OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN … · 2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae _ 11 2.7.2. Tolerancia al etanol_ 12 2.8. Determinación de azúcares

OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN VEGETAL Y SU

EVALUACIÓN CON CÉLULAS LIBRES DE Saccharomyces cerevisiae.

JOHANNA CAROLINA BUITRAGO ESTRADA

DOLLY GISELLE TENJO CAMACHO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar el titulo de

Microbiólogo Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C.

Enero 2007

Articulo 23 de la Resolución N°13 de julio de 1946

“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de

buscar la verdad y la justicia”.





APROBADO

Balkys Quevedo Hidalgo

Ingeniera Quimica M.Sc.

Director

Ivonne Gutiérrez

Bacterióloga M.Sc

Jurado

Adriana Matiz

Bacterióloga M.Sc

Codirector

Andrea Aguirre

Bacterióloga M.Sc

Jurado





APROBADO

___________________________

Angela Umaña Ph.D

Decana Académica

___________________________

David Gómez Méndez

Director de carrera

V

Agradecemos a nuestros padres y hermanos: Alba, Freddy, Jonathan, Blanca,

Gabriel, Angela y Delvin por su apoyo incondicional y por transmitirnos la fuerza

para seguir adelante. A los amigos y compañeros del laboratorio de

Biotecnología Aplicada por la colaboración y ánimo que nos brindaron. A la

Ingeníera Balkys Quevedo por su compromiso, dedicación, conocimiento,

paciencia y amistad. A la Doctora Adriana Matiz por su paciencia, comprensión y

conocimiento transmitido. Y a todas aquellas personas que no mencionamos

gracias por ayudarnos a lograr esta meta.

VI

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN

ABSTRACT

INTRODUCCIÓN

2. MARCO TEÓRICO ___________________________________________________ 2

2.1 Uso de residuos vegetales ___________________________________________ 2

2.2 Cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) ________________________ 2

2.3 Celulosa _________________________________________________________ 3

2.4 Pretratamientos de residuos vegetales__________________________________ 5

2.5 Obtención de etanol ________________________________________________ 6

2.6 Microorganismos fermentativos _______________________________________ 7

2.7 Saccharomyces cerevisiae ___________________________________________ 7 2.7.1 Requerimientos nutricionales _______________________________________ 8 2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae __________________________ 11 2.7.2. Tolerancia al etanol______________________________________________ 12

2.8. Determinación de azúcares reductores_________________________________ 13

3. JUSTIFICACIÓN____________________________________________________ 14

4. OBJETIVOS _______________________________________________________ 16

4.1. Objetivo general___________________________________________________ 16

4.2. Objetivos específicos _______________________________________________ 16

5. MATERIALES Y MÉTODOS___________________________________________ 17

5.1. Ubicación _______________________________________________________ 17

5.2. Obtención del sustrato fermentable ___________________________________ 17 5.2.1. Microorganismos________________________________________________ 17 5.2.2. Residuo Vegetal ________________________________________________ 17 5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal __________________________________ 18 5.2.3.2. Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación oxidativa) 18 5.2.4. Pretratamiento biológico __________________________________________ 19 5.2.4.1. Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celulolítico

19 5.2.4.1.1. Preparación del inóculo___________________________________________ 19 5.2.4.1.2. Fermentación discontinua_________________________________________ 19 5.2.5. Determinación de actividad celulolítica cuantitativa _____________________ 20 5.2.5.1. Actividad celulolítica a pH 7 _______________________________________ 20 5.2.5.2. Actividad celulolítica a pH 5 _______________________________________ 21

5.3. Evaluación del Sustrato con Saccharomyces cerevisiae ___________________ 21 5.3.1. Fermentación discontinua control ___________________________________ 21 5.3.1.1. Preparación del inóculo___________________________________________ 22 5.3.1.2. Fermentación discontinua_________________________________________ 22

VII

5.3.2. Fermentación discontinua con sustrato vegetal (SF) ____________________ 22 5.3.2.1. Preparación del inóculo___________________________________________ 22 5.3.2.2. Fermentación discontinua_________________________________________ 23 5.3.3. Determinación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5dinitrosalicílico

(DNS) ________________________________________________________ 23 5.3.4. Determinación de biomasa por peso seco en función del tiempo___________ 24 5.3.5. Determinación de etanol __________________________________________ 24 5.3.6. Determinación de rendimientos ____________________________________ 25 5.3.7. Análisis estadístico ______________________________________________ 25

6. RESULTADOS Y DISCUSION _________________________________________ 27

6.1 Pretratamiento del residuo vegetal ____________________________________ 27

6.2 Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico _____ 30 6.2.1 Residuo vegetal al 10% (p/v) ______________________________________ 30 6.2.2 Residuo vegetal al 12% (p/v) ______________________________________ 35 6.2.3 Residuo vegetal al 5% (p/v) _______________________________________ 36

6.3 Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae__________ 38 6.3.1 Fermentación discontinua control ___________________________________ 38 6.3.1.1 Fermentación control con 20 g/L de glucosa __________________________ 39 6.3.1.2 Fermentación control con 2 g/L de glucosa ___________________________ 41 6.3.2 Fermentación discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces

cerevisiae _____________________________________________________ 43

CONCLUSIONES _________________________________________________________ 49

RECOMENDACIONES_____________________________________________________ 51

BIBLIOGRAFÍA___________________________________________________________ 52

ANEXOS________________________________________________________________ 59

VIII

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Azúcares reductores liberados en función del Tiempo. Residuo tratado con

SDS y sin SDS. ____________________________________________________27

Figura 2. Fermentación del residuo vegetal con el consorcio celulolítico.________30

Figura 3. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10%,

tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad

enzimatica pH 7 a 37°C Y pH 5 a 50°C en función del Tiempo. _______________31

Figura 4. Azúcares reductores liberados y pH en función del Tiempo. Fermentación

del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento,

con y sin suplemento.________________________________________________32

Figura 5. Actividad enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. Fermentación

del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con

y sin suplemento. ___________________________________________________34



y sin suplemento. ___________________________________________________34



y sin suplemento. ___________________________________________________35



y sin suplemento. ___________________________________________________36

Figura 9. Actividad enzimática pH 5 a 50°C vs. Tiempo. Fermentación del

consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con y

sin suplemento. ____________________________________________________36

Figura 10. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 5%

(p/v), tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad

enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. ___________________________37

IX

Figura 11. Concentración de biomasa, azúcares reductores y pH en función del

tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L

de glucosa. ________________________________________________________40


tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de

glucosa. __________________________________________________________43

Figura 13. Fermentación del sustrato fermentable con células libres de

Saccharomyces cerevisiae____________________________________________44

Figura 14. Concentración de biomasa y azúcares reductores en función del tiempo.

Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF. __________________46

X

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal al 10% sin

suplemento tratado con SDS y peróxido de hidrógeno. (Temperatura 50°C por 12

horas). ___________________________________________________________28

Tabla 2. Determinación de etanol por HPLC fermentaciones control ___________41

Tabla 3. Determinación de etanol fermentación en SF ______________________47

XI

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO A Soluciones de trabajo

A.1 Buffer fosfato

A.2 Buffer ácido cítrico

ANEXO B Curva patrón de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS

Tabla 1. Curva patrón de glucosa.

Figura 1. Curva patrón de glucosa y ecuación lineal.



ANEXO C Pretratamiento del residuo vegetal

Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en

residuo vegetal 10% con y sin tratamiento en SDS

ANEXO D Caracterización físico-química del Residuo Vegetal de

Crisantemo Fermentación discontinua del residuo vegetal

con el consorcio celulolítico

ANEXO E TABLA 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en

residuo vegetal 10% suplementado y tratado con SDS

TABLA 2. Fermentación con el consorcio celulolítico en

residuo vegetal 10% suplementado y sin tratamiento


residuo vegetal 10% sin suplemento y sin tratamiento


residuo vegetal 12% suplementado y sin tratamiento


residuo vegetal 12% sin suplemento y sin tratamiento


residuo vegetal 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v)

suplementado y sin tratamiento

ANEXO F Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae

Figura 1. Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae.

Absorbancia en función de la concentración de biomasa

XII

ANEXO G. Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces

cerevisiae. Fermentación discontinua control

TABLA 1. Fermentación control con Saccharomyces

cerevisiae en caldo YGC 20 g/L de glucosa

TABLA 2. Fermentación control con Saccharomyces

cerevisiae en caldo YGC 2 g/L de glucosa

ANEXO H. Fermentación discontinua del sustrato fermentable con

Saccharomyces cerevisiae

TABLA 1. Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en

caldo SF

ANEXO I. Caracterización de composición nutricional del sustrato

fermentable (SF)

ANEXO J. Cromatografía líquida HPLC

J1. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC

con 20 g/L de glucosa

J2. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC

con 2 g/L de glucosa

J3. Fermentación con S. cerevisiae en SF

RESUMEN

La acumulación de residuos sólidos principalmente generados por el desarrollo de la

floricultura, ofrece una amenaza al ambiente y una oportunidad biotecnológica al

aprovechar los tres componentes que conforman los residuos vegetales: celulosa,

hemicelulosa y lignina, como fuente de carbono para los microorganismos que

poseen el complejo enzimático para metabolizar estos polímeros y liberar azúcares

simples que puden quedar a disposición de otros microorganismos fermentativos.

En este trabajo se plantea una alternativa de manejo de residuos vegetales de

Crisantemo (Dendranthema grandiflora), al realizar la conversión de este material

celulósico a azúcares fermentables por pretratamiento biológico con un consorcio

celulolítico en cultivo discontinuo, y de esta manera obtener un sustrato fermentable

(SF) rico en nutrientes y azúcares reductores que permitan el crecimiento de

Saccharomyces cerevisiae y la producción de etanol.

Se evaluaron varias variables para obtener el mejor sustrato fermentable con el

consorcio celulolítico: la concentración del residuo vegetal al 5% (p/v), 10% (p/v) y

12% (p/v), pretratamientos químicos y suplemento con extracto de levadura y

peptona. Se determinó que la actividad enzimática fue mejor en la fermentación con

el residuo al 10% sin tratamiento y sin suplemento al obtenerse un SF con 2.5 g/L

de azúcares reductores.

El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que

favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, presentando el

mismo rendimiento (Yx/s) al compararlo con la fermentación control de 2g/L de

glucosa en caldo YGC, pero se determinó que no favorece la producción de etanol

por la mínima concentración de azúcares presentes.

ABSTRACT

The accumulation of solid waste, mainly generated through the development of the

flower-growing, brings a treat to the environment and a biotechnological opportunity

taking advantage of the three components that constitute the vegetable waste:

cellulose, hemicellulose and lignin as a source of carbon to the microorganisms that

own the enzymatic complex in order to metabolize these polymers and release the

simple sugars that might be left available to the other fermentative microorganisms.

This work proposes a management alternative of the vegetable waste of

Chrysanthemum (Dendranthema grandiflora) that consists in the conversion of this

cellulosic substrate to fermentable sugars through the biological pretreatment with a

microbial consortium and thus obtains a fermentable substrate (SF) rich in nutrients

and reductor sugars that allow the growing of Saccharomyces cerevisiae and the

production of ethanol.

Many variables were examined to obtain the best fermentable substrate with the

microbial consortium: the concentration of the vegetable waste to 5% (w/v), 10%

(w/v) and 12% (w/v), chemical pretreatment and supplement with extract of yeast

and peptone. It was found a better enzimatic activity with the vegetable waste 10%

(w/v) without treatment and without supplement obtaining a fermentable substrate

with 2.5 g/L of reductor sugars.

The fermentable substrate proved to be a nutritious and economic environment that

favors the production of biomass of Saccharomyces cerevisiae showing the same

yield (Yx/s) that was obtained with the fermentation control of 2 g/L of glucose in

media YGC, but one determined that it does not favor the ethanol production by the

minimum concentration of sugar.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, se ha venido acentuando progresivamente el aumento de la

conciencia y preocupación social por el ambiente y el desarrollo sostenible. Cerca

del 90% de residuos sólidos convencionales generados por la floricultura

corresponde a desechos vegetales, esto hace que la acumulación de residuos

orgánicos genere un desequilibrio en el ecosistema.

La actual administración colombiana ha iniciado algunas acciones tendientes a

identificar y promover alternativas de producción de biocombustibles como el etanol,

a partir de distintas fuentes, pues la actividad del sector agropecuario nacional es

generadora, actual o potencial de: jugo de caña de azúcar, paja de cereales, maíz,

papa, remolacha, melaza, yuca, residuos de la industria forestal y residuos

vegetales como los generados en los cultivos de flores, producto del manejo y ciclo

vital de las plantas que actualmente son aprovechados en compostaje y

reincorporados al proceso productivo como fuente de nutrientes y acondicionador de

suelos, además pueden servir como fuente de carbono de los microorganismos en

el proceso de fermentación de los azúcares que los componen. Esto promete doble

beneficio para el ambiente: primero una alternativa de manejo de residuos vegetales

y agroindustriales y el aprovechamiento biotecnológico de sus tres componentes:

celulosa, hemicelulosa y lignina, en la obtención de biomasa y etanol u otros

combustibles.

Por tal razón, la obtención de un sustrato fermentable a partir de la conversión del

residuo vegetal de Crisantemo (material celulósico), por pretratamiento biológico con

microorganismos celulolíticos representa una alternativa para la producción de

etanol, al lograr obtener un sustrato rico en azúcares fermentables u otros

nutrientes que permitan el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en cultivo

discontinuo, contribuyendo con el desarrollo biotecnológico a nivel industrial.

2

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Uso de residuos vegetales

El aumento de la producción de etanol en el mundo ha estado ligado con el

desarrollo de nuevas tecnologías que permiten obtenerlo a partir de residuos de

madera, de desechos sólidos y de todos los materiales que contengan celulosa y

hemicelulosa lo que permite revalorizar los desechos de varias industrias

convirtiéndolos en materia prima para la obtención de etanol.

El interés por el uso de materiales lignocelulósicos como materia prima en procesos

de transformación por microorganismos, es importante desde hace ya varias

décadas. Entre las razones fundamentales para tal interés se encuentran: la materia

lignocelulósica es el subproducto agrícola de mayor abundancia y constituye la parte

estructural en el reino vegetal, por ello es una fuente de materia prima renovable.

Sus tres mayores constituyentes, celulosa, hemicelulosa y lignina, tienen

aplicaciones practicas apreciables, por ejemplo, la celulosa es el polímero en mayor

proporción en los residuos vegetales provenientes de floricultura se utiliza para la

obtención de etanol y biomasa, la hemicelulosa como fuente de etanol y/o biomasa

y la lignina como combustible y como fuente de adhesivos y de inmunoadyuvantes

(Romano, et al., 2005).

2.2 Cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora)

Colombia se ha convertido en el segundo exportador mundial (después de Holanda)

de flores cortadas, con una participación del 10% sobre el total de las exportaciones

mundiales. Más de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan el

clavel, el pompon, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la sabana de

Bogotá, el oriente antioqueño y el Valle del Cauca, siendo sus principales mercados

Estados Unidos (80%) y la Unión Europea (14%)

(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).

3

El Crisantemo (Dendranthema grandiflora) es un hibrido complejo perteneciente a la

familia Asteraceae y engloba flores de las más antiguas cultivadas en Colombia.

Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas, ligulosas o rugosas, de color variables

entre el verde claro y oscuro, recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un

aspecto grisáceo (Stace, 2003; Santana, 2002).

En cuanto a sus requerimientos nutricionales el Crisantemo es un cultivo exigente

en lo referido a las cantidades de nitrógeno, fósforo y potasio necesarias para la

obtención de flores y plantas de óptima calidad. Cuando existen deficiencias,

aplicaciones moderadas no logran evitar los trastornos ocasionados, por lo cual,

luego de la siembra de los esquejes se recomienda utilizar fertilizantes con alto

contenido de nitrógeno, potasio y otros microelementos, manteniendo un pH entre

5.5 y 6,5 (Santana 2002).

2.3 Celulosa

La celulosa es un carbohidrato que constituye el 50% o más del total de átomos de

carbono en las plantas. Casi la mitad de la madera es celulosa, y el algodón tiene al

menos 90% de celulosa. Las células vegetales están rodeadas por paredes

celulares resistentes, formadas en su mayor parte de celulosa. Este carbohidrato es

el polímero más abundante del mundo, constituye alrededor de 40% a 60% de las

paredes celulares vegetales en peso seco. Es un polímero de unidades de glucosa

unidas entre sí por enlaces �- 1,4. Cada molécula de celulosa consta de miles de

subunidades de glucosa unidas para formar una cadena plana parecida a un listón.

De 40 a 70 de estas cadenas yacen paralelas entre sí y están conectadas por

enlaces de hidrógeno para formar una microfibrilla de celulosa con regiones

cristalinas y amorfas (no cristalinas), éstas últimas contienen torceduras y espacios

lo cual permite la formación de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos

para permitir la penetración de moléculas relativamente grandes incluyendo, en

algunos casos enzimas celulasas (Solomon, et al., 2001; Howard, et al., 2003; Lynd,

et al., 2002).

4

2.3.1. Celulasas

Las enzimas implicadas en la degradación de la celulosa son conocidas como

celulasas dentro de las cuales se encuentran: la endo �-1,4 glucanasa (�- 1,4

glucanohidrolasa), la exo �- 1,4 celobiohidrolasa y la �- 1,4 glucosidasa.

La endo �-1,4 glucanasa actúa sobre la región amorfa de la celulosa cortando al

azar la región interna de las cadenas del polisacárido generando así oligosacaridos

de varias longitudes. La exo �- 1,4 celobiohidrolasa actúa sobre los extremos no

reductores del sustrato generando unidades de celobiosa; y la �- 1,4 glucosidasa

completa el proceso hidrolítico convirtiendo los fragmentos de la celobiosa a glucosa

o removiendo glucosa desde los extremos no reductores de pequeños celo-

oligosacaridos (Howard, et al., 2003).

2.3.2. Microorganismos celulolíticos

Muchos microorganismos no tienen la maquinaría enzimática para hidrolizar los

enlaces beta de la celulosa (Solomon, et al., 2001), por esto, los residuos vegetales

son de difícil manejo y presentan un impacto ambiental; ya que pueden generar

alteraciones en las propiedades de los suelos, atraer plagas de insectos y roedores,

producir olores, pérdida del espacio físico y un impacto paisajístico; además al ser

incinerados como una alternativa para su manejo se produce un impacto a la

atmósfera al generar gases tóxicos (Corbitt, 2003). Por lo tanto, se ha centrado el

interés en los microorganismos celulolíticos que participan en la descomposición de

este polímero a glucosa, permitiendo que los microorganismos fermentativos utilicen

este azúcar para la producción de etanol; además a nivel industrial se realiza un

pretratamiento al material celulolítico utilizando procedimientos como la hidrólisis

ácida, la sacarificación y la licuefacción; debido a que los materiales lignocelulosicos

son, en general, de muy baja susceptibilidad a los ataques enzimáticos y

microbianos, lo que se debe a factores derivados de su composición y de su

estructura físico-química: estrecha relación existente entre celulosa, hemicelulosa y

lignina, las que forman una estructura que no es accesible a las enzimas y a otros

agentes químicos y la cristalinidad de la celulosa (Yu y Zhang, 2004; Romano, et

5

al., 2005).

Diversos grupos de microorganismos son capaces de degradar total o parcialmente

la celulosa, entre las bacterias que se destacan están algunas especies de los

genéros Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus sp, Bacillus subtilis,

en el caso de los clostridios, Clostridium cellulovorans hidroliza la celulosa en

condiciones de anaerobiosis, en tanto que especies celulolíticas de Streptomyces la

degradan en ambiente aeróbico (Ramírez y Coha 2003; Murashima, et al., 2002).

2.4 Pretratamientos de residuos vegetales

El propósito de los pretratamientos es aumentar la susceptibilidad del material, para

lo que es necesario remover la lignina y la hemicelulosa, reducir la cristalinidad de la

celulosa, e incrementar la porosidad de los materiales. La tecnología ideal del

pretratamiento debe cumplir los siguientes requerimientos:

• Aumentar la concentración de azúcares

• Minimizar la degradación o pérdida de carbohidratos

• Impedir la formación de coproductos colaterales inhibitorios para los procesos de

hidrólisis y fermentación subsecuentes.

• Escasa o nula la formación de residuos

• Ser económico

Con la aplicación de los pretratamientos se consigue además:

• Remover total o parcialmente la lignina y la hemicelulosa

• Disminuir la cristalinidad de la celulosa

• Reducir el tamaño de las partículas del material.

Los métodos de pretratamiento se clasifican en:

• Físicos: Reducción de tamaño de partícula, radiación de alta energía, pirolisis,

etc.

• Físico – químicos: explosión a vapor o con amonio, oxidación húmeda, etc.

6

• Químicos: Ozonólisis, hidrólisis ácida o alcalina, delignificación oxidativa, etc.

• Biológicos: Hidrólisis enzimática por bacterias y hongos de pudrición blanca,

marrón y blanda (Romano, et al., 2005).

2.5 Obtención de etanol

El etanol es el producto metabólico que puede ser obtenido por la hidrólisis de

diferentes sustratos ricos en carbohidratos como: caña de azúcar, maíz, arroz y

remolacha (Zaldivar, et al., 2005; Karimi, et al., 2006).

Teóricamente se puede obtener a partir de 1 gramo de glucosa 0,511 g de etanol.

Cuando se fermentan sustratos puros el rendimiento es del 95% y se reduce al 91%

cuando se utilizan materias primas grado industrial. 100 gramos de glucosa pura

producirán 48,4 gramos de etanol, 46,6 gramos de CO2, 3,3 gramos de glicerol y

1,2 gramos de biomasa (células de levadura). Las levaduras usualmente

demuestran un rendimiento de etanol de 0.42g/g bajo condiciones ideales a partir de

Xilosa (Karimi, et al, 2006).

La producción de etanol se puede realizar por diferentes tipos de fermentaciones

como: batch o discontinua, continua y lote alimentado. La fermentación batch opera

en un sistema cerrado, toda la materia (sustrato, cultivo de la levadura) se añade al

fermentador al principio del proceso; el sistema se cierra y los productos se recogen

únicamente cuando el proceso ha finalizado. Esta fermentación es la más utilizada

en la producción industrial, debido a las ventajas como: menor costo de producción,

y requiere menor control en comparación con los otros procesos (Doran, 1995;

Caylak y Vardar, 1998)

En la fermentación continua, el crecimiento del microorganismo es mantenido a una

tasa estable de crecimiento mediante el bombeo continuo de medio fresco y la

eliminación del medio utilizado; de tal forma que, el volumen del sustrato se

mantiene constante durante el tiempo de fermentación. Por esto, si las velocidades

de entrada y de salida de materia son iguales, el proceso puede operar

indefinidamente (Doran, 1995; Caylak y Vardar, 1998).

7

La fermentación lote alimentado consiste en un proceso de alimentación intermitente

ya que permite la entrada de materia (sustrato e inóculo) al sistema, pero no la

salida (Doran, 1995).

Estos diferentes procesos deben ser monitoreados de acuerdo con el conocimiento

que se tenga sobre las variables físicas, químicas y biológicas que afectan al

proceso; de acuerdo a esto es posible determinar parámetros como la concentración

de biomasa, de producto y de sustrato. Para calcular el rendimiento de la reacción,

es decir la cantidad de producto formado o acumulado por cantidad de reactante

suministrado o consumido durante la fermentación.

El rendimiento (Yx/s) expresa la cantidad de biomasa producida a partir del sustrato

consumido. Este rendimiento se ve afectado por factores como la composición del

medio, la naturaleza de las fuentes de carbono y nitrógeno, el pH, la temperatura, y

la concentración de oxígeno. Además, el rendimiento del producto a partir del

sustrato (Yp/s), es el factor más importante en la producción de etanol; ya que afecta

a la economía del proceso (Doran, 1995).

2.6 Microorganismos fermentativos

El principal microorganismo utilizado en la fermentación es Saccharomyces

cerevisiae, que aunque es efectivo en la producción de etanol está limitado en

cuanto a los sustratos que puede utilizar, al igual que otros microorganismos como:

Mucor indicus, Candida shehatae, Pichia stipitis, Zymomonas mobilis, Trichoderma

sp, algunos microorganismos como Escherichia coli y Klebsiella oxytoca han sido

modificados por ingeniería genética para la producción eficiente de etanol a partir de

hexosas y pentosas presentes en los polímeros de hemicelulosa (Zaldivar, et al.,

2005; Becker y Boles, 2003).

2.7 Saccharomyces cerevisiae

Reino: Fungi – Mycetae

8

División: Amastigomycota – Eumycota

Subdivisión: Ascomycotina

Clase: Asmomycetes – Hemiascomycete

Subclase: Hemiascomycetidae

Orden: Endomycetales - Saccharomycetales

Familia: Saccharomycetaceae - Endomycetaceae

Subfamilia: Saccharomycetoidea

Género: Saccharomyces

Especie: cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levaduras utilizada por excelencia para

la obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fácil

manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto

costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación produce bajos

niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones

de azúcares, presenta alta viabilidad celular para el reciclado y características de

floculación y sedimentación para el procesamiento posterior (Carballo, 2000).

El etanol es el producto del metabolismo anaeróbico de esta levadura y es parte de

su metabolismo energético (Carballo, 2000). En los procesos de fermentación los

valores de pH deben ser controlados entre 4 y 5 para reducir el riesgo de

contaminación bacteriana, además para la producción de etanol la temperatura

puede estar en el rango de 30°C – 39°C, sin embargo, cerca de 39°C se presenta

perdida de viabilidad de las células; ya que la temperatura óptima de crecimiento de

Saccharomyces cerevisiae es entre 28°C y 35°C. Teóricamente la temperatura

óptima para la producción de etanol debe ser de 5°C a 10°C más elevada que la

temperatura de crecimiento, esto para incrementar el rendimiento del proceso de

fermentación (Tuite y Oliver, 1991).

2.7.1 Requerimientos nutricionales

• Carbono:

Los compuestos carbonados son utilizados a la vez como fuente de energía y como

9

fuente de carbono por Saccharomyces cerevisiae ya que necesita D-azúcares como

hexosas, glucosa, fructosa, manosa, etc., porque los L-azúcares pueden ser

considerados no fermentables por esta levadura (Tuite y Oliver, 1991).

• Nitrógeno:

Este elemento es un constituyente importante en los medios de cultivo para

promover el crecimiento; ya que representa alrededor del 10% de peso seco de las

levaduras, S. cerevisiae es capaz de utilizar el nitrógeno en forma de ión amonio.

Los iones amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro de amonio, el

nitrato de amonio, fosfato de amonio y sobretodo el sulfato de amonio que provee

además una fuente de azufre asimilable ((NH4)2SO4). Otra fuente de nitrógeno son

los aminoácidos, los dipéptidos, tripéptidos, y la urea en asociación con biotina y las

bases púricas y pirimídicas (Carballo, 2000).

• Fósforo:

Es esencial para el crecimiento, regula la síntesis de los lípidos y los carbohidratos,

y mantiene la integridad de la pared celular. El fósforo es asimilado por la célula en

forma de iones ortofosfato (H2PO-4). Las fuentes de fósforo en el medio de cultivo

están constituidas por el dihidrogenofosfato (KH2PO4) o por el hidrogenofosfato

disódico (Na2HPO4) en una concentración 0.6 mM/g de células para una

fermentación óptima (Carballo, 2000).

• Azufre:

Constituye el 0.4% del peso seco de las levaduras. La fuente de azufre más

utilizada por Saccharomyces es el sulfato de amonio, el sulfito y el tiosulfato; la

metionina puede ser utilizada como fuente única de azufre y permite un crecimiento

más rápido que los iones sulfatos (Carballo, 2000).

• Elementos traza:

Macronutrientes. K, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Cl. Se requiere en concentraciones de 0.1

– 1 mM.

10

• Potasio:

A pH ácidos estimula la fermentación y la respiración, actúa como efector de

numerosas enzimas: piruvato quinasas, aldolasa, aldehído deshidrogenasa y

permeasa e interviene en la estructura de los ARN. Las fuentes de potasio son el

cloruro potásico y los fosfatos mono y dipotásico (Carballo, 2000).

• Magnesio:

Es utilizado como activador de las enzimas glicolíticas, estimula la síntesis de ácidos

grasos, regulas las ATPasas de las membranas y participa con el potasio en la

penetración del fosfato. El magnesio es aportado en los medio de cultivo en forma

de sulfato o de cloruro de magnesio (Carballo, 2000).

• Microelementos: Co, B, Cd, Cr, Cu, I, Mo; Ni, Va. Se requieren concentraciones

0.1 - 100µM.

Los inhibidores, los cuales pueden afectar el crecimiento de la levadura cuando se

encuentran en concentraciones superiores a 100µM: Hg, Ag, Ar, Ba, Li, Ni, Os, Pb,

Se, Te (Tuite y Oliver, 1991).

• Otros compuestos:

El inositol juega un papel importante en la síntesis de los lípidos de las membranas.

El pantotenato es un factor de crecimiento para Saccharomyces y debe presentarse

en el medio en forma de pantotenato de calcio a una concentración de alrededor de

6.25mg/l.

La vitamina B6 o piridoxina es transformada en fosfato de piridoxal y en

piridoxamina, coenzimas implicadas en la desaminación y descarboxilación de los

aminoácidos.

La tiamina (vitamina B1) tiene un papel en el metabolismo respiratorio, el

metabolismo de los lípidos, la glucólisis y la fermentación alcohólica. Las

necesidades para S. cerevisiae son alrededor de 5 mg/l en tiamina-HCl.

11

La biotina es un factor de crecimiento para las levaduras. Está implicada en

numerosas reacciones anabólicas: carboxilación del piruvato, síntesis de las bases

púricas y pirimídicas, de los nucleótidos y de los ácidos nucleicos, síntesis de las

proteínas, de los polisacáridos y de los ácidos grasos.

Las necesidades de biotina son del orden de 1mg/l para S. cerevisiae. Las otras

vitaminas, ácido fólico, ácido p-amino benzoico y riboflavina son normalmente

sintetizadas por las levaduras (Carballo, 2000).

2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae

Es un microorganismo que puede llevar a cabo un metabolismo respiratorio o

fermentativo de acuerdo con concentración de oxígeno (Noor, et al., 2003). En

condiciones aerobias aumenta la biomasa y produce poco alcohol, pero en

anaerobiosis el crecimiento celular es lento y la producción de etanol es alta. Por

esta razón, la oxidación completa de la fuente de carbono a CO2 y H2O presenta

una producción celular óptima, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones en

la fosforilación oxidativa durante la respiración. Es así, que en concentraciones altas

de oxígeno disuelto la fermentación de azúcar a etanol es inhibida. Esta situación

fue observada por Pasteur en 1967, y se denomina el efecto Pasteur (Fiechter, et

al., 1981).

Saccharomyces cerevisiae convierte la glucosa a etanol a través de la ruta de la

glicólisis. Esta es una vía ubicua para el catabolismo de los monosacáridos. Por

cada molécula de hexosa que se convierte a piruvato, hay una producción neta de

dos moléculas de ATP a partir de ADP + Pi y dos moléculas de NAD + se reducen a

NADH. La glicólisis se puede dividir en dos etapas: una de hexosas, en la cual el

ATP es consumido, y una etapa de triosas, en la cual se obtiene una ganancia neta

de ATP (Nelson y Cox. 2000).

En la fermentación alcohólica la producción de etanol se presenta en dos pasos: el

piruvato es descarboxilado por la piruvato descarboxilasa hasta acetaldehído; este

último es reducido a etanol por la alcohol deshidrogenada, con liberación de NAD+

12

proveniente de la etapa de la glicólisis, que había oxidado el 3-fosfogliceraldehido a

ácido 3- fosfoglicerico. El etanol y CO2 son productos finales de la fermentación

alcohólica y su ecuación general es la siguiente:

Glucosa + 2 ADP + 2 Pi 2 Etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

La conversión de glucosa en etanol y CO2 produce 2 moles de ATP por mol de

glucosa transformada (Nelson y Cox. 2000).

2.7.2. Tolerancia al etanol

No todas las levaduras presentan la misma sensibilidad al etanol. Las más

resistentes son las especies de Saccharomyces sp. que se presentan en los

procesos de fermentación alcohólica para la elaboración de bebidas o la producción

industrial de etanol. Según las cepas y el estado fisiológico del cultivo, el etanol es

tóxico en concentraciones del 8% (p/v) al 18% (p/v). La tolerancia al etanol depende

de la composición en ácidos grasos de las membranas citoplasmáticas. Las células

cultivadas en presencia de ácido linoleico (C18:2) toleran mejor el etanol añadido al

medio que las células en presencia de ácido oleico (18:1). La viabilidad es mejor en

presencia de ergosterol que de camposterol (Carballo, 2000).

El etanol intracelular es más tóxico para las células que el etanol extracelular. La

viabilidad de los cultivos puede incrementar por la eficiencia de la excreción del

etanol, debido a esto, hay una influencia de la presión osmótica: cuando la presión

osmótica aumenta en el medio, la secreción del etanol se disminuye

considerablemente. En un medio que contiene 30% (p/v) de sorbitol y 10% (p/v) de

sacarosa, no hay prácticamente ninguna secreción del etanol durante 24 horas

mientras que en un medio con presión osmótica baja, el etanol difunde rápidamente.

Las medidas de etanol intracelular permiten situar el lumbral de toxicidad hacia 0.25

mg de etanol intracelular para 106 células viables. Es así que, la presión osmótica

elevada de los medios representa un problema importante en la fermentación

alcohólica, que debe ser tenido en cuenta en el procedimiento (Carballo, 2000).

13

Por otra parte, para hacer frente a estas situaciones desfavorables, S. cerevisiae

responde rápidamente sintetizando moléculas que le permiten actuar o reparar el

daño causado por el estrés. Entre las moléculas mejor caracterizadas en la

respuesta están las llamadas “proteínas de estrés”. Su estudio ha evidenciado que

la respuesta a nivel transcripcional es importante para la supervivencia celular y ha

llevado a la descripción de varias vías de transducción de señales y factores de

transcripción involucrados en esta respuesta (Folch, et al, 2004). Según estudios el

etanol inhibe el crecimiento de los microorganismos y causa daños en el ADN

mitocondrial de las células de las levaduras y la inactivación de algunas enzimas

como la hexoquinasa y la dehidrogenasa. Además, se ha encontrado que cuando S.

cerevisiae crece en presencia de etanol se incrementa la cantidad de ácidos grasos

insaturados en la membrana como una alternativa ante el estrés generado por la

toxicidad del etanol (Martini, et al., 2005; Man, et al., 2003).

2.8. Determinación de azúcares reductores

Una de las técnicas usadas para la detección de azúcares reductores es la

denominada DNS o ácido 3,5 dinitrosalicílico; esta es una técnica de oxido-

reducción en la que el ácido 3,5 dinitrosalicílico es reducido mientras que el grupo

aldehído del monosacárido es oxidado. La reducción del reactivo genera una

coloración amarilla la cual es proporcional a la concentración de azúcares

reductores presentes, esto se evidencia por medio de la lectura de absorbancias en

el espectrofotómetro lo que implica la aplicación de la ley de Beer Lambert (Miller,

1959).

14

3. JUSTIFICACIÓN

Actualmente la acumulación de residuos sólidos principalmente de origen vegetal

han generado impactos ambientales por el creciente desarrollo especialmente en el

sector agroindustrial como la floricultura; ya que producen alteraciones en el paisaje,

olores, plagas de insectos y roedores, generan gases tóxicos al ser incinerados

como una alternativa de manejo, producen eutrofización de aguas si estos o sus

lixiviados son dispuestos en cuerpos de agua y potencializan riesgos de

magnificación de plaguicidas en la cadena trófica si estos se dan como alimento a

animales de granja (Corbitt, 2003). Aproximadamente, el 90% de los residuos

sólidos generados en floricultura corresponden a residuos vegetales, los cuales

ofrecen tanto una amenaza al ambiente como una alternativa de uso biotecnológico

según el manejo y disposición que se les dé. Actualmente, la oportunidad consiste

en aprovecharlos en compostaje y reincorporarlos al proceso productivo como

fuente de nutrientes (Asocolflores, 2000).

Además, junto al manejo de los residuos vegetales se está presentando el impacto

ambiental por la emisión de gases de efecto invernadero en la utilización de

combustibles fósiles, pues actualmente es uno de los problemas que esta afectando

a todo el mundo, por la incidencia en el cambio climático y la contaminación

atmosférica; por esta razón, muchos países como Brasil y Estados Unidos, están

adoptando como alternativa a esta problemática, el uso del alcohol combustible

“Bioetanol”, para reducir las emisiones nocivas ambientales (Zaldivar, et al., 2001).

Por tal motivo el aprovechamiento biotecnológico de estos residuos vegetales como

sustratos de origen natural en la producción de biomasa y bioetanol, proporcionan

ventajas en la reducción tanto en el costo de la materia prima, como en el volumen

de residuos generados y en las emisiones de gases de efecto invernadero mitigando

esta serie de impactos ambientales.

La utilización de microorganismos representa una opción viable para la producción

de etanol, además, del manejo de residuos vegetales que pueden servir como

fuente de carbono para la producción del mismo, favoreciendo al medio ambiente.

Por esto, en el presente trabajo se plantea una alternativa biotecnológica para la

15

obtención de un sustrato fermentable a partir de la conversión del material vegetal

por pretratamiento biológico con microorganismos celulolíticos y su evaluación con

células libres de Saccharomyces cerevisiae en producción de biomasa y de etanol,

usando un sustrato económico y de origen natural, que puede llegar a proporcionar

los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo.

16

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Obtener un sustrato fermentable a partir de residuos vegetales de Crisantemo

(Dendranthema grandiflora) y evaluarlo con células libres de Saccharomyces

cerevisiae.

4.2. Objetivos específicos

Obtener un extracto crudo que pueda ser utilizado como sustrato fermentable.

Evaluar el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en el sustrato de origen

vegetal

Comparar rendimientos Yx/s y Yp/s obtenidos a partir del sustrato

fermentable de origen vegetal con los obtenidos a partir de medio de cultivo

YGC.

Cuantificar el etanol como producto final de la fermentación del sustrato de

origen vegetal.

17

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los procesos experimentales planteados en este proyecto fueron realizados

por triplicado.

Durante todos los procedimientos se llevó a cabo la prueba de pureza para asegurar

cultivos axénicos.

5.1. Ubicación

Este proyecto de investigación, se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de

Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.2. Obtención del sustrato fermentable

5.2.1. Microorganismos

Se utilizó un consorcio microbiano celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de

origen vegetal y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitán y Pérez

2006)

5.2.2. Residuo Vegetal

Se utilizaron residuos de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de

un cultivo localizado al norte del municipio de Tocancipá. Estos fueron sometidos a

una caracterización físico-química en un laboratorio certificado por el FCA. A los

residuos vegetales se les realizó pretratamiento tanto químico, como biológico para

obtener el extracto crudo o sustrato fermentable (SF), éste fue la fuente de carbono

(azúcar fermentable: glucosa) para ser utilizado como sustrato fermentable en la

producción de etanol con células libres de Saccharomyces cerevisiae.

18

5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal

El objetivo de estos procedimientos fue aumentar la susceptibilidad del residuo

vegetal, al reducir la cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad y de

esta manera obtener un extracto crudo con mayor concentración de glucosa; por lo

tanto, se seleccionó el mejor pretratamiento por análisis de medias (Daniel, 2002;

Romano, et al., 2005).

5.2.3.1. Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)

Los residuos vegetales de Crisantemo se lavaron con SDS (Sodio Dodecil Sulfato)

al 1% (p/v) y se redujo de tamaño realizando molienda, para posteriormente ser

sometidos a ebullición por un periodo de una hora con SDS al 1% (p/v). Luego se

realizó un secado a 55°C y por último, se sometió a un proceso de esterilización

(Guevara y Zambrano, 2006).

5.2.3.2. Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación

oxidativa)

En una solución alcalina de peróxido de hidrógeno al 2% se suspendió el residuo

vegetal molido y pretratado con SDS en una relación 10:1 respectivamente, esta

mezcla fue llevada a un baño termostatado durante 12 horas a 50°C. Luego se filtró

y lavó con agua destilada. Por último se sometió a un proceso de secado en horno

de convección a 90°C por 12 horas (Sun, et al., 2000).

El residuo vegetal fue sometido a diferentes pretratamientos todos con reducción de

tamaño:

• Lavado con SDS.

• Lavado con SDS y tratado con peróxido de hidrógeno.

• Sin lavado con SDS y sin tratamiento con peróxido de hidrógeno (Control).

• Sin lavado con SDS y con tratamiento con peróxido de hidrógeno.

Todos los anteriores se sometieron a temperatura de 50°C por 12 horas,

condiciones del pretratamiento con peróxido de hidrógeno.

19

5.2.4. Pretratamiento biológico

5.2.4.1. Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del

consorcio celulolítico

Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v)

y 12% (p/v) de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtenía la

mayor concentración de azúcares reductores.

5.2.4.1.1. Preparación del inóculo

Las cepas de los microorganismos celulolíticos fueron cultivadas en agar celulosa al

1% (p/v), cuya composición en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura

2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato

monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/-

0.2, bajo condiciones controladas de 35°C por 48 horas. Posteriormente, se realizó

un raspado de las colonias para preparar una suspensión en solución salina

0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml, la cual fue obtenida para el

inóculo de bacterias igualando al tubo 5 de McFarland. En el caso del inóculo del

actinomiceto se realizó el recuento en cámara de Neubauer para obtener la misma

concentración en el consorcio.

En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los

10ml de preinóculo y se cultivaron a 130 rpm, 35ºC por 24 horas.

5.2.4.1.2. Fermentación discontinua

Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal estéril a la concentración

correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) ó 12%(p/v)) cuya composición en g/L es:

residuo vegetal a las diferentes concentracines, extracto de levadura 2.5, peptona

universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de

potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, (Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros;

posteriormente se agregó el 10% de inóculo (100mL), y se controlaron las

20

condiciones de operación: temperatura 35°C por 24 horas y agitación de 130 rpm.

Adicionalmente, como control se realizó una fermentación con la concentración de

residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) sin la adición de los demás componentes

(sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo SV), esto para verificar si el residuo

proporcionaba todas las fuentes nutricionales para el desarrollo de los

microorganismos celulolíticos.

Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas. Para cada

muestreo, se tomaron 6 mL distribuidos así: 1mL para evaluar la producción de

azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959), 2mL para

determinación de pH, 3mL para determinación de actividad enzimática.

Al finalizar el proceso de fermentación se obtuvo el extracto crudo o sustrato

fermentable (SF), mediante un proceso de centrifugación y filtración, con el fin de

eliminar la población celular.

Se seleccionó la concentración de residuo vegetal que arrojó mayor cantidad de

azúcares; éste sustrato fermentable obtenido, fue sometido a la técnica de

cromatografía líquida HPLC para evaluar la concentración de glucosa, sacarosa y

celulosa disponible.

5.2.5. Determinación de actividad celulolítica cuantitativa

Esta se realizó evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes

(37 y 50°C) reportadas por literatura. Para la interpretación de los resultados, una

unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una

micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo (Guevara y

Zambrano, 2006).

5.2.5.1. Actividad celulolítica a pH 7

Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de

muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta

21

en buffer fosfato 0.1M pH 7 +/- 0.2 (Anexo A1). La mezcla final se incubó en baño

termostatado a 37°C durante 1 hora, finalizado este tiempo se frenó la reacción

refrigerando a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó la muestra por

10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determinó la concentración de

azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959; Guevara y Zambrano,

2006).

5.2.5.2. Actividad celulolítica a pH 5

Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de

muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta

en buffer ácido cítrico 0.1M pH 5 +/- 0.2 (Anexo A2). La mezcla final se incubó en

baño termostatado a 50°C durante 1 hora, finalizado este tiempo se frenó la

reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó la

muestra por 10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determinó la

concentración de azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959; Sun y

Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005).

5.3. Evaluación del Sustrato con Saccharomyces cerevisiae

Como microorganismo control para la producción de etanol se utilizó la levadura

Saccharomyces cerevisiae (Muñoz y Poutou, 1999). La cepa fue tomada del banco

de cepas del Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad Javeriana.

A partir de la concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccionó el

sustrato fermentable que aportó mayor concentración de azúcares reductores para

la fermentación con Saccharomyces cerevisiae.

5.3.1. Fermentación discontinua control

Se realizó esta fermentación con el objetivo de verificar la actividad metabólica de la

cepa Saccharomyces cerevisiae en la producción de etanol.

22

5.3.1.1. Preparación del inóculo

La cepa de Saccharomyces cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composición

es en g/L: extracto de levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9,

pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo condiciones controladas de 30ºC por 12 horas.

Posteriormente se realizó un raspado de las colonias de la levadura para preparar

una suspensión en solución salina 0.85%(p/v), con una absorbancia de 0.8 a

620nm.

En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml

de preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.

5.3.1.2. Fermentación discontinua

Se adicionaron 1350mL de caldo YGC estéril a un erlenmeyer de 2 litros;

posteriormente se agregó el 10% de inóculo (150ml), y se controlaron las

condiciones de operación: temperatura 30°C por 14 horas y agitación de 70rpm

(Noor, et al., 2003).

Se tomaron 3 ml de medio estéril para determinar la concentración inicial de sustrato

y el pH. Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 7 ml de muestra, que

correspondió a la hora cero (0) y, posteriormente se realizaron cada dos horas hasta

completar 14 horas; a estas muestras se les determinó la concentración de biomasa

por el método de peso seco y de azúcares reductores mediante la técnica de DNS.

Adicionalmente, se evaluó la producción de etanol por cromatografía líquida HPLC.

5.3.2. Fermentación discontinua con sustrato vegetal (SF)

5.3.2.1. Preparación del inóculo

La cepa de Saccharomyces cerevisiae fue cultivada en agar YGC, bajo condiciones

23

controladas de 30ºC por 12 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las

colonias de la levadura para preparar una suspensión en solución salina 0.85%(p/v),

con una absorbancia de 0.8 a 620nm.

En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml

de preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.

5.3.2.2. Fermentación discontinua

Se adicionaron 1350mL de caldo SF a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se

agregó el 10% de inóculo (150ml), y se controlaron las condiciones de operación:

temperatura 30°C por 24 horas y agitación de 70 rpm (Noor, et al., 2003).

Se tomaron 3 ml de medio estéril para determinar la concentración inicial de sustrato

y el pH. Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 7 ml de muestra, que

correspondió a la hora cero (0) y, posteriormente se realizaron cada dos horas hasta

completar 32 horas; a estas muestras se les determinó la concentración de biomasa

por el método de peso seco, de azúcares reductores mediante la técnica de DNS

(Miller, 1959) y de etanol por cromatografía líquida HPLC.

5.3.3. Determinación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5

dinitrosalicílico (DNS)

Se tomó un volumen de 0.25 ml a partir del extracto crudo obtenido en cada

muestreo durante la fermentación, al cual se le adicionó 0.25 ml de DNS, esta

mezcla fue sometida primero a ebullición por 5 minutos, y luego a un recipiente con

hielo por 5 minutos para frenar la reacción, y por último se adicionaron 2.5 ml de

agua destilada, a la mezcla. Para determinar la absorbancia, esta solución fue leída

en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad media. El

dato de absorbancia fue reemplazado en la ecuación de la línea recta determinada

por la curva patrón utilizando glucosa previamente realizada y se obtuvo la

concentración de glucosa residual en g/L para cada muestreo (Miller, 1959).

24

5.3.4. Determinación de biomasa por peso seco en función del tiempo

Este procedimiento permitió obtener la concentración celular de Saccharomyces

cerevisiae al transformar los valores de absorbancia correspondientes a cada

tiempo de fermentación en unidades de gramos de masa celular seca por litro (g/L).

Para realizar la curva patrón de peso seco, se preparó una suspensión concentrada

de la levadura, fue lavada dos veces con solución salina 0.85% (p/v) por

centrifugación a 2250 g por 20 minutos. El pellet se resuspendió al volumen inicial.

Posteriormente, fueron adicionados en 10 tubos previamente pesados 10 mL de la

solución de células a cada uno, igualmente 10 mL de solución salina en 10 tubos

que sirvieron como blanco. Estos fueron llevados al horno a 105°C por 24 horas,

terminado el tiempo de evaporación del líquido se pasaron al desecador para ser

pesados nuevamente y determinar el promedio del peso de los 10 tubos que

contenían las células y el de los 10 tubos con solución salina, a partir de esto se

calculó la diferencia de peso entre los dos promedios para expresar la concentración

en gramos de biomasa seca por litro de solución (g/L). A partir de la solución

concentrada de células se realizaron diluciones por triplicado para ajustar la

absorbancia entre 0.2 – 0.9 y calcular las concentraciones finales para cada

dilución. Esto permitió hallar la ecuación bcmAbs += * al graficar la absorbancia

promedio en función de la concentración celular (g/L).

Se tomaron 5 ml de cada muestra de fermentación, se realizaron dos lavados con

solución salina 0.85 % (p/v) por centrifugación a 2250 g por 20 minutos. El pellet se

resuspendió al volumen inicial. Se agitó en vortex y se leyó la absorbancia a 620nm

para hallar la concentración de biomasa a partir de la ecuación de peso seco

(Godoy, 2002).

5.3.5. Determinación de etanol

El contenido de etanol se analizó por cromatografía líquida de alto desempeño

HPLC, en un cromatógrafo WATERS, con detector de indice de refracción (Waters

25

Corporation, Milford, MA). La fase móvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se

empleo una columna Sugar Pak I con precolumna KC-G (Waters Corporation,

Milford, MA). La temperatura de la columna fue 84°C. Para el análisis de los

resultados se uso el programa Millenium V 2.15.01.

Para la determinación de los factores de respuesta se utilizaron glucosa grado

cromatográfico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analítico

Merck (Darmastadt, Alemania).

5.3.6. Determinación de rendimientos

A partir de los datos de biomasa obtenidos por peso seco, de sustrato por la técnica

del DNS, y de producto por cromatografía líquida HPLC. Se determinaron los

rendimientos por las siguientes fórmulas (Doran, 1995):

sustratodeconsumoformadoproducto

sp

Y..

)etanol.(.=

sustratodeConsumoformadaBiomasa

sx

Y..

.=

5.3.7. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los datos obtenidos se realizaron curvas de biomasa,

consumo de sustrato y actividad enzimática en función del tiempo, además se utilizó

el programa SPSS versión 14 en el cual se determinaron las medias (nivel de

confianza 95%), la desviación estándar, el coeficiente de variación y la estadística

de prueba de la distribución t student para comparar la concentración de azúcares

liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la

26

concentración celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el

SF (Daniel, 2002).

Hipótesis general:

La concentración de azúcares reductores liberados en la fermentación con SV al

10%(p/v) no difiere de la concentración de azúcares reductores liberados en la

fermentación con SV al 12%(p/v).

H0: µ1 - µ2 = 0

Hi: µ1 - µ2 � 0

Hipótesis general:

La concentración celular de Saccharomyces cerevisiae en el caldo sustrato

fermentable no difiere de la concentración celular en el caldo YGC con 2 g/L de

glucosa (control).

H0: µ1 - µ2 = 0

Hi: µ1 - µ2 � 0

27

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Pretratamiento del residuo vegetal

El propósito de realizar pretratamiento a los residuos vegetales es aumentar la

susceptibilidad del material al remover la lignina y hemicelulosa, reducir la

cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad del residuo. Por tal razón, se

evaluaron diferentes pretratamientos para determinar cual permitía obtener mayor

concentración de azúcares reductores, al facilitar la hidrólisis enzimática de la

celulosa por parte del consorcio celulolítico. Para estos análisis se seleccionó la

concentración de residuo vegetal al 10% (p/v) por ser la concentración intermedia a

las propuestas.

Con el residuo vegetal molido tratado con y sin SDS; se realizó una fermentación de

22 horas realizando muestreos en las horas 0 y 22, obteniendo como resultado que

la mayor cantidad de azúcares reductores liberados por los microorganismos

celulolíticos se presentó en el residuo vegetal sin tratamiento con SDS teniendo una

concentración de 2.46 g/L comparado con 1.44g/L del tratado con SDS (Figura 1,

anexo C).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 22

TIEMPO (h)

CALDO SV 10% SIN SDS CALDO SV 10% CON SDS

Figura 1. Azúcares reductores liberados en función del Tiempo. Residuo tratado con

SDS y sin SDS.

28

Al realizar los pretratamientos del residuo al 10% (p/v) con SDS, con peróxido de

hidrógeno 2% y un control en agua a las mismas condiciones 50°C por 12 horas,

se evaluó la liberación de azúcares reductores por parte del consorcio celulolítico en

una fermentación de 22 horas para cada tratamiento. El control se realizó con el

objetivo de evaluar el efecto de la temperatura. La concentración de azúcares

reductores con el residuo tratado con SDS y H2O2 fue de 0.870 g/L, estos

resultados mostraron que no actuó el complejo enzimático por parte del consorcio

celulolítico; porque de la hora 0 a la 22 no hubo una diferencia en la concentración

de azúcares reductores; mientras que en el control se presentó la mayor

concentración de azúcares reductores 1.84g/L a las 12 horas teniendo relación con

la mayor actividad enzimática 52.1 UC/L, como se observa en la tabla 1.

Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal al 10% sin

suplemento tratado con SDS y peróxido de hidrógeno. (Temperatura 50°C por 12

horas).

ND = No se determinó a Una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una

micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.

Se observó que el tratamiento a 50°C por 12 horas no tiene efecto en la liberación

de azúcares (Tabla 1); ya que los resultados obtenidos con el residuo vegetal sin

ningún tratamiento (sin SDS, sin H2O2 y sin temperatura a 50°C) son similares en la

hora 0 de fermentación (1.35 g/L y 1.329 g/L) (Figura 1), además en la hora 22 la

concentración de azúcares reductores fue mayor (2.461 g/L), que en el control de la

CALDO SV 10% (p/v) CON

SDS


H 2O2 Y SIN SDS

CALDO SV 10% (p/v)SIN

H 2O2 Y SIN SDS (control)


H 2O2 Y CON SDS

AZÚCARES

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

AZÚCARES

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

AZÚCARES

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

AZÚCARES

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC HO

RA

g/L aUC/L g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L

0 0,595 0,0 0,471 0,0 1,350 0,0 0,835 0

12 0,926 23,1 0,484 15,0 1,840 52,1 ND ND

22 0,749 23,9 0,555 17,4 1,502 40,0 0,871 4,07

29

fermentación del residuo con tratamiento de temperatura (1.502 g/L); posiblemente,

en los pretratamientos al realizar los lavados para retirar tanto el SDS como el

peróxido de hidrógeno se pierden varios nutrientes necesarios para el crecimiento y

actividad enzimática de los microorganismos celulolíticos.

Estos resultados reflejaron que el tratamiento con SDS y H2O2 causa una inhibición

enzimática en el consorcio celulolítico, esto se debe a que el SDS es un tensoactivo

iónico y desnaturalizante de proteínas, y al quedar trazas de éste en el residuo

impide la degradación de la celulosa por parte del complejo enzimático (Castagnino,

2000), al igual que el peróxido de hidrógeno, agente oxidante usado para remover

la lignina y la hemicelulosa presentes en materiales lignocelulósicos. Según la

caracterización físico – química del residuo vegetal de Crisantemo, el porcentaje de

lignina es 0.51%, de hemicelulosa 2.03% y celulosa 65.3% (Anexo D), por lo tanto,

el pretratamiento con peróxido no sería necesario por la baja proporción de lignina y

hemicelulosa. Por el contrario su presencia inhibió la hidrólisis enzimática al

proporcionar un pH alcalino de 9.8 el cual esta por encima de las condiciones

óptimas de actividad del complejo enzimático reportadas por varios autores pH 5 a

50°C (Palmarola, et al., 2005; Sun y Cheng 2002; Duff y Murria, 1996).

Al comparar los pretratamientos realizados al residuo vegetal, se determinó que era

suficiente la reducción de tamaño del material para obtener mayor concentración de

azúcares reductores y de actividad enzimática, pues algunos factores que afectan la

hidrólisis de la celulosa son el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad de

la materia prima (área superficial accesible) y cristalinidad de la celulosa, la cual se

reduce con la molienda; por lo tanto, no es necesario realizar tratamientos químicos

al residuo de crisantemo debido a la mínima proporción de lignina y hemicelulosa,

polímeros que reducen la eficiencia de la hidrólisis (Prasad, et al., 2006); debido

esto, el residuo vegetal se redujo de tamaño en un molino de martillo hasta que

pasara por un tamiz con un diámetro de poro menor a 850µm.

30

6.2 Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico

El objetivo de utilizar el consorcio celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en

fermentación discontinua con el residuo vegetal, fue obtener azúcares reductores

presentes en la celulosa, gracias a la hidrólisis enzimática catalizada por el complejo

de celulasas. Por tal razón se evaluaron diferentes variables: concentración 5%

(p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo vegetal fresco y suplemento con: sales,

extracto de levadura y peptona (SVS), que podrían tener algún efecto sobre la

degradación de este polímero y por ende, en la concentración de azúcares

reductores liberados en el extracto crudo al finalizar la fermentación (Figura 2). De

acuerdo con estos resultados, se determinaron las variables que permitieran obtener

la mayor concentración de azúcares reductores en el extracto crudo que fue

evaluado como sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae.

Figura 2. Fermentación del residuo vegetal con el consorcio celulolítico.

6.2.1 Residuo vegetal al 10% (p/v)

Para confirmar el efecto del tratamiento con SDS en la hidrólisis enzimática, se

decidió realizar una fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal

fresco al 10% (p/v), suplementado (SVS) y tratado con SDS, se realizaron

muestreos desde la hora 12 hasta la 24 (Figura 3, tabla 1 del anexo E). Además se

31

realizó una fermentación con SVS sin tratamiento con SDS (Figura 4, tabla 2 -

anexo E), para establecer diferencias, con el fin de determinar si el consorcio

necesita otros requerimientos nutricionales para su crecimiento y actividad

enzimática.

Al comparar los resultados de la fermentación con suplemento (SVS) 10% (p/v) con

y sin tratamiento se observó que la actividad enzimática del consorcio es mejor al

utilizar el residuo sin tratamiento, al obtenerse una concentración de azúcares

reductores de 1.63g/L a la hora 12, mientras que en el residuo tratado fue 1.317 g/L

en la hora 20 (Figura 3 y 4). Este resultado corroboró que el SDS afecta la hidrólisis

enzimática y reduce su velocidad de reacción; probablemente al quedar trazas de

este tensoactivo en el residuo vegetal; razón por la cual se decidió no realizar

ningún pretratamiento, lo que significa una gran ventaja para llevar a cabo el

proceso al disminuir costos y tiempo de fermentación.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 5 10 15 20 25 30

TIEMPO (h)

AZ

ÚC

AR

ES

RE

DU

CT

OR

ES

(g

/L)

0

10

20

30

40

50

60

UC

/L

Azúcares reductores (g/L) UC/L pH 7 37°C UC/L pH 5 50°C

Figura 3. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10%,

tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad

enzimatica pH 7 a 37°C Y pH 5 a 50°C en función del Tiempo.

Al analizar los resultados de la fermentación con residuo fresco al 10% (p/v) sin

tratamiento, con y sin suplemento, se observó que la mayor concentración de

32

azúcares reductores liberados se presentó al utilizar el residuo sin suplemento de

sales y fuente de nitrógeno (caldo SV). A la hora 12 y 22 se obtuvo una

concentración de azúcares de 2.08 g/L y 2.47 g/L, respectivamente (Figura 4, tabla

3 - anexo E), mientras que en la fermentación con el residuo suplementado (caldo

SVS) la mayor concentración de azúcares fue 1.63 g/L a la hora 12.

Este resultado se presentó gracias a la composición del residuo vegetal, el cual

posee 5.01% de proteínas como fuente de nitrógeno, además de minerales que

proporcionan un medio nutritivo para el crecimiento del consorcio celulolítico (Anexo

E). Los requerimientos nutricionales de los microorganismos celulolíticos son

nitrógeno, fósforo, azufre, macroelementos y microelementos, los cuales

encuentran en su ambiente natural (residuo de Crisantemo); por esta razón no se

requieren de fuentes adicionales de nutrientes como peptona, extracto de levadura y

sales (Lynd, et al., 2002).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 5 10 15 20 25

TIEMPO (h)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH

Azúcares (con suplemento) Azúcares (sin suplemento)

pH (con suplmento) pH (sin suplemento)



y sin suplemento.

33

Para determinar las mejores condiciones de la actividad celulolítica se evaluó la

técnica cuantitativa en un buffer fosfato pH 7 a 37ºC y un buffer de ácido cítrico pH 5

a 50ºC. Según varios autores el pH ácido en un rango de 4 a 5 y la temperatura

entre 45ºC – 50ºC, favorecen la hidrólisis enzimática de la celulosa (Palmarola, et

al., 2005; Sun y Cheng, 2002; Duff y Murria, 1996). Los resultados obtenidos

mostraron en general, que la actividad enzimática es mayor en condiciones de pH 7

y 37ºC (Figura 5 y 6), evidenciando que la expresión de las enzimas es mejor a pH

neutro y a una temperatura que no exceda los 40ºC, por ser microorganismos

mesófilos; y el pH ácido reduce la producción enzimática de los dos

microorganismos en consorcio (Lynd, et al., 2002).

No obstante, la actividad celulolítica es muy baja con el consorcio celulolítico; ya que

la mayor actividad fue de 98.4UC/L (0.098 UC/mL), a la hora 22 de la fermentación

con caldo SV 10% (p/v) (Figuras 5 y 6), en la cual el pH se mantuvo en un rango de

6 – 7 durante todo el proceso (Figura 4). Esta actividad es menor a la reportada por

Guevara y Zambrano 2006, al utilizar consorcios con cepas de B. subtilis y

Streptomyces sp. en residuos de caña de azúcar, obteniendo valores máximos de

0.694 UC/mL y 0.680 UC/mL. A pesar que la actividad celulolítica se determinó con

carboximetilcelulosa (CMC), sustrato que no representa la misma estructura

heterogénea de los sustratos celulósicos naturales; siendo más fácil de degradar por

los microorganismos al producir enzimas endoglucanasas, mientras que la hidrólisis

de la celulosa cristalina requiere todo el complejo enzimático (Guevara y Zambrano

2006). Esto indica que los microorganismos utilizados para degradar el residuo

vegetal de Crisantemo no tienen una buena actividad celulolítica, también se ve

reflejado en la baja concentración de azúcares reductores liberados, al tener en

cuenta que la proporción de celulosa en el residuo vegetal es de 65.3% (Anexo D),

aunque varios autores reportan que Streptomyces sp. produce las enzimas del

complejo, endoglucanasas, exoglucanasa y �- glucosidasa (Ramírez y Coha 2003).

34

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

TIEMPO (h)

UC

/L

UC/L 10% sin suplemento UC/L 10% con suplemento



y sin suplemento.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

TIEMPO (h)

UC

/L




y sin suplemento.

35


Al evaluar esta concentración de residuo vegetal en caldo SV y SVS se observó que

el consorcio tiene el mismo comportamiento de la fermentación al 10% (p/v), ya que

la mayor concentración de azúcares reductores se obtuvo a la hora 14 con 2.25 g/L

en el caldo SV, mientras en el caldo SVS fue 2.15 g/L (Figura 7, tabla 4 y 5 - anexo

E). Igualmente la actividad enzimática fue baja y mostró mejor expresión a 37ºC

(Figura 8 y 9) y pH neutro, durante las 22 horas de fermentación el pH se mantuvo

entre 6 y 7 (Figura 7).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

TIEMPO (h)

AZ

ÚC

AR

ES

RE

DU

CT

OR

ES

(g

/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pHAzúcares (con suplemento) Azúcares (sin suplemento)

pH (con suplemento) pH (sin suplemnto)



y sin suplemento.

36

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

TIEMPO (h)

UC

/L




y sin suplemento.

0102030405060708090

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

TIEMPO (h)

UC

/L


Figura 9. Actividad enzimática pH 5 a 50°C vs. Tiempo. Fermentación del

consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con y

sin suplemento.


En esta fermentación, se observó que la mayor actividad enzimática y concentración

de azúcares reductores fue de 35.70 UC/L (pH 7 a 37°C) y 0.849g/L en la hora 18,

37

respectivamente (Figura 10). Al comparar las tres concentraciones evaluadas de

sustrato vegetal con suplemento (SVS) 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) se

observaron valores muy bajos, por tal razón, no se realizaron más experimentos con

la concentración al 5% (p/v), como se muestran en la tabla 6 - anexo E.

0

0.10.2

0.3

0.40.5

0.60.70.80.9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

TIEMPO (h)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

UC

/L

Azúcares reductores (g/L) UC/L pH 7 37ºC

Figura 10. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 5%

(p/v), tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad

enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo.

La concentración de sustrato es uno de los principales factores que afectan la

producción y la velocidad inicial de la hidrólisis enzimática de la celulosa. Un

incremento de la concentración de sustrato normalmente resulta en un aumento de

la producción y de la velocidad de reacción de la hidrólisis. Sin embargo, altas

concentraciones de sustrato pueden causar inhibición enzimática, lo cual disminuye

sustancialmente la velocidad de la hidrólisis, y la dimensión de la inhibición por

sustrato depende de la relación del sustrato total a enzima total (Romano, et al.,

2005; Sun y Cheng, 2002). Al evaluar las tres concentraciones de residuo vegetal

(SVS) se observó una diferencia en la actividad celulolítica entre el 5% (p/v) y el

10% (p/v), pues la mayor actividad en el caldo SVS, fue 35.70 UC/L y 64.2 UC/L

respectivamente, de igual forma en el caldo SVS 12% (p/v) fue 80 UC/L a 37ºC y pH

7. En el SV 10% (p/v) y 12% (p/v) a la hora 22 se presentó la actividad más alta

98.4 UC/L y 105.2 UC/L respectivamente (Tabla 3 y 5 - anexo E).

38

De acuerdo al análisis de medias y la desviación estándar los datos de las

repeticiones de cada fermentación no presentaron una amplia dispersión, por lo

tanto, se determinó que la mayor concentración de azúcares reductores liberados

estaba entre el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12% (p/v) sin tratamiento y sin

suplemento, se decidió obtener el sustrato fermentable con el residuo de crisantemo

al 10% (p/v); ya que se llevo a cabo la estadística de prueba con la distribución t

student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadística para rechazar la

hipótesis nula (Ho). Por lo tanto, se afirma que no existe evidencia estadísticamente

significativa en la concentración de azúcares reductores liberados tanto en el SV

10%(p/v) como en el SV 12%(p/v). Además, la manipulación del residuo a esta

concentración (10%) era más fácil y se obtenía un volumen más alto del extracto

crudo (Anexo E). Así mismo, se decidió utilizar el caldo SV porque presentó mayor

concentración de azúcares reductores liberados, lo cual es una ventaja en cuanto

costos del proceso, ya que no es necesario adicionar fuentes nutricionales para que

el consorcio se desarrolle, pues el residuo vegetal de Crisantemo proporciona la

fuente de carbono, nitrógeno y sales. También se determinó que el tiempo de la

fermentación para la obtención del sustrato fermentable (extracto crudo) fuera de 12

horas al encontrar que la diferencia con la hora 22 no era relevante para prolongar

10 horas más el proceso.

6.3 Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

6.3.1 Fermentación discontinua control

Se evaluó el comportamiento de Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20

g/L y 2 g/L de glucosa, para determinar biomasa por peso seco (Anexo F), consumo

de sustrato y producción de etanol. Estas curvas se utilizaron como control para

evaluar el comportamiento de la cepa, teniendo en cuenta que esta levadura crece

con 20g/L de glucosa, pero debido a que la concentración de azúcares reductores

en el sustrato fermentable obtenido a partir del residuo vegetal de Crisantemo fue de

2g/L, se realizó el control con esta concentración.

39

De acuerdo a pruebas preliminares realizadas para determinar las condiciones

óptimas de las fermentaciones control se decidió llevarlas a cabo durante 16 horas a

30°C, 70 rpm, pH 6,5 – 6,7 y sin suministro de oxígeno.

Se utilizó un inóculo de 12 horas de incubación con una concentración celular de

2.76 g/L, un recuento de 50 x 106 UFC/mL, y una concentración de azúcares de 0.37

g/L

6.3.1.1 Fermentación control con 20 g/L de glucosa

En esta fermentación no se presentó una fase de adaptación, se observó una fase

exponencial desde la hora 0 hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de

6.326 g/L, en esta hora del proceso la concentración de glucosa disminuyó hasta

0.311 g/L, y luego empezó la fase estacionaria, esto mostró un crecimiento rápido

de la levadura relacionado con el consumo de sustrato (Figura 11, tabla 1 - anexo

G).

Saccharomyces cerevisiae en condiciones aerobias aumenta la biomasa y produce

poco alcohol, pero en anaerobiosis el crecimiento celular es lento y la producción de

etanol es alta al realizar la conversión de hexosas, principalmente glucosa, fructosa,

manosa y galactosa. Alrededor del 70% de la energía es liberada como calor; el

resto es preservado en dos ATP, con enlaces fosfato terminales de alta energía,

para usarlo en las reacciones de transferencia, tales como la activación de la

glucosa (fosforilación) y de aminoácidos antes de la polimerización (Romano, et al.,

2005; Zaldivar, et al., 2005). Por tal razón, Saccharomyces cerevisiae es el

microorganismo más utilizado para producción de etanol al llevar a cabo un

metabolismo respiratorio o fermentativo de acuerdo con la concentración de oxígeno

(Noor, et al., 2003).

En la fermentación control la concentración de oxígeno fue baja, por la mínima

agitación (70 rpm) y el volumen utilizado, aunque no se proporcionó totalmente las

40

condiciones de anaerobiosis para producción de etanol. Sin embargo por el

metabolismo de la levadura en medios ricos en azúcar en presencia de aire se pasa

espontáneamente al proceso anaeróbico porque el consumo de oxígeno es muy

alto, por lo que se agota rápidamente. Además, la abundante producción de CO2

suele desplazar el aire de la atmósfera, dificultando la disolución del oxígeno

(Carballo 2000; Otterstedt, et al., 2004).

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

TIEMPO (h)

BIO

MA

SA

(g

/L)

- p

H

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

Biomasa (g/L) pH Azúcares reductores (g/L)


tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L

de glucosa.

Al principio de la fermentación el valor de pH fue de 6.38, al transcurrir el proceso el

pH disminuyó hasta llegar a 5 en la hora 10, lo que tuvo relación con la caída de la

concentración de la fuente de carbono; esto indica que el consumo de la glucosa

acidificó el medio al producirse ácidos como el succínico, acético, fórmico,

propiónico y pirúvico. Desde la hora 12 el pH presentó un leve aumento debido al

consumo del extracto de levadura; ya que se da la liberación de aminoácidos y otros

productos nitrogenados (Figura 11).

Para cuantificar el etanol por cromatografía líquida HPLC se seleccionaron las

muestras de las diferentes horas de fermentación que por destilación simple

indicaron la producción de este alcohol (datos no mostrados).

41

Al determinar el etanol por HPLC, a la hora 10 de fermentación se obtuvo una

concentración de 9.333 g/L y un rendimiento (Y p/s) de 0.45 g/g (Tabla 2). Este

resultado evidenció que la cepa de S. cerevisiae utilizada si produjo etanol bajo las

condiciones de fermentación planteadas. Según un estudio realizado por Yu y

Zhang, 2004, esta levadura con una concentración de 31.6 g/L de glucosa produce

13.7g/L de etanol con un rendimiento (Y p/s) de 0.43 g/g, luego de 18 horas de

fermentación en caldo YGC; por lo tanto, en la fermentación control con 20g/L de

glucosa, el consumo de la fuente de carbono fue consistente con el periodo de

tiempo de producción de etanol (Anexo J1).

Tabla 2. Determinación de etanol por HPLC fermentaciones control

Control con 20g/L Control con 2g/L Hora Rendimiento Y(p/s) (g/g)

Etanol g/L

%v/v Rendimiento Y(p/s) (g/g)

Etanol g/L

%v/v

6 (Fase

exponencial) ND ND ND 0.11 0.229 0.029

10 (Fase

estacionaria) 0.45 9.333 1.20 1.14 2.8 0.36

ND= No se determinó

6.3.1.2 Fermentación control con 2 g/L de glucosa

En esta fermentación Saccharomyces cerevisiae no presentó fase de adaptación, la

fase exponencial fue hasta la hora 6 con una concentración celular de 2.7g/L y de

glucosa 0.35g/L, a partir de la hora 8 empezó la fase estacionaria y la concentración

de la fuente de carbono se mantuvo estable (Figura 12, tabla 2 – anexo G).

El pH disminuyó de 6.3 a 5.75 a la hora 4, mostrando la relación del consumo de

glucosa y la producción de ácidos, mientras en la fase estacionaria el pH tuvo un

aumento leve por la liberación de aminoácidos al consumirse el extracto de levadura

(Figura 12).

42

Al comparar esta fermentación con la de 20g/L de glucosa (Yx/s= 0.37 g/g), se

evidenció un mayor rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s) de 1.44 g/g

para la fermentación de 2g/L de glucosa. Esto indica que la levadura transforma con

mayor eficiencia la glucosa en mínimas concentraciones; ya que cuando la fuente

de carbono es el factor limitante del crecimiento se obtiene más biomasa y un

equilibrio entre el número de células, el peso seco, el nitrógeno celular, el RNA y el

DNA al producirse a la misma velocidad (Parés y Juárez 1997). Con 20 g/L de

glucosa Saccharomyces cerevisiae presentó en la hora 6 una concentración celular

de 3.07 g/L al consumir 7.53 g/L de glucosa, esto confirmó que en la fermentación

control de 2 g/L existió mayor producción de biomasa con menor consumo de

sustrato al obtenerse la mayor concentración de células a la hora 6 de fermentación

2.729g/L al consumir 1.775g/L de glucosa.

Al analizar la cinética de S. cerevisiae en las fermentaciones control no fue posible

comparar la velocidad de crecimiento (µx); ya que el control de 20g/L no cumple con

la cinética de orden 1, por esto solo se determinó el tiempo de duplicación el cual

fue de 18 min para el control de 20g/L y 57 min en el control de 2g/L, esto evidenció

que la levadura al tener mayor concentración de glucosa tiene un crecimiento más

rápido.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

TIEMPO (h)

BIO

MA

SA

(g

/L)

-

p

H

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

BIOMASA (g/L) pH AZÚCARES REDUCTORES (g/L)

43


tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de

glucosa.

Al cuantificar el etanol por cromatografía líquida se obtuvo una concentración de

etanol de 2.805 g/L (Anexo J2) con un rendimiento (Yp/s) de 1.14 g/g en la hora 10

de fermentación (Tabla 2). Este resultado evidenció que con 2g/L de glucosa

Saccharomyces cerevisiae puede producir etanol, esta concentración de azúcar es

mínima para la obtención de alcohol; pues en varios estudios la menor

concentración de glucosa para este fin es de 20g/L, aunque en la investigación

realizada por Zaldivar, et al., 2005, con una concentración de 13.5g/L y 120 g/L de

glucosa se obtuvo un rendimiento de producto a partir de sustrato (Yp/s) de 0.46 g/g

y 0.47 g/g con una concentración de etanol de 6.2 g/L y 5.6 g/L, respectivamente.

El rendimiento (Yp/s) obtenido en esta fermentación control fue mayor al teórico 0.51

g/g, posiblemente, por la presencia de sacarosa en el medio de cultivo, azúcar que

fue detectado en el análisis cromatográfico y no por la técnica de DNS por ser un

azúcar no reductor. S. cerevisiae posee la enzima invertasa para hidrolizar la

sacarosa y producir glucosa y fructosa, azúcares fermentables que no fueron

cuantificados desde la hora 0 de fermentación, esto ocasionó la determinación de

valores no reales de la concentración de azúcares reductores, por esta razón el

rendimiento fue muy alto.

6.3.2 Fermentación discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

El sustrato fermentable con una concentración de 2.547 g/L de azúcares reductores

se obtuvo al realizar la fermentación de 12 horas con el consorcio celulítico en el

residuo vegetal de Crisantemo al 10% sin pretratamiento ni suplemento (Figura 13).

44

La evaluación del SF se llevó a cabo en una fermentación con Saccharomyces

cerevisiae por 32 horas, se determinó concentración de biomasa por peso seco, de

azúcares reductores por la técnica de DNS y producción de etanol por cromatografía

líquida HPLC.

Figura 13. Fermentación del sustrato fermentable con células libres de


El SF fue sometido a esterilización por 30 minutos a 20 lb de presión, además se le

adicionó ampicilina en una concentración de 300mg/L; esto debido a la presencia

del bacilo esporulado del consorcio celulolitico que podría ser un contaminante en

esta parte del proceso. Lo anterior se determinó al realizar pruebas preliminares que

demostraron la resistencia de este microorganismo a la esterilización en condiciones

normales (15min, 15 lb de presión a 121°C), además, no se evidenció algún efecto

por parte de la ampicilina sobre Saccharomyces cerevisiae, por ser un antibiótico

bactericida que inhibe la síntesis del peptidoglicano.

El inóculo se realizó bajo las mismas condiciones que en la fermentación control, se

propagó en caldo YGC para asegurar una alta concentración de biomasa al iniciar la

fermentación. El inóculo presentó una concentración celular de 2.8 g/L, un recuento

de 40 x 106 UFC/mL, y una concentración de azúcares de 0.38 g/L.

45

Las condiciones durante las 32 horas de fermentación fueron iguales a las del

control, es decir que la concentración de oxígeno fue reducida por el volumen

efectivo de trabajo utilizado y la mínima agitación (70 rpm).

La levadura en el SF tuvo una fase exponencial hasta la hora 12 con una

concentración de biomasa de 2.594 g/L, de azúcares reductores 1.09g/L y un

rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s) de 1.45 g/g; desde de la hora 14

se observó la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual, la biomasa disminuyó

entrando a la fase de muerte y la concentración del sustrato se mantuvo estable. El

consumo de azúcares reductores fue rápido hasta la hora 14, terminando la

fermentación con una concentración de 0.667 g/L (Figura 14), estos posiblemente

pueden ser azúcares reductores no asimilables por Saccharomyces cerevisiae como

la celobiosa, que es producto de la hidrólisis de la celulosa del residuo vegetal de

Crisantemo.

Al comparar la cinética de Saccharomyces cerevisiae en el SF con el control de 2g/L

de glucosa, se encontró una diferencia en fase exponencial, en el control fue hasta

la hora 6 y en el sustrato fermentable hasta la hora 14, se determinó que la levadura

presenta una fase de adaptación hasta la hora 4, posiblemente porque el inóculo se

propagó en caldo YGC; razón por la cual, la fase logarítmica se prolongó unas horas

más. Por otra parte, no fue posible comparar con el control de 2g/L de glucosa, la

velocidad de crecimiento (µx); ya que la fermentación en el SF no cumple con la

cinética de orden 1, por esto solo se determinó el tiempo de duplicación el cual fue

de 57 min y 46.5 min, respectivamente, esto evidenció que la levadura tiene un

crecimiento más rápido en el sustrato fermentable.

El comportamiento de la biomasa en la fermentación evidenció que el SF puede ser

considerado como un medio que permite el crecimiento de Saccharomyces

cerevisiae al suplir ciertos requerimientos nutricionales como la fuente de carbono,

de nitrógeno, fósforo, azufre y elementos traza. Según la caracterización de

composición nutricional el SF contiene 0.87g/L de nitrógeno total, 0.41 g/L de

fósforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro, magnesio y

manganeso en bajas concentraciones (Anexo I); estas fuentes nutricionales

46

promueven el crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros

componentes al sustrato fermentable, ya que se obtuvo un tiempo de duplicación

menor, una concentración de biomasa similar y el mismo rendimiento (Y x/s) que en

caldo YGC (medio sintético) de la fermentación control 2 g/L de glucosa. Este SF es

una alternativa como medio de cultivo que proporciona ventajas en cuanto a costos

y composición nutricional al tener además elementos traza que no se encuentran en

el medio convencional (YGC), lo que favorece la producción de biomasa.

El pH fue aumentando en función del tiempo de 6.38 a 6.8 (Figura 14), esto

evidenció que el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae puede darse en un

rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH intracelular

entre 5.8 y 6.3 (Tuite, 1991). Varios autores reportan que el pH ácido (4.5 – 5) es

una de las condiciones óptimas para la levadura al incrementar la producción de

biomasa y de etanol (Yu y Zhang, 2004; Martín, et al, 2005; Palmarola, et al, 2005).

En este estudio se realizó una prueba preeliminar para determinar si el pH 4.5

favorecía la producción de etanol por parte de la cepa utilizada; se concluyó que el

pH entre 6 y 7 mostró mejores resultados, ya que a pH ácido no hubo producción de

etanol (datos no mostrados).

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

TIEMPO (h)

BIO

MA

SA

(g

/L)

-

pH

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

BIOMASA (g/L) pH AZÚCARES REDUCTORES (g/L)

Figura 14. Concentración de biomasa y azúcares reductores en función del tiempo.

Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF.

47

Al analizar los datos de cromatografía líquida se obtuvo una concentración promedio

de etanol de 3.5 g/L (Anexo J3) y un rendimiento (Yp/s) de 1.73 g/g, en la hora 10 de

fermentación. En la fase estacionaria la concentración de etanol estuvo estable

hasta la hora 28, en la cual disminuyo posiblemente, porque la levadura lo empezó a

consumir como fuente de carbono (Tabla 3). Esto indica que la producción de etanol

si esta directamente asociada con el metabolismo energético, es decir, que la

velocidad de producción esta relacionada con la demanda de energía de las células;

por esto, el etanol se sintetiza en las rutas de formación de ATP (Doran, 1995).

A la hora 24 del proceso el rendimiento (Yp/s) mostró un resultado de 0.46 g/g, pero

los demás rendimientos fueron mayores al teórico 0.51 g/g, posiblemente, por la

presencia de sacarosa en el sustrato fermentable, azúcar que fue detectado en el

análisis cromatográfico y no por la técnica de DNS por ser un azúcar no reductor.

Pues S. cerevisiae seguramente hidrolizó la sacarosa en glucosa y fructosa durante

el tiempo de fermentación, esto ocasionó la determinación de valores no reales de

la concentración de azúcares reductores, por esta razón el rendimiento fue muy alto.

Tabla 3. Determinación de etanol fermentación en SF

Hora Rendimiento Y(p/s)

(g/g) Etanol g/L %v/v etanol

10 (Fase exponencial)

1.73 3.5 0.45

18 (Fase estacionaria)

0.85 3.536 0.45


0.613 3.750 0.48


0.46 3.627 0.47


0.21 2.212 0.28

Al comparar estos resultados con el control de 2g/L de glucosa se corroboró que

Saccharomyces cerevisiae si puede producir etanol con esta mínima concentración

de glucosa. Aunque en el SF la concentración de etanol fue mayor que el control,

esto confirmó que el SF si es un medio nutritivo, natural y económico que

48

proporciona los requerimientos para el crecimiento de la levadura y la producción de

etanol con mejores resultados que el medio de cultivo sintético YGC; ya que,

además de glucosa tiene otros azúcares como fructosa y sacarosa que S. cerevisiae

puede fermentar (Anexo J4).

De acuerdo al análisis de medias se determinó que la mayor concentración de

biomasa se obtuvo en la fermentación control con 20g/L de glucosa, además, los

datos de las repeticiones de cada fermentación no presentaron una amplia

dispersión (Anexo H). Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control

con 2 g/L de glucosa y la fermentación del sustrato fermentable se llevo a cabo la

estadística de prueba con la distribución t student, concluyendo que no existe

suficiente evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho). Por lo tanto, se

afirma que no existe evidencia estadísticamente significativa en la concentración

celular promedio de S. cerevisiae tanto en el control como en el sustrato

fermentable evaluado (p > 0.05) (Anexo K).

49

CONCLUSIONES

• Los tratamientos con SDS y Peróxido de hidrógeno mostraron inhibición de la

actividad enzimática del consorcio celulolítico.

• El residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere

pretratamiento químico por la proporción mínima de lignina 0.51% y

hemicelulosa 2.03%, solo es necesario la reducción de tamaño para obtener

mayor concentración de azúcares reductores liberados por parte del consorcio

celulolítico.

• El residuo vegetal de Crisantemo no requiere de suplemento para liberar mayor

concentración de azúcares reductores por parte del consorcio celulolítico.

• Se seleccionó el residuo vegetal al 10% (p/v), el cual mostró una mínima

diferencia con el 12% (p/v) al comparar la concentración de azúcares reductores

liberados en las fermentaciones de las tres concentraciones evaluadas.

• El proceso para la obtención del sustrato fermentable consta de las siguientes

etapas: reducción de tamaño, fermentación discontinua con el consorcio

celulolítico (35ºC por 12 horas, 130 rpm), centrifugación y filtración.

• Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un

consorcio celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentración de

azúcares reductores de 2.547 g/L.

• Al comparar la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae entre las

fermentaciones control de 20g/L y 2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el

rendimiento Yx/s fue igual en las dos últimas 1.44 g/g, mejor que el obtenido con

20g/L.

50

• El tiempo de duplicación fue mayor en el sustrato fermentable, demostrando

mayor velocidad de crecimiento comparado con el control de 2 g/L de glucosa.

• La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada mostró baja producción de

etanol tanto en caldo YGC como en el SF.

• Los rendimientos Yp/s de la fermentación control 2 g/L y del SF fueron mayores

que el teórico, seguramente por la presencia de sacarosa, azúcar que no se

cuantifico durante el proceso.

• No existió evidencia estadísticamente significativa en la concentración celular

promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa como en el

sustrato fermentable evaluado.

• El sustrato fermentable permitió la obtención de etanol con una concentración de

3.75 g/L usando S. cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de

glucosa 2.8 g/L.

• El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico

que favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, al tener

fuente de carbono, nitrógeno, sales y elementos traza.

51

RECOMENDACIONES

• Evaluar otras cepas de microorganismos celulolíticos en el residuo vegetal

de Crisantemo, que puedan presentar mayor actividad enzimática, para

obtener un sustrato fermentable con alta concentración de azúcares

reductores.

• Utilizar técnicas de inmovilización de microorganismos en la obtención del

sustrato fermentable y en la producción de etanol.

• Estudiar la producción de etanol a partir del sustrato fermentable utilizando

otra cepa capaz de fermentar los azúcares reductores presentes.

• Utilizar el sustrato fermentable para producción de biomasa o suplemento

nutricional para suelos o procesos de compostaje.

• Evaluar el crecimiento de otros microorganismos en el sustrato fermentable,

al ser una alternativa como medio de cultivo.

52

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BIBLIOGRAFIA COMO RECURSOS ELECTRONICOS

Universidad Nacional de Colombia Comunicaciones y divulgación cultural

http://unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm [Consulta 28 de Enero de 2006].

59

ANEXO A

SOLUCIONES DE TRABAJO

A.1 Buffer fosfato

• Pesar 3.5g de Na2HPO4 y disolver en 100ml de agua destilada

• Pesar 3.45g de NaH2PO4 y disolver en 100ml de agua destilada.

• Mezclar las dos soluciones

• Ajustar a pH 7±0.2

A.2 Buffer ácido cítrico

• Pesar 1.03g de ácido citrico y disolver en 49 mL de agua destilada.

• Pesar 2.74g de Na2HPO4 y disolver en 51 mL de agua destilada.

• Mezclar las dos soluciones.

• Ajustar a pH 5 ± 0.2

60

ANEXO B

Curva patrón de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS


Curva utilizada para conocer la concentración de azúcares reductores obtenidos en

el residuo tratado con el consorcio celulolítico

Concentración de glucosa g/L Absorbancia a 540nm

0.5 0.26

0.7 0.37

1 0.5

1.5 0.73

1.7 0.89

2 1.09

Promedio tres repeticiones

y = 0.5346x - 0.0186R2 = 0.9885

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Concentración (g/L)

AB

S 5

40nm


61


Curva utilizada para conocer la concentración de glucosa consumida por


CONCENTRACIÓN

g/l

ABS

540nm

0,5 0,271

0,7 0,352

1 0,485

1,5 0,775

1,7 0,827

2 0,995


y = 0.4883x + 0.0153R2 = 0.9962

0.00.20.40.60.81.01.2

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Concentración (g/L)

AB

S 5

40nm


62

ANEXO C

Pretratamiento del residuo vegetal

TABLA 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% con y

sin tratamiento en SDS

SIN SDS CON SDS

AZÚCARES REDUCTORES Hora

g/L

0 1,329 0,586

22 2,461 1,440

Promedio de tres repeticiones

63

ANEXO E.

Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico

TABLA 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% suplementado y tratado con SDS

Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH Hora

g/L Desv. estándar Coef. variación *UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación

12 1,104 0,03 3,1 35,0 0,01 0,03 43,7 0,05 0,11 6,65 0,03 0,43

14 1,062 0,02 2,2 33,7 0,20 0,59 35,7 0,06 0,16 6,63 0,01 0,09

16 0,961 0,08 8,8 32,8 0,05 0,15 30,1 0,09 0,30 6,64 0,04 0,53

18 1,286 0,00 0,0 52,1 0,11 0,22 37,8 0,80 2,12 6,61 0,01 0,11

20 1,317 0,02 1,5 53,7 0,03 0,06 41,0 0,44 1,08 6,55 0,01 0,15

22 1,059 0,06 5,3 35,2 0,01 0,03 28,2 1,14 4,06 6,45 0,04 0,54

24 1,118 0,04 3,7 39,8 0,05 0,13 41,4 0,57 1,37 6,39 0,01 0,16


* Una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones del

ensayo.

64

TABLA 2. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% suplementado y sin tratamiento


g/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desviación estándar Coeficiente de variación Promedio Desv. estándar Coef. variación

0 1,08 0,021 1,9 ND ND ND ND ND ND 5.83 0.01 0.17

6 1,42 0,026 1,9 54,4 1,20 2,21 38,5 1,13 2,93 5,91 0,01 0,17

12 1,63 0,018 1,1 55,7 1,23 2,21 39,9 0,93 2,32 6,02 0,08 1,33

14 1,59 0,000 0,0 56,2 2,36 4,20 46,2 0,00 0,00 6,31 0,30 4,76

16 1,19 0,084 7,0 52,5 2,08 3,96 37,6 0,14 0,37 6,22 0,02 0,28

18 1,03 0,075 7,2 32,7 0,12 0,37 33,2 1,90 5,72 6,26 0,09 1,42

20 1,05 0,035 3,4 35,1 1,34 3,81 35,3 1,20 3,40 6,46 0,29 4,43

22 1,14 0,042 3,7 37.9 0 0 43,2 0,00 0,00 7,12 0,49 6,85


* ND= No se determinó

65

TABLA 3. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% sin suplemento y sin tratamiento


g/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación

0 1,533 0,08 5,0 ND ND ND ND ND ND 6.00 0.01 0.17

6 1,607 0,03 1,6 59,7 1,56 2,62 46,5 0,36 0,77 6,30 0,02 0,32

12 2,084 0,04 2,0 80,8 2,47 3,06 55,7 0,00 0,00 6,54 0,05 0,76

14 2,082 0,06 2,9 97,6 4,36 4,47 72,5 0,21 0,29 6,72 0,03 0,39

16 2,015 0,06 3,0 83,9 3,28 3,91 54,0 0,38 0,70 6,96 0,06 0,90

18 1,932 0,09 4,7 80,2 4,68 5,83 60,2 0,28 0,46 7,27 0,13 1,77

20 1,742 0,05 2,9 65,1 4,26 6,54 48,3 2,36 4,89 7,47 0,03 0,39

22 2,474 0,09 3,6 98,4 4,65 4,73 78,1 0,99 1,27 7,60 0,03 0,33


* ND= No se determinó

66

TABLA 4. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 12% suplementado y sin tratamiento


g/L Desv. estándar Coef. variación *UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación

0 1,47 0,07 4,8 ND ND ND ND ND ND 5.53 0.02 0.36

6 1,53 0,00 0,1 51,56 1,045 2,03 31,92 0,84 2,64 5,70 0,03 0,53

12 2,15 0,10 4,7 79,73 1,732 2,17 36,67 0,00 0,00 5,83 0,04 0,69

14 1,91 0,00 0,0 82,79 0,000 0,00 74,81 0,02 0,03 5,89 0,05 0,85

16 1,89 0,02 1,1 76,24 2,861 3,75 29,13 0,02 0,07 6,50 0,06 0,92

18 1,60 0,04 2,2 58,54 1,423 2,43 32,23 0,32 0,98 6,26 0,09 1,44

20 1,78 0,02 1,3 54,22 2,754 5,08 29,83 1,14 3,80 6,26 0,08 1,28

22 1,60 0,02 1,2 56,04 2,052 3,66 33,52 1,30 3,89 6,29 0,03 0,48


* ND No se determinó

67

TABLA 5. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 12% sin suplemento y sin tratamiento

Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH

Hora g/L Desv. estándar Coef. variación *UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación

0 1,773 0,05 2,8 ND ND ND ND ND ND 6.29 0.01 0.16

6 1,842 0,06 3,0 77 0,44 0,57 50,914 10,00 19,64 6,31 0,05 0,81

12 1,952 0,09 4,6 85,1 0,18 0,21 55,388 15,42 27,85 6,6 0,01 0,15

14 2,249 0,03 1,3 104,9 0,82 0,78 68,093 6,89 10,12 6,82 0,11 1,57

16 2,227 0,06 2,6 92 0,95 1,03 61,256 11,28 18,42 6,96 0,03 0,38

18 2,089 0,06 2,7 94,9 0,43 0,45 68,481 23,90 34,90 7,15 0,15 2,14

20 1,931 0,08 4,0 73,4 0,18 0,25 48,332 23,37 48,35 7,4 0,05 0,62

22 2,317 0,03 1,3 105,2 0,29 0,28 82,884 8,39 10,12 7,49 0,08 1,11

* ND No se determinó

68

TABLA 6. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 5%

(p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) suplementado y sin tratamiento


• ND No se determinó

Residuo vegetal 5% Residuo vegetal 10% Residuo vegetal 12%

Azúcares

reductores

Act

enzimática

37° pH 7

Azúcares

reductores

Act

enzimática

37° pH 7

Azúcares

reductores

Act

enzimática

37° pH 7

HORA

g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L

0 0,378 0 1,08 ND 1,47 ND

6 0,435 11,85 1,42 54,4 1,53 51,56

12 0,352 30,27 1,63 55,7 2,15 79,73

14 ND ND 1,59 56,2 1,91 82,79

16 0,589 17,80 1,19 52,5 1,89 76,24

18 0,849 35,70 1,03 32,7 1,60 58,54

20 0,423 35,00 1,05 35,1 1,78 54,22

22 0,419 25,50 1,14 37,9 1,60 56,04

69

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Estadística de prueba distribución t student

Hipótesis general:

La concentración de azúcares reductores liberados en la fermentación con SV al

10%(p/v) no difiere de la concentración de azúcares reductores liberados en la

fermentación con SV al 12%(p/v).

H0: µ1 - µ2 = 0

Hi: µ1 - µ2 � 0

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales SV 10%(p/v) SV 12%(p/v) Media 1.934 2.048 Varianza 0.092 0.041 Observaciones 8 8 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 12 Estadístico t -0.881 P(T<=t) dos colas 0.395 Valor crítico de t (dos colas) 2.179

70

ANEXO D

Caracterización físico-química del Residuo Vegetal de Crisantemo

RESULTADOS ANALÍTICOS

Humedad 7,92 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Fracción Mineral 2,84 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Pérdidas por Volatilización 89,2 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2 %)

Proteína 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)

Celulosa 65,3 % SUMATORIA

Hemicelulosa 2,03 % SUMATORIA

Carbohidratos no

estructurales 16,6 % COLORIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Lignina 0,51 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Humedad 7,92 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Fracción Mineral 2,84 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Pérdidas por Volatilización 89,2 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2%)

Grasa 0,31 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Fibra Cruda 46,4 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

Proteína 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)

Extracto no Nitrogenado 37,5 % SUMATORIA

Fibra detergente neutra 68,3 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

71

Fibra detergente ácida 66,3 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)

NUTRIENTES

Fósforo (P2O5) 0,27 % COLORIMÉTRICO (NTC 234)

Calcio (CaO) 0,69 % ABS. ATÓMICA (MET. INTERNO)

Sílice (SiO2) 0,55 % ABS. ATÓMICA (MET. INTERNO)

72

ANEXO F

Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae

Concentración biomasa g/L ABS 620 nm

3.18 0.858

2.39 0.745

1.59 0.501

1.19 0.416

0.95 0.339

0.8 0.294

0.68 0.257

0.6 0.192

0.53 0.170


y = 0,2625x + 0,0718R2 = 0,9803

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Biomasa g/L

AB

S 6

20 n

m

Figura 3. Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae. Absorbancia en función

de la concentración de biomasa

73

ANEXO G.

Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

Fermentación discontinua control

TABLA 1. Fermentación control con Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC 20 g/L de glucosa

AZÚCARES REDUCTORES BIOMASA pH

HORA g/L Desv. estándar Coef. variación g/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación

0 18,850 0,09 0,48 0,201 0,01 7,32 6,38 0,19 2,95

2 17,559 0,09 0,51 0,460 0,06 11,95 6,03 0,14 2,36

4 15,727 0,06 0,38 1,868 0,04 1,94 5,565 0,10 1,88

6 11,323 0,61 5,39 3,068 0,23 7,40 5,24 0,07 1,28

8 2,411 0,04 1,66 5,541 0,05 0,97 5,12 0,04 0,71

10 2,487 0,05 2,01 6,205 0,08 1,20 4,99 0,01 0,25

12 0,311 0,03 10,51 6,326 0,26 4,15 5,045 0,07 1,47

14 0,269 0,04 15,92 6,207 0,13 2,00 5,095 0,09 1,81

16 0,258 0,02 8,22 6,277 0,01 0,09 5,125 0,02 0,41


74

TABLA 2. Fermentación control con Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC 2 g/L de glucosa



0 2,124 0,18 8,56 0,174 0,01 7,28 6,26 0,17 2,71

2 1,667 0,33 19,57 0,409 0,09 23,06 6,12 0,10 1,70

4 1,141 0,42 36,76 1,405 0,24 17,15 5,75 0,03 0,59

6 0,349 0,11 30,31 2,729 0,32 11,54 5,75 0,23 4,00

8 0,184 0,01 7,55 2,445 0,07 2,73 5,89 0,19 3,17

10 0,172 0,02 13,37 2,412 0,10 4,19 5,98 0,18 3,09

12 0,15 0,03 17,29 2,434 0,12 5,08 6,02 0,26 4,24

14 0,148 0,03 17,63 2,443 0,25 10,13 6,13 0,20 3,26

16 0,124 0,00 0,00 2,404 0,01 0,56 6,08 0,22 3,61


75

ANEXO H.

Fermentación discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

TABLA 1. Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF



0 2,738 0,06 2,25 0,194 0,010 4,91 6,38 0,04 0,65

2 2,650 0,01 0,38 0,185 0,012 6,49 6,38 0,01 0,16

4 2,590 0,02 0,77 0,210 0,016 7,62 6,37 0,02 0,31

6 1,605 0,03 1,87 1,340 0,014 1,01 6,36 0,04 0,64

10 1,224 0,02 1,63 1,986 0,020 1,02 6,29 0,03 0,51

12 1,091 0,04 3,72 2,594 0,014 0,52 6,37 0,04 0,57

14 0,888 0,02 2,21 2,545 0,006 0,24 6,43 0,03 0,39

18 0,871 0,03 2,99 2,531 0,004 0,14 6,53 0,07 1,13

20 0,861 0,08 8,87 2,526 0,008 0,31 6,57 0,06 0,95

22 0,816 0,02 3,03 2,529 0,002 0,09 6,59 0,06 0,92

24 0,797 0,001 0,13 2,487 0,006 0,25 6,60 0,09 1,39

26 0,725 0,01 1,70 2,449 0,004 0,16 6,69 0,11 1,70

28 0,686 0,001 0,17 2,400 0,008 0,33 6,73 0,10 1,43

30 0,674 0,01 1,69 2,367 0,015 0,63 6,76 0,09 1,29

32 0,667 0,01 1,80 2,228 0,006 0,27 6,80 0,12 1,71


76

ANEXO I.

Caracterización de composición nutricional del sustrato fermentable (SF)

PARÁMETRO RESULTADO UNIDADES MÉTODO ANALÍTICO

Carbono Orgánico Oxidable 4,00 g/L WALKLEY-BLACK (NTC 5167)

Nitrógeno total (NT) 0,87 g/L MICRO-KJELDHAL (NTC 5167)

Fósforo total (P2O5) 0,41 g/L COLORIMÉTRICO (NTC 5167)

Potasio total (K2O) 1,93 g/L ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Calcio total (CaO) 0,07 g/L ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Magnesio total (MgO) 0,05 g/L ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Azufre total 34 p.p.m. TURBIDIMÉTRICO (NTC 5167)

Hierro total 2,6 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Manganeso total 1,4 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Cobre total 0,21 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Zinc total 1,6 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)

Boro total 7,0 p.p.m. COLORIMÉTRICO (NTC 5167)

Sodio total 225 p.p.m. EMISIÓN LLAMA (NTC 5167)

77

ANEXO J

Cromatografía líquida HPLC

J1. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L de

glucosa hora 10 (Repetición 1)

78

Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L de glucosa

hora 10 (Repetición 2)

79

J2. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de

glucosa hora 6

80

Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 2g/L de glucosa

hora 10

81

J3. Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repetición 1)

82

Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repetición 2)

83

Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repetición 3)

84

Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 18

85


86

Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 24 (repetición 1)

87


88


89


90

J4. Sustrato fermentable

91

ANEXO K

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Tabla 1. Estadística de prueba distribución t student

SF CONTROL 2 g/L Prueba t para dos muestras suponiendo

varianzas desiguales Biomasa g/L Biomasa g/L

Media 2.167394383 1.872671958

Varianza 0.467267849 0.940370635

Observaciones 13 9

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 13

Estadístico t 0.786473886

P(T<=t) dos colas 0.445690435

Valor crítico de t (dos colas) 2.160368652

Hipótesis general:

La concentración celular de Saccharomyces cerevisiae en el caldo sustrato

fermentable no difiere de la concentración celular en el caldo YGC con 2 g/L de

glucosa (control).

H0: µ1 - µ2 = 0

Hi: µ1 - µ2 � 0

EVALUACIÓN DE UN SUSTRATO VEGETAL OBTENIDO A PARTIR DE RESIDUOS

VEGETALES DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) CON UN CONSORCIO

CELULOLÍTICO

J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz.

Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología

Pontificia Universidad Javeriana, Cra. 7 No. 40 – 62, Bogotá, Colombia

[email protected]

RESUMEN En este trabajo se planteó una alternativa de manejo de residuos vegetales de crisantemo (Dendranthema grandiflora), mediante la transformación de este material celulósico en azúcares fermentables, por pretratamiento biológico con un consorcio celulolítico en cultivo discontinuo, y de esta manera obtener un sustrato fermentable (SF) rico en nutrientes y azúcares reductores que permitan el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae y la producción de etanol. Se evaluaron diferentes variables para obtener el mejor sustrato fermentable con el consorcio celulolítico: la concentración del residuo vegetal al 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v), pretratamientos químicos y suplemento con sales, extracto de levadura y peptona. Se determinó que la actividad enzimática fue mejor en la fermentación con el residuo al 10% (p/v) sin tratamiento y sin suplemento al obtenerse un SF con 2.5 g/L de azúcares reductores. El SF obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, pero no favorece la producción de etanol por la mínima concentración de azúcares liberados. Palabras claves: Consorcio celulolítico, crisantemo, etanol, residuos vegetales, Saccharomyces cerevisiae ABSTRACT

This work proposes a management alternative of the vegetable waste of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora) that consists in the conversion of this cellulosic substrate to fermentable sugars through the biological pretreatment with a microbial consortium and thus obtains a fermentable substrate (SF) rich in nutrients and reductor sugars that allow the growing of Saccharomyces cerevisiae and the production of ethanol. Different variables were examined to obtain the best fermentable substrate with the microbial consortium: the concentration of the vegetable waste to 5% (w/v), 10% (w/v) and 12% (w/v), chemical pretreatment and supplement with salts, extract of yeast and peptone. It was found a better enzimatic activity with the vegetable waste 10% (w/v) without treatment and without supplement obtaining a fermentable substrate with 2.5 g/L of reductor sugars. The fermentable substrate proved to be a nutritious and economic that favors the production of biomass of Saccharomyces cerevisiae, but one determined that it does not favor the ethanol production by the minimum concentration of sugar presents.

Keywords: celulolytic consortium, chrysanthemum, ethanol, Saccharomyces cerevisiae, vegetable

waste.

J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz

INTRODUCCIÓN

Aproximadamente, el 90% de los residuos sólidos generados en floricultura corresponden a

residuos vegetales, los cuales ofrecen tanto una amenaza al ambiente, como una alternativa de uso

biotecnológico según la disposición final de los mismos. Actualmente, la oportunidad consiste en

aprovecharlos en compostaje y reincorporarlos al proceso productivo como fuente de nutrientes

(Asocolflores, 2000).

La actual administración colombiana ha iniciado algunas acciones tendientes a identificar y

promover alternativas de producción de biocombustibles (como el etanol), de forrajes y alimento

para animales a partir de distintas fuentes, pues la actividad del sector agropecuario nacional es

generadora, actual o potencial de: jugo de caña de azúcar, paja de cereales, maíz, papa,

remolacha, melaza, yuca, y residuos vegetales como los que provienen de los cultivos de flores,

producto del manejo y ciclo vital de las plantas que actualmente son aprovechados en compostaje

y reincorporados al proceso productivo como fuente de nutrientes y acondicionador de suelos,

además pueden servir como fuente de carbono de los microorganismos en el proceso de

fermentación de los azúcares que los componen. Esto promete doble beneficio para el ambiente:

primero una alternativa de manejo de residuos vegetales y subproductos agroindustriales que

actualmente son utilizados en compostaje o incinerados (generando gases tóxicos), y sus tres

componentes: celulosa, hemicelulosa y lignina. Segundo, la posible utilización en la obtención de

etanol u otros combustibles.

Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo fue la obtención de un sustrato

fermentable a partir de la conversión del residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema

grandiflora), por pretratamiento biológico con microorganismos celulolíticos y su evaluación con

células libres de Saccharomyces cerevisiae, como una alternativa para la producción de etanol,

para lograr obtener un sustrato rico en azúcares fermentables u otros nutrientes que permitan el

crecimiento en cultivo discontinuo, contribuyendo con el desarrollo biotecnológico a nivel

industrial.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos

Se utilizó un consorcio microbiano celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de origen vegetal

y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitán, et al., 2006). Como microorganismo

control para la evaluación del sustrato fermentable se utilizó la levadura Saccharomyces


cerevisiae (Muñoz y Poutou, 1999), microorganismos tomados del banco de cepas del

Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad Javeriana.

Obtención del sustrato fermentable

Residuo Vegetal

Se utilizaron residuos de crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de un cultivo

localizado al norte del municipio de Tocancipá. Estos fueron sometidos a una caracterización

físico-química en un laboratorio certificado por el ICA (Instituto colombiano Agropecuario).


Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)

Se redujo de tamaño el residuo vegetal realizando molienda, se lavaron con SDS (Sodio Dodecil

Sulfato) al 1% (p/v) para posteriormente ser sometidos a ebullición por un periodo de una hora en

SDS al 1% (p/v) y se realizaron lavados con agua destilada. Luego fueron secados a 55°C y por

último, se sometió a un proceso de esterilización (Guevara y Zambrano, 2006).

Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación oxidativa)

En una solución alcalina de peróxido de hidrógeno al 2% se suspendió el residuo vegetal molido

y pretratado con SDS en una relación 10:1 respectivamente, esta mezcla fue llevada a un baño

termostatado durante 12 horas a 50°C. Luego se filtró y lavó con agua destilada. Por último se

sometió a un proceso de secado en horno de convección a 90°C por 12 horas (Sun, et al., 2000).

Adicionalmente, como control, se estudió el residuo molido y sin ningún tratamiento.

Pretratamiento biológico

Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celulolítico

Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v)

de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtenía la mayor concentración de

azúcares reductores.

Preparación del inóculo

Las cepas de los microorganismos celulolíticos fueron cultivadas en agar celulosa al 1% (p/v),

cuya composición en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura 2.5, peptona universal

2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato

dibásico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/- 0.2, bajo condiciones controladas de 35°C por


48 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las colonias para preparar una suspensión en

solución salina 0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml.

En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los 10ml de

preinóculo y se cultivaron a 130 rpm, 35ºC por 24 horas.

Fermentación discontinua

Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal suplementado (SVS) estéril a la concentración

correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) ó 12%(p/v)) cuya composición en g/L fue: residuo vegetal a

las diferentes concentraciones, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio

0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1,

(Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo (100mL), y

se controlaron las condiciones de operación: temperatura 35°C por 24 horas y agitación de 130

rpm. Adicionalmente, se realizaron cultivos con la concentración de residuo vegetal 10% (p/v) y

12% (p/v) sin la adición de los demás componentes (sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo

SV). Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas, evaluando la producción de

azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959), pH y actividad enzimática

(Guevara y Zambrano, 2006; Sun y Cheng, 2002).

Al finalizar el proceso de fermentación se obtuvo el extracto crudo o sustrato fermentable (SF),

mediante un proceso de centrifugación y filtración, con el fin de eliminar la población celular.

Determinación de actividad celulolítica cuantitativa

Esta técnica se realizó evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes (37 y

50°C) reportadas por literatura. Para la interpretación de los resultados, una unidad celulolítica

(UC) equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por

minuto, bajo las condiciones de ensayo.

Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de muestreo y se

adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta en buffer fosfato 0.1M pH 7

+/- 0.2 y en buffer ácido cítrico 0.1M pH 5. La mezcla final se incubó en baño termostatado a

37°C y 50ºC, respectivamente, durante 1 hora. Finalizado el tiempo de incubación de cada

muestra se frenó la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos (Guevara y Zambrano, 2006;

Sun y Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005). Posteriormente se centrifugó cada muestra por 10


minutos a 5000 rpm. A partir del sobrenadante se determinó la concentración de azúcares

reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959).

Evaluación del Sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

A partir de las concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccionó el sustrato fermentable

que aportó mayor concentración de azúcares reductores para la fermentación con S. cerevisiae.

Como control de la cepa se realizaron fermentaciones en caldo YGC cuya composición es en g/L:

extracto de levadura 5, D-glucosa 20 y cloramfenicol 0.1, pH final 6.6 (Merck, 2000), y se llevó a

cabo la modificación de este medio de cultivo al utilizar 2g/L de glucosa para comparar con el

sustrato fermentable.

Preparación del inóculo

La cepa de S. cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composición es en g/L: extracto de

levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9, pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo

condiciones controladas de 30ºC por 12 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las

colonias de la levadura para preparar una suspensión en solución salina 0.85%(p/v), con una

absorbancia de 0.8 a 620nm.

En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml de

preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.

Fermentación discontinua

Se adicionaron 1350mL del respectivo caldo (YGC, YGC modificado y SF) estéril a un

erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo, y se controlaron las

condiciones de operación: temperatura 30°C por 16 horas para cultivo con YGC y 32 horas para

el SF con agitación de 70rpm, tomando muestras cada dos horas. A estas muestras se les

determinó la concentración de biomasa por el método de peso seco (Godoy, 2002), de azúcares

reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959) y de etanol por cromatografía líquida

(HPLC).

Determinación de etanol

El contenido de etanol se analizó por cromatografía líquida de alto desempeño HPLC, en un

cromatógrafo WATERS, con detector de indice de refracción (Waters Corporation, Milford,


MA). La fase móvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se empleo una columna Sugar Pak I

con precolumna KC-G (Waters Corporation, Milford, MA). La temperatura de la columna fue

84°C. Para el análisis de los resultados se usó el programa Millenium V 2.15.01. Para la

determinación de los factores de respuesta se utilizaró glucosa grado cromatográfico (Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analítico Merck (Darmastadt, Alemania).

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los datos obtenidos se utilizó el programa SPSS versión 14 en el

cual se determinaron las medias (nivel de confianza 95%), la desviación estándar, el coeficiente

de variación y la estadística de prueba de la distribución t student para comparar la concentración

de azúcares liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la

concentración celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el SF (Daniel,

2002).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Obtención del sustrato fermentable


Se evaluaron diferentes pretratamientos para determinar cual permitía obtener mayor

concentración de azúcares reductores, al facilitar la hidrólisis enzimática de la celulosa por parte

del consorcio celulolítico.

Con el residuo vegetal molido tratado con y sin SDS; se realizó una fermentación de 22 horas,

obteniendo como resultado que la mayor cantidad de azúcares reductores liberados se presentó en

el residuo vegetal sin tratamiento con SDS teniendo una concentración de 2.46 g/L comparado

con 1.44g/L del tratado con SDS a la hora 22.

Al realizar los pretratamientos del residuo al 10% (p/v) con y sin peróxido de hidrógeno 2%,

luego de una fermentación de 22 horas se presentaron valores de concentración de azúcares

reductores de 0.555 g/L y 1.502 g/L, respectivamente (Tabla 1).

Estos resultados reflejaron que el tratamiento con SDS y H2O2 causa una inhibición enzimática

en el consorcio celulolítico, esto se debe a que el SDS es un tensoactivo iónico y desnaturalizante


de proteínas, y al quedar trazas de éste en el residuo impide la degradación de la celulosa por

parte del complejo enzimático (Castagnino, 2000), al igual que el peróxido de hidrógeno, agente

oxidante usado para remover la lignina y la hemicelulosa presentes en materiales

lignocelulósicos. Según la caracterización físico – química del residuo vegetal de Crisantemo, el

porcentaje de lignina es 0.51%, de hemicelulosa 2.03% y celulosa 65.3%, por lo tanto, el

pretratamiento con peróxido no sería necesario por la baja proporción de lignina y hemicelulosa

Se determinó que era suficiente la reducción de tamaño del material para obtener mayor

concentración de azúcares reductores y de actividad enzimática, pues algunos factores que

afectan la hidrólisis de la celulosa son el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad de la

materia prima (área superficial accesible) y cristalinidad de la celulosa, la cual se reduce con la

molienda.

Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal al 10% sin suplemento

tratado con SDS y peróxido de hidrógeno. (Temperatura 50°C por 12 horas).

ND = No se determino Fuente: Autores a Una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol

de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.

Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico

Se evaluaron diferentes variables: concentración 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo

vegetal fresco y suplemento con: sales, extracto de levadura y peptona (SVS), que podrían tener

algún efecto sobre la degradación de este polímero y por ende, en la concentración de azúcares

reductores liberados en el extracto crudo al finalizar la fermentación con el consorcio celulolítico

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.), los resultados se muestran en la tabla 2.

CALDO SV 10% (p/v)

CON SDS

CALDO SV 10% (p/v)

CON H2O2 Y SIN SDS

CALDO SV 10% (p/v)SIN

H 2O2 Y SIN SDS

(control)

CALDO SV 10% (p/v)

CON H 2O2 Y CON SDS

AZÚCAR

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

AZÚCAR

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

AZÚCAR

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

AZÚCAR

REDUC.

ACT. ENZ

pH 7 37ºC

HO

RA

g/L aUC/L g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L

0 0,595 0,0 0,471 0,0 1,350 0,0 0,835 0

12 0,926 23,1 0,484 15,0 1,840 52,1 ND ND

22 0,749 23,9 0,555 17,4 1,502 40,0 0,871 4,07


TABLA 2. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 5% (p/v), 10% (p/v) y

12% (p/v) suplementado y sin tratamiento

ND= No se determinó Fuente: Autores Las concentraciones del 10% y 12% (p/v) mostraron los valores más altos de azúcares reductores

en la hora 12 de fermentación, evidenciando mejor expresión de la actividad enzimática. Al

evaluar la concentración de residuo al 5% (p/v) se presentaron valores muy bajos, por tal razón,

no se realizaron más experimentos con esta concentración.

Es importante analizar la concentración de sustrato; ya que es uno de los principales factores que

afectan la producción y la velocidad inicial de la hidrólisis enzimática de la celulosa. Un

incremento de la concentración de sustrato normalmente resulta en un aumento de la producción

y de la velocidad de reacción de la hidrólisis. Sin embargo, altas concentraciones de sustrato

pueden causar inhibición enzimática, lo cual disminuye sustancialmente la velocidad de la

hidrólisis (Romano, et al., 2005; Sun y Cheng, 2002).

Se evaluó la concentración de residuo vegetal fresco al 10% (p/v) y 12%(p/v) sin suplemento,

para determinar si la composición del residuo (tabla 3) puede ser favorable para el crecimiento

del consorcio celulolítico. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Este resultado se presentó gracias a la composición del residuo vegetal, el cual posee 5.01% de

proteínas como fuente de nitrógeno, además de minerales, fósforo, azufre, macroelementos y

microelementos que proporcionan un medio nutritivo para el crecimiento del consorcio

celulolítico.

Residuo vegetal 5% Residuo vegetal 10% Residuo vegetal 12%

Azúcares

reductores

Act enzimática

37° pH 7

Azúcares

reductores

Act enzimática

37° pH 7

Azúcares

reductores

Act enzimática

37° pH 7

HORA

g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L

0 0,378 0 1,08 ND 1,47 ND

6 0,435 11,85 1,42 54,4 1,53 51,56

12 0,352 30,27 1,63 55,7 2,15 79,73

14 ND ND 1,59 56,2 1,91 82,79

16 0,589 17,80 1,19 52,5 1,89 76,24

18 0,849 35,70 1,03 32,7 1,60 58,54

20 0,423 35,00 1,05 35,1 1,78 54,22

22 0,419 25,50 1,14 37,9 1,60 56,04


De acuerdo al análisis de medias y la desviación estándar, los datos no presentaron una amplia

dispersión, por lo tanto, se determinó que la mayor concentración de azúcares reductores

liberados estaba entre el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12% (p/v) sin tratamiento y sin

suplemento (Tabla 4), se decidió obtener el sustrato fermentable con el residuo de crisantemo al

10% (p/v); ya que no se encontró gran diferencia con el 12%(p/v), mostrando 2.1g/L y 2.2g/L de

azúcares reductores, respectivamente. Por lo tanto, se llevo a cabo la estadística de prueba con la

distribución t student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadística para rechazar la

hipótesis nula (Ho). Por consiguiente, se afirma que no existe evidencia estadísticamente

significativa en la concentración de azúcares reductores liberados tanto en el SV 10%(p/v) como

en el SV 12%(p/v). También se determinó que el tiempo de la fermentación para la obtención del

sustrato fermentable fuera de 12 horas al encontrar que la diferencia con la hora 22 no era

relevante para prolongar 10 horas más el proceso.

Los resultados obtenidos mostraron en general, que la actividad enzimática es mayor en

condiciones de pH 7 y 37ºC, evidenciando que la expresión de las enzimas es mejor a pH neutro y

a una temperatura que no exceda los 40ºC, por ser microorganismos mesófilos (Tabla 4) (Lynd, et

al., 2002).

TABLA 3. Caracterización físico-química del Residuo Vegetal de Crisantemo

CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2 %)

Proteína 5,01 %

Celulosa 65,3 %

Hemicelulosa 2,03 %

Carbohidratos no estructurales 16,6 %

Lignina 0,51 %

FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2%)

Grasa 0,31 %

Fibra Cruda 46,4 %

Proteína 5,01 %

NUTRIENTES

Fósforo (P2O5) 0,27 %

Calcio (CaO) 0,69 %

Sílice (SiO2) 0,55 %

FUENTE: LABORATORIO AGRILAB


TABLA 4. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) suplemento y sin tratamiento

ND= No se determinó Fuente: Autores

Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

Fermentación discontinua control caldo YGC 20 g/L de glucosa.

En esta fermentación no se presentó una fase de adaptación, se observó una fase exponencial

desde la hora 0 hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de 6.326 g/L, en esta hora del

proceso la concentración de glucosa disminuyó hasta 0.311 g/L, y luego empezó la fase

estacionaria, esto mostró un crecimiento rápido de la levadura relacionado con el consumo de

sustrato (Figura 1).

Al principio de la fermentación el valor de pH fue de 6.38, al transcurrir el proceso el pH

disminuyó hasta llegar a 5 en la hora 10, lo que tuvo relación con la caída de la concentración de

la fuente de carbono; esto indica que el consumo de la glucosa acidificó el medio (Navarro y

Sossa, 2003).

Al determinar el etanol por HPLC, a la hora 10 de fermentación se obtuvo una concentración de

9.333 g/L. Este resultado evidenció que la cepa de S.cerevisiae utilizada si produjo etanol bajo las

condiciones de fermentación planteadas. Ya que, la concentración de oxígeno fue baja, por la

mínima agitación (70 rpm) y el volumen utilizado, aunque no se proporcionaron totalmente las

condiciones de anaerobiosis para producción de etanol. Sin embargo por el metabolismo de la

levadura en medios ricos en azúcar en presencia de aire se pasa espontáneamente al proceso

anaeróbico porque el consumo de oxígeno es muy alto, por lo que se agota rápidamente (Carballo

2000; Otterstedt, et al., 2004).

RESIDUO VEGETAL 10% (p/v) RESIDUO VEGETAL 12% (p/v)

Azúcares reductores

Act enzimática

37° pH 7

Act enzimática

50° pH 5

Azúcares reductores

Act enzimática

37° pH 7

Act enzimática

50° pH 5

Hora

g/L UC/L UC/L g/L UC/L UC/L

0 1,53 ND ND 1,77 ND ND 6 1,61 59,7 46,5 1,84 77 50,91 12 2,1 80,8 55,7 1,95 85,1 55,39 14 2,08 97,6 72,5 2,25 104,9 68,09 16 2,01 83,9 54,0 2,23 92 61,26 18 1,93 80,2 60,2 2,09 94,9 68,48 20 1,74 65,1 48,3 1,93 73,4 48,33 22 2,47 98,4 78,1 2,32 105,2 82,88


Fermentación discontinua control caldo YGC 2 g/L de glucosa.

En esta fermentación Saccharomyces cerevisiae no presentó fase de adaptación, la fase

exponencial fue hasta la hora 6 con una concentración celular de 2.7g/L y de glucosa 0.35g/L, a

partir de la hora 8 empezó la fase estacionaria y la concentración de la fuente de carbono se

mantuvo estable (Figura 2).

El pH disminuyó de 6.3 a 5.75 a la hora 4, mientras en la fase estacionaria el pH tuvo un

aumento leve por la liberación de aminoácidos al consumirse el extracto de levadura.

Al cuantificar el etanol por cromatografía líquida (HPLC) se obtuvo una concentración de etanol

de 2.805 g/L en la hora 10 de fermentación. Este resultado evidenció que con 2g/L de glucosa S.

cerevisiae puede producir etanol.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

TIEMPO (h)

BIO

MA

SA

(g/L

) - p

H

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

AZÚ

CA

RE

S R

ED

UC

TOR

ES

(g

/L)

BIOMASA g/L pH AZÚCARES REDUCTORES g/L

Figura 1. Fermentación control en caldo

YGC 20g/L de glucosa.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0 5 10 15 20

TIEMPO (h)

BIO

MA

SA

(g/L

) - p

H

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

AZÚ

CA

RE

S

RE

DU

CTO

RE

S (g

/L)

BIOMASA g/L pH AZÚCARES REDUCTORES g/L

Figura 2. Fermentación control en caldo

YGC con 2 g/L de glucosa.

Fermentación discontinua del sustrato fermentable (SF) con Saccharomyces cerevisiae

El sustrato fermentable con una concentración de 2.547 g/L de azúcares reductores se obtuvo al

realizar la fermentación de 12 horas con el consorcio celulítico en el residuo vegetal de crisantemo

al 10% (p/v) sin pretratamiento ni suplemento.

La fermentación en el SF se realizó de 32 horas. La levadura presentó una fase de adaptación de 4

horas y la exponencial hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de 2.5g/L, 1.1g/L de

azúcares reductores; desde de la hora 14 se observó la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual,


la biomasa disminuyó entrando a la fase de muerte. El consumo de azúcares reductores fue rápido

hasta la hora 14, terminando la fermentación con una concentración de 0.667 g/L (Figura 3), estos

posiblemente pueden ser azúcares reductores no asimilables por S. cerevisiae como la celobiosa,

que es producto de la hidrólisis de la celulosa del residuo vegetal de crisantemo.

Al analizar los datos de cromatografía líquida (HPLC) se obtuvo una concentración de etanol de

3.5 g/L en la hora 10 de fermentación y 3.8 g/L en la hora 22 (Figura 3 y 4).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

TIEMPO (h)

BIO

MA

SA

g/L

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

AZÚ

CA

RE

S R

ED

UTO

RE

S

ETA

NO

L (g

/L)

BIOMASA g/L ETANOL g/L AZÚCARES REDUCTORES g/L

Figura 3. Fermentación en SF con S. cerevisiae

Por otra parte, se determinó el tiempo de duplicación el cual fue de 57 min para el control de 2 g/L

y 46.5 min para el SF, esto evidenció que la levadura tiene un crecimiento más rápido en el sustrato

fermentable. Según la caracterización de composición nutricional el SF contiene 0.87g/L de

nitrógeno total, 0.41 g/L de fósforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro,

magnesio y manganeso en bajas concentraciones, además el análisis cromatográfico mostró la

presencia de sacarosa, glucosa y fructosa (Figura 5); estas fuentes nutricionales promueven el

crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros componentes al sustrato fermentable, ya

que se obtuvo un tiempo de duplicación menor, una concentración de biomasa similar que en caldo

YGC (medio sintético) de la fermentación control 2 g/L de glucosa.


Figura 4. Fermentación en SF con S.

cerevisiae hora 10.

Figura 5. Cromatografía liquida SF.

El pH fue aumentando en función del tiempo de 6.38 a 6.8, esto evidenció que el crecimiento de S.

cerevisiae puede darse en un rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH

intracelular entre 5.8 y 6.3 (Tuite y Oliver, 1991). En este estudio se realizó una prueba preeliminar

para determinar si el pH 4.5 favorecía la producción de etanol por parte de la cepa utilizada; se

concluyó que el pH entre 6 y 7 mostró mejores resultados, ya que a pH ácido no hubo producción

de etanol (datos no mostrados).

Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control con 2 g/L de glucosa y la fermentación

del sustrato fermentable se llevo a cabo la estadística de prueba con la distribución t student,

concluyendo que no no existe evidencia estadísticamente significativa en la concentración celular

promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2g/L de glucosa como en el sustrato fermentable

evaluado.

CONCLUSIONES

El residuo vegetal de crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere pretratamiento químico

ni suplemento para obtener mayor concentración de azúcares reductores liberados por parte del

consorcio celulolítico.


Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un consorcio

celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentración de azúcares reductores de

2.5g/L.

El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que favorece la

producción de biomasa de S. cerevisiae, al tener fuente de carbono, nitrógeno, sales y elementos

traza; pero esta cepa mostró baja producción de etanol tanto en caldo YGC como en el SF.

Al comparar la producción de biomasa de S. cerevisiae entre las fermentaciones control de 20g/L y

2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el rendimiento Yx/s fue igual en las dos últimas 1.44 g/g,

mejor que el obtenido con 20g/L.

El sustrato fermentable permitió la obtención de etanol con una concentración de 3.8 g/L usando S.

cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de glucosa 2.8 g/L.

El Sustrato fermentable permitió la obtención de etanol 3.5 g/L, luego de la fermentación con

Saccharomyces cerevisiae.

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OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN … · 2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae _____ 11 2.7.2. Tolerancia al etanol_____ 12 2.8. Determinación de azúcares

OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN … · 2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae _ 11 2.7.2. Tolerancia al etanol_ 12 2.8. Determinación de azúcares