Inmunología 2013

OBTENCIÓN DE MACRÓFAGOS Y ESPLENOCITOS A PARTIR DE Mus musculus BALB/cMorán, G., Villarreal, J.1

Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Departamento de Ciencias de la Vida, 1Laboratorio Inmunología. Sangolquí, Ecuador.

RESUMENMus musculus BALB/c es un ratón de laboratorio que se utiliza para la investigación científica. Su cariotipo está compuesto por 40 cromosomas y son albinos. Para cada experimento se escogen ratones de laboratorio que pertenezcan a una misma cepa pura o endogámica. Los individuos de una misma cepa llevan los mismos genes, por lo cual se facilita la comparación de los efectos de los diferentes tratamientos experimentales (fármacos, entorno físico, etc.), sin que se produzca confusión debido a las diferencias genéticas. El estudio que se llevó a cabo con 2 roedores fue el cambio de peso, la supervivencia durante 17 días, a los 11 días se le inyectó una solución de tioglicolato para inmunizarlos, a los tres días se sacrificó a uno de los dos para ver y hacer el conteo de los macrófagos, se hizo la disección de los órganos y se midió cada uno de ellos. Finalmente los tres días siguientes se sacrificó al otro para realizar un conteo de los esplenocitos haciendo de esta manera una comparación con los datos de todo el curso.Palabras claves: Ratón, albino, laboratorio.

ABSTRACTMus musculus BALB / c mouse is a laboratory that is used for scientific research. Its karyotype consists of 40 chromosomes and is albinos. For each experiment, laboratory mice are chosen belonging to the same pure or inbred strain. The individuals of the same strain carry the same genes, so it is easy to compare the effects of different experimental treatments (drugs, physical environment, etc.), without causing confusion due to genetic differences . The study was carried out with 2 rodents was weight change , survival for 17 days , at 11 days was injected with thioglycolate solution for immunization , three days were sacrificed one of the two to see and do count macrophages became organs dissected and measured for each . Finally three days sacrificed to another to perform a count of splenocytes thus making a comparison with the data of the entire course.Keywords: Mouse, albino, laboratory.

INTRODUCCION

El ratón de laboratorio es una especie cosmopolita, se adapta a una gran variedad de condiciones ambientales, desde zonas muy frías hasta regiones tropicales. En general, las especies prefieren ambientes más secos que húmedos (Cellis, 1998).

El ratón es un mamífero de sangre caliente, de hábitos nocturnos y su comportamiento está influenciado por feromonas. Posee un

agudo sentido de la audición, por lo que se alteran rápidamente con los ruidos, es por ello que hay que tener cuidado con los equipos que se utilizan (Guevara, 1999).

Su sentido del olfato está muy desarrollado, no sólo para detectar comida y depredadores, sino también para percibir un orden social (Cellis, 1998).

Su visión es muy pobre y no pueden percibir los colores (AVMA, 1995). En la órbita del ojo

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posee unas glándulas con forma de herradura llamadas glándulas Harderianas, cuando el ratón está en estrés, excreta en la zona periocular una sustancia de color marrón llamada porfirina (SENASA, 2004).

El sistema social depende de la densidad de población, viven en grandes colonias y el rango social está bien desarrollado (Guevara, 1999).

Generalmente, son muy dóciles a excepción de algunas cepas exocriadas que mantienen su agresividad, al igual que sus antecesores salvajes (Wilson, 2005).

Por su pequeño tamaño son muy susceptibles a cambios ambientales, puesto que una variación de la temperatura entre 2 a 3°C, puede afectar su temperatura corporal y modificar su fisiología. El tamaño del ratón adulto varia entré 12 a 15 cm desde la punta de la nariz a la punta de la cola; el largo de la cola es igual al largo del cuerpo y con un peso aproximado de 30 gr (AVMA, 1995). Las crías al nacer tienen un peso aproximado de 1 a 2 g y gana rápidamente peso durante la lactancia (Wilson, 2005).

Tienen una vida útil de 1 a dos años y se obtiene de ocho a diez camadas (Wilson, 2005).Las características que han hecho del ratón de laboratorio el modelo biológico y biomédico más utilizado en las investigaciones científicas son:

1. Su fácil manejo (Quezada, 2006).

2. Su tamaño apropiado para la crianza y manipulación (Quezada, 2006).3. No requieren demasiados cuidados.4. Tienen un sistema inmune similar al de los seres humanos (Quezada, 2006).5. Tienen un alto número de crías (Quezada, 2006).6. Poseen un breve período de gestación (19-21 días), y su destete es rápido (Quezada, 2006).7. Las hembras producen un gran número de óvulos, los cuales al ser fecundados son muy resistentes (Quezada, 2006).8. Al ser mamíferos euterios, poseen un genoma muy similar al de los seres humanos (Quezada, 2006).

El objetivo del experimento será obtener macrófagos y esplenocitos a partir de Mus musculus balb/c

MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo se realizó en los laboratorios de biotecnología de la Universidad de las Fuerzas Armadas-Espe. Se trabajó con 12 ratones, divididos en grupos de 4 personas, de la línea BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad y un peso promedio de 22 g, procedentes del bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Central, mantenidos en condiciones convencionales a una temperatura ambiente de 25°C y con iluminación artificial, en cajas plásticas con camas de virutas de madera, alimentados con frutas y granos y agua.

MANIPULACIÓN DEL RATÓN

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Se utilizó la técnica de sujeción que consistió en tomar al ratón por la zona media de la cola y se apoyó en una rejilla. Luego se colocó la base de la cola del ratón entre los dedos anular y meñique, se sujetó la parte superior del cuello, hombros y se levantó. Se pesó el ratón y como parte de dicha manipulación se le inyectó 200 uL de PBS por la vía de administración intraperitoneal y subcutánea.

TRATAMIENTOSCon una jeringa y aguja calibre 25 G, de bisel pequeño se inoculó a los 11 días una solución de tioglicolato al 2 % en PBS a los ratones por vía intraperitoneal.

OBTENCIÓN DE MACRÓFAGOS3 días después se preparó jeringas con 5 ml de medio de recuperación de macrófagos RPMI frío (200 U/ml, svf 2% HEPES 2 ml) y se colocaron en un cooler con hielo. Luego se sacrificó el ratón 1 del grupo 3 así como de los demás grupos de trabajo por dislocación cervical y se realizó 3 lavados en la cavidad peritoneal con 3 ml de RPMI para el cual se presionó ligeramente la zona de inyección para la recuperación de toda la solución administrada. Posteriormente se colocó el líquido del lavado peritoneal que contenía los macrófagos en un tubo de 50 ml frío con tapa de rosca.

CULTIVO DE MACRÓFAGOSSe realizó dos centrifugaciones a 1000 rpm por 5 minutos a 4 °C de las la cuales se eliminó el sobrenadante y se retomó el pellet en el medio de recuperación de macrófagos.

Después de la última centrifugación se recuperó del pellet en un medio RPMI (glutamina 1ml, P/S 200 uL. Hepes 2 ml, svf 10%) y se observó macrófagos sobre una cámara de Malassez.Por último se colocó la muestra en cajas Petri y se dejó que los macrófagos se adhieran durante 3 días a 37 °C, después de este tiempo se los volvió a recuperar por medio de la técnica de raspado y realizó el conteo de macrófagos en una cámara de Neubauer para determinar el número de macrófagos por ml, esta cantidad se dividió entre 4 y se multiplico por 10.000.

TAMPÓN DE LISISSe realizó un tampón de lisis con 41,45 g deNH4Cl, 5g de KHCO3, 0,372 g de EDTA y se ajustó el pH a 7,4.

DISECCIÓN DEL RATÓNEl material usado constó de guantes, tijeras, bisturí, pinzas, etc. Se colocó al ratón sobre sus espalda sobre una plancha de espuma flex cubierta con papel aluminio.Se esterilizó la parte media del abdomen, se cortó con unas tijeras y se retiró la piel con una pinza. Después de realizó una incisión hasta encontrar el peritoneo visceral. Se extrajo los órganos más importantes del ratón como bazo, intestino delgado, cerebro, corazón, hígado, riñón; y se midió la longitud de cada uno con una regla.

OBTENCIÓN DE ESPLENOCITOS Se sacrificó el ratón 2 del grupo 3 así como de los demás grupos de trabajo por dislocación cervical.

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Se realizó una disección del ratón y se extrajo el bazo. Con la ayuda del pistón de una jeringa se trituró el bazo en una caja Petri con medio RPMI. Debido a que pudo existir una contaminación con glóbulos rojos, se procedió a realizar una hemólisis con un buffer lisis. Se realizaron 2 lavados con dicho medio con 3 aspiraciones sucesivas por 3 minutos.Después se centrifugó por dos ocasiones durante 10 minutos a 1500 rpm y se recuperó el pellet ya limpio de glóbulos rojos que posteriormente fue resuspendido en un medio con 5 ml de RPMI para el conteo de células, para lo cual se realizó una dilución 1:10 y se colocó 10 uL en la cámara de Neubauer. Para determinar el número de esplenocitos por ml se utilizó la relación: Concentración=(# de celulas*10000)/(# de cuadros*dilución)

RESULTADOS Se determinó el peso de Mus musculus BALB/c 1, 2 del grupo 3 y de cada uno de los grupos de trabajo antes de la disección:

Gráfica 1. Peso de Mus musculus 1 y 2 del grupo 3 a los 0 (inicial) 7, 14 y 17 días.

Gráfica 2. Peso de Mus musculus de todos los grupos de trabajo. Se obtuvo un 100% de supervivencia de Mus musculus del grupo 3 así como de todos los grupos de trabajo

Gráfica 3. Supervivencia de Mus musculus 1 y 2 del grupo 3.

Gráfica 4. Supervivencia de Mus musculus de los grupos de trabajo.El tamaño de los principales órganos del ratón 1 se muestra a continuación

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Gráfica 5. Tamaño de los órganos principales de Mus musculus 1 del grupo 3. En las siguientes tablas se observa el conteo de macrófagos peritoneales y conteo de esplenocitos de Mus musculus de todos los grupos de trabajo Tabla 1. Conteo de macrófagos en cámara de Neubauer de todos los grupos de trabajo.

Tabla 2. Conteo de esplenocitos en cámara de Neubauer de todos los grupos de trabajo.

Se puede observar en las siguientes fotos algunos esplenocitos contabilizados del grupo 3 Foto 1. Conteo de esplenocitos en cámara de Neubauer.

Gráfica 6. Conteo de macrófagos y esplenocitos de Mus musculus del grupo 3.

Gráfica 7. Conteo de macrófagos y esplenocitos de Mus musculus de todos los grupos de trabajo.

Se determinó la media aritmética y la desviación stándard para todos los ratones de los grupos de trabajo, obteniéndose los siguientes resultados:

Tabla 3. Media del número total de macrófagos/ml de todos los ratones de los grupos de trabajo.

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Tabla 4. Media del número total de esplenocitos/ml de todos los ratones de los grupos de trabajo.

DISCUSION

SNASA 2004 dice que el alimento es el material primario en la alimentación de los ratones. Se les alimentó con alimento para roedores en las noches y fruta en las mañanas a partir del cual se formaron y renovaron los tejidos y estructuras corporales, tanto las nuevas como las ya existentes, que debían ser reemplazadas debido al proceso de desgaste. El consumo de alimento y agua varía entre las cepas de ratones (Tur-Mari, 2000). En los ratones se observó que el acto de comer era cíclico, con un pico máximo durante el periodo de oscuridad. El mayor consumo de agua fue durante las horas de la noche pero no fue el consumo diario estándar de 7 mL por ratón por lo que los ratones presentaron una deshidratación lo cual bajo su peso durante los 17 días.

Según Montañez, 2008 el ratón es un animal sociable y se mantiene en grupos sin ningún inconveniente, estos grupos deben formarse rápidamente luego del destete. Se mantuvo a varios ratones en una sola jaula y no se observó inconveniente con las hembras, el macho comenzó a mostrar agresividad a los 7 días de haberlos puesto en la jaula.

El 100% de los ratones sobrevivieron, según Sáenz 2005 esto se debe a las condiciones adecuadas en las que se encontraban,

temperatura de 20 a 25°C, humedad relativa ambiental entre 40 y 70%, buena aireación y ventilación.

Riera 2006, manifiesta que las condiciones ambientales en que se crían y experimentan los animales influyen decisivamente en las respuestas a los diferentes tratamientos. Se aplicó el tratamiento de tioglicolato (sustancia que promueve la captura de macrófagos) a los 11 días de la adquisición del ratón y se observó que el pelaje de los roedores cambió volviéndose áspero y disminuyeron su peso por lo que si se requiere respuestas estandarizadas, las condiciones en que se mantienen los animales deben ser fijas.

Al recibir la dosis de tioglicolato los ratones empezaron a capturar rápidamente neutrófilos y monocitos, aumentando rápidamente los niveles de F4/80 (una proteína de membrana exclusiva de los macrófagos) afirma Olfert, 1973.

Los macrófagos son células importantes en el desarrollo de la inmunidad innata y adaptativa. Cuando son activados ya sea por efecto de citoquinas pro-inflamatorias o infecciones con microorganismos, liberan Óxido Nítrico (NO) y otros intermediarios reactivos del oxígeno, responsables de su actividad citotóxica y citostática contra microorganismos infecciosos y células tumorales (Tamez et al., 2001; Ignacio et al., 2001).

Musser 2008, menciona que los ratones son muy sensibles al ruido y pueden percibir

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frecuencias de sonido que son inaudibles para el ser humano. Al tercer día de aplicado el tratamiento los ratones en el laboratorio mostraban estress, agresividad. Se sacrificó al primer roedor y se analizaron los resultados haciendo un lavado peritonial, posteriormente se realizó el conteo de macrófagos.

La inoculación de Caldo Tioglicolato indujo un incremento en la población de macrófagos peritoneales, siendo el número de macrófagos 5,47 x 106, esta técnica es muy utilizada para la colección de mayor cantidad de estas células (McCarron et al., 1984), el medio actúa como un estímulo inflamatorio no específico. Según Musser 2008, se aumenta también las concentraciones de nitrito fueron en un 7,45mM para los extractos metanóicos.

Hudson 1978 afirma que también se observa producción de óxido nítrico debido al uso de caldo tioglicolato como atrayente que permite concentrar una mayor cantidad de macrófagos (agente inflamatorio inespecífico).

Finalmente, tres días después se sacrificó al otro ratón y ser realizó el conteo de esplenocitos.

Ignacio 2001, dice que la caracterización de los antígenos de superficie se puede realizar en células obtenidas de diversos especímenes, por ejemplo, esplenocitos.

Como parte de la gran variedad de protocolos y debido a su facilidad relativa en

la manipulación y por su alta densidad celular representativa de los demás órganos linfoides y de sangre periférica, se encuentra el bazo; por consiguiente, el análisis de las subpoblaciones de esplenocitos se constituye en parámetro fundamental al determinar el potencial inmunosupresor de una molécula según Holladay 2002.

Los análisis se realizaron en cada ratón sacrificado, que de acuerdo con lo reportado por Pheng et al. 2003, pertenece a los esplenocitos maduros y viables, en la cámara de Neubauer se contó 9,50x106, determinando mayor producción de éstos que de macrófagos.

Según Krause 1990, estos resultados sugieren que la Melatonina (MLT) actúa en forma directa en la proliferación linfocitaria uniéndose, posiblemente, a los receptores de alta afinidad para la hormona localizada en los esplenocitos, que estimula la producción de IL-2 e IL-1b originando un incremento de la inmunidad celular.

CONCLUSIONES Los ratones de todos los grupos

tuvieron un porcentaje de supervivencia de 100% correspondiente a los días antes de que se sacrificaran. Además de que sus pesos no variaron significativamente.

Los órganos del ratón 1del grupo 3 se encontraron en buen estado sin deformaciones o tumoraciones.

El grupo de trabajo 4 obtuvo mayor número de macrófagos de Mus musculus BALB/c siendo este de 7,6x106 células/ml en relación al

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grupo de trabajo 3 en el que se obtuvo 5,47x106 células/ml.

Considerando a todos los grupos de trabajo, en el conteo de macrófagos se obtuvo una media de 5,14x106 células/ml y una desviación estándar de 1966432,8.

El ratón 2 del grupo 3 tuvo mayor número de esplenocitos que fue de 9,50x106 células/ml en relación a todos los grupos de trabajo.

Se obtuvo una media de 2,08x106 células/ml y una desviación estándar de 3706806,81para todos los grupos de trabajo considerando el número de esplenocitos.

El investigador decide, de acuerdo con sus necesidades, dónde ubicar a los animales empleados, teniendo en cuenta que el lugar brinde las condiciones ambientales y de manejo óptimos que aseguren la salud y la comodidad de los especímenes, de modo que sus patrones metabólicos y de comportamiento se mantengan normales y estables, dando respuestas confiables.

RECOMENDACIONES Se recomienda que para una próxima

investigación se tenga en cuenta un grupo control de ratones.

Los investigadores que trabajen y experimenten con animales están moralmente obligados a manifestarles tres tipos de actitudes: respeto, afecto y gratitud.

› Respeto: por tratarse de seres vivos y sensibles, que están experimentando sufrimiento y podrían terminar perdiendo la vida, tratárseles con todas las consideraciones que el caso merece.

› Afecto: considerándolos partícipes con nosotros, del misterio de la vida.› Gratitud: reconocimiento por la importante ayuda al constituirse nuestros más íntimos colaboradores.

BIBLIOGRAFÍA

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Geographic Reference (3rd ed). Pp. 365 - 378

ANEXOS

Imagen1. Alimentación.

Imagen2. Manipulación del ratón.

Imagen3. Primer peso del ratón

Imagen4. Segundo peso del ratón.

Imagen5. Inmunización con tioglicolato.

Imagen6. Tercer peso del ratón.

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Imagen7. Decapitación.

Imagen8. Disección.

Imagen9. Lavado para obtención de macrófagos

Imagen10. Medición de los órganos internos del roedor.