente crescente de concentração sendo cada sub-fração
obtida, agrupada de acordo com perfil determinado por cromatografia em camada
delgada (CCD) (CECHINEL FILHO et al., 1998). As sub-frações que apresentaram a
presença de marrubiina foram então agrupadas e recromatografadas com a mesma
fase estacionária, utilizando uma mistura de Hexano:Acetato de etila em gradiente,
rendendo o composto isolado em alguma de suas sub-frações.
Nas separações cromatográficas foi utilizado sílica gel-60 de granulometria
70-230 mesh (0,063-0,20 mm) e para as CCDs foram utilizadas cromatoplacas com
sílica. Todos os reagentes e solventes utilizados foram de grau analítico P.A.
As CCDs, após eluidas, foram visualizadas sob luz ultravioleta nos
comprimentos de onda de 250 e 366 nm, e em seguida submetidas a revelação por
vaporização com solução de anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento.
43
4.4 Obtenção da droga vegetal
As partes aéreas da M. vulgare utilizadas para produção das soluções
extrativas foram coletadas no município de Bom Retiro em Santa Catarina, Brasil, no
período de julho a setembro de 2013. Uma excicata encontra-se depositada no
Herbarium Flor sob número 4725, em Florianópolis – SC.
Após a colheita, o material vegetal foi tratado manualmente por meio da
seleção das partes aéreas, em folhas, caules e flores, eliminando-se o material
estranho. O material vegetal foi pesado para determinação do rendimento fresco,
distribuído em prateleiras na sala de secagem com temperatura e umidade
controladas até atingir teor de umidade inferior a 14% (BRASIL, 2010). Após esse
período a droga vegetal foi acondicionada em embalagens plásticas de polietileno
recobertas por papel pardo.
Após a secagem, foi determinado o rendimento em massa seca de cada parte
da droga vegetal, as quais foram submetidas ao processo de moagem grosseira em
moinho de facas. Nova moagem foi realizada em moinho de martelos com abertura
de malha de 3 mm, e padronizadas entre 0,150 e 2 mm.
4.4.1 Determinação da perda por dessecação
Exatamente 1,0 g da droga vegetal pulverizada, foi transferida e distribuída
uniformemente em prato de balança de infravermelho, e dessecada a 105 °C
(BRASIL, 2010). O ensaio foi realizado em triplicata, e o resultado foi expresso pela
média e desvio padrão relativo.
4.4.2 Análise granulométrica
A análise granulométria foi realizada para folhas e caules em separado. Cerca
de 25,0 g de folhas e caules, secos e moídos, foram submetidos à tamisação em
tamises com aberturas de malhas de diferentes tamanhos (0,150; 0,250; 0,600; 1,18;
1,7 e 2 mm). A tamisação foi realizada a 60 vibrações por segundo, durante 15
minutos. Em seguida as frações retidas nos tamises e no coletor foram pesadas. O
ensaio foi realizado em duplicata, a distribuição granulométrica foi representada
mediante um histograma, o tamanho médio de partículas foi calculado segundo a
44
equação 1 (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007). O resultado foi expresso pela média
e desvio padrão relativo.
1 Eq.
%100
%
FrAMdmédio
Equação 1
onde dmédio = diâmetro médio aritmético (mm); AM = abertura média de malha (mm)
e a Fr% = fração retida percentual em cada tamis.
4.5 Obtenção dos derivados extrativos
4.5.1 Soluções extrativas
As soluções extrativas da M. vulgare foram obtidas pelo método de
maceração dinâmica a frio, em agitador mecânico, fixando-se a velocidade de 600
rpm e o tempo de 8 horas, uma vez que não há registros anteriores de otimização
para esta técnica de extração.
A proporção droga:solvente utilizada foi de 5% (m/v) com proporção 1:1 entre
folhas e caules, conforme Oliveira (2011), variando-se apenas o tipo de solvente:
álcool 70% e metanol PA.
Ambos os extratos foram filtrados com auxílio de sistema à vácuo, usando
tecido Sontara com pressão manual, sobre o papel de filtro qualitativo (80 G). As
soluções extrativas foram obtidas em triplicata.
4.5.2 Extratos moles
As soluções extrativas foram concentradas em rota-evaporador à temperatura
de 50 C até um volume de aproximadamente 20%, a evaporação do restante do
solvente até consistência de extrato mole se deu em estufa de ar circulante com
temperatura aproximada de 40 C.
45
4.5.3 Extratos secos
Os extratos secos foram obtidos em aparelho de Mini Spray Dryer Buchi® 290,
mantendo-se fixa a pressão e o fluxo do ar comprimido em 5 mbar e 473 NL.h-1,
respectivamente, taxa de aspiração de 90%, e fluxo de alimentação em 4,0 mL/min.,
em sistema aberto. A temperatura de entrada foi fixada em 120 °C e a de saída em
aproximadamente 90 °C.
Foi planejado rendimento de 5,0 g de extrato seco, 70% desse rendimento foi
calculado em extrato mole, sendo o restante acrescentado do adjuvante de secagem
dióxido de silício coloidal. O teor de sólidos do fluido de secagem foi padronizado
para cerca de 10% (m/V). Assim, cada extrato seco foi obtido de 50 mL de fluido
preparado pela junção de extrato mole, dióxido de silício coloidal e água, mantendo-
se sob agitação durante todo o processo de secagem.
4.6 Caracterização dos derivados vegetais (soluções extrativas, extrato mole e
extratos secos)
4.6.1 Determinação do pH dos derivados extrativos
Para determinação do pH, o extrato mole e o extrato seco, foram pesados em
quantidade equivalente ao resíduo seco da solução extrativa correspondente, para
serem reconstituídos no solvente no qual foram obtidos. Para facilitar a dissolução,
foi usada agitação em banho de ultrassom por 15 min, para posterior leitura a 25 ºC
em potenciômetro calibrado com soluções tampão fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0,
respectivamente. O resultado foi calculado pela média de três determinações.
As soluções extrativas foram lidas diretamente em potenciômetro igualmente
ao procedimento de leitura realizado para os extratos mole e seco.
4.6.2 Determinação do resíduo seco dos derivados extrativos
Foram adicionados cerca de 2,0 g das soluções extrativas, ou 0,2 g do extrato
mole em cadinhos de porcelana previamente dessecados, e a seguir o solvente foi
evaporado em chapa de aquecimento. O cadinho contendo o resíduo foi dessecado
em estufa a 100 ºC ± 5 ºC por aproximadamente 2 horas e resfriado em dessecador
46
por aproximadamente 15 minutos. Após a primeira pesagem, os cadinhos contendo
os resíduos foram novamente levados à estufa por mais 30 minutos e pesados após
resfriamento em dessecador por aproximadamente 15 minutos. Este procedimento
foi repetido até massa constante. O resíduo seco foi calculado em relação a 100 g
da solução extrativa, pela média de três determinações, expresso em porcentagem
ponderal.
Para os extratos secos, cerca de 0,2 g foram pesados em cadinhos de
porcelana previamente dessecados e levados em estufa até peso constante.
4.6.3 Análises cromatográficas por CG para determinação do teor de
marrubiina
Inicialmente foram determinados os parâmetros de linearidade e precisão,
adequados à análise da marrubiina, para garantir que o método atendesse às
exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados,
conforme a RE n° 899/2003 (BRASIL, 2003).
Para verificar a linearidade do método foi construída uma curva de calibração
com o padrão do composto marrubiina previamente isolado conforme o item 4.3.
Foram realizadas diluições sucessivas de uma solução-mãe preparada a partir de
1,6 mg do padrão diluído em 1,6 mL de etanol 96 °GL, obtendo-se a concentração
de 1 mg/mL. A partir dessa solução foram realizadas diluições no intervalo de 1 a
0,004 mg/mL, em 5 níveis (4,0; 15; 62,5; 250 e 1000 µg/mL).
Cada nível foi injetado em triplicata, e através do software CGSolution foi
construído a curva analítica através da elaboração de um gráfico de área média do
pico versus concentração.
A precisão foi determinada através do método de repetibilidade (precisão
intra-corrida), no qual foram realizadas 6 determinações de uma solução da amostra
da marrubiina (concentração alvo).
A precisão foi expressa como desvio padrão relativo (DPR), abrangendo
valores menores que 5% (BRASIL, 2003).
As análises cromatográficas foram realizadas no Laboratório de
Instrumentação Analítica da UNIVALI pelo Prof. Msc. Theodoro Marcel Wagner, em
cromatógrafo gasoso Shimadzu modelo QP 2010S, com detector de ionização de
chama (CG/FID), usando coluna RTX-1 (100% de dimetilpolisiloxano) de 30 m de
47
comprimento, com 0,25 mm de diâmetro interno (ID) e 0,10 µm de espessura do
filme.
As condições de operação da análise cromatográfica foram: temperatura
inicial do forno 180 ºC, seguido de aquecimento 15 ºC /min até 300 ºC,
permanecendo por 2 min, seguido de 10 ºC /min até 310 ºC, permanecendo por 7
min; temperatura do injetor 300 ºC; gás de arraste hélio, com fluxo de 0,72 mL/min,
modo de injeção na forma de divisão de fluxo (Split 40:1). A temperatura do detector
foi de 300 ºC e o volume de injeção de 1 µL.
Foram submetidas a esta análise as soluções extrativas, extratos moles e
extratos secos, reconstituídos com os solventes de origem. As soluções extrativas
foram injetadas sem prévia diluição. Para a análise dos EM, cerca de 0,25 g foram
pesados e dissolvidos em 10 mL do solvente de origem. Esta solução foi diluída
numa razão 1:4 (250 µL da solução e 750 µL de solvente). Para a análise dos ES,
cerca de 0,1 g do extrato foram pesados e dispersos em 10 mL de seus solventes de
origem. Cerca de 1 mL dessa solução foi filtrada em membrana de PTFE de 0,45 µm
para a retirada do dióxido de silício colloidal.
As injeções foram realizadas em duplicata. O software do CG calcula o teor
de marrubiina em mg/mL, a partir da curva de calibração feita com o padrão de
marrubiina. Para o cálculo do teor nos extratos, a massa da amostra pesada foi
corrigida, descontando-se o teor de umidade e a porcentagem de adjuvante de
secagem. O teor de marrubiina foi expresso em mg de marrubiina por grama de
resíduo seco.
4.6.4 Análise do tamanho de partículas e morfologia dos extratos secos
As amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
em microscópio eletrônico de varredura Philips XL30, no Centro de Microscopia
Eletrônica da UFPR (Universidade Federal do Paraná).
Após tratamentos de secagem em dessecador a vácuo e presença de
pentóxido de fósforo, as amostras foram coladas com fita dupla face de carbono em
stubs, identificadas e revestidas com fina camada de ouro coloidal.
Foram analisadas as propriedades de morfologia, aglomeração e
homogeneidade de tamanho. A análise do tamanho foi realizada pelo software Size
Meter 1.1, foram utilizadas fotos em aumento de 2.500x para a medição.
48
sobre a imagem obtida por MEV. As medições do tamanho de partícula foram
realizadas pelo método do diâmetro de Feret, que compreende a distância entre as
duas tangentes traçadas nas extremidades da partícula e que são paralelas a uma
direção previamente fixada (PRISTA et al., 2003). Foram analisadas 150 partículas
de uma única lâmina, e os resultados foram representados pelo histograma de
distribuição granulométrica, e o diâmetro médio aritmético.
4.6.5 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Análise Termogravimétrica
(TG) dos extratos moles, extratos secos e adjuvante de secagem
O comportamento térmico dos derivados extrativos e do adjuvante de
secagem dióxido de silício coloidal foram determinados por calorimetria exploratória
diferencial (DSC) e análise termogravimétrica (TG). O ponto de fusão das amostras
foi determinado pelo pico endotérmico no DSC.
Aproximadamente 10 mg de cada amostra foi colocada em cadinho de
alumina e submetida a rampa de aquecimento de 20 a 500 °C, em uma taxa de
aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de nitrogênio
4.6.6 Estudo de estresse térmico do marcador marrubiina
A solução etanólica 90% a 320 µg/mL da marrubiina, com volume de 10 mL
foi colocada em balão volumétrico de 25 mL e submetida ao refluxo em banho de
óleo, controlando-se a temperatura a aproximadamente 65 ºC, por períodos de 0 h, 1
h, 4 h e 8 h. A cada tempo foram retiradas alíquotas de 1 mL, sem reposição de
volume e as amostras foram injetadas em triplicata em cromatógrafo gasoso,
conforme as condições descritas no item 4.6.1.
Este ensaio foi planejado levando-se em consideração as condições normais de
calor às quais o produto é submetido durante o processo de obtenção do extrato
mole em evaporador rotativo.
A extensão da degradação do marcador foi avaliada comparando-se a
concentração do pico referente a marrubiina na amostra submetida à degradação
nos diferentes tempos, com a solução da amostra não degradada, calculando-se o
percentual de degradação.
49
4.7 Avaliação da atividade gastroprotetora dos extratos
Foram utilizados ratos machos, pesando de 150 a 160 gramas, provindos do
Biotério Central da Univali. Os animais foram alojados em gaiolas plásticas e
permaneceram em sala com temperatura de 21 ± 1 °C com ciclo claro/escuro de
12/12 horas controlados, recebendo água e ração ad libtum. Doze horas anteriores
ao experimento, os animais foram mantidos em jejum, com livre acesso à água,
sendo adicionada à caixa uma grade para inibir a coprofagia. Todos os testes
foram realizados de acordo com as normas internacionais de cuidados com animais
de laboratório (NIH). O projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa
com Animais da Univali (CEUA) sob o número 026/13 (ANEXO A), para aprovação
dos testes farmacológicos. Somente após aprovação dos protocolos os
procedimentos experimentais foram iniciados
Neste estudo foram avaliados o efeito gastroprotetor dos extratos secos
obtidos das partes aéreas da M. vulgare na dose de 100 mg/kg. Esta dose foi
selecionada por já ter apresentado atividade gastroprotetora em experimentos
anteriores realizados por Oliveira (2011).
Para avaliar a atividade gastroprotetora dos extratos moles e secos da M.
vulgare foram utilizados modelos experimentais que mimetizam os distúrbios
gástricos em humanos, baseados em fatores etiológicos da doença no homem,
como por exemplo, o uso de bebidas alcoólicas, o uso de drogas anti-inflamatórias
não esteroidais (AINE´s) e o aumento do suco gástrico.
4.7.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol
O primeiro modelo que foi utilizado é o modelo de úlcera aguda induzida por
etanol, cuja metodologia foi descrita por Mizui e Doteuchi (1983). Este modelo serviu
como um modelo de triagem, isto é, os extratos secos que apresentaram atividade
farmacológica neste modelo de indução de úlcera, foram avaliados em outros
modelos, dando sequência aos experimentos.
Os animais foram submetidos inicialmente a jejum de doze horas, após esse
período foram divididos em diferentes grupos (n=5), pré-tratados por via oral com
omeprazol 30 mg/kg (controle positivo), veiculo (controle negativo), extrato mole
metanólico e etanólico da M. vulgare na concentração de 100 mg/Kg, extrato seco
50
metanólico e etanólico por spray-dryer da M. vulgare na concentração de 100 mg/kg
e o adjuvante farmacêutico Aerosil também na concentração de 100 mg/Kg.
Após uma hora e meia, foi administrado aos animais 0,5 mL de solução de
EtOH (agente lesivo) por via oral, e uma hora e meia após a administração do
agente lesivo, os animais foram sacrificados em câmera de CO2, em seguida, os
estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior, esticados em
placas de parafina, e através de scanner, as imagens foram captadas e analisadas
por software de análise de imagens EARP, a fim de se determinar o número e o
tamanho das lesões.
Posteriormente foi realizada a determinação da área total da lesão (mm2),
área relativa lesada (%) e porcentagem de inibição (PI) que foi determinada como:
PI = 100 – (ULI tratado x 100/ULIcontrole)
Os resultados foram expressos em quantidade total de área lesada (mm2),
quantidade relativa de área lesada (%) e porcentagem de inibição (%).
4.7.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteroidal
A metodologia utilizada foi a descrita por Rainsford (1980). Após doze horas
de jejum, os animais foram divididos em diferentes grupos (n=5), pré-tratados com
ranitidina 100 mg/Kg (controle positivo), veículo (controle negativo), extrato mole
metanólico e etanólico da M. vulgare na concentração de 100 mg/Kg, extrato seco
metanólico e etanólico por spray-dryer da M. vulgare na concentração de 100 mg/kg
e o adjuvante farmacêutico Aerosil também na concentração de 100 mg/Kg. Após
uma hora e meia da administração dos tratamentos, os animais receberam 100
mg/kg de indometacina (v.o.).
Passadas cinco horas após a administração da indometacina, os animais
foram sacrificados em câmera de CO2 e os estômagos retirados e abertos ao longo
da grande curvatura, esticados e através de scanner, as imagens foram captadas e
analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de se determinar o
número de o tamanho das lesões.
Posteriormente foi realizada a determinação da quantidade total de área
lesada (mm2), quantidade relativa da área lesada (%) e porcentagem de inibição (%),
conforme descrito anteriormente.
51
4.8 Análise estatística
Para a análise estatística dos resultados, foi utilizada a análise de variância
(ANOVA) e para comparação das médias dos grupos testados utilizou-se o pós-teste
de Dunnett, sendo os valores com p<0,05 considerados estatisticamente
significativos (SOKAL; ROHLF, 1995). Para comparação entre os grupos de extrato
mole e seco foi utilizado pós teste de Bonferroni, sendo os valores com p<0,05
considerados estatisticamente significativos.
52
53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Tratamento e caracterização da droga vegetal
As partes aéreas da M. vulgare foram coletadas no município de Bom Retiro,
mantidas em sala de secagem por aproximadamente 20 dias em condições de
temperatura e umidade controladas. Após a secagem, as partes aéreas foram
separadas e moídas. As folhas e caules moídos foram armazenados
separadamente, e padronizada neste trabalho à proporção de 1:1 para a extração.
Foi analisado o rendimento fresco, antes da secagem, e seco, após o
processo de secagem. Os valores estão expressos na tabela 1.
Tabela 1 - Rendimento e perda por secagem (PPS) das parte aéreas de M. vulgare (caules e folhas fresco e seco) da estação do inverno de 2013.
Data da Coleta
Parte da planta /
Estação
Massa
fresca (g)
Massa
seca (g)
Rendimento
(%)
PPS (%)
09/2013
Folha (Inverno)
311,03 225,5 72,5 27,5
Caule (Inverno)
181,08 130,2 71,9 28,1
A perda por secagem representa um dado útil para o planejamento e cálculos
de rendimento para o cultivo e tratamentos pós-colheita, sobretudo a secagem. Os
valores determinados na prática indicam que as partes aéreas desta espécie
apresentam teor de umidade elevado, em torno de 30%, o que é condizente com a
consistência macia das folhas (OLIVEIRA, 2011). Este padrão de comportamento é
vantajoso, pois permite que a planta seja seca como partes aéreas, sem
necessidade de separação entre caules e folhas, pois ambos apresentam o mesmo
comportamento.
Após a coleta, secagem e moagem, as folhas e caules também foram
caraterizados separadamente quanto ao tamanho de partícula. A distribuição
granulométrica está demonstrada na figura 9.
54
Figura 9 - Análise granulométrica das folhas e caules moídos de M. vulgare.
Pode-se verificar que aproximadamente 100% das folhas moídas em moinho
de martelos ficaram retidas no primeiro tamis, devido a formação de aglomerados de
partículas (Figura 10A). Este comportamento se deve à própria natureza das folhas
desta espécie vegetal, que ao serem moídas, se reduzem a fibras filamentosas que
se enovelam com facilidade, impedindo a passagem pelos tamises.
Figura 10 – Aspecto macroscópico das folhas (A) e caules (B) secos e moídos de M vulgare.
A B
Para os caules moídos foi possível a passagem pelos tamises, sendo que
aproximadamente 80% das partículas passaram pelo tamis de 1,18 mm e ficaram
retidas nos tamises acima de 0,25 mm (Figura 10B). O tamanho médio de partícula
calculado foi de 0,77 mm ± 0,39 mm (DPR = 3,06%).
55
A perda por dessecação para as folhas foi de 10,25% (DPR = 1,67%) e de
9,72% (DPR = 1,68%) para os caules, valores dentro do intervalo de 8 a 14%
preconizado para drogas vegetais (BRASIL, 2010), o que demonstra que os
tratamentos pós-colheita até a estabilização da planta em sala de secagem foram
efetivos.
5.2 Obtenção e caracterização físico-química dos derivados extrativos
Estudos anteriores demonstraram que o metanol P.A. e o etanol 70% são
solventes eficazes na extração da marrubiina, e que a razão droga:solvente de 5% é
utilizada para evitar a saturação do solvente (DE SOUZA, 2011; BUENO, 2014).
Além disso, o etanol 70 GL foi escolhido para a preparação dessas soluções por ser
um solvente mais viável do ponto de vista industrial, devido à menor toxicidade e à
maior facilidade de remoção. O metanol foi usado como solvente extrator como
padrão de comparação, já que em trabalho anterior realizado com a M. vulgare o
extrato mole metanólido já apresentou efeito gastroprotetor (OLIVEIRA, 2011).
Todas as soluções extrativas e extratos moles foram caracterizados quanto
ao pH, resíduo seco e análise cromatográfica por CG para determinação do teor do
marcador marrubiina.
O pH e o resíduo seco estão descritos na tabela 2. O pH é uma parâmetro
físico-químico importante para avaliar a estabilidade e a qualidade das preparações.
Os resultados de pH são característicos das substâncias extraídas pelo solvente
empregado e representam um indicativo para o acompanhamento das diferentes
etapas do processo. Assim como o pH, o resíduo seco é outro parâmetro de
controle, que também pode ser usado para o cálculo do teor de marcador. Pode-se
observar que os extratos moles apresentam quantidade de resíduo seco maior que
70%, o que condiz com o preconizado pela literatura (BRASIL, 2010). Por sua vez,
os valores de resíduo seco dos extratos secos ficaram dentro do limite preconizado
de no mínimo 95% de resíduo seco calculados como percentagem de massa
(BRASIL, 2010).
Quantos aos valores de pH, pode-se observar que os extratos moles
apresentaram pH mais baixo quando comparados às soluções extrativas e extratos
secos reconstituídos. Esse fato provavelmente tem relação com a concentração de
compostos ácidos presentes na amostra com a evaporação do solvente.
56
Tabela 2 - Valores de pH e Resíduo seco (RS) para os derivados extrativos das partes aéres de M. vulgare. Resultados representam a média e o desvio padrão relativo entre parênteses.
pH SE
RS SE
(%)
pH EM
RS EM
(%)
pH ES
RS ES
(%)
Etanol 70% 6,7
(1,64)
0,9463
(8,07)
4,42
(2,43)
77,67
(14,17)
6,8
(1,86)
96,19
(6,58)
Metanol PA 7,27
(2,15)
0,9669
(0,30)
4,76
(0,73)
78,67
(13,55)
7,3
(1,55)
96,41
(7,72)
SE = Solução extrativa. EM = Extrato mole. ES = Extrato seco.
5.2.1 Análise cromatográfica por cromatografia gasosa
Para o cálculo do teor de marrubiina, empregou-se o método previamente
desenvolvido no trabalho de Oliveira (2011) e comprovado no presente trabalho
segundo os parâmetros da linearidade e precisão.
5.2.1.1 Linearidade
A linearidade do método foi verificada através da curva de calibração
mostrada na figura 22. A curva de calibração da marrubiina foi obtida pela análise de
regressão linear cuja equação da reta pode ser representada por y = 300426,4x –
1339,132 com o coeficiente de correlação (r) de 0,999 e coeficiente de determinação
(r2) de 0,999.
As concentrações escolhidas para a elaboração da curva de calibração
seguiram um parâmetro logarítmico, aumentando assim a confiabilidade na equação
matemática da tendência da curva.
A concentração máxima escolhida foi 1 mg/mL, pois concentrações acima
desse valor saturam o detector de ionização de chama (FID). Os demais pontos
foram feitos de maneira seriada, ou seja, tomando-se o mesmo volume de cada
balão volumétrico para o balão seguinte, ocasionando menor erro entre os pontos.
Neste caso os pontos da curva de calibração ficam mais espaçados, tornando mais
evidente se há algum erro ou problema do detector, tanto em baixas quanto em altas
concentrações.
57
Nesta curva o fator de diluição entre o maior e o menor valor foi de 250 vezes,
mostrando em todo o intervalo de concentração uma linearidade excelente.
Figura 11 - Curva analítica da marrubiina (Área x concentração mg/mL).
O valor do coeficiente de correlação encontrado foi próximo de 1, indicando
que a metodologia apresentou um bom ajuste linear na faixa de concentração de 1 –
0,004 mg/mL.
5.2.1.2 Precisão
A precisão para o método foi determinada através de seis determinações de
uma solução da amostra do padrão de concentração conhecida (0,25 mg/mL),
injetadas nas mesmas condições e pelo mesmo analista. Essa concentração foi a
escolhida por ser um valor intermediário entre as concentrações escolhidas para a
obtenção da curva de calibração.
A partir dos resultados demonstrados na tabela 4, pode-se verificar que o
método foi preciso para a marrubiina, visto que o coeficiente de variação foi inferior a
1%, e de acordo com o preconizado pela RE n° 899 os valores de DPR não devem
ser superiores a 5% (BRASIL, 2003).
58
Tabela 3 - Determinação da variação da quantificação da marrubiina em solução etanólica 96% no ensaio de repetibilidade.
Réplicas Marrubiina (mg/mL)
1 0,22124
2 0,22114
3 0,22075
4 0,22343
5 0,22375
6 0,22181
Média 0,22202
DPR (%) 0,57
5.2.1.3 Análises cromatográficas dos derivados extrativos
Os teores de marrubiina das soluções extrativas, extratos moles e extratos
secos estão descritos na tabela 4.
Tabela 4 - Teor de marrubiina (mg/g) nas soluções extrativas, extratos moles e extratos secos de M. vulgare (5% de droga vegetal, etanol 70% (v/v) e metanol P.A.). Resultados representam a média e o desvio padrão relativo entre parênteses.
TM SE
(mg/g)
TM EM
(mg/g)
TM ES
(mg/g)
Etanol 70 °GL 6,74
(10,23)
0,03
(10,16)
0,04
(6,64)
Metanol PA 9,61
(9,91)
0,19
(3,03)
0,14
(2,21)
TM = Teor de marrubiina. SE = solução extrativa. EM = extrato mole. ES =extrato seco.
Quanto ao teor de marrubiina, houve uma acentuada diminuição nos extratos
moles quando comparados com as soluções extrativas, o que sugere uma
instabilidade do marcador frente às condições do processo.
Segundo Popoola e colaboradores (2013), a marrubiina possui alta
estabilidade e pouco catabolismo. No entanto, no processo de obtenção do extrato
mole, em evaporador rotativo à vácuo, utiliza-se temperatura em torno de 50 °C por
aproximadamente 4 hs. Após a evaporação à vácuo, o processo é continuado em
59
estufa de ar circulante a aproximadamente 40 °C até consistência pastosa,
característico de extrato mole. Acredita-se que este tempo prolongado de exposição
ao calor, nestas temperaturas, somado à exposição ao ar, seja o fator determinante
para a degradação do marcador.
O teor de marrubiina nos extratos secos se manteve em relação aos extratos
moles, provavelmente devido ao fato do tempo de permanência no interior da
câmara de secagem ser relativamente pequeno, o que torna o processo de secagem
em spray-dryer um processo seguro e adequado para a secagem de produtos termo-
sensíveis como os extratos vegetais (SILVA et al., 2012)
Através da figura 12, onde tem-se a sobreposição dos cromatogramas obtidos
pelas análises do CG para os extratos etanólicos (SE, EM e ES), pode-se observar a
presença da marrubiina em todos os derivados extrativos, mais evidente na SE.
Figura 12 - Perfis cromatográficos dos derivados etanólicos de M. vulgare obtidos por cromatografia gasosa.
Para os extratos metanólicos (SE, EM e ES), a sobreposição dos
cromatogramas está representada na figura 13. Igualmente, pode-se observar o
aparecimento da marrubiina em todos os derivados extrativos, mais evidente na SE.
60
Figura 13 - Perfis cromatográficos dos derivados metanólicos da M. vulgare obtidos por cromatografia gasosa.
5.3 Análise do tamanho de partículas e morfologia dos extratos secos
O objetivo dessa análise foi verificar a influência do solvente na morfologia,
aglomeração e homogeneidade de tamanho das partículas. As figuras 14, 15 e 16
ilustram as fotomicroscopias e as figuras 17 e 18 representam as respectivas
distribuições de tamanho.
Figura 14 - Microscopia eletrônica de varredura dos extratos secos metanólico (A) e etanólico 70 °GL (B) em aumento de 2.500x.
A B
61
O tamanho médio de partícula dos extratos foi de 2,39 µm e 2,41 µm, porém
com ampla distribuição (Fig. 16), de 0,1 a 10,0 µm, conforme mostram os gráficos de
distribuição de tamanho (Fig. 17 e Fig. 18). A forma esférica (Fig. 15) é característica
do processo de secagem em spray-dryer (TONON; BRABET; HUBINGER, 2009).
Não foi constatada a influência do solvente na aglomeração das partículas.
Figura 15 - Microscopia eletrônica de varredura dos extratos secos metanólico (A) e etanólico 70 °GL (B) em aumento de 10.000x.
A B
Para visualização da superfície foi utilizada foto em aumento de 1.000x
conforme mostra a figura 16.
Figura 16 - Microscopia eletrônica de varredura dos extratos secos metanólico (A) e etanólico 70 °GL (B) em aumento de 1.000x.
A B
62
Figura 17 - Gráfico de distribuição de tamanho de partícula do extrato seco metanólico.
Figura 18 - Gráfico de distribuição de tamanho de partícula do extrato seco etanólico 70%.
5.4 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Análise Termogravimétrica
(TG) dos extratos moles, extratos secos e adjuvante de secagem dióxido de
silício coloidal
A calorimetria exploratória diferencial ou DSC (Differential scanning
calorimetry), é uma técnica pela qual se mede a diferença de energia fornecida à
63
uma substância enquanto essa substância é submetida a uma programação
controlada de temperatura (STORPIRTIS et al., 2009). A termogravimetria é uma
técnica termoanalítica na qual a verificação da massa da amostra (perda ou ganho)
é determinada em função da temperatura e/ou tempo. Esta técnica permite conhecer
as alterações que o aquecimento pode provocar na massa de materiais,
determinando sua estabilidade térmica, e também acompanhando reações de
desidratação, oxidação, combustão entre outros (STORPIRTIS et al., 2009).
Foram analisados os extratos moles e os extratos secos adicionados do
adjuvante de secagem dióxido de silício coloidal.
Na curva DSC do aerosil nota-se um evento endotérmico entre 100 °C a 150
°C, com máximo em torno de 131,5 °C. Não houve nenhum evento de cristalização
da amostra e a curva do TG mostrou uma massa residual em torno de 97%,
demonstrando assim a estabilidade térmica dessa matéria prima.
Figura 19 - Perfil de análise de DSC e TG para o adjuvante de secagem dióxido de silício coloidal.
O perfil da curva DSC para o extrato mole etanólico apresenta um evento
endotérmico entre 125°C e 150 °C, com máximo em torno de 140,5 °C, relacionado
provavelmente à fusão ou desidratação da amostra, e um pico exotérmico, na faixa
de 300 °C a 325 °C, relacionado provavelmente à degradação. Através da curva do
TG pode-se observar uma perda de massa em torno de 70% (Figura 20A).
Após o processo de secagem, com a adição do dióxido de silício coloidal,
houve um deslocamento da faixa de fusão, demonstrando assim na curva DSC um
evento endotérmico em torno de 75 °C a 100 °C, com máximo de 90 °C. O pico
64
exotérmico se manteve na mesma faixa de cristalização do extrato mole (Figura
20B). A curva do TG mostrou uma perda de massa de aproximadamente 55%,
sugerindo que houve interação entre a amostra de extrato e o excipiente adicionado.
Figura 20 - Curvas DSC e TG para o extrato mole (A) etanólico e extrato seco (B) etanólico de M. vulgare. Faixa de temperatura: 25-500°C. Atm N, 10°C/min.
A
B
Para o extrato mole metanólico, o perfil da curva DSC mostrou um evento
endotérmico na faixa de 125 °C a 150 °C com máximo de 129,5 °C, provavelmente
relacionado à fusão ou desidratação da amostra, e um evento exotérmico na faixa
de 350 °C a 375 °C, provavelmente relacionado à degradação. Houve perda de
massa em torno de 65% (Figura 21A). Com a adição do adjuvante de secagem, a
faixa de fusão foi deslocada para 75 °C a 100 °C, com máximo de 93 °C. A curva de
65
TG demonstrou uma perda de massa em torno de 55%, sugerindo interação entre a
amostra de extrato e o excipiente adicionado (Figura 21B).
Figura 21 - Curvas DSC e TG para o extrato mole (a) metanólico e extrato seco (b) metanólico de M. vulgare. Faixa de temperatura: 25-500°C. Atm N, 10°C/min.
A
B
5.5 Estudo do estresse térmico do marcador marrubiina
A estabilidade dos produtos farmacêuticos depende de fatores ambientais
como temperatura, umidade, luz e de outros fatores relacionados ao próprio produto,
como propriedades físicas e químicas, de substâncias ativas e excipientes
farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e
propriedades dos materiais de embalagem (BRASIL, 2005).
66
Com a finalidade de garantir a integridade química, física, microbiológica,
terapêutica e toxicológica do fármaco e da forma farmacêutica dentro dos limites
especificados, sob influência dos fatores ambientais em função do tempo, são
preconizados estudos de estabilidade (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007; LUCAS
et al., 2004; MATTHEWS, 1999).
A realização de testes de estresse, assim como a identificação e
quantificação dos produtos de degradação é de extrema importância para as
indústrias farmacêuticas, e a estabilidade térmica é um dos parâmetros mais simples
de determinar.
Os resultados encontrados para a concentração inicial e após 8 hs de
estresse térmico estão descrito na tabela 5.
Tabela 5 - Determinação da concentração de marrubiina em solução etanólica 96% antes e após ensaio de estabilidade térmica (T = 50 °C) por 8 horas.
Tempo (h) Marrubiina (mg/mL)
0 0,324
(0,99)
1 0,335
(0,84)
4 0,361
(0,19)
8 0,365
(0,02)
Média 0,346
DPR (%) 0,51
Os perfis cromatográficos dos diferentes tempos de estresse térmico (Fig. 22)
mostraram-se semelhantes, assim pôde-se observar visualmente que não houve
degradação da marrubiina após 8 hs de estresse, confirmando assim a estabilidade
do composto isolado (POPOOLA et al., 2013).
67
Figura 22 - Perfis cromatográficos por CG da solução de marrubiina após estresse térmico de 8 horas.
Análises anteriores demonstraram que o teor de marrubiina diminui quando as
soluções extrativas são submetidas ao processo de evaporação rotativo com o
emprego de temperatura de aproximadamente 60 °C e pressão negativa, mas se
mantém constante durante o processo de secagem por spray-dryer. Sendo assim,
estudos mais aprofundados de estabilidade do composto e dos derivados extrativos
se fazem necessários.
Os fitoterápicos atuam por mecanismos diversos, que estão atrelados à
complexidade química da matriz vegetal. Este estudo demonstrou até aqui, que a
matriz sofreu alterações importantes no teor do marcador escolhido ao longo das
etapas de transformação física (de solução extrativa, para extrato mole até o extrato
seco). Neste estudo, a obtenção dos extratos foi viável, pelo rendimento dos
produtos em massa, porém, com uma drástica redução da marrubiina evidenciando
como etapa crítica a obtenção do extrato mole. Esta redução independe do solvente
usado para a extração, e mostra se dependente das condições do processo,
possivelmente a temperatura, o tempo e o oxigênio.
A partir dos resultados demonstrados pelos estudos tecnológicos, cabe
investigar se o produto mantém sua atividade biológica, mesmo tendo sofrido
alterações químicas no processo, ou seja, a hipótese a ser avaliada é a relação
entre o teor de marrubiina, usado como indicador da estabilidade do processo, com
a atividade gastroprotetora.
68
5.6 Avaliação da atividade gastroprotetora dos extratos
A atividade gastroprotetora dos extratos mole e seco etanólico 70 °GL e
metanólico, foi inicialmente avaliada nos modelos de indução de úlceras agudas por
etanol, o qual é considerado um agente necrosante, e por AINE, a indometacina,
que inibe a proteção normal do estômago pela diminuição de síntese de
prostaglandinas constitutivas, relacionadas com processos de homeostase.
Apesar de não representarem integralmente a patologia humana, esses dois
modelos são clássicos no screening para o estudo de fármacos com atividade
gastroprotetora.
O modelo de indução de úlcera por etanol apresenta dois papeis importantes:
primeiro, ele indica a ação gastroprotetora dos extratos frente a um agente
extremamente lesivo, e segundo, serve de triagem para a realização de novos testes
de comprovação e de mecanismo de ação (ARRUDA et al., 2008).
O etanol é uma substância tóxica e ao ser utilizado em modelos
experimentais produz dano na mucosa gástrica, pois é capaz de alcançar o epitélio
da mucosa através do rompimento da barreira muco-bicarbonato. Suas ações
celulares refletem em ruptura da parede dos vasos sanguíneos, provocando assim,
lesões hemorrágicas resultantes de danos oxidativos das células do epitélio gástrico.
Estes danos levam à constrição de veias e artérias da mucosa gástrica, produzindo
congestão, inflamação e lesão tecidual. Provavelmente estes efeitos ocorrem devido
às ações de lipoperoxidação, formação de espécies reativas de oxigênio, estresse
oxidativo intracelular, alterações na permeabilidade e despolarização da membrana
mitocondrial que culminam na morte celular das células do epitélio gástrico
(HIRUMA-LIMA, 2009; REPETTO; LLESUY, 2002).
Neste modelo, conforme mostra a tabela 6, pode-se observar que o
tratamento com o fármaco omeprazol (30 mg/kg) e com os extratos (moles e secos)
metanólico e etanólico 70 °GL (100 mg/kg) reduziram significativamente a área total
da lesão e porcentagem de área lesada quando comparados ao grupo controle. O
grupo tratado com o adjuvante de secagem dióxido de silício coloidal não
apresentou redução significativa da área total da lesão e porcentagem de área
lesada, resultado já esperado, já que o dióxido de silício coloidal é um adjuvante
tecnológico que não possui ação farmacológica (VASCONCELOS et al., 2005).
69
A análise comparativa ANOVA e o teste de Bonferroni mostraram que houve
diferença estatística somente entre os grupos tratados com o extrato mole e seco
etanólicos, no que se refere à área total de lesão. O grupo tratado com o extrato
seco teve uma maior diminuição da área total de lesão quando comparado com o
grupo tratado com o extrato mole. Quanto às porcentagens de área lesada e de
inibição esses grupos não são diferentes entre si, demonstrando que tanto o
processo de secagem quanto os diferentes solventes não influenciaram na atividade
farmacológica.
Tabela 6 - Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/Kg) e dos diferentes extratos metanólico e etanólico 70% das partes aéreas de M. vulgare em úlceras agudas induzidas por etanol em ratos.
Tratamento Dose
(mg/kg) Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão (%)
% de inibição
Controle Veículo 91,22 ± 6,88 16,06 ± 3,39 0,0
EM MetOH 100 22,63 ± 8,63*** 7,29 ± 1,29*** 75,19 ± 9,46*
EM EtOH 100 35,64 ± 4,98*** 5,36 ± 0,86*** 60,93 ± 5,46**
ES MetOH 100 32,64 ± 5,76*** 6,12 ± 0,91*** 64,22 ± 6,32**
ES EtOH 100 16,46 ± 3,51***; # 3,25 ± 0,61*** 73,32 ± 6,44*
Aerosil® 100 71,60 ± 4,54* 10,10 ± 0,49* 18,94 ± 4,81**
Omeprazol 30 0,00 ± 0,00*** 0,00 ± 0,00*** 100,0 ± 0,00
Diferença significativa (***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05), ANOVA. Teste a posteriori de Dunnet (*).
Diferença significativa (#p<0,05), ANOVA. Teste a posteriori de Bonferroni (
#).
Comparando os grupos quanto à porcentagem de inibição (Fig. 23), todos os
grupos foram estatisticamente diferentes do grupo tratado com o fármaco omeprazol
que teve 100% de inibição de úlceras. Pode-se observar que apesar de serem
estatisticamente diferentes do fármaco controle omeprazol, os extratos tiveram uma
porcentagem de inibição relativamente alta, variando de 60% a 75%, no entanto,
continuam não sendo tão efetivos quanto o fármaco, que é amplamente utilizado na
clínica.
No modelo de úlcera aguda induzida por etanol, as lesões ulcerativas são
decorrentes da ação necrosante do etanol sobre a mucosa gástrica, com menor
participação da secreção ácida, sendo de etiologia bastante ampla e complexa,
envolvendo a depleção dos fatores protetores (muco e bicarbonato por exemplo) e
aumentando os fatores agressores (ácido clorídrico, por exemplo) (REPETTO;
LLESUY, 2002; VAZQUEZ-RAMIREZ et al., 2006).
70
Figura 23 - Porcentagem de inibição obtida pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/Kg) e dos diferentes extratos moles e secos das partes aéreas de M. vulgare (100 mg/Kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol em ratos.
Posi
tivo
EM
etO
H
EM
meO
H
ES e
tOH
ES m
eOH
Aer
osil
0
50
100
150
Omeprazol EM EtOH EM MeOH ES EtOH ES MeOH Aerosil
**
** **
* *
Po
rce
nta
ge
m d
e in
ibiç
ão
(%
)
Diferença significativa em relação ao grupo controle omeprazol (**p<0,01, *p<0,05), ANOVA, teste a posteriori de Dunnet (*).
Na figura 24 estão representados os cortes dos estômagos e suas
características macroscópicas.
Figura 24 - Imagens dos estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos, utilizando tratamento com os extratos moles e secos de M. vulgare a 100 mg/Kg, aerosil e o fármaco omeprazol.
Outro modelo de triagem utilizado para a avaliação do potencial gastroprotetor
é o de indução de úlceras gástricas por AINEs. Os AINEs são frequentemente
utilizados para o tratamento de processos inflamatórios de diversas origens. Sua
maior limitação de uso está relacionada ao fato de produzirem reações adversas no
trato gastrointestinal, que incluem a formação de lesões gástricas, a potencialização
da resposta ulcerogênica ao estresse e o comprometimento da cicatrização das
úlceras gástricas (TAKEUCHI, 2012).
71
A indometacina e outros AINEs atuam inibindo a síntese das PGs
constitutivas, e consequentemente, diminuindo os mecanismos de citoproteção da
mucosa gástrica mediadas por estas (SULEYMAN et al., 2010). Os AINEs não
seletivos como a aspirina, a indometacina e outros, provocam danos na mucosa
gástrica por mais de uma via, ao inibirem COX-1 reduzem o fluxo sanguíneo e
produção de PGs, ao inibirem COX-2 aumentam a aderência de leucócitos no
endotélio vascular e por uma ação tópica direta causam irritação da mucosa
(WALLACE, 2006).
As PGs são responsáveis pela secreção de muco e bicarbonato na mucosa
gástrica, sua diminuição acarreta em perda da proteção e redução do fluxo
sanguíneo local, o que dificulta a cicatrização (MALFERTHEINER; CHAN; Mc COLL,
2009). A diminuição dos fatores de proteção da mucosa diminui a capacidade do
estômago de resistir aos agentes agressores (TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
A atividade gastroprotetora dos extratos moles e secos (etanólico 70 °GL e
metanólico) foi avaliada no modelo de úlcera induzida por AINE (indometacina).
Neste modelo observou-se que os tratamentos com os extratos moles e a
ranitidina reduziram significativamente a área total da lesão e a porcentagem da área
lesada em comparação ao grupo controle (Tab. 7), enquanto que o grupo tratado
com o adjuvante de secagem causou um aumento significativo desses parâmetros.
Ainda não se sabe o motivo do aumento das lesões, mas, acredita-se que o dióxido
de silício, sendo uma sílica, portanto com características abrasivas, aliado ao fato do
modelo de indução de úlcera por indometacina proporcionar um contato maior com a
mucosa gástrica do animal, o peristaltismo favoreceu o atrito da sílica com a
mucosa, causando um efeito abrasivo, proporcionando um processo inflamatório, o
que levou a um aumento da lesão.
Em estudo realizado por Martins e colaboradores (2003), o dióxido de silício
coloidal demonstrou ser capaz de reduzir a área de lesão em modelo de indução de
úlcera por indometacina em ratos, resultado esse que não condiz com o encontrado
neste trabalho.
Os demais grupos tratados com os extratos secos não apresentaram valores
significativos de diminuição de área total de lesão e porcentagem de área lesada.
Provavelmente, a presença do adjuvante de secagem dióxido de silício coloidal,
tenha interferido negativamente na eficácia desses extratos.
72
Foi feito análise comparativa ANOVA com teste a posteriori de Bonferroni,
para verificar se houve diferença estatística entre os grupos de tratamento com os
extratos moles (antes do processo de secagem) e extratos secos (após o processo
de secagem). Pôde-se verificar que houve diferença estatística entre os grupos
tratados com os extratos secos em comparação com os grupos tratados com os
extratos moles no que se refere à área total de lesão, porcentagem de área lesada e
porcentagem de inibição. Para esses grupos, o processo de secagem teve
influência, pois os extratos secos não foram eficazes em diminuir a área de lesão e
porcentagem de área lesada, efeito causado provavelmente devido à presença do
adjuvante de secagem aerosil, que também demonstrou aumentar a área total de
lesão e porcentagem de área lesada quando testado separadamente.
Tabela 7 - Efeitos da administração oral de ranitidina (100 mg/Kg) e dos diferentes extratos (moles e secos) metanólico e etanólico 70% das partes aéreas de M. vulgare em úlceras agudas induzidas por AINEs em ratos.
Tratamentos Dose
(mg/kg) Área total de lesão (mm2)
% de área lesada
% de inibição
Controle Veículo 17,18 ± 0,63 2,36 ± 0,33 -
EM MetOH 100 2,62 ± 0,69*** 0,48 ± 0,09** 84,04 ± 4,23
EM EtOH 100 4,18 ± 1,13** 0,54 ± 0,14** 74,49 ± 6,88
ES MetOH 100 19,68 ± 4,91### 1,37 ± 0,35## -2,73 ± 28,81*; ##
ES EtOH 100 21,80 ± 1,57### 3,63 ± 0,41### -32,77 ± 9,59***; ###
Aerosil® 100 36,46 ± 4,11*** 4,83 ± 0,52*** -122,1 ± 25,01***
Ranitidina 100 3,75 ± 1,65** 0,34 ± 0,14*** 77,12 ± 10,04
Diferença significativa (***p<0,001, **p<0,01), ANOVA. Teste a posteriori de Dunnet (*). Diferença
significativa (###
p<0,001, ##
p<0,01) ANOVA. Teste a posteriori de Bonferroni (#).
Quanto à porcentagem de inibição (Fig. 25), apenas os extratos moles foram
eficazes quando comparados ao grupo tratado com o fármaco ranitidina,
demonstrando que nesse modelo de indução de úlcera, a presença do adjuvante
farmacêutico dióxido de silício coloidal parece ter sido fator determinante para a não
manutenção da atividade farmacológica dos extratos após o processo de secagem.
73
Figura 25 - Porcentagem de inibição obtida pelo efeito da administração oral de ranitidina (100 mg/Kg) e dos diferentes extratos moles e secos das partes aéreas de M. vulgare (100 mg/Kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em ratos.
Posi
tivo
EM
etO
H
EM
meO
H
ES e
tOH
ES m
eOH
Aer
osil
-160
-40
80
ES MeOH
Ranitidina EM EtOH EM MeOH
ES EtOH Aerosil
***
***
*
#####
Po
rce
nta
ge
m d
e in
ibiç
ão
(%
)
Diferença significativa em relação ao grupo controle ranitidina (***p<0,001, *p<0,05), ANOVA, teste a posteriori de Dunnet (*). Diferença significativa (
###p<0,001,
##p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de
Bonferroni (#).
Através das imagens dos estômagos demostrada na figura 26, pode-se
observar visivelmente o aumento das lesões ulcerativas nos estômagos tratados
com os extratos secos e com o Aerosil em comparação com os estômagos tratados
com os extratos moles, reforçando a hipótese da influência do adjuvante de
secagem nesse processo de aumento das lesões.
Figura 26 - Imagens dos estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos, utilizando tratamento com os extratos moles e secos de M. vulgare a 100 mg/Kg, aerosil e o fármaco ranitidina.
74
Levando-se em consideração que o adjuvante tecnológico dióxido de silício
coloidal é uma matéria prima amplamente utilizada e citada na literatura para a
produção de extratos secos (VASCONCELOS et al., 2005), os resultados
farmacológicos preliminares obtidos, apontam para a utilização de outros adjuvantes
de secagem para a obtenção dos extratos secos de M. vulgare.
75
6 CONCLUSÕES
1. Não houve diferenças significativas nos resultados encontrados quanto ao
tratamento e caracterização da droga vegetal para caules e folhas de M.
vulgare.
2. A presença da marrubiina pôde ser verificada em todos os derivados
extrativos (SE, EM e ES) por cromatografia gasosa (CG), no entanto houve
drástica redução no teor do marcador após a etapa de concentração até a
obtenção do EM para ambos os solventes, demonstrando problemas de
estabilidade durante a secagem com o aporte de calor por tempo prolongado.
3. A secagem por spray dryer não alterou o teor de marrubiina se comparado ao
extrato mole.
4. A secagem por spray dryer se mostrou um método eficaz para a secagem de
extratos vegetais visto o rendimento satisfatório dos extratos e a recuperação
do marcador.
5. A cromatografia gasosa se mostrou um método confiável para a análise do
teor de marrubiina.
6. O teste de estresse térmico demonstrou que, a princípio, a marrubiina é um
composto estável, sugerindo que novos testes sejam realizados para a
determinação da estabilidade dos derivados extrativos e do composto isolado.
7. O teor de marrubiina parece não ter sido fator determinante na atividade
farmacológica, já que ambos os extratos metanólico e etanólico,
apresentaram valores muito próximos.
8. No modelo de úlcera induzida por etanol, todos os extratos testados
apresentaram diminuição da área total de lesão e porcentagem de área
lesada, no entanto não foram tão eficazes quanto à porcentagem de inibição.
76
9. No modelo de úlcera induzida por AINEs, apenas os extratos moles
apresentaram diminuição da área total de lesão e porcentagem de área
lesada.
77
REFERÊNCIAS
AIHARA, T.; NAKAMURA, E.; AMAGASE, K.; TOMITA, K.; FUJISHITA, T. Pharmacological control of gastric and secretion for the treatment of acid-related peptic desease: past, present and future. Pharmacology & Therapeutics, n. 98, p. 109-127, 2003. ALLEN JR, L. V.; POPOVICH, N. G.; ANSEL, H. C. Formas Farmacêuticas e Sistemas de Liberação de Fármacos. 8 ed. Porto Alegre: Artmed, 2007. ALVES, L. F. Produção de Fitoterápicos no Brasil: História, Problemas e Perspectivas. Revista Virtual de Química, v. 5, n. 3, p. 450-513, 2013. AMER, M. M. A. Constituents of the aerial parts of Marrubium vulgare L. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 9, p. 92-98, 1993. ARAUJO, M. B.; BORINI, P.; GUIMARÃES, R. C. Etiopathogenesis of peptic ulcer: back to the past? Arquivos de Gastroenterologia, v. 51, n. 2, p. 155-161, 2014. ARRUDA, A. B. N.; FERRAZOLI, C.; COELHO, R. G.; HONDA, N. K.; HIRUMA-LIMA, C. A. Avaliação da atividade antiulcerogênica e tóxica dos extratos metanólicos e clorofórmico das folhas de Serjania erecta radlk (sapindaceae)., 2008. BALMÉ, F. Plantas medicinais. São Paulo: Hemus, 1982. BARROS, M. P.; LEMOS, M.; MAISTRO, E. L.; LEITE, M. F.; SOUSA, J. P. B.; BASTOS, J. K.; ANDRADE, S. F. Evaluation of antiulcer activity of the main phenolic acids found in Brazilian Green Propolis. Journal of Ethnopharmacology, v. 120, p. 372-377, 2008. BHATTARAM, V. A.; GRAEFE, U.; KOHLERT, C.; VEIT, M.; DERENDORF, H. Pharmacokinetics and Bioavailability of Herbal Medicinal Products. Phytomedicine, v. 9, p. 1-33, 2002. BRASIL, Ministério da saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução n° 899: Guia para validação de método analítico e bioanalítico, de 29 de maio de 2003. DOU: 02 de agosto de 2003. BRASIL, Ministério da saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução n° 01: Guia para realização de estudos de estabilidade, 29 de julho de 2005. DOU: 01 de agosto de 2005. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopéia Brasileira. 5. ed. Brasília, 2010 BRUNTON, L. L.; LAZO, J. S.; PARKER, K. L. Goodman & Gilman – As bases farmacológicas da terapêutica. 11 ed. Rio de Janeiro: McGraw Hill, 2006.
78
BUENO, A. S. Desenvolvimento tecnológico de extratos secos por Spray Drying da Marrubium vulgare. 29 p. Relatório IC – Curso de Farmácia. Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2014. CARVALHO, A. B. C.; BALBINO, E. E.; MACIEL, A. S. Situação do registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 18, p. 314-319, 2008. CARVALHO, F. Construção e Avaliação de Desempenho de um Spray Dryer Piloto. Tese de doutorado, Lavras-MG, 2012. CASAGRANDE, T.R. Desenvolvimento e otimização de soluções extrativas vegetais a partir das partes aéreas de Marrubium vulgare. 18 p. Relatório Final ProBIC, 2012. Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí-SC CASALI, J. J.; FRANZON, O.; KRUEL, N. F.; NEVES, B. D. Análise epidemiológica e emprego do teste rápido da uréase em pacientes com úlcera péptica perfurada. Revista Colégio Brasileiro Cirurgiões, v. 39, n. 2, p. 93-98, 2012
CECHINEL FILHO, V. Principais avanços e perspectivas na área de produtos naturais ativos: Estudos desenvolvidos no NIQFAR/UNIVALI, Química Nova, v. 23, p. 680-685, 2000. CECHINEL FILHO, V.; YUNES R.A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Química Nova, v. 21, n. 1, p. 99-105, 1998. CIRILO, V. K. Manual de Plantas Medicinais. 44. ed. Francisco Beltrão: Assesoar, 1993. CORRÊA, P. M. Dicionário de plantas úteis do Brasil. Brasília: Inst. de Des. Florestal, 1984, v. 5. COUTO, G.; MACEDO, G.; RIBEIRO, F. Hemorragia digestiva alta associada ao consumo de ácido acetilsalicílico e de anti-inflamatórios não-esteróides em Portugal: Resultados do estudo PARAINES. Jornal Português de Gastroenterologia, v. 17, 2010. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Natural products: A continuing source of novel drugs leads. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1830, p. 3670-3695, 2013. CRAGG, M. G.; GROTHAUS, P. G.; NEWMAN, D. J. New Horizons for Old Drugs and Drug Leads. Journal of Natural Products, 2014. DAJANI, E. Z.; KLAMUT, M. J. Novel therapeutic approaches to gastric and duodenal ulcers: an update. Expert opinion on Investigational Drugs, v. 9, p. 1537-1544, 2000. DA SILVA, R. M. L.; COUTO, A. G.; BRESOLIM, T. M. B. Medicinal plants and pharmaceutical technology. In: CECHINEL-FILHO, V. Plant bioactives and drug
79
discovery: principles, practice, and perspectives. United States of America: Wiley p.359-393, 2012. DE SOUZA, M. M.; JESUS, R. A. P.; CECHINEL FILHO, V.; SCHLEMPER, V. Analgesic profile of hydroalcoholic extract obtained from the Marrubium vulgare. Phytomedicine, v. 5, n.2, p. 103, 1998. DE SOUZA, H. G. T. Avaliação da variação sazonal sobre as características físico-químicas das partes aéreas de Marrubium vulgare. 23 p. Relatório Final PIBIC, 2012. Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí-SC. EL-BARDAI, S.; LYOUSSI, B.; WIBO, M.; MOREL, N. Pharmacological evidence of hypotensive activity of Marrubium vulgare and Foeniculum vulgare in spontaneously hypertensive rat. Clinical and Experimental Immunology, v. 23, p. 329-343, 2001. EL-BARDAI, S.; MOREL, N.; WIBO, M.; FABRE, N.; LLABRES, G.; LYOUSSI, B. The vasorelaxant activity of Marrubenol and Marrubiin from Marrubium vulgare. Planta Medica, v. 69, p. 75-77, 2003. ELBERRY, A. A.; HARRAZ, F. M.; GHAREIB, S. A.; GABR, S. A.; NAGY, A. A.; ABDEL-SATTAR, E. Methanolic extract of Marrubium vulgare ameliorates hyperglycemia and dyslipidemia in streptozotocin-induced diabetic rats. International Journal of Diabetes Mellitus, 2011. FALCÃO, H. S.; MARIATH, I. R.; DINIZ, M. F. F. M.; BATISTA, L. M.; BARBOSA-FILHO, J. M. Plants of the American continente with antiulcer activity. Phytomedicine, v. 15, p. 132-146, 2008. FUMOTO, S.; NISHI, J.; NAKAMURA, J.; NISHIDA, K. Gene therapy for gastric diseases. Current Gene Therapy., v. 8, n. 3, p. 187-200, 2008.
GOBBO NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: Fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Quimica Nova, v. 30 n. 2, p. 374-371, 2007. HERBS OF MEXICO – Herb Emporium, 2009. Disponível em: https://herbsofmexico.com/store/index.php?main_page=page&id=8. Acesso em: 16 nov. 2014. HERRERA-ARELLANO, A.; AGUILAR-SANTAMARIA, L.; GARCIA-HERNANDEZ, B.; NICASIO-TORRES, P.; TORTORIELLO, J. Clinical Trial of Cecropia obtusifolia and Marrubium vulgare leaf extracts on blood glucose and serum lipids in type 2 diabetics. Phytomedicine, v. 11, p. 561-566, 2004. HIRUMA-LIMA, C. A. The anti-ulcerogenic effects of Curatella Americana L. Journal of Ethnopharmacology, v. 121, p. 425-432, 2009. HUSSAIN, J.; ULLAH, R.; KHAN, A.; MABOOD, F.; SHAH, M. R.; AL-HARRASI, A.; GILANI, A. H. Antispasmodic and Ca++ antagonist potential of marrubiin, a labdane type diterpene from Phlomis bracteosa. Journal of Pharmacy Research, v. 4, p. 178-180, 2011.
80
JESUS, R. A. P.; CECHINEL FILHO, V.; OLIVEIRA, A. E.; SCHLEMPER, V. Analysis of the antinociceptive properties of marrubiin isolated from Marrubium vulgare. Phytomedicine, v. 7, n. 111-115, 1999. KLEIN-JR, L. C.; GANDOLFI, R. B.; SANTIN, J. R.; LEMOS, M.; CECHINEL-FILHO, V.; ANDRADE, S. F. Antiulcerogenic activity of extracts fractions, and some compounds obtained from Polygala cyparissias St. Hillaire & Moquin (Polygalaceae). Naunyn-Schmiedberg Archive of Pharmacology, v. 381, p. 121-126, 2010. KNÖSS, W. In Biotechnology in Agriculture and Forestry 43; Bajaj, Y. P. S, Ed.; Springer, Berlim, 1999; p. 275. KONTUREK, P. C. H.; BRZOZOWSKI, T.; SLIWOWSKI, Z.; PAJIDO, R.; STACHURA, J.; HAHN, E. G.; KONTUREK, S. J. Involvement of nitric oxide and prostaglandins is grastroprotection induced by bacterial lipopolysaccharide. Scandinavian Journal of Gastroenterology, v. 33, p. 691-700, 1998. KRACHINSKI, S. V. Extratos secos da Marrubium vulgare L. (Lamiaceae): Avaliação da qualidade química e microbiológica frente às condições do processo de obtenção e ao armazenamento. 23 p. Relatório Final PROBIC, 2014. Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí-SC. LAONIGRO, G.; LANZETTA, R.; PARRILLI, M.; ADINOLFI, M.; MANGONI, L. The configuration of the diterpene spiro ethers from Marrubium vulgare and from Leonotis leonurus. Gazzetta Chimica Italiana, v. 109, p. 145-150, 1979. LUCAS, T. I.; BISHARA, R. H.; SEEVERS, R. H. A stability program for the distribution of drug products. Pharmaceutical Technology, v. 2, p. 68-73, 2004. MALFERTHEINER, P.; CHAN, F. K.; McCOLL, K. E. Peptic ulcer disease. Lancet, v. 374, n. 9699, p. 1449-1461, 2009. MASCOLO, N.; AUTORE, G.; CAPASSO, F.; MENGHINI, A.; FASULO, M. P. Biological screening of Italia medicinal plants for anti-inflamatory activity. Phytotherapy Research, v. 1, p. 28-31, 1987. MARTINS, A. G.; GUTERRES, S. S.; GONZÁLEZ ORTEGA, G. Anti-ulcer activity of Spray-dried powders prepared from leaf extracts of Maytenus ilicifolia Matius ex Reiss. Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 22, n. 1, p. 39-44, 2003. MATTHEWS, B. R. Regulatory aspects of stability testing in Europe. Drug Development and Industrial Pharmacy, v. 25, p. 831-856, 1999. MEYRE-SILVA, C. Análise fitoquímica e farmacológica de plantas medicinais selecionadas da flora catarinense: Aleurites moluccana, Bauhinia microstachya e Marrubium vulgare. 2003. Tese de Doutorado – Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2003. MEYRE-SILVA, C.; YUNES, R. A.; SCHLEMPER, V.; CAMPOS-BUZZI, F.; CECHINEL FILHO, V. Analgesic potencial of marrubiin derivates, a bioactive
81
diterpene present in Marrubium vulgare (Lamiaceae). II Fármaco, v. 60, p. 321-326, 2005. MEYRE-SILVA, C.; CECHINEL-FILHO, V. A review of the chemical and pharmacological aspects of the genus Marrubium. Current Pharmaceutical Design, v. 16, n. 31, p. 3503-3518, 2010. MISHRA, B. B.; TIWARI, V. K. Natural products: An evolving role in future drug discovery. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 46, p. 4769-4807, 2011. MIZUI, T.; DOTEUCHI, M. Effect of polyamines on acidified ethanol-induced gastric lesion in rats. The Japanese Journal of Pharmacology, v. 33, n. 5, p. 939-945, 1983. MOLINARI, M.; CAVALLI, R.; CECHINEL-FILHO, V.; SCHLEMPER, V. Avaliação farmacológica preliminary do extrato hidroalcoólico da Marrubium vulgare (EHM) em anéis de traquéia isolada de cobaia. In:, 12., REUNIÃO ANUAL DA FESBE, 1997, Caxambu, MG. Caxambu: FESBE, 1997. p. 282. MORENO-SALAZAR, S. F.; ROBLES-ZEPEDA, R. E.; JOHNSON, D. E. Plant folk medicines for gastrointestinal disorders among the main tribes of Sonora, México. Fitoterapia, v. 79, p. 132-141, 2008. MORIMOTO, Y.; SHIMOHARA, K.; OSHIMA, S.; SUKAMORO, T. Effects of the new anti-ulcer agente KB-5492 on experimental gastric mucosal lesions and gastric mucosal defensive factors, as compared to those terpenone and cimetidine. Japanese Journal of Pharmacology, n. 57, p. 955-6053, 1991. NOVAES, A. P.; ROSSI, C.; SCHLEMPER, V.; CECHINEL FILHO, V.; BURGUER, C. XV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, Àguas de Lindoia, SP, p. 70, 1998. OGBOURNE, S. M.; PARSONS, P. G. The value of nature´s natural product libbrary for the Discovery of New Chemical Entities: The Discovery of ingenol mebutate. Fitoterapia, v. 98, p. 36-44, 2014. OLIVEIRA, O. W.; PETROVICK, P. R. Secagem por aspersão (spray drying) de extratos vegetais: bases e aplicações. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n. 4, p. 541-650, 2010. OLIVEIRA, A. P.; SANTIN, J. R.; LEMOS, M.; KLEIN, J. L. C.; COUTO, A. G.; MEYRE-SILVA, C.; CECHINEL-FILHO, V.; ANDRADE, S. F. Gastroprotective activity of methanol extract and marrubiin obtained from leaves of Marrubium vulgare L. (Lamiaceae). Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 63, p. 1230-1237, 2011. OLIVEIRA, A. P. Avaliação da atividade gastroprotetora do extrato metanólico e desenvolvimento tecnológico de preparações extrativas das partes aéreas de Marrubium vulgare L. (Lamiaceae) 2011. Dissertação (Mestrado) – Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011.
82
PADILLA, F. B.; NORIEGA, J. R. Z. Comparación de los inhibidores de la bomba de protones omeprazole, lansoprazol, pantoprazole y rabeprazol em lo tratamiento de enfermedad ácido péptica. Medicina Universitária, v. 3, p. 37-50, 2001. PATEL, R. P.; PATEL, M. P.; SUTHAR, A. M. Spray drying technology: an overview. Indian Journal of Science and Technology, v. 2, n. 10, 2009. POLLAK; MERCER AND TENCH, inventors. Improvements in or relating to Extracts of Marrubium. London patent 1098,065, 1968, Jan 3. POPOOLA, O. K., ELBAGORY, A. M., AMEER, F., HUSSEIN, A. A. Marrubiin. Molecules, v.18, p. 9049-9060, 2013. PRISTA, L. N.; ALVES, A. C.; MORGADO, R.; LOBO, J. S. Tecnologia Farmacêutica. Lisboa: Calouste Gulbekian, 2003. 281 p. QUER, P. F. Plantas Medicinales. 13 ed. Barcelona: Labor, 1992. p. 659-661. RAHMAN, M. A.; MOSSA, J. S.; AL-SAID, M. S.; AL-YAHYA, M. A. Medicinal plant diversity in the flora of Saudi Arabia 1: a report on seven plant families. Fitoterapia, v. 75, p. 149-161, 2004. RAINSFORD, K. D. Biochemical gastroprotection from acute ulceration induced by aspirin and related drugs. Biochemical Pharmacology, v. 29, n. 9, p. 1281-1289, 1980. REPETTO, M. G.; LLESUY, S. F. Antioxidant properties of natural compounds used in popular medicine for gastric ulcers. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 35, n. 5, p. 523-534, 2002. ROWE, R. C.; SHESKEY, P. J.; OWEN, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5 ed. Michigan: Pharmaceutical Press, 2006. SCHLEMPER, V.; RIBAS, A.; NICOLAU, M.; CECHINEL FILHO, V. Antiespasmodic effects of hydroalcoholic extract of Marrubium vulgare on isolated tissues. Phytomedicine, v. 3, n. 2, p. 211-216, 1996. SEO, P. J.; KIM, N.; KIM, J.; LEE, B. H.; NAM, R. H.; LEE, H. S.; PARK, J. H.; LEE, M. K.; CHANG, H.; JUNG, H. C.; SONG, S. Comparison of Indomethacin, Diclofenac and Aspirin-Induced Gastric Damage according to Age in Rats. Gut and Liver, v. 6, n. 2, p. 210-217, 2012. SHMUELY, H.; KATICIC, M.; KANIZAJ, T. F.; NIV, Y. Helicobacter pylori and Nonmalignant Diseases. Helicobacter, v. 17, p. 22-25, 2012. SHU, M-H.; APPLETON, D.; ZANDI, K.; ABUBAKAR, S. Anti-inflamatory, gastroprotective and anti-ulcerogenic effects of red algae Gracilaria changii (Gracilariales, Rhodophyta) extract. BMC Complementary & Alternative Medicine, v. 13, 2013.
83
SILVA JÚNIOR, J. O. C.; VIEIRA, J. L. F.; BARBOSA, W. L. R.; PEREIRA, N. L. Caracterização físico química do extrato fluido e seco por nebulização de Symphytum officinale L. Revista Brasileira Farmacognosia, v. 16, p. 671-677, 2006. SILVA R. M. F.; GOMES, T. C. B. L.; ALBUQUERQUE, M. M.; SILVA JUNIOR, J. O. C.; BARBOSA, W. L. R. Abordagem sobre os diferentes processos de secagem empregados na obtenção de extratos secos de plantas medicinais. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 1, p. 103-109, 2012. SIQUEIRA, J. S.; LIMA, P. S. S.; BARRETO, A. S.; QUINTANS-JUNIOR, L. J. Aspectos gerais nas infecções por Helicobacter pylori. Revisão. Revista Brasileira de Análises Clínicas, v. 39, n. 1, p. 9-13, 2007. SOKAL, R. R.; ROHLF, F. J. Biometry. The principles and practice of statistics in biological research. New York: W. H. Freeman Company, 1995. SOUZA, M. C.; BESERRA, A. M. S.; MARTINS, D. C.; VILLA-REAL, V.; SANTOS, R. A. N.; RAO, V. S.; SILVA, R. M.; MARTINS, D. T. O. In vitro and in vivo anti Helicobacter pylori activity of Calophyllum brasiliense Camb. Journal Ethnopharmacology, v. 83, p. 45-52, 2009. STORPIRTIS, S.; GONÇALVES, J. E.; CHIANN, C.; GAI, M. N. Biofarmacotécnica. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2009. STULZER, H. K.; TAGLIARI, M. P.; ZAMPIROLO, J. A.; CECHINEL-FILHO, V.; SCHLEMPER, V. Antioedematogenic effect of marrubiin obtained from Marrubium vulgare. Journal of Ethnopharmacology, v. 108, p. 379-384, 2006. SULEYMAN, H.; BILICI, M.; CADIRCI, E.; HALICI, Z. Different mechanism in formation and prevention of indomethacin-induced gastric ulcers. Journal of Pharmacology, v. 33, n. 4, p. 224-234, 2010. TAKEUCHI, K. Pathogenesis of NSAID-induce gastric damage: Importance of cyclooxygenase inhibition and gastric hypermotility. World Journal of Gastroenterology, v. 18, p. 2147-2160, 2012. TARNAWSKI, A. S.; AHLUWALIA, A.; JONES, M. K. Increased susceptibility of aging gastric mucosa to injury: the mechanisms and clinical implications. World Journal of Gastroenterology, v. 28, n. 16, p. 4467-4482, 2014. TONETO, M. G.; OLIVEIRA, F. J. M.; LOPES, M. H. I. Evolução histórica da úlcera péptica: da etiologia ao tratamento. Revisão. Sciencia Medica, v. 21, n. 1, p. 23-30, 2011. TONON, R. V.; BRABET, C.; HUBINGER, M. D. Influência da temperatura do ar de secagem e da concentração de agente carreador sobre as propriedades físico-químicas do suco de açaí em pó. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 29, n. 2, 2009.
84
TOSO, R. E.; TORIBIO, M. S.; MENGELLE, P.; BOERIS, M. A. Plantas de La província de La Pampa, Argentina, com actividad gastroprotetora y antiespasmódica. InVet [on line], v. 9, n. 1, p. 145-151, 2007. TULASSAY, Z.; HERSZENYI, L. Gastric mucosal defense and cytoprotection. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, v. 24, p. 99-108, 2010. TYTGAT G. N. J. Treatment of peptic ulcer. Digestion, v. 59, p. 446-452, 1998. VASCONCELOS, E. A. F.; MEDEIROS, M. G. F.; RAFFIN, F. N.; MOURA, T. F. A. L. Influência da temperatura de secagem e da concentração de Aerosil®200 nas características dos extratos secos por aspersão da Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 15, n. 3, p. 243-249, 2005. VÁZQUEZ-RAMIREZ, R.; OLGUÍN-MARTÍNEZ, M.; KUBLI-GARFIAS, C.; HERNÁNDEZ-MUNOZ, R. Reversing gastric mucosal alterations during etanol-induced chronic gastrites in rats by oral administration of Opuntia fícus-indica mucilage. World Journal of Gastroenterology, v. 12, n. 27, p. 4318-4324, 2006. VELOZ, A. I. R.; PERERA, L. M. S.; DORVIGNY, B. M. Tratamientos convencionales y medicina alternativa de la úlcera péptica. Revista Cubana de Farmacia, v. 46, p. 127-137, 2012. WALLACE, J. L. COX-2: A Pivotal Enzyme in Mucosal Protection and Resolution of Inflammation. The Scientific World Journal, v. 6, p. 577-588, 2006. WEEL, K. G. C.; VENSKUTONIS, P. R.; PUKALSKAS, A.; GRUZDIENE, D.; LINSSEN, J. P. H. Antioxidant activity of horehound (Marrubium vulgare L.) grown in Lithuania, FETT/LIPID, v. 101, n. 10, p. 395-400, 1999. WESTERGAARD, V. Milk powder technology: evaporation and spray-drying. 5ᵃ ed. Copenhague: Niro A/S, p. 69-173, 2004. WHITE HOREHOUND, 2008. Disponível em: <http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/druginfo/natural/patient-whitehorehound.html.> Acesso em: 19 mar. 2015.
W.H.O. Biodiversity. World Health Organization. Jan. 2015. Disponivel em <http://www.who.int/globalchange/ecosystems/biodiversity/en/> acesso em 28 de Janeiro de 2015. YUHONG, Y.; IRENEUSZ, T. P.; RICHARD, H. H. Peptic ulcer disease today. Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology, n. 3, p. 80-89, 2006. YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas medicinais: sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, 2001
ZUANAZZI, J. A. S.; MAYORGA, P. Fitoprodutos e desenvolvimento econômico. Quimica Nova, v. 33, n. 6, p. 1421-1428, 2010.
85
ANEXO A
![EVA poster1- Rev[1]b.ppt [Modo de Compatibilidade] · aumento da quantidade de MMT no EVA reduziu o índice de fluidez das amostras. A adição da ... MMT reduziu a temperatura de](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5be9cbfa09d3f29e6f8ce001/eva-poster1-rev1bppt-modo-de-compatibilidade-aumento-da-quantidade-de.jpg)
![Biomonitoramento Com Tradescantia Pallida Em Mato Grosso [97 170211 SES MT]](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/577c7b161a28abe0549739b3/biomonitoramento-com-tradescantia-pallida-em-mato-grosso-97-170211-ses-mt.jpg)
