ODREĐIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM ODREĐIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM GROGROŽŽĐU PRIMJENOM HPLC METODE S ĐU PRIMJENOM HPLC METODE S

ELEKTROKEMIJSKIM DETEKTOROMELEKTROKEMIJSKIM DETEKTOROM

Ivana Novak,dipl.ing.Ivana Novak,dipl.ing.

PrehrambenoPrehrambeno--tehnolotehnološški fakultet,Osijekki fakultet,Osijek

POLIFENOLIPOLIFENOLI

predstavljaju veliku grupu prirodnih

spojeva vrlo raširenih u biljnom svijetu

glavni nutritivni izvori polifenola su: voće,

povrće, sjemenke, te napici kao što su

čajevi, voćni sokovi, vino i kava

O

A C2

3

456

7

8

2’

3’

4’

5’

6’

B1’

DifenilpropanDifenilpropan

podjela polifenola:� ne-flavonoidi

� fenolne kiseline

� stilbeni

� flavonoidi

� flavoni

� flavanoli

� flavonoli

� flavanoni

� izoflavoni

� antocijanidini

značaj flavonoida:� primjena u prehrambenoj industriji

� pozitivno djelovanje na ljudsko zdravlje

U samim biljkama antocijanini djeluju:

- antibakterijski,

- antifungalno,

- kao agensi koji privlače insekte koji

sudjeluju u oprašivanju biljaka,

- pružaju zaštitu od štetnog UV

zračenja

Biološke funkcije flavonoida pripisuju se

njihovoj izvanrednoj antioksidacijskoj i

antiradikalskoj aktivnosti.

GROGROŽŽĐE ĐE kao izvor polifenolakao izvor polifenolacrne sorte grožđa predstavljaju iznimno bogat

izvor flavonoida

oko 70% polifenola dolazi u sjemenci dok oko

30% dolazi u kožici grožđa

Polifenolni spojevi identificirani u

grožđu su:

� flavan-3-oli (katehin i epikatehin),

� polimeri (procijanidini) i oligomeri

(tanini) flavan-3-ola,

� flavonoli (kvercetin, miricetin),

� antocijanidini.antocijanidini.

Antocijanini – u kožici grožđa

Sadržaj antocijanina u grožđu kreće se od 12 do 30 mg/g

ANTOCIJANINIANTOCIJANINI

predstavljaju najrašireniju i najznačajniju grupu prirodnih

biljnih pigmenata

odgovorni su za širok spektar boja u biljkama i biljnim

proizvodima, uključujući narančastu, crvenu, ljubičastu i plavu

antocijanini su po svom

kemijskom sastavu glikozidi

antocijanidina

antocijanin = antocijanidin + šećerO

OH

OH

OH

R1

OH

R2

+

Osnovna struktura Osnovna struktura antocijanidina antocijanidina --flavilijev kationflavilijev kation

Cijanidin-3-O-glukozid

Euroazijske vrste grožđa (Vitis vinifera) sadrže sljedeće antocijanine:

+

O-Gluc

OH

OH

OH

OH+

O-GLuc

OH

OCH3

OH

OH

Peonidin-3-O-glukozid

+

O-Gluc

OH

OH

OH

OH

OH

Petunidin-3-O-glukozid

+

O-Gluc

OCH3

OH

OCH3

OH

OH

Malvidin-3-O-glukozid

antocijanini određuju boju vina

koncentracija antocijanina u vinu određena sadržajem antocijanina u grožđu i tehnološkim postupkom proizvodnje vina

sadržaj antocijanina u grožđu ovisi o :

� vrsti grožđa,

� klimatskim faktorima,

� uvjetima uzgoja vinove loze,

� sastavu tla,...

i povećava se tijekom zrenja grožđa.

Indikator zrelosti grožđa – “phenolic maturity”

SPEKTROSKOPSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINASPEKTROSKOPSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA

antocijanini intenzivno apsorbiraju u vidljivom dijelu spektra, što je posljedica efikasne delokalizacije i rezonancijske stabilizacije u aromatskom π elektronskom sustavu molekula

maksimum apsorbancije antocijanina je oko 520 nm

Cijanidin-3-glukozid

Malvidin-3-glukozid

25

50

75

100

125

150

175

mAU

200 300 400 500 nm

191.91 603.20

25

50

75

100

125

150

175

mAU

200 300 400 500 nm

191.91 603.20

Peonidin-3-glukozid

Delfinidin-3-glukozid

Spektri antocijanina

+H+

kinoid

-H+ + H O2

flavilijev kation

karbinol pseudobazahalkon pseudobaza

apsorpcijski spektri malvina kod različitih pH vrijednosti

ELEKTROKEMIJSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINAELEKTROKEMIJSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA

antocijanini podliježu elektrokemijskoj oksidaciji

Mehanizam elektrokemijske oksidacije antocijanina

+

R3

OH

R1

OH

OHR

2

� elektroaktivne fenolne skupine

� elektroketrokemijska svojstva antocijanina utvrđena su primjenom elektrokemijskih metoda cikličke voltametrije, diferencijalne pulsne voltametrije i pravokutno valne voltametrije

� elektrokemijske metode daju podatak o:

�mehanizmu elektrokemijske oksidacije spojeva

� elektrokemijskim svojstvima spoja

� antioksidacijskoj aktivnosti spoja

Veća sposobnost otpuštanja elektrona=niži oksidacijski potencijal=veća antioksidacijska aktivnost

Za separaciju i kvantifikaciju antocijanina u prirodnim uzorcima najčešće se koriste metode visokodjelotvorne tekućinske kromatografije (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) u kombinaciji s:

� UV/Vis,

� PDA,

� masenim detektorom.

kolona

detektor obrada podataka

mobilna faza

pumpa

injektor

-Shematski prikaz tekućinskog kromatografa

konduktometrijski

potenciometrijski

kulometrijski

amperometrijski

ELEKTROKEMIJSKI DETEKTORELEKTROKEMIJSKI DETEKTOR

protočna ćelija wall-jet tipa, u kojoj je:

� radna elektroda elektroda od staklastog ugljika,

� referentna elektroda je ISAAC elektroda (in situ Ag/AgCl),

� protuelektroda je Pt žica

inletOutlet

Referentna elektroda

Radna elektroda

Pomocna elektroda

RADNA RADNA

ELEKTRODAELEKTRODA

signal pobude

konst. električni

napon

signal odzivastruja

RR O + neO + ne--

detekcija elektroaktivnih supstanci

OSJETLJIVOSTOSJETLJIVOST

Granice detekcijeGranice detekcije

- najmanja količina analita u uzorku koja se može detektirati

Granice kvantifikacijeGranice kvantifikacije

- najmanja količina analita u uzorku koja se može kvantificirati

7·10-112 ·10-111.2·10-83.7·10-8kuromanin1.7 ·10-115.3 ·10-111.7·10-85·10-8mirtilin1.5 ·10-114.5 ·10-111·10-83·10-8peonidin2.5 ·10-117.5 ·10-113.6 ·10-81·10-8oenin

LOQLODLOQLOD

Elektrokemijski detektorPDA detektorUzorak

Granice detekcije (LOD) i kvantifikacije (LOQ), izražene u mol L-1, dobivene primjenom PDA i elektrokemijskog detektora

Detekcija analita u tragovima

4 6 8 10 12

0.25 mAU

Time (min)

0.1 nA

6 8 10 12 14 16 18 20 22

oenin

4 mAU

petunidinmyrtillin

Time (min)

(A)

(B)

kuromanin

peonidin

1 nA

(A)

(B)

Kromatogrami dobiveni (A) elektrokemijskim i (B) PDA detektorom za otopine kuromanina koncentracija 5·10-10

M (─), 1·10-9M (─),1·10-8M (─)

Kromatogrami ekstrakta kožice grožđa vrste tinta roriz, razrijeđenog 100-puta. (A) Kromatogram snimljen elektrokemijskim detektorom pri potencijalu +0.5 V, (B) kromatogram snimljen PDA detektorom, pri valnoj duljini 520 nm

PREDNOSTI PRIMJENE ELEKTROKEMIJSKIH DETEKTORA U PREDNOSTI PRIMJENE ELEKTROKEMIJSKIH DETEKTORA U KVALITATIVNOJ I KVANTITATIVNOJ ANALIZIKVALITATIVNOJ I KVANTITATIVNOJ ANALIZI

� visoka osjetljivost

� selektivnost

� selektivna detekcija elektroaktivnih spojeva odabirom radnog potencijala (multi-channel elektrokemijski detektori)

� linerana ovisnost visine pika o koncentraciji elektroaktivne vrste

� dobra reproducibilnost

� cijena

Kromatogrami meda dobiveni primjenom multi-channel elektrokemijskog detektora kod potencijala: (a) +900 mV, (b) +700 mV, (c) +600 mV, (d) +400 mV.Pikovi: (1) galna kiselina, (2) protokatehinska kiselina, (3) , vanilinska kiselina, (kafeinska kiselina), (siringična kiselina), (6) p-kumarinska kiselina

PRIMJENA:PRIMJENA:

� MEDICINADetermination of total cholesterol in serum by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (K. Hojo et.al.)

� FARMACIJASensitive quantification of chosen drugs by reversed-phase chromatography with electrochemical detection at a glassy carbon electrode (A. Chmielewska et.al.)

� PREHRAMBENA INDUSTRIJAApplication of HPLC with electrochemical detection for the determination of low lewels of antioxidants (M. Škrinjar et.al.)

Determination of phenolic acids in vegetable oil using HPLC coupled with electrochemical detection (I. Bernweiser et.al.)(I. Bernweiser et.al.)

� EKOLOGIJAFast separation and sensitive detection of carcinogenic aromatic amines by reversed phase m-liquid chromatography coupled with electrochemical detection (M. Shelke et.al.)

Cilj istraživanja:

� optimizacija HPLC metode za analizu antocijanina u kožici grožđa

� u metodi su korišteni PDA i elektrokemijski (amperometrijski) detektor

Za analizu su korištene 4 vrste grožđa (jaen, tinta roriz, touriga nacional, alfrosheiro) uzorkovane u regiji Dão, Portugal.

ZAHVALAZAHVALA

NACINALNOJ ZAKLADI ZA VISOKO NACINALNOJ ZAKLADI ZA VISOKO ŠŠKOLSTVO, KOLSTVO, OBRAZOVANJE OBRAZOVANJE

I TEHNOLOGIJSKI RAZVOJ REPUBLIKE HRVATSKE I TEHNOLOGIJSKI RAZVOJ REPUBLIKE HRVATSKE