ÍÀÖ²ÎÍÀËÜÍÀ ÀÊÀÄÅÌ²ß ÍÀÓÊ ÓÊÐÀ¯ÍÈlibrary.nuft.edu.ua/ebook/file/MB_2_2013.pdf · 2017. 11. 13. · issn 0201-8462. Ì³êðîá³îë. æóðí., 2013,

copy sup2iacutentildeograveegraveograveoacuteograve igravesup3ecircethicircaacutesup3icirceumlicircatildesup3iquest sup3 acircsup3ethoacutentildeicirceumlicircatildesup3iquest IacuteAgraveIacute Oacuteecircethagraveiquestiacuteegrave sup3igrave AumlEcirc Ccedilagraveaacuteicirceumlicircograveiacuteicircatildeicirc 2013

IacuteAgraveOumlsup2IcircIacuteAgraveEumlUumlIacuteAgrave AgraveEcircAgraveAumlAringIgravesup2szlig IacuteAgraveOacuteEcirc OacuteEcircETHAgravemacrIacuteEgrave

sup2IacuteNtildeOgraveEgraveOgraveOacuteOgrave Igravesup2EcircETHIcircAacutesup2IcircEumlIcircAtildesup2macr sup2 Acircsup2ETHOacuteNtildeIcircEumlIcircAtildesup2macr sup3igrave AumlEcirc CcedilAgraveAacuteIcircEumlIcircOgraveIacuteIcircAtildeIcirc

IacuteAgraveOumlsup2IcircIacuteAgraveEumlUumlIacuteEgraveEacute OacuteIacutesup2AcircAringETHNtildeEgraveOgraveAringOgrave Aacutesup2IcircETHAringNtildeOacuteETHNtildesup2Acirc sup2 IumlETHEgraveETHIcircAumlIcircEcircIcircETHEgraveNtildeOgraveOacuteAcircAgraveIacuteIacuteszlig OacuteEcircETHAgravemacrIacuteEgrave

Ccedil Igrave sup2 Ntilde OgraveAringecircntildeiumlaringethegraveigravearingiacuteograveagraveeumluumliacutesup3 iumlethagraveoumlsup3

IacuteAgraveOacuteEcircIcircAcircEgraveEacute AEligOacuteETHIacuteAgraveEuml

CcedilAgraveNtildeIacuteIcircAcircAgraveIacuteEgraveEacute Oacute 1934 eth

AcircEgraveOtildeIcircAumlEgraveOgraveUuml IcircAumlEgraveIacute ETHAgraveCcedil IacuteAgrave AumlAcircAgrave Igravesup2NtildeszligOumlsup2

MICROBIOLOGICHNY ZHURNAL

Ograveicircigrave 75 sup1 2 aacutearingetharingccedilaringiacuteuumlndashecircacircsup3ogravearingiacuteuuml 2013

EcircEgravemacrAcirc

Смирнова ГФ Подгорский ВС Особенности метаболизма бактерий устойчивых к высоким концентрациям хроматовПирог ТП Шевчук ТА Антонюк СИ Кравченко ЕЮ Иутинская ГА Влияние одновалентных катионов на синтез поверхностно-активных веществ Аcinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241Патика ВП Симочко ЛЮ Мікробіологічний моніторинг ґрунту природних та трансформованих екосистем Закарпаття УкраїниГрицай РВ Антіпов ІО Варбанець ЛД Ідентифікація 16S РНК та PagL генів Ralstonia solanacearumВасилів ОМ Гнатуш СО Вплив сполук перехідних металів на активність супероксиддисмутази сірковідновлювальних бактерій Desulfuromonas acetoxidansБорецкая МА Суслова ОС Методы выделения экзополимерного комплекса из планктона и биопленки Stenotrophomonas maltophilia 22МБалко АБ Балко ОИ Авдеева ЛВ Формирование биопленки штаммами Рseudomonas aeruginosa украинской коллекции микроорганизмовКурченко ИН Полигалактуроназная активность микроскопических грибов разных трофических групп Чуркина ЛН Авдеева ЛВ Войчук СИ Ярошенко ЛВ Изменчивость свойств Pseudomonas batumici 1720 после длительного хранения Брехлічук ПП Петров ВО Баті ВВ Левчук ОБ Бойко НВ Біологічна деконтамінація відбитків виготовлених із різних стоматологічних матеріалівТовкач ФИ Мороз СН Король НА Файдюк ЮВ Кушкина АИ Поливалентность бактериофагов изолированных из плодовых деревьев пораженных бактериальным ожогом Міщенко ЛТ Дуніч АА Данілова ОІ Поліщук ВП Властивості томатних ізолятів М- та Y-вірусів картоплі В Україні

Ювілеї і дати

Бойко Анатолій Леонідович До 75-річчя з дня народження

Світлої памrsquoяті Анатолія Яковича Циганенка

3

10

21

32

37

45

50

57

67

72

89

98

100

80

ISSN 0201-8462 Igravesup3ecircethicircaacutesup3icirceuml aeligoacuteethiacute 2013 Ograve 75 sup1 22

CONTENTS

Experimental Works

Smirnova GF Pidgorskyi VS Metabolism Features of Bacteria Resistant to High Concentrations of Chromate

Pirog TP Shevchuk TA Antonyuk SI Kravchenko YeYu Iutynska HO Effect of Univalent Cations on Synthesis of Surfactants by Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241

Patyka V P Symochko L Y Soil Microbiological Monitoring of Natural and Transformed Ecosystems in the Transcarpathian Region of Ukraine

Gritsay RV Antipov IO Varbanets LD Identifi cation of 16S RNA and PagL Genes of Ralstonia solanacearum

Vasyliv OM Hnatush SO Infl uence of Transition Metal Compounds on Superoxide Dismutase Activity of Sulfur Reducing Desulfuromonas acetoxidans Bacteria

Boretskaya MA Suslova OS Methods for Extraction of Exopolymeric Complex of Plancton and Biofi lm Growth Mode of Stenotrophomonas maltophilia 22M

Balko AB Balko OI Avdeeva LV Biofi lm Formation by Pseudomonas aeruginosa Strains of Ukrainian Collection of Microorganisms

Kurchenko IN Polygalacturonase Activity of Microscopic Fungi of Different Trophic Groups

Churkina LN Avdeeva LV Voychuk S I Yaroshenko LV Pseudomonas batumici 1720 Properties Variability after Long-Term Storage

Brekhlichuk P P Petrov V O Bati V V Levchuk O B Boyko N V Biological Decontamination of the Imprints Obtained from Different Dental Materials

Tovkach FІ Moroz SM Korol NA Faidiuk YV Kushkina AI Polyvalence of Bacteriophages Isolated from Fruit Trees Affected by Bacterial Fire Blight

Mishchenko LT Dunich AA Danilova OI Polischuk VP Properties of Potato Virus M and Potato Virus Y Isolates in Ukraine

Jubilees and DatesBoyko Anatoliy Leonidovych On His 75th Birthday

Blessed Memory of Anatoliy Yakovych Tsyganenko

3

10

21

32

37

45

50

57

67

72

89

98

100

80

ДО УВАГИ ЧИТАЧІВ

Стаття авторів LP Babenko LM Lazarenko LM Shynkarenko VV Mokrozub VS Pidgorskyi MJa Spivak надрукована в Мікробіологічному журналі 6 2012 р помилково з технічних причин

3ISSN 0201-8462 Igravesup3ecircethicircaacutesup3icirceuml aeligoacuteethiacute 2013 Ograve 75 sup1 2

Aringecircntildeiumlaringethegraveigravearingiacuteograveagraveeumluumliacutesup3 iumlethagraveoumlsup3

УДК57922+6618881+661877

ГФ Смирнова ВС Подгорский

Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украиныул Академика Заболотного 154 Киев ГСП Д 03680 Украина

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА БАКТЕРИЙ УСТОЙЧИВЫХ К ВЫСОКИМ КОНЦЕНТРАЦИЯМ ХРОМАТОВ

Из различных экологических ниш изолировано 20 штаммов бактерий устойчивых к высо-ким концентрациям хроматов и способных восстанавливать их до соединений трехвалент-ного хрома minus нерастворимой гидроокиси хрома или растворимых кристаллогидратов трех-валентного хрома Описаны особенности роста этих микроорганизмов на средах содержа-щих хроматы в высоких концентрациях (до 200 гл) Наряду с хроматами бактерии могут восстанавливать ванадаты до соединений четырехвалентного ванадия и молибдатыminus до Мо5+ Лучше всего редукция происходит на средах где источником углерода служит МПБ глюкоза этиловый спирт На органических кислотах рост культур и восстановление кисло-родсодержащих анионов отсутствовали Показано что вольфраматы хлораты и перхло-раты в высоких концентрациях (до 10 гл) не токсичны для изучаемых бактерий однако не восстанавливаются этими микроорганизмами Самые активные штаммы были отнесены к родам Pseudomonas Oerskovia Bacillus Micrococcus

К л ю ч е в ы е с л о в а хроматрезистентные бактерии кислородсодержащие анионы бактериальное восстановление хроматов хлоратов перхлоратов ванадатов молибдатов

Годовое производство хрома достигает 107 тонн Он используется в металлурги-ческой химической кожевенной и лакокрасочной отраслях промышленности для хромирования металлических изделий Такое широкое применение привело к тому что хром стал одним из основных загрязняющих веществ почвы и воды

Основным источником поступления хроматов в водоемы через сети водоотведе-ния являются технологические сточные воды и отработанные растворы электроли-тов При этом наиболее широкий спектр загрязнения по составу и концентрациям дают сточные воды гальванических производств Более половины таких стоков пос-тупают в городскую канализацию без очистки Соединения шестивалентного хрома растворимы и чрезвычайно токсичны поэтому попадая на очистные сооружения они в десятки раз снижают окислительную способность биоценозов аэротенков и метантенков

Для очистки хроматсодержащих сточных вод используют в основном химичес-кие и физико-химические методы которые требуют большого расхода реагентов электроэнергии вспомогательных материалов в десятки раз увеличивают количес-тво образующихся шламов и значительно повышают минерализацию очищенных вод Это приводит к использованию огромных объемов питьевой воды для разведе-ния обезвреженных стоков с целью соблюдения нормативов по солесодержанию для сброса в канализацию Микробиологический метод очистки гальванических стоков основан на способности микроорганизмов переводить шестивалентный хром в трехвалентный с последующим выпадением гидроокиси хрома в осадок Способ обладает рядом преимуществ

не увеличивает солесодержание очищенных водbull позволяет на 60-100 отказаться от вспомогательных материаловbull снижает на 50-60 расходы электроэнергии bull

Это свидетельствует о его экономической привлекательности и экологической безопасности

copy AtildeOcirc Ntildeigraveegraveethiacuteicircacircagrave AcircNtilde Iumlicircaumlatildeicircethntildeecircegraveeacute 2013


Хром ndash необходимый микроэлемент в метаболизме живых организмов влияю-щий на нормальное функционирование жирового и углеводного обмена регуляцию ферментных систем стабилизацию нуклеиновых кислот Хром существует в двух стабильных валентных состояниях Cr3+ и Cr6+ Токсичность зависит от валентного состояния хрома minus шестивалентный хром в 1000 раз более токсичен чем трехвален-тный Именно шестивалентный хром обусловливает мутагенное онкогенное и тера-тогенное действия на живые организмы [16] Для большинства живых организмов концентрация шестивалентного хрома в несколько миллиграммов в литре является токсичной [17 18] Хроматы могут восстанавливаться химически [15 18 19] или при неспецифических биологических процессах [22] Существует ряд сообщений о прямом ферментативном восстановлении хроматов [1 9] Наряду с бактериями вовлеченными в процесс хроматредукции были выделены бактерии резистент-ные к высоким концентрациям хроматов но не способные к его восстановлению Хроматрезистентность в некоторых случаях коррелировала с наличием плазмидной ДНК [13 14 23]

Первые упоминания о хроматрезистентных бактериях способных восстанавли-вать высокие концентрации хроматов относятся к концу 70-х годов прошлого века [21] Тогда же на основе хроматрезистентного штамма Ps fl uorescens был предло-жен способ очистки сточных вод [10]

Целью нашей работы было изучить распространение бактерий устойчивых к высоким концентрациям хроматов в разных экологических нишах установить при-чину устойчивости выяснить насколько часто высокая резистентность к хроматам сопряжена со способностью микроорганизмов восстанавливать CrO4

2- а также дру-гие кислородсодержащие анионы (КСА) изучить характер роста изолированных микроорганизмов на хроматах и других КСА

Материалы и методы Выделение хроматрезистентных бактерий (ХРБ) прово-дили из сточных вод заводов дренажных вод муниципальных свалок содержимого кишечника домашнего скота и птицы поверхностных водоемов садовой и лесной почвы а также почвы на территории машиностроительного завода

Для изоляции ХРБ пробы высевали в жидкую питательную среду следующего со-става (гл) NH4Cl ndash 20 K2НPO4 ndash 10 KH2PO4 ndash 10 MgSO4 ndash 02 NaCl ndash 01 CaCl2 ndash 002МПБ ndash 25 от объема среды хроматы вносились в виде K2CrО4 в концентрации 20 гл с последующим культивированием либо в условиях ограниченного доступа воздуха под резиновыми пробками либо в таких же условиях но с предварительной продувкой среды газовой смесью N2 CO2 8020 Получение чистых культур прово-дили на МПА с 10 гл хромата калия Чистые культуры хранились в жидкой или на агаризованной среде содержащие не менее 10 г л K2CrО4 Устойчивость выделен-ных культур к антибиотикам проверяли с помощью дисков по стандартной методике нанося на свежезасеянный газон с культурой диски пропитанные антибиотиками ампициллин ndash 10 мкг эритромицин ndash 15 мкг гентамицин ndash 10мкг стрептомицин ndash10 мкг пенициллин 10 ед тетрациклин ndash 30 мкг Устойчивость к антибиотикам считалась положительной при наличии роста по краю диска спустя 48 часов роста Для выяснения влияния концентрации тяжелых металлов на культуры их высевали на МПА куда вносились соли тяжелых металлов Fe2(SO4)3 CdCl2 Co(NO3)2 6H2O Cu(NO3)2 3H2O Pb(NO3)2 6H2O NiCl2 6H2O ZnSO4 MnCl2 3H2O растворенные в дистиллированной воде до конечной концентрации их в среде от 30 до 100 мгл по катиону Ингибирующей считалась концентрация при которой полностью отсутс-твовал рост

Способность культур использовать различные органические вещества для вос-становления хроматов изучали в жидкой среде куда вносили испытуемое органичес-кое вещество глюкозу соли органических кислот minus 1 МПБ ndash 10 об этиловый


спирт в концентрации 03 об Хроматы вносили в виде K2CrO4 в количестве 10 гл Восстановление кислородсодержащих анионов minusVO3

minus MoO42minus ClO3

minus ClO4minusWO4

2minus minus изолированными культурами проверяли на жидкой минеральной среде приведенной выше в аналогичных условиях в среду вместо хроматов вносили вышеперечислен-ные анионы в концентрации 10 гл Источником питания служил МПБ в концентра-ции 10 от объема среды Восстановление сульфатов изучали на среде Постгейта laquoВraquo Во всех случаях для инокуляции одной пробирки использовали 1 мл суспензии клеток плотностью 105ndash10 6 клмл выращенных на МПА и смытой минеральной средой без внесения какого-либо акцептора Восстановление хроматов определяли по снижению концентрации шестивалентного хрома по реакции с дифенилкарбази-дом (ДФК) [20] Остаточные хлораты и перхлораты определяли аналитически [36] о восстановлении ванадатов сульфатов молибдатов судили по изменению окраски среды и появлению осадка Кроме того концентрацию пятивалентного ванадия оп-ределяли титрованием солью Мора в присутствии дифениламинсульфоната как ин-дикатора [8] пятивалентный молибден обнаруживали реакцией с роданидом калия [4] а также посевом культур на среду LPM [11] Наличие сульфатредукции регис-трировали по появлению черного осадка при культивировании на среде Постгейта laquoВraquo Рост культур в анаэробных условиях с хроматом и другими акцепторами элект-ронов изучали на жидкой минеральной среде (см выше) под резиновыми пробками количество жизнеспособных клеток ndash высевом 01 мл десятикратных разведения культуральной жидкости на МПА с соответствующими КСА (100 мгл) Выделение плазмидной ДНК проводили согласно [14] Идентификацию культур до рода прово-дили по фенотипическим признакам [5] Все опыты проводили в трех повторностях Статистическую обработку вели согласно [7]

Результаты и их обсуждение Из исследованных образцов было выделено 20 штаммов бактерий которые росли аэробно на поверхности МПА с высокими концентрациями хроматов (до 200 гл) и в условиях ограниченного доступа воздуха в пробирках под резиновыми пробками на жидкой среде с хроматами Хроматрезис-тентные микроорганизмы с одинаковой частотой выделялись как из мест с высоким уровнем техногенных нагрузок (дренажные воды свалок сточные воды заводов) так и из относительно чистых мест (воздух садовая почва помет домашней птицы) Чистые культуры были получены при рассеве накопительных культур на МПА с 2 гл хроматов Идентификация выделенных культур позволила отнести их к родам Pseudomonas Oerskovia Bacillus и Micrococcus Помимо хроматов культуры были устойчивы практически ко всем проверенным антибиотикам (некоторое угнетение роста оказывал лишь гентамицин) и тяжелым металлам

Бактериальное восстановление CrO42minus идет с поглощением протонов как реду-

цирующих эквивалентов Это приводит к значительному повышению исходного рН среды что способствует осаждению восстановленного хрома в виде гидроокиси [24] При выращивании изолированных штаммов в условиях ограниченного до-ступа воздуха под резиновыми пробками в жидкой минеральной среде с хромата-ми рН среды повышался с 695 до 73minus78 что сопровождалось восстановлением хроматов о чем свидетельствовало наличие осадка гидроокиси хрома и изменение окраски среды При содержании в среде хроматов до 300 мгл на дне пробирки на-блюдался осадок Cr(OH)3 надосадочная жидкость была окрашена в желтый цвет Шестивалентный хром в ней (по реакции с дифенилкарбазидом) отсутствовал При повышении концентрации хроматов до 1000-20000 мгл в среде где источником органического питания был МПБ наряду с незначительным количеством плотного серо-голубого осадка образовывался аморфный травянисто зеленый осадок или та-кой же осадок цвета морской волны Надосадочная жидкость также была окрашена в желтый цвет Шестивалентный хром в ней отсутствовал При росте на жидкой


питательной среде с глюкозой или этанолом на дне пробирки образовывался не-значительный осадок трехвалентного хрома шестивалентный хром в надосадочной жидкости отсутствовал а сама жидкость была окрашена в травянисто зеленый или темно зеленый цвет что характерно для комплексных соединений трехвалентного хрома а именно кристаллогидратов с одним или двумя атомами хлора в молекуле Состав этих соединений можно установить на основании взаимодействия их со све-жеприготовленным раствором нитрата серебра [2] При росте на МПА с хроматами в условиях ограниченного доступа воздуха последний также окрашивался в травя-нисто-зеленый темно зеленый или сине-фиолетовый цвет (характерный для крис-таллогидрата трехвалентного хрома содержащего в своей молекуле три атома хло-ра) Чем объясняется образование той или иной формы кристаллогидрата выяснить не удалось В контрольных образцах в случае если в среду не вносился источник углеродного питания или культивирование бактерий проводилось в аэробных усло-виях подобных изменений в среде не наблюдали Восстановление шестивалентного хрома и рост культур на органических кислотах (Na-солях уксусной пропионовой лимонной кислот) отсутствовали Изолированные штаммы росли и восстанавли-вали хроматы при концентрации последних в жидкой среде до 5 гл (те 134 гл Cr6+) При повышении концентрации количество активных штаммов снижалось Так при концентрации хроматов до 10 гл росли и восстанавливали этот анион лишь 7 штаммов а при 20 гл ndash только 2 штамма значительно увеличивалась также продолжительность процесса восстановления ndash 2-3 10-14 и 28-35 суток соответс-твенно (табл 1) Предварительная продувка среды газовой смесью для удаления остаточного кислорода не приводила к уменьшению лаг-фазы и не снижала время восстановления хроматов Все изолированные культуры восстанавливали ванадаты о чем свидетельствовало появление голубого осадка и изменение окраски среды а также молибдаты При выращивании на среде LPM где соотношение молибдата и фосфата равнялось 401 в течение суток у большинства культур (у 11 из 20 шт) на-блюдалось образование молибденовой сини что свидетельствует о восстановлении шестивалентного молибдена На среде с вольфраматом роста и изменения окраски не было На среде с хлоратами и перхлоратами (50 и 100 гл) рост практически от-сутствовал восстановление хлоратов и перхлоратов не превышало 30-50 мг от пер-воначального количества хотя ни хлораты ни перхлораты ни вольфраматы не были токсичны для изолятов Бактерии хорошо росли в аэробных условиях с внесением такого же количества этих анионов Разницы в активности восстановления и устой-чивости к различной концентрации хрома у бактерий выделенных из загрязненных и относительно незагрязненных мест также не наблюдалось Ни один штамм не восстанавливал сульфаты

Известно что устойчивость бактерий к ионам тяжелых металлов может кодиро-ваться как хромосомными так и внехромосомными генетическими детерминанта-ми Некоторые авторы отмечают что гены отвечающие за нормальный метаболизм ионов металлов в клетке как правило располагаются на хромосоме а генетические детерминанты устойчивости микроорганизмов к токсическим концентрациям ионов металлов имеют плазмидную природу [12 ] Для определения природы устойчивос-ти изолированных бактерий к ионам тяжелых металлов был исследован генетичес-кий профиль трех наиболее активных штаммов Было показано что каждый из этих штаммов содержал высокомолекулярную плазмиду весом примерно 100 kd Однако достоверно доказать что именно она ответственна за суперустойчивость изолиро-ванных штаммов к хроматам и другим кислородсодержащим анионам на данном этапе исследования не удалось Возможно что обнаруженная плазмида определяет устойчивость изучаемых бактерий как к антибиотикам так и к тяжелым металлам


Таким образом из различных объектов были изолированы бактерии устойчи-вые к высоким концентрациям хроматов и других кислородсодержащих анионов и способные восстанавливать эти соединения до нетоксичных форм Это делает их перспективными для использования в биотехнологиях обезвреживания концентри-рованных сточных вод Следует однако иметь в виду что при значительной концен-трации хроматов в сточных водах результат их обезвреживания культурами не га-рантирован поскольку наряду с нерастворимым осадком гидрата окиси хрома обра-зуются и растворимые продукты Это обстоятельство заставляет регламентировать максимальную концентрацию хроматов в сточных водах подающихся на очистку Нечувствительность изолированных культур к начальному невысокому содержанию кислорода значительно упрощает конструкцию установки и время пребывания воды в биореакторе Подобное отношение к кислороду растворенному в среде отмеча-лось также и у хлоратвосстанавливающих бактерий Однако в условиях аэрации ни хлораты ни хроматы ни хлоратредуцирующими ни изучаемыми культурами не восстанавливались

Таблица 1

Восстановление различных кислородсодержащих анионов хроматустойчивыми микроорганизмами

штамма

Рост на МПА с K2CrO4 в конц (гл)

Восстановление К2CrO4 в конц (гл)

Восстановление

50 100 200 50 100 200 Mо6+ V5+ Cl5+ Cl7+

53 + + + + + - -54 + + + + - -59 + + + + - -61 + + + + + + - -64 + + + + - -51 + + + - -69 + + + + + - -58 + + + + + + + - -43 + + - -67 + + + + + + - -45 + + + - -85 + plusmn + + - -86 + + + + + + - -131 + + + + - -132 + + + + + - -101 + + + + - -68 + + + + + + + + - -

151 + + + + - -152 + + + + - -70 + + + + + + + + - -

Культуры изолированные нами относятся к различным таксономическим груп-пам У представителей некоторых из них уже была описана способность редуциро-вать хроматы (9 10 23) Способность восстанавливать хроматы у представителей например рода Oerskovia установлена нами впервые Интересен также факт выде-ления хроматустойчивых штаммов способных восстанавливать кроме хроматов и другие КСА из содержимого кишечника домашних животных и птицы хотя в ес-тественных условиях обитания они вряд ли сталкиваются с такими концентрациями токсикантов Здесь логично было бы предположить что имеет место множествен-ная устойчивость к различным неблагоприятным факторам


ГФ Смирнова ВС Підгорський

Інститут мікробіології і вірусології ім ДК Заболотного НАН України Київ

ОСОБЛИВОСТІ МЕТАБОЛІЗМУ БАКТЕРІЙ СТІЙКИХ ДО ВИСОКИХ КОНЦЕНТРАЦІЙ ХРОМАТІВ

Р е з ю м еЗ різних екологічних ніш ізольовано 20 штамів бактерій стійких до високих концентрацій

хроматів і здатних відновлювати їх до сполук тривалентного хрому minus нерозчинного гідрок-сиду хрому або розчинних кристалогідратів Описані особливості росту цих мікроорганізмів на середовищах що містили хромати у високих концентраціях (до 200 гл) Подібно до хро-матів бактерії можуть відновлювати ванадати до сполук чотиривалентного ванадію та моліб-дати до Мо5+ Найкраще відновлення відбувається на середовищах де джерелом органічного живлення були МПБ глюкоза або етиловий спирт На органічних кислотах ріст культур і відновлення КВА не відбувалось Показано що вольфрамати хлорати і перхлорати у високих концентраціях (до 10 гл) не токсичні для цих бактерій але не відновлюються ними Найак-тивніші штами відносяться до родів Pseudomonas Oerskovia Bacillus Micrococcus

К л ю ч о в і с л о в а хроматрезистентні бактерії кисеньвмісні аніони бактеріальне від-новлення хроматів хлоратів перхлоратів ванадатів молібдатів

GF Smirnova VS Pidgorskyi

Zabolotny Institute of Microbiology and VirologyNational Academy of Sciences of Ukraine Kyiv

METABOLISM FEATURES OF BACTERIA RESISTANT TO HIGH CONCENTRATIONS OF CHROMATE

S u m m a r yTwenty strains of bacteria resistant to high concentrations of chromate were isolated from

different ecological niches They were able to reduce chromate to compounds of trivalent chromium minus nonsoluble chromium hydroxide or soluble crystalline hydrates of trivalent chromium The growth features of these microorganisms on media containing chromate at high concentrations (up to 200 gl) are described Besides chromate bacteria can reduce vanadate to compounds of V4+ and Mo6+ to Мо5+ The best reduction takes place on the media where MPB glucose or ethanol serves as the source of carbon The growth and reduction of anion-in-study did not occur on organic acids It was shown that tungstate chlorate or perchlorate were not toxic for the studied bacteria up to concentrations of 100 gl however were not reduced by these microorganisms The most active strains belong to genera Pseudomonas Oerskovia Bacillus Micrococcus

The paper is presented in RussianK e y w o r d s chromate-resistant bacteria oxygen-containing anions bacterial reduction of

chromate chlorate perchlorate vanadate molybdateT h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Smirnova GF Zabolotny Institute of Microbiology and

Virology National Academy of Sciences of Ukraine 154 Acad Zabolotny St Kyiv MSP D 03680 Ukraine

Биологическая1 очистка хромсодержащих промышленных сточных вод ndash Киев Наук думка 1990 minus 108 сГлинка НЛ2 Общая химия minus Л Химия 1980 minus 720 сГолосницкая ТА Петрашень ВИ3 Экстрационно-колориметрическое определение перхлоратов в присутствии хлоратов ЖАХ ndash 1962 ndash17 7 ndash С 878ndash881 4 Методические указания по определению вредных веществ в сварочном аэрозоле (твердая фаза и газы) Госкомсанэпиднадзор РФ ndash 1988 ndash 334 с


5 Определитель бактерий Берги В 2-х т Т1 Пер с англ Под ред ДжХоулта НКрига ПСнита СУильямсаminus М Мир 1997 ndash 432 сПетрашень ВИ6 Объёмный анализ ndash М Наука 1946 ndash 227 с 7 Химмельблау Д Анализ процессов статистическими методами minus М Мир 1973 minus 975 с Шарло Г8 Методы аналитической химии ndash М Химия 1969 ndash 928 с Bopp Z Ehrlich H9 Enzymatic reduction of Cr6+ by a strain of Ps fl uorescens Abstr Anm Meet Amer Soc Microbiol ndash Washington DC 1980 ndash Р 212minus216 10 Bopp LH Microbiological removal of chromate from contaminated waste water ndash 1985 ndash US Pat 4468461 11 Campbell A M Campillo-Campbell AD Villaret DB Molybdate reduction by Escherichia coli K-12 and its chl mutants Proc Nat Acad Sci USA ndash 1985(Jan) ndash 82 ndash Р 227minus231 12 Cervantes C Campos-Garsia J Devars S Gutierres-Corona F Loza-Tavera H Torres-Guzman JC Moreno-Sanchez R Interaction of chromium with microorganisms and plants FEMS Microbiol Rev minus 2001 minus 25 N 3 minus P 335ndash347 13 Efstathion J D McKay LL Inorganic salts resistance associated with a lactose-fermenting plasmid in Staphylococcus lactis L J Bacteriol ndash 1977 ndash 130 N 1 ndash P 257ndash265 14 Law D Crickmore N Use of simplifi ed rapid size screen protocol for the detection of recombinant plasmids Elsevier Trends Technical Tips ndash 1997 ndash P 301ndash304 15 Nakayama E Fujinaga T Chemical speciation of chromium in sea water II Effects of manganese oxides and reducible organic materials on the redox processes of chromium Anal chim acta ndash1981 ndash130 N 2 ndash P 401ndash404 16 Novick RP Roth C Plasmid-linked resistance to inorganic salts in Staphylococcus aureus J Bacteriol ndash 1968 (Apr) ndash 95 N 4 ndash P 1335ndash1342 17 Petrilli FL de Flora S Toxity and mutagenicity of hexavalent chromium on Salmonella typhimurium Appl Environ Microbiol ndash 1977 ndash 33 N 4 ndash P 805ndash809 18 Petrilli FL de Flora S Metabolic deactivation of hexavalent chromium mutagenicity Mutat Res ndash 1978(Oct) ndash 54 N 2 ndash P 139ndash147 Petrilli FL de Flora S Oxidation of inactive trivalent chromium to the mutagenic hexavalent 19 form Mutat Res ndash 1978(Nov) ndash 58 N 2-3 ndash P 167ndash173 20 Pilkington ES Smith PR Spectrophotomеtric determination of chromium in ilmenite Anal chim acta ndash 1965 ndash 39 N 2 ndash P 321ndash328 21 Shimada K Effects of sixvalent chromium on growth and enzyme production of chromium-resistant bacteria Abstr 79-Annu Meet Amer Soc Microbiol ndash Los Angeles Calif 1979 Washington DC 1979 ndash P 238 22 Smillie RH Hunter K Loutit M Reduction of chromium (VI) by bacterially produced hydrogen sulfi de in a marine environment Water Res ndash 1981 ndash 15 N 12 ndash P 1351-1354 23 Summers AO Jacoby GA Plasmid-determined resistance to boron and chromium compounds in Pseudomonas aeruginosa Antimicrob Agents Chemother ndash 1978 ndash13 N 4 ndash P637ndash640 24 Zakaria ZA Zakaria Z Surif S Ahmad WA Biological detoxifi cation of Cr(VI) using wood-husk immobilized Acinetobacter haemolyticus J Hazardous Materials ndash 2007 ndash148 N 1-2 ndash P 164ndash171

Отримано 15102012


УДК 7598730885661185ТП Пирог12 ТА Шевчук2 СИ Антонюк1

ЕЮ Кравченко1 ГА Иутинская2

1Национальный университет пищевых технологийул Владимирская 68 Киев 01601 Украина

2Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украиныул Академика Заболотного 154 Киев ДСП Д03680 Украина

ВЛИЯНИЕ ОДНОВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

ACINETOBACTER CALCOACETICUS ІМВ В-7241Исследовано влияние одновалентных катионов на активность ключевых фермен-

тов С2-метаболизма у продуцента поверхностно-активных веществ (ПАВ) Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 выращенного на этаноле

Установлено что катионы калия являются ингибиторами пирролохинолинхинон-зависи-мых алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназ ферментов биосинтеза поверхностно-активных аминолипидов (НАДФ+-зависимой глутаматдегидрогеназы) и гликолипидов (фосфоенолпиру-ват(ФЕП)-карбоксикиназы) а катионы аммония ndash активаторами этих ферментов и ФЕП-карбоксилазы Снижение в среде культивирования концентрации катионов калия до 1 мМ и повышение содержания аминного азота до 10 мМ в результате замены нитрата калия на эквимолярную по азоту концентрацию мочевины сопровождалось увеличением активности ферментов метаболизма этанола и биосинтеза ПАВ а также повышением в 2 раза услов-ной концентрации поверхностно-активных веществ

К л ю ч е в ы е с л о в а Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 метаболизм этанола интенсификация биосинтеза поверхностно-активные вещества ключевые ферменты

Ранее было показано что Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 выделенный нами из загрязненных нефтью образцов почвы образует низкомолекулярные по-верхностно-активные вещества (ПАВ) при росте на гидрофобных и гидрофильных субстратах [10] Отметим что штамм ІМВ В-7241 является интересным и необыч-ным как с биотехнологической так и биологической точек зрения по следующим причинам

Во-первых большинство представителей рода Acinetobacter синтезируют высо-комолекулярные ПАВ обладающие эмульгирующими но не поверхностно-активны-ми свойствами [5 13] Наиболее изученными на сегодняшний день являются эмуль-сан (продуцент Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 новое название ndash A venetianus RAG-1 [5] A calcoaceticus BD4) алазан (продуцент A radioresistens К53 и КА53) дисперсан (продуцент A calcoaceticus А2) По химической природе указанные биосурфактанты представляют собой комплексы внеклеточных полисахаридов и белков Лишь недавно [18] в литературе появилось одно из первых сообщений о способности представителей рода Acinetobacter синтезировать низкомолекулярные ПАВ однако только при культивировании на гидрофобных субстратах

Во-вторых изолированный нами штамм ІМВ В-7241 образует ПАВ при выра-щивании на этаноле Отметим что на сегодняшний день в литературе практически отсутствуют сведения о способности микроорганизмов синтезировать низкомоле-кулярные поверхностно-активные вещества на этом субстрате Ранее нами была показана возможность образования ПАВ штаммом Rhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017 как на гидрофобных (гексадекан жидкие парафины) так и гидрофильных (глюкоза этанол) субстратах [3 10 12]

В-третьих A calcoaceticus ІМВ В-7241 синтезирует необычные по химическому составу ПАВ представляющие собой комплекс нейтральных амино- и гликолипи-дов [11] причем гликолипиды представлены трегалозомиколатами ndash метаболитами характерными для бактерий рода Rhodococcus но не Acinetobacter [13] Способ-ность A calcoaceticus ІМВ В-7241 синтезировать трегалозомиколаты подтверждена также и энзимологическими исследованиями [1]copy OgraveIuml Iumlegraveethicircatilde OgraveAgrave Oslasharingacircdivideoacuteecirc NtildeEgrave Agraveiacuteograveicirciacutethornecirc AringTHORN Ecircethagraveacircdividearingiacuteecircicirc AtildeAgrave Egraveoacuteograveegraveiacutentildeecircagraveyuml 2013


В-четвертых исследование особенностей С2-метаболизма A calcoaceticus ІМВ В-7241 показало наличие у штамма ферментов не характерных для представите-лей рода Acinetobacter [1] К таким ферментам относятся прежде всего 4-нитрозо-NN-диметиланилин(НДМА)-зависимые алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназы пирролохинолинхинон(ПХХ)-зависимая ацетальдегиддегидрогеназа АТФ-зави-симая фосфоенолпируват(ФЕП)-карбоксикиназа и трегалозофосфатсинтаза От-метим что наличие НДМА-зависимых алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназ у грамотрицательных бактерий нами установлено впервые НДМА-зависимые алко-гольдегидрогеназы были обнаружены в 90-х годах ХХ ст у некоторых грамположи-тельных бактерий (Mycobacterium gastri Rhodococcus rhodochrous R erythropolis Rhodococcus sp и Amycolatopsis methanolica) [16] Это новый тип никотинопротеи-новых (НАД(Ф)Н-содержащих) алкогольдегидрогеназ в реакции выявления кото-рых в качестве искусственного акцептора электронов используется 4-нитрозо-NN-диметиланилин Они содержат в качестве активного сайта связанный НАД(Ф)Н который является кофактором но не коферментом этих дегидрогеназ

Цель данной работы ndash выявление возможных активаторов и ингибиторов клю-чевых ферментов С2-метаболизма у A calcoaceticus ІМВ В-7241 с последующей модификацией состава среды культивирования для интенсификации синтеза повер-хностно-активных веществ

Материалы и методы Объект исследования ndash штамм A calcoaceticus K-4 за-регистрированный в Депозитарии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины под номером ІМВ В-7241

Бактерии выращивали на жидкой минеральной среде следующего состава (гл) KNO3 ndash 10 NaCl ndash 10 Na2HPO412H2O ndash 06 KH2PO4 ndash 014 MgSO47H2O ndash 01 вода дистиллированная ndash до 1 л рН 68ndash70 (среда 1) а также на среде 2 аналогичной по составу среде 1 за исключением KNO3 Вместо KNO3 в среде 2 использовали (NH2)2CO в эквимолярной по азоту концентрации В одном из вариантов в среду 2 дополнительно вносили дрожжевой автолизат ndash 05 (по объему) и раствор микро-элементов ndash 01 (по объему [11]) В качестве источника углерода и энергии исполь-зовали этанол в концентрации 1minus2 (по объему) Посевной материал minus культура из середины экспоненциальной фазы роста (48 ч) выращенная на средах указаного выше состава с 05 этанола Количество инокулята ndash 5 от объема засеваемой среды (104ndash105 клетокмл) Культивирование осуществляли в 750 мл колбах со 100 мл среды на качалке (220 обмин) при 30 ordmС в течение 24ndash120 ч

Показатели роста и синтеза ПАВ minus концентрация биомассы поверхностное на-тяжение (σs) свободной от клеток культуральной жидкости условная концентрация ПАВ (ПАВ безразмерная величина) индекс эмульгирования культуральной жид-кости (Е24 ) определяли как описано в наших предыдущих работах [2 10 11 12]

Для получения бесклеточных экстрактов бактериальную суспензию полученную после культивирования A calcoaceticus ІМВ В-7241 в жидкой минеральной среде центрифугировали (4000 g 15 мин 4 оС) Осадок клеток дважды отмывали от остат-ков среды 005 М К+-фосфатным буфером (рН 70) центрифугируя (4000 g 15 мин 4 оС) Отмытые клетки ресуспендировали в 005 М К+-фосфатном буфере (рН 70) и разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 40 с при 4 оС на аппарате УЗДН-1 (Рос-сия) Дезинтеграт центрифугировали (12000 g 30 мин 4 оС) осадок отбрасывали надосадочную жидкость использовали в качестве бесклеточного экстракта

Активность ПХХ-зависимой алкогольдегидрогеназы (КФ 1128 ранее КФ 11998) и ПХХ-зависимой альдегиддегидрогеназы (КФ 12993) определяли по восстановлению дихлорфенолиндофенола в присутствии феназинметасульфата при 600 нм с этанолом и ацетальдегидом как донором электронов соответственно Активность никотинопротеиновой (НАД(Ф)Н-содержащей) алкогольдегидрогеназы (КФ 119936) и ацетальдегиддегидрогеназы (КФ 1299) измеряли спектрофотомет-рически по восстановлению 4-нитрозо-NN-диметиланилина при 440 нм с этанолом


и ацетальдегидом как донорами электронов соответственно как описано в наших предыдущих работах [1 10 12]

Активность ацетаткиназы (КФ 2721) ацетил-КоА-синтетазы (КФ 6211) изоцит-ратлиазы (КФ 4131) цитратсинтазы (КФ 2331 ранее КФ 4137) аконитатгидрата-зы (КФ 4213) изоцитратдегидрогеназы (КФ 11142) 2-оксоглутаратдегидрогеназы (КФ 1242) малатдегидрогеназы (КФ 11137) сукцинатдегидрогеназы (КФ 13991) фумаратгидратазы (КФ 4212) оксалоацетатдекарбоксилазы (КФ 4113) глутамат-дегидрогеназы (КФ 1414 и 1412) ФЕП-синтетазы (КФ 2792) ФЕП-карбокси-киназы (КФ 41149) ФЕП-карбоксилазы (КФ 41131) трегалозофосфатсинтазы (КФ 24115) анализировали как описано ранее [1 2 10 12]

При проведении энзиматических анализов использовали реактивы фирмы laquoMerckraquo (Германия) этанол ацетальдегид додеканаль феназинметасульфат laquoFlukaraquo (Швейцария) НАД уридин-5-дифосфатглюкоза коэнзим А laquoServaraquo (Гер-мания) дихлорфенолиндофенол лактатдегидрогеназа АДФ изоцитрат остальные реактивы фирмы laquoSigmaraquo (США)

При исследовании влияния катионов калия натрия и аммония на активность ферментов отмывание клеток ультразвуковую обработку и определение активности ферментов осуществляли в 005 М трис-фосфатном буфере (рН 70) Концентрация катионов в реакционной смеси составляла 25 50 и 100 мМ Катионы вносили в ре-акционную смесь в виде 20 -ных растворов KCl NaCl и NH4Cl

Содержание белка в бесклеточных экстрактах рассчитывали по Брэдфорд [6] ак-тивность ферментов определяли при 28ndash30оС ndash температуре оптимальной для роста A calcoaceticus ІМВ В-7241

Все опыты проводили в 3 повторностях количество параллельных определений в экспериментах составляло от 3 до 5 Статистическую обработку эксперименталь-ных данных проводили как описано ранее [1 2 10 12] Различия средних показате-лей считали достоверными при уровне значимости рlt005

Результаты В предыдущих наших работах [1 2] было показано что у A calcoaceticus ІМВ В-7241 растущего на этаноле функционирует неполный цикл трикарбоновых кислот (не обнаружена активность 2-оксоглутаратдегидрогеназы) и в то же время выявлена высокая активность как изоцитратдегидрогеназы так и изоцитратлиазы Более того несмотря на наличие ферментов глиоксилатного цик-ла в клетках штамма ІМВ В-7241 обнаружена и дополнительная анаплеротическая реакция катализируемая ФЕП-карбоксилазой Такие результаты энзимологических исследований могут свидетельствовать о биосинтетической роли цикла трикарбо-новых кислот у A calcoaceticus ІМВ В-7241 в частности его участии в образовании поверхностно-активных аминолипидов

Для проверки этого предположения на первом этапе исследований анализирова-ли активность НАД(Ф)+-зависимой глутаматдегидрогеназы ndash фермента катализиру-ющего восстановительное аминирование 2-оксоглутаратдегидрогеназы с образова-нием глутамата и принимающего участие в биосинтезе аминокислот глутаматного семейства (табл 1) В табл 1 представлены также данные об активности ферментов биосинтеза поверхностно-активных гликолипидов (трегалозомиколатов) у штамма ІМВ В-7241

Полученные результаты (табл 1) согласуются с нашими предыдущими данными [1] и свидетельствуют о высокой активности в клетках A calcoaceticus ІМВ В-7241 выращенных на этаноле НАДФ+-изоцитратдегидрогеназы (фермента цикла трикар-боновых кислот) изоцитратлиазы и ФЕП-карбоксилазы (ферментов двух различных анаплеротических путей) Логичным подтверждением наличия такого набора фер-ментов (при отсутствии 2-оксоглутаратдегидрогеназы) явилась достаточно высокая (879 нмольmiddotмин-1middotмг-1 белка) активность НАДФ+-глутаматдегидрогеназы (табл 1) Таким образом энзиматические исследования подтвердили способность штамма ІМВ В-7241 к синтезу поверхностно-активных аминолипидов


Таблица 1

Активность ферментов анаплеротических реакций и биосинтеза поверхностно-активных веществ у A calcoaceticus ІМВ В-7241

Фермент

Активность (нмольmiddotмин-1middotмг-1 белка) в бесклеточных экстрактах полученных из клеток находящихся

в начале экспоненциальной фазы

в конце экспоненциальной фазы

Изоцитратлиаза 540plusmn27 478plusmn23

ФЕП-карбоксилаза 556plusmn27 467plusmn23

ФЕП-карбоксикиназа 450plusmn22 394plusmn19

ФЕП-синтетаза 2173plusmn108 1406plusmn70

Трегалозофосфатсинтаза 0 46plusmn2

НАДФ+-зависимая изоцитратдегидрогеназа 498plusmn24 486plusmn24

2-Оксоглутарат-дегидрогеназа 0 0

НАДФ+-зависимая глутаматдегидрогеназа 879plusmn44 855plusmn42

НАД+-зависимая глутаматдегидрогеназа 0 0

Примечания Продолжительность культивирования 24 и 72 ч (начало и конец экспоненциальной фазы роста соответственно) Табл 1minus3 культивирование осуществляли на среде 1 содержащей 1 этанола

В синтезе поверхностно-активных трегалозомиколатов у A calcoaceticus ІМВ В-7241 принимают участие оба ключевых фермента глюконеогенеза (табл 1) От-метим что к концу экспоненциальной фазы роста в клетках бактерий наблюдалось снижение активности ФЕП-синтетазы и увеличение трегалозофосфатсинтазной ак-тивности (табл 1)

На следующем этапе исследовали влияние катионов калия аммония и натрия на активность ключевых ферментов ассимиляции этанола у штамма ІМВ В-7241 Со-гласно предыдущим данным [1] окисление этанола и ацетальдегида у данных бакте-рий осуществляется ПХХ- и НДМА-зависимыми дегидрогеназами

Как видно из представленных в табл 2 данных с увеличением концентрации катионов калия в реакционной смеси наблюдалось существенное снижение актив-ности ПХХ-зависимых ферментов Так в присутствии 100 мМ К+ активность этих дегидрогеназ уменьшалась в 25minus29 раза по сравнению с таковой без катионов Ак-тиваторами ПХХ-зависимых дегидрогеназ оказались катионы аммония причем по мере увеличения концентрации NH4

+ активность этих ферментов также повышалась Катионы натрия в концентрации 25 и 50 мМ повышали активность ПХХ-зависимой алкогольдегидрогеназы в то время как при всех исследуемых концентрациях Na+ наблюдалось снижение активности ПХХ-зависимой ацетальдегиддегидрогеназы в 15 раза

Отметим что НДМА-зависимая алкогольдегидрогеназная активность практи-чески не изменялась в присутствии всех изученных одновалентных катионов а ак-тивность НДМА-ацетальдегиддегидрогеназы незначительно (в 12minus13 раза) увели-чивалась при наличии в реакционной смеси катионов калия и натрия (табл 2)

Дальнейшие исследования показали что активность ферментов цикла трикарбо-новых кислот у A calcoaceticus ІМВ В-7241 практически не изменялась в присутс-твии катионов калия натрия и аммония


Таблица 2

Влияние одновалентных катионов на активность ключевых ферментов окисления этанола у A calcoaceticus ІМВ В-7241

ФерментАктивность (нмольmiddotмин-1middotмг-1 белка) при наличии в реакционной смеси

Без ка-тионов

К+ мМ NH4+ мМ Na+ мМ

25 50 100 25 50 100 25 50 100

ПХХ-зависимая алкоголь-

дегидрогеназа158plusmn7 100plusmn5 80plusmn5 55plusmn2 230plusmn11 240plusmn12 350plusmn17 220plusmn16 240plusmn12 138plusmn7

ПХХ-зависимаяацетальдегид-дегидрогеназа

85plusmn4 53plusmn3 40plusmn2 34plusmn2 190plusmn9 205plusmn10 200plusmn10 54plusmn3 57plusmn3 57plusmn3

НДМА-зависимая алкоголь-

дегидрогеназа


НДМА-зависимая

ацетальдегид-дегидрогеназа


Примечания Активность определяли в бесклеточных экстрактах полученных из клеток находящихся в начале экспоненциальной фазы роста (24 ч)

Данные по влиянию одновалентных катионов на активность ключевых фермен-тов биосинтеза поверхностно-активных веществ у штамма ІМВ В-7241 представ-лены в табл 3 Наличие в реакционной смеси катионов калия натрия и аммония во всем диапазоне исследуемых концентраций не сопровождалось существенным изменением активности изоцитратлиазы Катионы калия не влияли на ФЕП-карбок-силазную активность однако ингибировали активность глутаматдегидрогеназы и обоих ферментов глюконеогенеза

Катионы аммония оказались активаторами ФЕП-карбоксикиназы ФЕП-карбок-силазы и НАДФ+-глутаматдегидрогеназы Так например при 50 мМ NH4

+ актив-ность последнего фермента увеличивалась более чем в 2 раза (табл 3) Отметим что внесение в реакционную смесь катионов аммония не сопровождалось сущест-венным изменением активности ФЕП-синтетазы

В присутствии всех исследуемых концентраций NH4+ наблюдали снижение в

12minus13 раза ФЕП-синтетазной активности однако катионы аммония практически не влияли на активность НАДФ+-глутаматдегидрогеназы ФЕП-карбоксикиназы и ФЕП-карбоксилазы (табл 3)

Данные по влиянию одновалентных катионов на активность ключевых фер-ментов С2-метаболизма у A calcoaceticus ІМВ В-7241 свидетельствуют о том что большинство из исследуемых ферментов ингибировалось катионами калия и акти-вировалось катионами аммония (табл 2 и 3) В связи с этим предположили что сни-жение в среде культивирования содержания К+ и повышение концентрации NH4

+ мо-жет сопровождаться интенсификацией метаболических процессов в клетках данных бактерий С этой целью нитрат калия в среде заменили на эквимолярную по азоту концентрацию мочевины При этом концентрация К+ в среде снизилась до 1 мМ а концентрация аминного азота увеличилась до 10 мМ

На следующем этапе анализировали активность ключевых ферментов С2-мета-болизма при культивировании штамма ІМВ В-7241 на исходной (среда 1) и модифи-цированной среде 2 (табл 4) Внесение дрожжевого автолизата и микроэлементов в модифицированную среду осуществляли в связи с тем что в предыдущих исследо-ваниях было установлено их стимулирующее влияние на синтез ПАВ [11]


Таблица 3

Изменение активности ключевых ферментов синтеза ПАВ у A calcoaceticus ІМВ В-7241 в присутствии одновалентных катионов

Фер-мент

Активность (нмольmiddotмин-1middotмг-1 белка) при наличии в реакционной смеси



25 50 100 25 50 100 25 50 100

НАДФ

+ -глутамат

-дегидрогеназа


ФЕП

-синтетаза


ФЕП

-карбокси-

киназа

430plusmn21 287plusmn14 Но 287plusmn14 480plusmn24 580plusmn29 650plusmn32 487plusmn24 465plusmn23 448plusmn22

ФЕП

-карбок-

силаза


Изоцитрат

-лиаза

576plusmn25 513plusmn21 Но 556plusmn28 550plusmn28 Но Но 556plusmn28 556plusmn28 Но

Примечания Активность определяли в бесклеточных экстрактах полученных из клеток находящихся в середине экспоненциальной фазы роста (48 ч) Но ndash не определяли

Как видно из представленных в табл 4 данных при культивировании бактерий на среде с мочевиной наблюдали увеличение в 13minus25 раза активности большинства исследованных ферментов по сравнению с таковой на среде с нитратом калия Так активность ФЕП-карбоксилазы и ФЕП-карбоксикиназы повысилась в 25 обоих ацетальдегиддегидрогеназ ndash в 2 ФЕП-синтетазы ndash в 17 ПХХ-зависимой алкоголь-дегидрогеназы ацетил-КоА-синтетазы и НАДФ+-зависимой глутаматдегидрогена-зы ndash в 13minus14 раза

Отметим что внесение дрожжевого автолизата и микроэлементов в среду с мо-чевиной не сопровождалось существенным повышением активности исследуемых ферментов (табл 4) Тем не менее и в этом случае активность всех ферментов за исключением оксалоацетатдекарбоксилазы была значительно выше чем на исход-ной среде 1

Показатели синтеза ПАВ при культивировании штамма ІМВ В-7241 на исходной и модифицированной средах представлены в табл 5 Условная концентрация ПАВ и индекс эмульгирования на среде содержащей в качестве источника азота мочевину были соответственно в 2 и 15 раза выше чем на среде с нитратом калия В то же время при наличии в модифицированной среде дрожжевого автолизата и микроэле-ментов не наблюдали повышения синтеза ПАВ по сравнению с культивированием бактерий на среде 2


Таблица 4

Активность ключевых ферментов С2-метаболизма в различных условиях культивирования A calcoaceticus ІМВ В-7241

ФерментАктивность (нмольmiddotмин-1middotмг-1 белка) при культивировани на

среде 1с KNO3

среде 2 c (NH2)CO

среде 2 с дрожжевым автолизатом и микроэлементами

ПХХ-зависимая алкогольдегидрогеназа 158plusmn7 222plusmn11 214plusmn10

ПХХ-зависимая ацетальдегиддегидрогеназа 85plusmn4 172plusmn8 126plusmn6

НДМА-зависимая ацетальдегиддегидрогеназа 51plusmn2 98plusmn5 76plusmn4

Ацетил-КоА-синтетаза 36plusmn2 48plusmn3 57plusmn3

Изоцитратлиаза 576plusmn25 588plusmn27 690plusmn35

Ацетаткиназа 103plusmn5 120plusmn6 116plusmn6

Оксалоацетатдекарбоксилаза 182plusmn9 Но 140plusmn7

НАДФ+-зависимая изоцитратдегидрогеназа 480plusmn24 523plusmn26 545plusmn27

НАДФ+-зависимая глутаматдегидрогеназа 833plusmn42 1100plusmn55 1241plusmn62

НАД+-зависимая малатдегидрогеназа 492plusmn24 Но 885plusmn44

ФЕП-синтетаза 2230plusmn111 3856plusmn192 3716plusmn185

ФЕП-карбоксикиназа 430plusmn21 1075plusmn53 978plusmn49

ФЕП-карбоксилаза 660plusmn33 1660plusmn78 1484plusmn74

Примечания Активность определяли в бесклеточных экстрактах полученных из клеток находящихся в середине экспоненциальной фазы роста (48 ч) laquoНоraquo minus не определяли minus активность ферментов измерена в начале экспоненциальной фазы роста (24 ч)

Таблица 5

Влияние условий культивирования A calcoaceticus ІМВ В-7241 на накопление биомассы и синтез ПАВ

Условия культивирования Биомасса гл Условная концентрация ПАВ

Индекс эмульгирования

Среда 1 13plusmn006 20plusmn01 40plusmn2


Среда 2 с дрожжевым автолизатом и микроэлементами

18plusmn009 38plusmn019 60plusmn3

Примечания Длительность культивирования 120 ч Содержание этанола в средах 2 (по объему)

Таким образом на основе энзимологических исследований нам удалось моди-фицировать состав питательной среды для культивирования A calcoaceticus ІМВ В-7241 что в свою очередь дало возможность повысить в два раза условную кон-центрацию синтезированных поверхностно-активных веществ

Обсуждение Известно что одним из способов интенсификации технологий микробного синтеза является определение сайтов метаболического лимитирования и разработка подходов к их устранению [3]


Чаще всего исследователи для компенсации laquoузких местraquo метаболизма исполь-зуют методы метаболической инженерии ndash получение рекомбинантных штаммов с повышенной экспрессией генов ответственных за синтез ферментов катализирую-щих скорость-лимитирующие реакции

На сегодняшний день достигнуты значительные успехи в метаболической ин-женерии микроорганизмов ndash продуцентов олиго- и полисахаридов [14] Многообе-щающими являются первые результаты в получении с помощью рекомбинантных штаммов гиалуроновой кислоты [17] и aльгината с заданными свойствами [14] С использованием методов метаболической инженерии удалось повысить количес-тво синтезированных микроорганизмами антибиотиков [15] каротиноидов [7] ами-нокислот [9] спиртов (ксилитол маннитол сорбитол) [4] биотоплива [8]

Наши предыдущие исследования [3] показали что существует более простой и не менее эффективный способ устранения laquoузкихraquo мест метаболизма увеличение активности скорость-лимитирующей реакции изменением состава питательной сре-ды (исключение ингибиторов и повышение концентрации активаторов фермента катализирующего эту реакцию) Использование таких приемов позволяет не только повысить количество синтезированного целевого продукта но и минимизировать состав питательной среды а также интенсифицировать процесс микробного син-теза (сократить продолжительность культивирования повысить скорость синтеза целевого продукта и сместить время ее достижения в более раннюю ростовую фазу и др)

Так исследование особенностей С2-метаболизма у Acinetobacter sp ІМВ В-7005 (продуцент микробного экзополисахарида этаполана) показало что laquoузкимraquo мес-том метаболизма этанола является ассимиляция ацетата о чем свидетельствовало ингибирование ионами натрия как окисления ацетата интактными клетками так и активности ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте а также лимитиро-вание С2-метаболизма коэнзимом А [3] Установлено что кроме катионов натрия ингибиторами ацетил-КоА-синтетазы являются интермедиаты окисления этанола и ацетальдегида (НАДН и НАДФН) а активаторами ndash катионы калия и магния Ис-ключение Na+ из состава среды культивирования штамма ІМВ В-7005 и повышение содержания катионов калия позволили устранить лимитирование С2-метаболизма и повысить активность ацетил-КоА-синтетазы в 3 раза а также реализовать процесс синтеза этаполана на незабуференной среде в которой содержание солей было сни-жено в 4 раза (до 295 гл) [3]

Показана возможность устранения лимитирования С2-метаболизма в условиях миксотрофного роста Acinetobacter sp ІМВ В-7005 на смеси С2minusС6-субстратов по-вышением в среде концентрации активаторов ацетил-КоА-синтетазы (пантотената К+ Mg2+) использованием инокулята выращенного на этаноле или ацетате дроб-ным внесением субстратов порциями по 025 в процессе культивирования бакте-рий [3]

Другим подходом к интенсификации технологий микробного синтеза базирую-щемся на исследовании особенностей метаболизма штамма-продуцента является выявление возможных активаторов иили ингибиторов ключевых ферментов ме-таболизма с последующей соответствующей модификацией состава питательной среды

Так изучение особенностей метаболизма н-гексадекана у продуцента поверх-ностно-активных веществ Rerythropolis ІМВ Ас-5017 позволило установить усло-вия культивирования бактерий обеспечивающих повышение в 4 раза синтеза ПАВ [3 12] Установлено что у штамма ІМВ Ас-5017 катионы калия являются ингиби-торами алкангидроксилазы и НАДФ+-зависимой альдегиддегидрогеназы а катионы натрия ndash активаторами этих ферментов Снижение в среде с н-гексадеканом концент-рации К+ до 1 мМ повышение содержания Na+ до 35 мМ внесение 36 мкмольл Fe2+ необходимого для функционирования алкангидроксилазы сопровождалось увели-


чением активности ключевых ферментов метаболизма н-гексадекана а также повы-шением количества синтезированных поверхностно-активных веществ

Отметим что в отличие от Acinetobacter sp ІМВ В-7005 у Rerythropolis ІМВ Ас-5017 laquoузкиеraquo места метаболизма те явно выраженные скорость-лимитирую-щие реакции выявлены не были

Результаты данной работы показали что у A calcoaceticus ІМВ В-7241 катионы калия являются ингибиторами ключевых ферментов метаболизма этанола (ПХХ-зависимых алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназ) а также ферментов биосинтеза поверхностно-активных аминолипидов (НАДФ+-зависимой глутаматдегидрогена-зы) и гликолипидов (ФЕП-синтетазы и ФЕП-карбоксикиназы) Активаторами этих ферментов являются катионы аммония Однако используемый нами ранее подход (исключение или снижение в среде культивирования Acinetobacter sp ІМВ В-7005 и Rerythropolis ІМВ Ас-5017 концентрации ингибиторов и повышение содержания активаторов ключевых ферментов метаболизма этанола и гексадекана соответствен-но) не привел к желаемому результату в случае модификации питательной среды для выращивания A calcoaceticus ІМВ В-7241 Замена нитрата калия на эквимо-лярную по азоту концентрацию аммонийного источника азотного питания (сульфат хлорид или нитрат аммония) сопровождалась не ожидаемым повышением а сниже-нием показателей роста и синтеза ПАВ A calcoaceticus ІМВ В-7241 [2] И только ис-пользование мочевины в качестве источника азота в составе среды культивирования штамма ІМВ В-7241 дало возможность повысить активность ключевых ферментов метаболизма этанола и биосинтеза ПАВ В таких условиях культивирования наблю-дали также повышение концентрации синтезированных поверхностно-активных ве-ществ В нашей предыдущей работе [2] мы объясняли такие необычные результаты проблемами транспорта катионов аммония в клетки A calcoaceticus ІМВ В-7241

При исследовании особенностей метаболизма штамма ІМВ В-7241 растущего на этаноле мы установили еще один интересный факт Оказалось неожиданным что несмотря на наличие ферментов глиоксилатного цикла в клетках бактерий об-наружена достаточно высокая активность ФЕП-карбоксилазы ndash фермента анаплеро-тического пути восполняющего пул С4-дикарбоновых кислот при росте микроор-ганизмов на углеводных субстратах [1 2] В работе [2] мы предположили что фи-зиологическая роль ФЕП-карбоксилазы при культивировании A calcoaceticus ІМВ В-7241 на среде с этанолом и мочевиной состоит в обезвреживании углекислого газа образуемого в уреазной реакции Это сопровождается повышением в клетках бактерий пула С4-дикарбоновых кислот усилением глюконеогенеза и увеличением синтеза поверхностно-активных гликолипидов

При изучении влияния условий культивирования на образование ПАВ A calcoaceticus ІМВ В-7241было установлено что внесение в среду с этанолом дрожжевого автолизата и микроэлементов сопровождалось повышением показа-телей синтеза ПАВ [11] В то же время результаты энзиматических исследований представленные в настоящей работе не подтверждают полученных ранее данных Так нами не обнаружено существенного положительного влияния дрожжевого ав-толизата и микроэлементов в среде культивирования штамма ІМВ В-7241 на ак-тивность ключевых ферментов биосинтеза ПАВ Выяснению этого вопроса будут посвящены наши дальнейшие исследования

Таким образом в результате проведенной работы установлено что замена в сре-де культивирования A calcoaceticus ІМВ В-7241 нитрата калия на эквимолярную по азоту концентрацию мочевины сопровождалась повышением в 2 раза синтеза ПАВ что обусловлено увеличением в таких условиях культивирования штамма активнос-ти ключевых ферментов метаболизма этанола (ПХХ- и НДМА-зависимых ацеталь-дегиддегидрогеназ) и биосинтеза ПАВ (НАДФ+-зависимой глутаматдегидрогеназы ФЕП-карбоксилазы ФЕП-синтетазы и ФЕП-карбоксикиназы)


ТП Пирог12 ТА Шевчук2 СІ Антонюк1 ЄЮ Кравченко1 ГО Іутинська2

1Національний університет харчових технологій Київ2Інститут мікробіології і вірусології НАН УкраїниКиїв

ВПЛИВ ОДНОВАЛЕНТНИХ КАТІОНІВ НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН

ACINETOBACTER CALCOACETICUS ІМВ В-7241

Р е з ю м еДосліджено вплив одновалентних катіонів на активність ключових ферментів С2-мета-

болізму у продуцента поверхнево-активних речовин (ПАР) Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 вирощеного на етанолі

Встановлено що катіони калію є інгібіторами піролохінолінхінон-залежних алкоголь- і ацетальдегіддегідрогеназ ферментів біосинтезу поверхнево-активних аміноліпідів (НАДФ+-залежної глутаматдегідрогенази) і гліколіпідів (фосфоенолпіруват(ФЕП)-карбоксикінази) а катіони амонію ndash активаторами цих ферментів і ФЕП-карбоксилази Зниження у середовищі культивування концентрації катіонів калію до 1 мМ і підвищення вмісту амінного азоту до 10 мМ в результаті заміни нітрату калію на еквімолярну за азотом концентрацію сечовини супроводжувалося збільшенням активності ферментів метаболізму етанолу і біосинтезу ПАР а також підвищенням у 2 рази умовної концентрації поверхнево-активних речовин

К л ю ч о в і с л о в а Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 метаболізм етанолу інтен-сифікація біосинтезу поверхнево-активні речовини ключові ферменти

TP Pirog12 TAShevchuk2 SI Antonyuk1 YeYu Kravchenko1 HO Iutynska2

1 National University of Food Technologies Kyiv2 Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine Kyiv

EFFECT OF UNIVALENT CATIONS ON SYNTHESIS OF SURFACTANTS

BY ACINETOBACTER CALCOACETICUS IMV B-7241

S u m m a r yThe effect of univalent cations on activity of key enzymes of C2-metabolism has been investigated

in the producer of biosurfactants Acinetibacter calcoaceticus IMV B-7241 grown on ethanol It was established that potassium cations are inhibitors of pyroquinolinequinone-dependent alcohol- and acetaldehyde dehydrogenases the enzymes of biosynthesis of surface-active aminolipids (NADP-dependent glutamate dehydrogenase) and glycolipids (phosphoenopyruvate(PhEP)-carboxikinase) while ammonium cations are activators of these enzymes and PhEP-carboxylase A decrease of potassium cations concentration in the cultivation medium to 1 mM and increase of the content of amine nitrogen to 10 mM as a result of potassium nitrate substitution by equimolar as to nitrogen urea concentration were accompanied by the increase of activity of enzymes of ethanol metabolism and SAS biosynthesis as well as by the 2-fold increase of conditional concentration of the biosurfactants

The paper is presented in Russian

K e y w o r d s Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241 ethanol metabolism biosynthesis intensifi cation biosurfactants key enzymes

T h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Pirog TP National University of Food Technologies 68 Volodymyrska St Kyiv 01601 Ukraine


1 Пирог ТП Шевчук ТА Дугинец ОС Особенности окисления этанола у продуцента поверхностно-активных веществ Acinetobacter calcoaceticus К-4 Микробиол журн ndash 2010 ndash 72 6 ndash С 3ndash10

2 Пирог ТП Шевчук ТА Долотенко ЕЮ Роль фосфоенолпируваткарбоксилазы в синтезе поверхностно-активных веществ Acinetobacter calcoaceticus К-4 Микробиол журн ndash 2011 ndash 73 3 С 9ndash15

3 Подгорский ВС Иутинская ГО Пирог ТП Интенсификация технологий микробного синтеза ndash Киев Наук думка 2010 ndash 327 с

4 Akinterinwa O Khankal R Cirino P C Metabolic engineering for bioproduction of sugar alcohols Cur Opinion Biotechnol ndash 2008 ndash 19 N 5 ndash P 461ndash467

5 Bach H Berdichevsky Y Gutnick D An exocellular protein from the oil-degrading microbe Acinetobacter venetianus RAG-1 enhances the emulsifying activity of the polymeric bioemulsifi er emulsan Appl Environ Microbiol minus 2003 ndash 69 N 5 minus P 2608minus2615

6 Bradford M A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem ndash 1976 ndash 72 3 ndash P248ndash254

7 Klein-Marcuschamer Ajikumar PK Stephanopoulos G Engineering microbial cell factories for biosynthesis of isoprenoid molecules beyond lycopene Trends Biotechnol ndash 2007 ndash 25 N 9 ndash P 417ndash424

8 Mukhopadhyay A Redding A M Rutherford B J Keasling J D Importance of systems biology in engineering microbes for biofuel production Cur Opinion Biotechnol ndash 2008 ndash 19 N 3 ndash P 228ndash234

9 Park J H Lee SY Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production Ibid ndash 2008 ndash 19 N 5 ndash P 454ndash460

10 Pirog TP Korzh YuV Shevchuk TA Tarasenko DO Peculiarities of C2ndashmetabolism ans intensifi cation of the synthesis of surface active substances in Rhodococcus erythropolis EK-1 grown in ethanol Microbiology ndash 2008 minus 77 N 6 minus P 665minus673

11 Pirog TP Antonuk SI Karpenko YV Shevchuk TA The infl uence of conditions of Acinetobacter calcoaceticus K-4 strain cultivation on surface-active substances synthesis Appl Biochem Microbiol ndash 2009 minus 45 N 3 ndash P 272minus278

12 Pirog TP Shevchuk TA Klimenko Yu A Intensifi cation of surfactant synthesis in Rhodococcus erythropolis EK-1 cultivated on hexadecane Appl Biochem Microbiol ndash 2010 minus 46 N 6 minus P 599minus606

13 Rosenberg E Ron EZ High- and low-molecular-mass microbial surfactants Appl Microbiol Biotechnol ndash 1999 ndash 52 N 2 ndash P 154ndash162

14 Ruffi ng A Chen RR Metabolic engineering of microbes for oligosaccharide and polysaccharide synthesis Microbial Cell Factories ndash 2006 ndash 5 ndash P 25ndash33

15 Stack D Neville C Doyle S Nonribosomal peptide synthesis in Aspergillus fumigatus and other fungi Microbiology ndash 2007 ndash 153 N 5 ndash P 1297ndash1306

16 Van Ophem PW van Beeumen J Duine J A Nicotinoprotein [NAD(P)-containing] alcoholaldehyde oxidoreductases Purifi cation and characterization of a novel type from Amycolatopsis methanolica Eur J Biochem ndash 1993 ndash 212 N 3 ndash P 819ndash826



УДК 6314272631433363145ВП Патика1 ЛЮ Симочко2

1Інститут мікробіології і вірусології ім ДК Заболотного НАН України вул Акад Заболотного 154 Київ ГСП Д03680 Україна

2ДВНЗ Ужгородський національний університетвул Волошина 32 88000 Ужгород Україна

МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ ҐРУНТУ ПРИРОДНИХ ТА ТРАНСФОРМОВАНИХ ЕКОСИСТЕМ ЗАКАРПАТТЯ УКРАЇНИПроаналізовано та узагальнено результати мікробіологічних моніторингових досліджень

ґрунту пралісових та антропогенно трансформованих екосистем Показано що чисельність представників основних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів варіює залеж-но від висоти розташування лісових масивів і рівня антропогенного навантаження Рівень біологічної активності в усіх досліджуваних трансформованих екосистемах був найниж-чим у ґрунті який безпосередньо відбирався на прилеглих до залізничної колії або автошляхів територіях Максимальне значення біологічної активності ґрунту зафіксовано в пралісових екосистемах Рівень фітотоксичної активності ґрунту трансформованих екосистем був у середньому втричі вищим ніж в еталонній пралісовій екосистемі Фітотоксичність ґрунту ndash інформативний показник який доцільно використовувати при здійсненні моніторингових досліджень ґрунту з метою оцінки антропогенного впливу на екосистеми

Ключові слова трансформовані екосистеми ґрунтові мікроорганізми біологічна ак-тивність ензиматична активність санітарний стан фітотоксичність ґрунту

Ґрунт як складова біогеоценозу знаходиться під впливом різного за часом ін-тенсивністю масштабом антропогенного навантаження яке в свою чергу порушує нормальний перебіг ґрунтових процесів що призводить до значних змін у функціо-нуванні мікробного угруповання [14-16 22] Відомо що кількісний та якісний склад ґрунтової мікробіоти адекватно віддзеркалює ступінь антропогенного навантажен-ня тому використовується як діагностичний показник при оцінці екологічного ста-ну ґрунту трансформованих біогеоценозів [2 3 10 12 17] В Україні близько 60 земельного фонду складають землі сільськогосподарського призначення Активне використання інтенсивних агротехнологій з метою одержання високих врожаїв час-то призводить до надмірного забруднення ґрунту агроекосистем ксенобіотиками [23 25 31 41] Відповідно до концепції сталого розвитку агроекосистем в Україні на період до 2025 року яка спрямована на забезпечення ідей і принципів декларо-ваних конференцією ООН з навколишнього середовища і розвитку (Ріо-де-Жанейро 1992 р) та Всесвітнім самітом із збалансованого розвитку (Йоханнеcбург 2002 р) передбачено організацію науково-методичного забезпечення комплексного агроеко-логічного моніторингу агроекосистем України до біотичної складової якого входить мікробіологічний моніторинг [24 27 33] Мікробіологічний моніторинг ndash регулярна система спостережень та діагностики за станом ґрунту екосистем з використанням показників які характеризують функціональний стан ґрунтової мікробіоти [21 23 26 29]

До основних завдань мікробіологічного моніторингу входить визначення біомаси ґрунтових мікроорганізмів дослідження особливостей функціонування різних еко-лого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів при антропогенному навантаженні визначення спрямованості мікробіологічних процесів у ґрунті за умов антропоген-ного впливу встановлення рівня біологічної та фітотоксичної активності ґрунту різ-них екосистем [10 18 23 28 38] Крім того важливим аспектом є визначення інтен-сивності ферментативних реакцій встановлення таксономічного складу ґрунтового мікробоценозу формулювання рекомендацій щодо покращення екологічного стану ґрунтів різних екосистем [1 21 42 44 46]

Для здійснення фонового мікробіологічного моніторингу ґрунту використову-ються екосистеми які не зазнали прямого антропогенного впливу [8 13 21 32 43]

copy AcircIuml Iumlagraveograveegraveecircagrave EumlTHORN Ntildeegraveigraveicircdivideecircicirc 2013


Саме такими екосистемами є букові праліси Карпатського Біосферного заповідника які досліджувалися як еталонні екосистеми для порівняльного аналізу мікробіоло-гічних показників трансформованих екосистем а саме агроекосистем залізничних примагістральних екосистем екосистем прилеглих до автошляхів

Матеріали і методи Матеріалом досліджень слугували зразки ґрунту відібрані в Ужгородському Мукачівському Берегівському Рахівському Міжгірському райо-нах Закарпатської області Дослідження проводились протягом 2007-2012 років Ґрунтові взірці відбирали на різній відстані від автошляхів та залізничних колій а саме 5 м 50 м 100 м на глибину до 25 см методом квадратів у чотирьохкратній пов-торності для приготування змішаної проби Фоновий мікробіологічний моніторинг ґрунту проводився у букових пралісах Широколужанського масиву Карпатського біосферного заповідника Відбір проб здійснювався за загальноприйнятою методи-кою на різній висоті над рівнем моря від 500 м до 1100 м

Перелік показників що досліджували при здійсненні мікробіологічного моніто-рингу [21 23] наведено в табл 1

Мікробіологічні аналізи ґрунту проводились за загальноприйнятими методика-ми [7 11 19 30 35] Біологічну активність ґрунту визначали методом В Штатнова [40] Спрямованість мікробіологічних процесів у ґрунті визначали за К Андреюк з співав[3] та методиками описаними ВВолкогоном із співав[7]

Коефіцієнт мінералізації-іммобілізації розраховували за формулою Км-і = СКААСМПА де

СКАА СМПА ndash кількість мікроорганізмів що виросли на відповідно крохмало-аміачному та мrsquoясопептонному агарах

Коефіцієнт оліготрофності розраховували за формулоюКол = СГА(СКАА + СМПА) де

СГА ndash кількість мікроорганізмів що виросли на голодному агаріКоефіцієнт педотрофності розраховували за відношеннями кількостей мікро-

організмів на ґрунтовому агарі (СГрА) до кількості мікроорганізмів що виросли на мrsquoясопептонному агарі (СМПА)

Кпед = СГрА СМПАТаблиця 1

Перелік показників що рекомендуються для визначення при проведенні мікробіологічного моніторингу ґрунтів різних екосистем

Процес що контролюється

Показник Процес що контролюється

Показник

Зміна чисельності основних груп ґрунтових мікроорганізмів

Кількість КУО на 1г аб сух ґрунту

ldquoДихання ґрунтуrdquo

Інтенсивність виділення СО2 мгкг ґрунту за добу

Зміна біомаси ґрунтових мікроорганізмів

Вміст вуглецю мікробної біомаси мкгг ґрунту

Азотфіксуюча активність ґрунту

Інтенсивність виділення етилену С2Н4 мкмольгґрунту за 1 добу

Накопичення фітотоксичних метаболітів ґрунтових мікроорганізмів

інгібування ростових процесів рослин

Фосфатазна активність ґрунту

мг Р2О5 100г ґрунту за 30 хв

Зміна стійкості екосистем

Оцінка різноманітності ґрунтового угруповання за допомогою індексів Сімпсона і Шенона D=1ΣPi2

H=ΣPiln Pi

Каталазна активність ґрунту

см3 О2гр ґрунту


Токсичність ґрунту відібраних зразків визначали за методикою О Берестецького [4] Ферментативну активність ґрунту ndash методом Хазієва [36-37]

Санітарну оцінку стану ґрунтів екосистем здійснювали відповідно до ГОСТу 174201-81(за санітарно-гельмінтологічним (СГП) ентомологічним (ЕП) показни-ками та показником бактеріального забруднення ґрунту (ПБЗ)

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Доспеховим [6]Результати та їх обговорення На території Карпатського біосферного заповід-

ника збереглися пралісові екосистеми що мають особливу цінність Дослідження мікрофлори ґрунту букових пралісів які є сенсабільними реагентами на вплив зов-нішніх чинників та індикаторами стану екосистеми і сукцесійних процесів що в ній відбуваються є надзвичайно актуальним [3239] Нами показано що співвідношен-ня різних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів змінюється залежно від висоти розташування біотопу над рівнем моря Так чисельність амоніфікаторів зі збільшенням висоти зменшувалась мінімальним вмістом органотрофів 122 млн (колонієутворюючих одиниць на 1 гр абсолютно сухого ґрунту) характеризувався ґрунт відібраний на висоті 1100 метрів над рівнем моря (табл 2)

Таблиця 2Чисельність різних еколого-трофічних груп мікроорганізмів

у ґрунті букових пралісів

варі-анту

Висота н р моря м

Чисельність ґрунтових мікроорганізмів (КУО на 1 гр аб сухого ґрунту)

Мікро-міцети

103

Амоніфі-катори

106

Оліго-трофи

106

Педотро-фи

106

Бактерії що асимілюють мінеральний азот 106

Azoto-bacter

1 500 17 707 233 168 432 80

2 600 20 430 261 188 364 68

3 700 20 346 287 200 322 60

4 800 21 293 324 226 314 58

5 900 25 166 370 296 218 54

6 1000 26 130 380 312 196 50

7 1100 28 122 394 365 183 41

НІР05 - 032 054 041 018 032 067

Примітка середні значення за роки досліджень

Як видно з табл 2 на висоті 500 метрів вміст амоніфікаторів був в шість разів вищим і складав 707 млн КУО гр абсгр що свідчить про значне збагачення ґрунту органічною речовиною рослинного походження Відповідна тенденція змін чисельності спостерігалась у випадку з бактеріями що використовують для свого живлення мінеральний азот Максимальна чисельність цих мікроорганізмів у ґрунті спостерігалась на висоті 500 метрів над рівнем моря і становила 432 млн КУО гр абсгр

У найвищій точці відбору (1100 м) їх чисельність була в 282 рази нижчою Що стосується мікроміцетів то слід зазначити що коливання їх чисельності не було таким значним як бактеріальної флори але в едафотопах розташованих в межах 500 ndash800 метрів їх біорізноманітність була вищою ніж в інших точках відбору проб

Вміст мікроскопічних грибів у ґрунті пралісових екосистем варіював у межах 17ndash28 тис КУО гр абсгр Чисельність оліготрофної та педотрофної мікрофлори зі збільшенням висоти над рівнем моря збільшувалась що вказує на зменшення по-


живних речовин які необхідні для життєдіяльності ґрунтового мікробоценозу ос-кільки оліготрофна і педотрофна мікрофлора інтенсивно розвиваються на збіднених ґрунтах що обумовлено їх трофічною специфічністю та відсутністю конкуренції (табл 2)

Для того щоб оцінити спрямованість мікробіологічних процесів у ґрунті буко-вих пралісів здійснювався розрахунок коефіцієнтів оліготрофності педотрофності та коефіцієнту мінералізації-іммобілізації (табл 3)

Таблиця 3Спрямованість мікробіологічних процесів у ґрунті

букових пралісів

варі-анту

Висота нр моря м

Коефіцієнт оліготрофності

Коефіцієнт педотрофності

Коефіцієнт мінералізації-іммобілізації

1 500 020 023 0602 600 031 044 0843 700 037 057 0934 800 050 077 1075 900 094 180 1316 1000 118 240 1507 1100 129 300 150

Як видно з табл 3 показники оліготрофності та педотрофності ґрунту зростали зі збільшенням висоти і свого максимального значення сягали на висоті 1100 метрів та становили відповідно 129 та 300 Підвищення показника педотрофності свід-чить про збільшення інтенсивності розкладу органічної речовини ґрунту зокрема гумусових сполук а збільшення оліготрофності ґрунту вказує на зниження вмісту у ґрунті поживних речовин Мінімальними ці показники були на висоті 500 метрів над рівнем моря і становили коефіцієнт оліготрофності ndash 020 коефіцієнт педотроф-ності ndash 023 що в 64 разів та в 13 разів менше порівняно з максимальними значен-нями цих показників у досліджуваній екосистемі Напруженість мінералізаційних процесів у ґрунті теж збільшувалась пропорційно висоті розташування досліджу-ванного едафотопу і максимального значення сягала на рівні 1100 м коефіцієнт мі-нералізації ndash іммобілізації складав 150 що в 25 рази вище ніж в едафотопі на висоті 500 м Сукцесійно-динамічні зміни мікробного угруповання ґрунту повrsquoязані в першу чергу з впливом на біоценоз абіотичних чинників таких як температура та вологість

Перебудова функціональної структури мікробного ценозу ґрунту обумовлена впливом екзогенних чинників що підтверджується не тільки зміною чисельності певних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів але й спрямованістю мікробіологічних процесів у ґрунті пралісових екосистем

Мікробіологічний моніторинг ґрунту примагістральних екосистем показав (табл 4) що ґрунт досліджуваних екосистем характеризувався значним підвищен-ням оліготрофної мікрофлори мікроміцетів спороутворювальної мікрофлори на-томість вміст азотфіксувальної мікрофлори складав лише 14 Вміст амоніфіка-торів по мірі віддалення від залізниці від 5 до 100 метрів збільшувався в середньому втричі мікроорганізмів здатних асимілювати мінеральний азот та азотфіксуваль-ної мікрофлори ndash вдвічі що свідчить про перебудову мікробного ценозу ґрунту та вказує на наявність алохтонної мікрофлори Це обумовлено не тільки фізичним та хімічним забрудненням але й надходженням біогенних контамінантів що в цілому ініціює створення екологічно несприятливих умов та погіршення санітарного стану педосфери в примагістральних екосистемах (табл 4)


Таблиця 4Чисельність різних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів

у залізничних примагістральних екосистемах

Відстань від за-лізниці

м



106


103

Мікроми здатні асимі-

лювати мінерф азо-

ту 106

Спороутворю-вальні бак-

терії106


106

Azoto-bacter

1 0 080 64 079 258 441 14

2 50 168 40 096 189 322 18

3 100 242 32 131 113 295 26

4 50 (оп) 197 29 138 124 264 20

5 100 (оп) 246 25 156 115 286 44

НІР05 - 042 034 044 013 028 056 Примітка середні значення за роки досліджень (оп-озима пшениця)

Подібним співвідношенням еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів характеризувався ґрунт відібраний поблизу автошляхів на відстані 5 метрів від до-роги В досліджуваному ґрунті домінували оліготрофи та спороутворювальні бак-терії вміст азотфіксаторів складав 19 по мірі віддалення від автошляхів збільшу-вався вміст органотрофів та відсоток Azotobacter на відстані 100 метрів від дороги відсоток вмісту азотфіксувальної мікрофлори зріс у 27 рази знизилась чисельність оліготрофів мікроміцетів натомість збільшилась у 28 рази чисельність амоніфіка-торів (табл 5)

Дослідження ґрунту відібраного в прилеглій до автошляху агроекосистемі де культивувалась кукурудза показали що зміни в мікробному угрупованні по мірі віддалення едафотопу від автомагістралі відбувались більш динамічно що обумов-лено наявністю антропогенних дотацій


в екосистемах прилеглих до автошляхів

Від-стань від авто-дороги

м



106


103

Мікроми здатні асимі-лювати мінерф азоту

106

Споро-утворю-вальні

бакте рії 106


106

Azoto-bacter

1 5 388 103 124 317 378 19

2 50 567 80 167 287 293 26

3 100 1102 62 195 231 222 52

4 50 (к) 606 44 221 207 203 39

5 100 (к) 1651 28 266 189 124 63

НІР05 - 066 056 033 048 032 033 Примітка середні значення за роки досліджень (к-кукурудза)

Токсичні речовини що утворюються мікроорганізмами надходять в рослини безпосередньо з ґрунту при цьому вони концентруються головним чином в надзем-них органах і майже не спостерігаються в коренях рослин Фітотоксини ґрунтових мікроорганізмів викликають істотні зміни в хімічному складі рослин порушують


обмін речовин в них (впливають на азотний та вуглеводневий обмін) пригнічують проростання насіння ріст паростків розвиток рослин та знижують урожай [4 5 34] Токсичні форми мікроорганізмів зустрічаються у всіх типах ґрунтів Серед бактерій це найчастіше представники родів Bacillus та Pseudomonas серед мікроміцетів ndash Penicillium Fusarium серед стрептоміцетів ndash Streptomyces aurantiacus S viridans S griseus

Фітотоксини які утворюють ґрунтові мікроорганізми відносяться до різних груп хімічних сполук Серед них зустрічаються азотовмісні та кисневмісні гетероцикліч-ні сполуки речовини ациклічної та ароматичної будови похідні фенолів хінонів а також терпеноїди та інші [20 45]

Для проявлення фітотоксичної дії більше значення має токсикоутворювальна активність штамів і їх інгібуюча здатність ніж їх накопичення в ґрунті у великих кількостях

Ґрунт відібраний у пралісовій екосистемі характеризувався досить низьким рів-нем фітотоксичної активності ndash 1671-1743 (табл 6) Натомість антропогенно трансформовані екосистеми характеризувались досить високим рівнем фітотоксич-ної активності в середньому втричі вищим ніж фоновий рівень

Таблиця 6Фітотоксична активність ґрунту досліджуваних екосистем

Екосистема прилегла до залізниці

Екосистема прилегла до автомагістралі

Пралісова екосистема

Відстань від заліз-ниці м

ФА Відстань від автомагіс-тралі м

ФА Висота

над рівнем моря м

ФА

1 5 8010plusmn 132 1 5 7043plusmn 122 1 500 1671plusmn 104



4 50 (оп) 4318plusmn 111 4 50 (к) 3835plusmn 116 - - -


Примітка середні значення за роки досліджень (к-кукурудза о п - озима пшениця)

Фітотоксична активність найвищою була у ґрунті відібраному з примагістраль-ної екосистеми на відстані 5 м від залізничної дороги фітотоксичність складала 8010 Далі від залізниці фітотоксична активність ґрунту поступово знижувалась і на відстані 100 м становила 5032 Подібна закономірність спостерігалась і в ін-ших досліджуваних примагістральних екосистемах Слід зазначити що фітотоксич-на активність ґрунту в агроекосистемах була в середньому на 20 нижчою порів-няно з лучними екосистемами Фітотоксичність ґрунту в екосистемах прилеглих до автошляхів була теж досить високою на відстані 5 метрів від дороги становила 7043 В агроекосистемі де культивувалась кукурудза рівень фітотоксичної актив-ності в середньому на 15 був нижчим ніж в лучній досліджуваній екосистемі Од-нак агробіогеоценози з кукурудзою та озимою пшеницею характеризувалась досить високим рівнем фітотоксичної активності порівняно з природною екосистемою в середньому фітотоксичність ґрунту цих агроекосистем була в 25 рази вищою що свідчить про формування екологічно несприятливих умов для функціонування ґрун-тових мікроорганізмів за яких активно починають розвиватись мікроорганізми з широкою екологічною валентністю що здатні продукувати екзаметаболіти фітоток-сичної дії

Діяльність ґрунтових мікроорганізмів визначає родючість ґрунтів їх екологіч-ний та фітосанітарний стан Крім того ґрунтові мікроорганізми є високочутливими індикаторами які миттєво реагують на наявність в екосистемах контамінантів що віддзеркалюється на показниках біологічної активності ґрунту зокрема фермента-


тивній активності та інтенсивності виділення вуглекислого газу з поверхні ґрунту Результати досліджень біологічної активності ґрунту за інтенсивністю виділення вуглекислого газу представлені в табл 7

Високим рівнем біологічної активності ґрунту характеризувались пралісові еко-системи інтенсивність виділення вуглекислого газу в яких коливалась в межах 88-80 мг СО2кг ґрунтудобу що свідчить про сприятливі екологічні умови для функціо-нування ґрунтових мікроорганізмів В трансформованих екосистемах які зазнають перманентного антропогенного впливу інтенсивність виділення вуглекислого газу з ґрунту була в середньому втричі нижча ніж в природних екосистемах Для комп-лексного аналізу біологічної активності ґрунту як інтегрального показника функціо-нального стану угруповання мікроорганізмів визначались каталазна та інвертазна активність ґрунту

Таблиця 7Біологічна активність ґрунту досліджуваних екосистем





(мг СО2кг ґрунтудобу)

Відстань від автома-гістралі м


Висота


(мг СО2кг ґрунту

добу






Примітка середні значення за роки досліджень (к-кукурудза оп - озима пшениця)

У функціонуванні ґрунтових екосистем ферменти що накопичуються у ґрун-ті в процесі життєдіяльності живих організмів відіграють важливу роль Завдяки біокаталітичним процесам за участю різних ферментів ґрунти здійснюють свої найважливіші біогеоценологічні функції такі як гумусово-енергетичні трофічні санітарно-відновлювальні тощо [36 37] Активність ґрунтових ферментів може ви-користовуватись як додатковий діагностичний показник ґрунтової родючості Од-ним із важливих ферментів класу оксидоредуктаз є каталаза Її активність повrsquoязана із розкладом токсичного для живих організмів перекису водню З ферментів класу гідролаз найбільш інформативним показником який відображає каталіз гідролітич-ного розкладу вуглецевовмістних речовин ароматичного ряду з перетворенням їх у гумусні сполуки є інвертаза [913]

Результати досліджень каталазної активності ґрунту (табл 8) показали що її рі-вень залежить від антропогенного навантаження а в агроекосистемах ще й від виду рослин що культивуються Пралісові екосистеми характеризувались досить висо-ким рівнем каталазної активності який в середньому складав 606 см3О2гр ґрунту Найбільш повільно розклад перекису водню проходив в едафотопах розташованих в безпосередній близькості до автошляхів та залізної дороги рівень каталазної ак-тивності коливався в межах 133-211 см3О2гр ґрунту Розкладання вуглецевовміст-них речовин ароматичного ряду з подальшим перетворенням їх у гумусні сполуки активно проходив в пралісових екосистемах Рівень інвертазної активності ґрунту в них був максимальним і становив у найнижчій точці відбору проб 2634 мг глю-кози гр ґрунту (табл 9)


Таблиця 8Каталазна активність ґрунту досліджуваних екосистем





см3О2грґрунту

Відстань від автомагі-стралі м


Висота над рівнем моря м


1 5 133plusmn 020 1 5 189plusmn 035 1 500 634plusmn 0232 50 145plusmn 045 2 50 198plusmn 031 2 800 597plusmn 0763 100 198plusmn 044 3 100 211plusmn 0116 3 1000 588plusmn 0314 50 (оп) 173plusmn 052 4 50 (к) 243plusmn 036 - - -5 100 (оп) 233plusmn 024 5 100 (к) 278plusmn 032 - - -

Примітка середні значення за роки досліджень (к-кукурудза о п - озима пшениця)Таблиця 9

Інвертазна активність ґрунту досліджуваних екосистемЕкосистема прилегла

до залізниціЕкосистема прилегла до автомагістралі



мг глю-кози гр ґрунту

Відстань від авто-

магіст ралі м


Висота


мгглюкози гр ґрунту

1 5 412plusmn 123 1 5 609plusmn 187 1 500 2634plusmn 1262 50 567plusmn 144 2 50 788plusmn 167 2 800 2490plusmn 1443 100 734plusmn 112 3 100 893plusmn116 3 1000 2318plusmn 1384 50 (оп) 902plusmn 117 4 50 (к) 1022plusmn 166 - - -5 100 (оп) 1204plusmn 098 5 100 (к) 1370plusmn 122 - - -

Примітка середні значення за роки досліджень (к-кукурудза о п - озима пшениця)Оцінку санітарного стану ґрунтів сільськогосподарських угідь які знаходять-

ся поблизу автошляхів та залізничної колії здійснювали відповідно до ГОСТу 174201-81 Результати досліджень наведено у табл 10

Таблиця 10Санітарний стан досліджуваних екосистем




Відстань від зп

мЕП СГП ПБЗ

Відстань від авто-магістралі

м

ЕП СГП ПБЗВисота над рм


50 (оп) 34 54 1х10-6 50 (к) 19 24 1х10-6 500 0 1 -100 (оп) 32 75 1х10-7 100 (к) 13 20 1х10-6 1000 0 0 -

Примітка (к-кукурудза о п - озима пшениця)Нами встановлено що ґрунт відібраний з агроекосистеми де вирощувалась ози-

ма пшениця на відстані 50 м та 100 м від залізниці за ентомологічним показником санітарно-гельмінтологічним та показником бактеріального забруднення характери-зувався як сильно забруднений Ґрунтові взірці відібрані у посівах кукурудзи харак-теризувались меншим вмістом яєць гельмінтів в 1 кг ґрунту їх нараховувалось 24 та 20 відповідно Чисельність личинок та лялечок мух в 025м2 поверхні ґрунту була вдвічі нижчою ніж в ґрунтових взірцях відібраних з посівів озимої пшениці Однак слід зазначити титр кишкової палички був досить низьким це свідчить про знач-не бактеріальне забруднення ґрунту Для порівняння результатів досліджень ґрун-ту відібраного з агроекосистем нами досліджувався ґрунт відібраний у пралісовій екосистемі Останній за санітарними показниками характеризувався як чистий що


обумовлено відсутністю прямого антропогенного впливу Оцінка санітарного стану прилеглих до автошляхів та залізниці агроекосистем вказує на їх незадовільний еко-логічний стан тому ці території не бажано використовувати для одержання первин-ної сільськогосподарської продукції

Отже чисельність представників основних еколого-трофічних груп ґрунтових мікроорганізмів варіює залежно від висоти розташування лісових масивів і рівня антропогенного навантаження Зі збільшенням висоти кількість амоніфікаторів та бактерій що використовують мінеральний азот зменшується а чисельність оліго-трофів та педотрофів поступово зростає Рівень біологічної активності в усіх до-сліджуваних трансформованих екосистемах був найнижчим у ґрунті який безпо-середньо відбирався на прилеглих до залізничної колії або автошляхів територіях Максимального значення показник біологічної активності ґрунту в досліджуваних екосистемах сягав на відстані 100 м де в середньому інтенсивність виділення вуг-лекислого газу з ґрунту збільшувалась на 42 Максимальне значення біологічної активності ґрунту зафіксовано в пралісових екосистемах Рівень фітотоксичної ак-тивності ґрунту трансформованих екосистем був у середньому втричі вищим ніж в еталонній пралісовій екосистемі

Оцінка санітарного стану ґрунтів прилеглих до залізниці та автошляхів агрое-косистем свідчить про те що вони знаходяться в незадовільному стані і непридатні для повноцінного сільськогосподарського використання Ґрунт під агрокультурами характеризувався як забруднений та сильно забруднений Мікробіологічні моні-торингові дослідження ґрунту трансформованих екосистем показали що ведення сільськогосподарських робіт з метою одержання первинної продукції рекомендуєть-ся здійснювати на відстані не менше ніж 100 м від автодоріг та залізничної колії

Рівень фітотоксичної активності ґрунту трансформованих екосистем був в се-редньому втричі вищим ніж в еталонній пралісовій екосистемі Таке явище обу-мовлено наявністю у ґрунті полютантів фітотоксичних екзометаболітів мікробного походження це підтверджується сукцесійними змінами в угрупованні ґрунтових мікроорганізмів Фітотоксичність ґрунту ndash інформативний показник який доцільно використовувати при здійсненні моніторингових досліджень ґрунту з метою оцінки антропогенного впливу на екосистеми

ВФ Патыка1 ЛЮ Симочко2

1 Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украины Киев 2 ГВУЗ laquoУжгородский национальный университетraquo Украина

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ПОЧВЫ ПРИРОДНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЭКОСИСТЕМ ЗАКАРПАТЬЯ УКРАИНЫ

Р е з ю м еПроанализированы и обобщены результаты микробиологических мониторинговых иссле-

дований почвы пралесовых и антропогенно трансформированных экосистем Показано что численность представителей основных эколого-трофических групп почвенных микроорга-низмов варьирует в зависимости от высоты расположения лесных массивов и уровня ант-ропогенной загрузки Уровень биологической активности во всех исследованных трансфор-мированных экосистемах был самым низким в почве которая отбиралась непосредственно на прилежащей к железной дороге и автомагистрали территории Максимальное значение биологической активности почвы зафиксировано в пралесовых экосистемах Уровень фито-токсической активности почвы трансформированных экосистем был в три раза выше чем в эталонной пралесовой экосистеме Фитотоксичность почвы ndash информативный показатель который целесообразно использовать при осуществлении мониторинговых исследований почвы с целью оценки антропогенного влияния на экосистемы

Ключевые слова трансформированные экосистемы почвенные микроорганизмы био-логическая активность энзиматическая активность санитарное состояние фитотоксичность почвы


V P Patyka1 L Y Symochko2

1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine Kyiv2SHEI laquoUzhgorod National Universityraquo Ukraine

SOIL MICROBIOLOGICAL MONITORING OF NATURAL AND TRANSFORMED ECOSYSTEMS IN THE TRANSCARPATHIAN REGION OF UKRAINE

S u m m a r yResults of soil microbiological monitoring of virgin forests and transformed ecosystems are

analyzed and generalized It is shown that the number of main ecological-trophic groups of soil microorganisms varies with the height of forest massive and level of anthropogenic load The level of biological activity of all studied transformed ecosystems was the lowest in the soil of territories directly adjacent to the railroad and highway The maximum value of soil biological activity was fi xed in virgin forest ecosystems The level of phytotoxical activity of soil in the transformed ecosystems was three times higher than in the virgin forests

Phytotoxicity of soil is the informative indicator it can be used for soil monitoring studies to evaluate anthropogenic impact on ecosystems

The paper is presented in UkrainianK e y w o r d s transformed ecosystems soil microorganisms biological activity enzymatic

activity sanitary condition phytotoxicity of soilT h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Patyka VP Zabolotny Institute of Microbiology and


1 Андреюк КИ Методологические аспекты изучения микробных сообществ почвы Микро-бные сообщества и их функционирование в почве ndash Киев Наук думка 1981 ndash С13ndash23

2 Андреюк КИ Валагурова ЕВ Основы экологии почвенных микроорганизмов ndash Киев Наук думка 1992 ndash 224 с

3 Андреюк КІ Іутинська ГО Антипчук АФ Валагурова ВО Пономаренко СП Функціо-нування мікробних ценозів ґрунту в умовах антропогенного навантаження ndash Київ Обереги 2001 ndash 240 с

4 Берестецкий ОА Фитотоксины почвенных микроорганизмов и их екологическая роль Фитотоксичные свойства почвенных микроорганизмов ndash Л 1978 ndash С 7ndash30

5 Виноградский СН Микробиология почвы Проблемы и методы ndash М Изд-во АН СССР 1952 ndash 792 с

6 Доспехов БА Методика полевого опыта ndash М Колос 1985 ndash 351с7 Експериментальна ґрунтова мікробіологія Монографія Волкогон ВВ Надкернична ОВ

Токмакова ЛМ Мельничук ТМ Чайковська ЛО та ін За наук ред ВВ Волкогона ndash Київ Аграрна наука 2010 ndash 464 с

8 Заварзин ГА Лекции по природоведческой микробиологии ndash М Наука 2003 ndash 347 с9 Звягинцев ДГ Бабьева ИЛ Зенова ГМ Биология почв ndash М Изд-во Моск ун-та 2005 ndash

448 с10 Звягинцев Д Г Почва и микрооранизмы ndash М Изд-во Моск ун-та 1987 ndash 235 с11 Инструментальные методы в почвенной микробиологии Под ред ЕИ Андреюк ndash Киев

Наук думка 1982 ndash 176 с12 Иутинская ГО Грунтова мікробіологія Навчальний посібник ndash Київ Арістей 2006 ndash 284 с13 Казеев КШ Колесников СИ Вальков ВФ Биологическая диагностика и индикация почв

методология и методы исследований ndash Ростов на Дону Изд-во ЦВВР 2004 ndash 350с 14 Коць СЯ Моргун ВВ Патыка ВФ Даценко ВК Кругова ЕД Кириченко ЕВ Мельни-кова НН Михалкив ЛМ Биологическая фиксация азота бобово-ризобиальный симбиоз Монография в 4-х т ndash Том 1 ndash Киев Логос 2010 ndash 508 с

15 Коць СЯ Моргун ВВ Патыка ВФ Маличенко СМ Маменко ПН Киризий ДА Михал-кив ЛМ Береговенко СК Мельникова НН Биологическая фиксация азота бобово-ризо-биальный симбиоз Монография в 4-х т ndash Т 2 ndash Киев Логос 2011 ndash 523 с

16 Коць СЯ Моргун ВВ Тихонович ИА Проворов НА Патыка ВФ Петриченко ВФ Мельникова НН Маменко ПН Биологическая фиксация азота генетика азотфиксации ге-нетическая инженерия штаммов Монография в 4-х т ndash Т 3 ndash Киев Логос 2011 ndash 404 с

17 Кудеярова ЕИ Разнообразие микробных сообществ при различных антропогенных нагруз-ках ndash Молдова Кишинев Высшая школа 1999 ndash 273 с

18 Марфенина ОЕ Микробиологические аспекты почв ndash М Изд-во Моск ун-та 1991 ndash 118 с19 Методы почвенной микробиологии и биохимии Под ред Звягинцева ДГ ndash М Изд-во

Моск Ун-та 1991 ndash 308 с


20 Мирчинк ТГ Почвенная микология ndash М Изд-во Моск ун-та 1988 ndash 219 с21 Никитина ЗВ Микробиологический мониторинг наземных экосистем ndash Новосибирск На-

ука Сиботд 1991 ndash 222 с22 Патика ВП Тихонович ІА Філіпrsquoєв ІД Гамаюнова ВВ Андрусенко ІІ Мікроорганізми

і альтернативне землеробство За ред ВП Патики ndash Київ Урожай 1993 ndash 176 с23 Патика ВП Тараріко ОГ Агроекологічний моніторинг та паспортизація сільськогоспо-

дарських земель ndash Київ Фітосоціоцентр 2002 ndash 296 с 24 Патика ВП Наукова концепція сталого розвитку агросфери України Вісник Полтавської

державної аграрної академії ndash Полтава 2002 ndash 2-3 ndash С5ndash925 Патика ВП Макаренко НА Моклячук ЛІ Середа ЛП Шкатула ЮМ Гриник ІВ Аг-

роекологічна оцінка мінеральних добрив та пестицидів ndash Київ Основа 2004 ndash 300 с26 Патика ВП Омельянець ТГ Гриник ІВ Петриченко ВФ Екологія мікроорганізмів

Посібник За ред ВП Патики ndash Київ Основа 2007 ndash 192 с 27 Патыка ВП Шкатула ЮН Симочко ЛЮ Биоиндикация и биотестирование в системе

органического земледелия Збірник наукових праць Уманського національного ун-ту садів-ництва Основи біологічного рослинництва в сучасному землеробстві ndash 2011 ndash С 88ndash93

28 Патика МВ Танчик СП Колодяжний ОЮ Іванюк МФ Круглов ЮВ Мельничук МД Патика ТІ Формування біорізноманіття та філотипові структури еубактеріального комп-лексу чорнозему типового при вирощуванні пшениці озимоїДоповіді НАН України - К 2012 - 11 ndash С163-171

29 Петриченко ВФ Тихонович ІА Коць СЯ Патика МВ Мельничук ТМ Патика ВП Сільськогосподарська мікробіологія і збалансований розвиток агроекосистем Вісник аг-рарної науки ndash 2012 ndash 8 ndash С 5ndash11

30 Сеги Й Методы почвенной микробиологии под дед ГС Муромцева пер с венг ИФКуренного ndash М Колос 1983 ndash 296 с

31 Симочко ЛЮ Симочко ВВ Інтегрованість мікробного ценозу ґрунту при антропогенному навантаженні Наукові записки державного природознавчого музею ndash 2007 ndash Вип 23 ndash С 111ndash118

32 Симочко ЛЮ Цикун ТВ Симочко ВВ Показники оліготрофності та педотрофності грун-ту пралісів Широколужанського масиву Карпатського біосферного заповідника Науковий Вісник Ужгородського ун-ту Серія Біологія ndash 2008 ndash 24 ndash С 91ndash95

33 Сымочко Л Ю Биоиндикация природных и антропогенных экосистем с помощью почвен-ных микроорганизмов Матеріали міжнародної наукової конференції ldquoШевченківська вес-на 2012 біологічні наукиrdquo ndash 19-23 березня 2012 року ndash Київ 2012 ndash С296ndash297

34 Степанов АМ Биоиндикация на уровне экосистем Биоиндикация и биомониторинг ndash М Наука 1991 ndash С 59ndash64

35 Теппер ЕЗ Шильникова ВК Переверзева ГИ Практикум по микробиологии Под ред ВК Шильниковой ndash 6-е изд ndash М Дрофа 2005 ndash 256 с

36 Хазиев ФХ Методы почвенной энзимологии М Наука 1990 ndash 189с 37 Хазиев ФХ Роль ферментативной активности в осуществлении почвой экологических

функций Тезисы докладов международной научной конференции rdquoЭкология и биология почвrdquo ndash Ростов-на Дону 2005 ndash С 514ndash515

38 Умаров ММ Кураков АВ Степанов АЛ Микробиологическая трансформация азота в почве М ГЕОС 2007 ndash 138 с

39 Чернявський МВ Ліси України та збереження їхнього біологічного розмаїття Охорона пралісів України Конвенція про біологічне розмаїття громадська обізнаність і участь ndash К Стилос 1997 ndash С 75-89

40 Штатнов ВИ К методике определения биологической активности почвы Доклады ВАС-ХНИЛ ndash 1952 ndash Вып 6 ndash С 27ndash33

41 Badreiner MR Talak VB Structure and organization of soil microorganisms in different ecological systems Biofutur ndash 1998 ndash N 180 ndash P 19ndash22

42 Cerna B Elhottova D Santruckova H Functional groups of soil microbial community International Symposium on Structure and Function of Soil Microbiota ndash 2003 ndash P 3ndash6

43 Debeljak M Coarse woody debris in virgin and managed forest Ecological Indicators ndash 2006 ndash 6 Iss 4 ndash P 733ndash742

44 Gregory E Antony V Nowak G Managing Soil Microorganisms to Improve Productivity of Agro-Ecosystems Plant Science ndash March 2004 ndash Iss 2 ndash P 175ndash193

45 Lynch JM Promotion and inhibition of soils aggregate stabilization by microorganisms J Gen Microbiol ndash 1981 ndash N 126 ndash P 371ndash373

46 Tate RL Soil microbial diversity research whither to now Soil Sci ndash 1997 ndash 162 N 9 ndash P 605ndash606



УДК 5771523 579258

РВГрицай1 ІО Антіпов ІО2 ЛД Варбанець 1

1Інститут мікробіології та вірусології ім ДК Заболотного НАН Українивул Академіка Заболотного 154 Київ ГСП Д03680 Україна

2Національний університет біоресурсів і природокористування України Київ

ІДЕНТИФІКАЦІЯ 16S РНК ТА PAGL ГЕНІВ RALSTONIA SOLANACEARUM

Проаналізовано особливості нуклеотидних послідовностей генів ліпід А деацилаз (PagL) Ralstonia solanacearum представлених на сьогодні в базі даних GenBank Підібрано праймери та проведено скринінг 12-ти штамів Ralstonia solanacearum на наявність в їхньому геномі гену PagL за допомогою методу ПЛР Ідентифіковано ген в штамі 749 та показано залежність його транскрипції від зовнішніх умов культивування бактерій на основі методу ЗТ-ПЛР

К л ю ч о в і с л о в а ліпід А ПЛР ферменти ковалентної модифікації ЛПС зворотна транскрипція

Ліпід А ndash гідрофобна частина молекули ЛПС та основний компонент зовніш-ньої мембрани грамнегативних бактерій що обумовлює її асиметричну будову та виконання барrsquoєрної функції Протягом останніх 15 років було відкрито ферменти конститутивного біосинтезу ліпіду А клонуванням підтверджено їхні функції для ентеробактерій та знайдено відповідні гомологи в геномі більшості фітопатогенних бактерій Окрім того вперше для ентеробактерій було описано існування регульо-ваних механізмів ковалентної модифікації ліпіду А і показано їхню роль в процесі патогенезу та адаптації до зміни умов середовища [6]

Всього відомо більше десятка генів грамнегативних бактерій що кодують фер-менти структурної модифікації як гідрофобної так і вуглеводної частини ЛПС Для більшості з них розкрито механізм регуляції експресії ndash активація транскрипції від-бувається у відповідь на появу певних несприятливих факторів середовища Так наприклад для бактерій кишкової групи та псевдомонад дані гени знаходяться під контролем двохкомпонентних мембранних рецепторів PhoPPhoQ та залежного ndash PmrAPmrB У відповідь на зменшення концентрації іонів магнію чи появи катіон-них антимікробних пептидів у середовищі сенсорна кіназа PhoP фосфофорилює генний активатор PhoQ Мутанти із дефектами в PhoPPhoQ характеризуються пос-лабленою вірулентністю та підвищеною чутливістю до пептидних антибіотиків [8]

Серед всіх типів модифікації ліпіду А найбільш вивченими є такі приєднання пальмітату за допомогою ферменту PagP деацилювання диглюкозаміну в положен-ні 3 (PagL) фософорилювання в положенні 1 (LpxE) приєднання L-4-N-арабінози (ArnT) тощо Нещодавно було показано існування гомологів гену PagL для ціло-го ряду грамнегативних бактерій в тому числі збудника вілту рослин ndash Ralstonia solanacearum для якого генетична основа синтезу ЛПС вивчена ще дуже фрагмен-тарно Показано що на рівні амінокислотної послідовності коефіцієнт гомології для ферменту PagL між різними видами бактерій досить низький [3] Для Pseudomonas aeruginosa як і для Salmonella typhimurium було описано кристалічну будову фер-менту ndash це 8-ми ланцюгова β-складчаста структура що інтегрована в зовнішню мембрану бактерій каталітичний центр якої містить Сер-Гіс-Глу на С-кінці поліпеп-тиду Клонуванням в E coli підтверджено активність PagL Bordetella bronchiseptica та показано існування відповідного гену для деяких штамів близькоспорідненого до нього виду R solanacearum [4]

Метою роботи було підібрати праймери для скринінгу 12 штамів R solanacearum різного географічного походження на наявність в складі їхнього геному гену ліпід А-3-0-деацилази та вивчити вплив на регуляцію його активності деяких зовнішніх факторів середовища

copy ETHAcirc Atildeethegraveoumlagraveeacute sup2Icirc Agraveiacuteogravesup3iumlicircacirc sup2Icirc EumlAuml Acircagraveethaacuteagraveiacutearingoumluuml 2013


Матеріали та методи В роботі використовували 12 штамів R solanacearum 4 35 52б 749 758 5712 7954 7859 8089 8202 TX1 TS3 які вирощували на картоп-ляному агарі Для вивчення впливу зовнішніх умов на експресію гену PagL культури бактерій вирощували на рідкому синтетичному середовищі N [9] при температурах 28 С0 і 37 С0 та відсутності іонів Mg2+ рН 70 та 58 Культивування бактерій на рослинному субстраті проводили шляхом інокуляції 1 мл суспензії бактеріальних клітин у фізрозчині диска вирізаного із бульби картоплі який потім поміщали у вологу камеру при 28 С0 на 2 доби

Вирівнювання нуклеотидних послідовностей проводили з використанням про-грами BioEdit (Ibis Biosciences)

Праймери підбирали з використанням компrsquoютерних програм Oligo 7 (Molecular Biology Insights Inc США) та Primer-BLAST (NCBI США) Послідовності прай-мерів до гену PagL RsPagL-F 5rsquo-ACCAACCGCCAGAACCTGACC-3rsquo RsPagL-R 5rsquo-AAGCGATAGCCGACCTGGAACT-3rsquo

Для проведення ПЛР використовували 2 мкл супернатанту прокипrsquoяченої сус-пензії бактеріальних клітин (95 0С 15 хв) Виділення РНК здійснювали за допомо-гою комерційних наборів Diatom RNA Prep 100 синтез кДНК проводили за допо-могою наборів RT-PCR Core Як внутрішній контроль використовували ЗТ-ПЛР із праймерами до 16S РНК R solanacearum

ПЛР проводили з використанням комерційних наборів GenePak PCR Core (laquoІзо-генraquo Росія) згідно з інструкцією виробника Програма ампліфікації була такою початкова денатурація ndash 3 хв за температури 95degС 35 циклів 20 с за 95 degС 30 с за 60 degС 40 с за 72 degС термінальна елонгація ndash 3 хв за 72 degС Реакційна суміш містила 20 пМ кожної з пари праймерів

Електрофоретичний розподіл продуктів ПЛР проводили в 15-ому агарозно-му гелі що містив бромистий етидій (05 мкгмкл) протягом 1 години при напрузі 3 В см довжини гелю

Визначення довжин ампліконів в гелі здійснювали за допомогою програми Gel-Pro Analyzer 45 (Media Cybernetics Inc США)

Результати та їх обговорення Аналіз бази даних GenBank виявляє декілька штамів R solanacearum в яких було ідентифіковано ген PagL що представлять різні раси та біовари Даний ген може розміщуватись як на хромосомі так і на мегаплаз-міді однак є монокопійним Окрім того нуклеотидну послідовність PagL можна знайти в складі дрібних плазмід (наприклад RCFBPv3_mp штаму CFBP2957) що може свідчити про можливість горизонтального трансферу GC-склад нуклеотидної послідовності гену PagL (67 ) відповідає середньому значенню частки GC-основ для всього геному R solanacearum [1] Іншим підтвердженням гіпотези про тривале еволюціонування PagL R solanacearum є низький рівень гомології із ліпід А-деаци-лазами інших бактерій Пошук в базі даних білкових послідовностей за допомогою програми blastp виявив існування в складі геномів штамів R solanacearum ряду гі-потетичних протеїнів амінокислотна послідовність яких повністю ідентична такій для PagL продукту цього виду бактерій Це підтверджує той факт що вивчення ге-нетичної основи ковалентної модифікації ліпіду А для такого гетерогенного виду як R solanacearum є актуальним на даному етапі досліджень Незважаючи на те що вперше ген PagL був ідентифікований для Salmonella sp в інших представників ентеробактерій його ортологів виявлено не було [6] Окрім того він характеризуєть-ся низьким значенням GC складу (39 ) що є нижчим від загального для геному сальмонел (53 ) Це свідчить що даний вид отримав цей ген через горизонтальний трансфер але не від бактерій із високим значенням GC складу Більш того аналіз відомих на сьогодні гомологів PagL показує що він характерний в основному для представників роду β-протеобактерій і має давнє еволюційне походження оскільки дивергенція за амінокислотною послідовністю корелює із філогенетичними дистан-ціями між видами


В якості ДНК-матриці при підборі праймерів до гену PagL було взято консен-сусну послідовність після вирівнювання генів PagL штамів R solanacearum в яких було підтверджено трансляцію даного гену Вирівнювання із нуклеотидними послі-довностями близькоспоріднених видів бактерій не дало змогу підібрати універсаль-ні праймери до них внаслідок низького коефіцієнту гомології

Підібрані нами праймери до гену PagL відповідають наступним критеріям дов-жина продукту ndash 227 пн розрахована температура відпалу від ДНК-матриці ndash 63 0C максимальна температура плавління димерів праймерів ndash 12 0C

ПЛР із 12 штамами R solanacearum в мультиплексній реакції виявив присут-ність цільової олігонуклеотидної послідовності PagL лише в одному із них ndash шт 749 (рис 1) Раніше нами було продемонстровано модифікацію жирнокислотного складу ЛПС для даного штаму при підвищенні температури культивування [2] Так при температурі росту 37 0C спостерігалась втрата 3-гідрокситетрадеканової кислоти при одночасному збільшенні вмісту пальмітату Ми припускаємо що такі зміни можуть бути пояснені активністю генів PagL та PagP відповідно Однак для R solanacearum в літературі даних про ідентифікацію відповідних генів на сьогодні немає

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -

Рис 1 Мультиплексна ПЛР із праймерами до 16S РНК та PagL генів R solanacearum 1- 4 2-35 3-52б 4-749 5-758 6-5712 7-7859 8-7954 9-8089 10-8202 11-TX1 12 - TS3 К- негативний контроль (вода) М-маркер молекулярної

маси OrsquoGene Ruler 100 bp (Fermentas)З метою зrsquoясування ролі ідентифікованого нами гену в процесі ковалентної мо-

дифікації ліпіду А провели реєстрацію його активності за допомогою ПЛР зі зворот-ною транскрипцією З літературних даних відомо що активація PagL S typhimurium відбувається при зниженні концентрації іонів магнію в середовищі lt100 мкМ та рН lt 58 [7] В механізмі регуляції активності гену бере участь двокомпонентний мембранний рецептор PhoPQ гомологів якого в геномі R solanacearum не виявле-но Тож залишаються не зрозумілими фізіологічний стан та біологічне значення гену та його продукту для життєдіяльності збудника бурої бактеріальної гнилі картоплі

З метою розкриття цих питань нами здійснено ідентифікацію транскрипції гену PagL R solanacearum культури яких вирощували на рідкому та твердому середови-щах за різних умов а також отримали із мацерованої тканини зараженої рослини

Результати проведеної ЗТ-ПЛР R solanacearum 749 єдиним із проаналізованих нами штамів в складі якого ідентифіковано ген PagL наведені на рис 2 Із представ-лених даних видно що продукт ампліфікації візуалізується тільки в двох зразках ndash отриманих із бактерій вирощених на картопляному агарі та з ексудату зараже-ної бульби картоплі Звідси можна зробити висновки що в активації роботи ліпід А-3-О-деацилази бере участь певний компонент або їх сукупність що міститься в складі рослин картоплі а отже відщеплення 3-гідроксиміристату може мати певне


значення в процесі патогенезу Ці хімічні фактори мають вірогідніше небілкову при-роду оскільки вони перенесли автоклавування в процесі приготування картопляно-го агару

Той факт що підвищення температури культивування призводило до зникнення 3-гідроксиміристинової кислоти зі складу ліпіду А R solanacearum проте не викли-кало активації транскрипції PagL можна пояснити тим що або існують інші ме-ханізми відщеплення даної жирної кислоти або рівень активності гену PagL інду-кований високою температурою нижчий порогу чутливості використовуваних нами для ідентифікації методів

1 2 3 4 5 6 -

Рис 2 ЗТ-ПЛР РНК виділеної із бактерій R solanacearum 749 культивованих за різних умов з праймерами до генів PagL та 16S РНК 1 ndash нормальні умови 2 ndash відсутність магнію 3 ndash рН 58 4 ndash 37 0С 5 ndash ексудат інфікованої рослини 6 ndash бактерії вирощені на картопляному агарі К- ndash негативний контроль (вода) М ndash маркер молекулярної ваги (OrsquoGene Ruler 100 bp (Fermentas))

Кв ndash внутрішній контроль (праймери до 16 S РНК)

Висновки Таким чином нами підібрані праймери та умови ПЛР для ідентифі-кації гену ліпід А-3-гідросиміристиноїлтрансферази проаналізовано секвеновані послідовності ліпід А деацилаз R solanacearum вивчено транскрипцію гену PagL за різних умов культивування бактерій

Штами R solanacearum були одержані нами із ICMP (749 758 5712 7954 7859 8089 8202) від НВ Житкевич (4 35 52б) від ВО Іваниці (ТХ1 TS3)

РВ Грицай1 ИА Антипов2 ЛД Варбанец1

1Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украины Киев 2Национальний университет биоресурсов и природопользования Украины Киев

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ 16S РНК И PAGL RALSTONIA SOLANACEARUM

Р е з ю м еПроанализированы особенности нуклеотидных последовательностей генов липид А деа-

цилаз (PagL) R solanacearum представленных на сегодня в базе данных GenBank Подобра-ны праймеры и проведен скрининг 12-ти штаммов R solanacearum на наличие в их геноме гена PagL с помощью метода ПЦР Идентифицирован ген в штамме 749 и показана зависи-мость его транскрипции от внешних условий культивирования бактерий с помощью метода ОТ-ПЦР

К л ю ч е в ы е с л о в а липид А ПЛР ферменты ковалентной модификации ЛПС об-ратная транскрипция


RV Gritsay 1 IO Antipov 2 LDVarbanets 1

1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine Kyiv2National University of Life and Environmental Resources Kyiv

IDENTIFICATION OF 16S RNA AND PAGL GENES OF RALSTONIA SOLANACEARUM

S u m m a r yFeatures of nucleic acids sequences of genes of lipid A deacylases of R solanacearum which

are presented in GenBank database were analyzed Primers to this gene were selected and using them 12 strains of R solanacearum were analyzed for the presence of this gene in their genome by means of PCR method PagL gene was identifi ed in strain 749 and dependence of its transcription on some environmental conditions was established

The paper is presented in UkrainianK e y w o r d s lipid А PCR enzymes of covalent modifi cation of LPS back transcriptionT h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Gritsay RV Zabolotny Institute of Microbiology and Virology

National Academy of Sciences of Ukraine 154 Acad Zabolotny St Kyiv MSP D03680 Ukraine

Варбанец ЛД Здоровенко ГМ Книрель ЮА1 Методы исследования эндотоксинов ndash Киев Наук думка 2006 ndash 237 с

Грицай Р В Броварська О С Варбанець Л Д2 Вплив температури культивування на склад ліпополісахаридів Ralstonia solanacearum Мікробіол журн ndash 2011 ndash73 4 ndash С 24ndash29

Geurtsen J Steeghs L Hove JT van der Ley P Tommassen J3 Dissemination of lipid A deacylases (pagL) among gram-negative bacteria identifi cation of active-site histidine and serine residues J Biol Chem ndash 2005 ndash 280 ndash P 8248ndash8259

MacArthur I Jones JW Goodlett DR Ernst RK Preston A4 Role of pagL and lpxO in Bordetella bronchiseptica lipid A biosynthesis J Bacteriol ndash 2011 ndash 193 ndash P 4726ndash4735

Perez JC Groisman EA5 Acid pH activation of the PmrAPmrB two-component regulatory system of Salmonella enterica Mol Microbiol ndash 2007 ndash 63 ndash P 283ndash-293

Raetz CR Reynolds CM Trent MS Bishop RE6 Lipid A modifi cation systems in gram-negative bacteria Annu Rev Biochem ndash 2007 ndash 76 ndash P 295ndash329

Remenant B Coupat-Goutaland B Guidot A Cellier G Wicker E7 Allen C Fegan M Pruvost O Elbaz M Calteau A Salvignol G Mornico D Mangenot S Barbe V Meacutedigue C Prior P Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal signifi cant evolutionary divergence BMC Genomics ndash 2010 ndash 11 ndash P 379ndash395

Richards SM Strandberg KL Conroy M Gunn JS8 Cationic antimicrobial peptides serve as activation signals for the Salmonella typhimurium PhoPQ and PmrAB regulons in vitro and in vivo Front Cell Infect Microbiol ndash 2012 ndash 2 ndash P 1ndash10

Trent MS Pabich W Raetz CR Miller SI9 A PhoPPhoQ-induced Lipase (PagL) that catalyzes 3-O-deacylation of lipid A precursors in membranes of Salmonella typhimurium J Biol Chem ndash 2001 ndash 276 ndash P 9083ndash9092



УДК 579[222[43]243]546[4559] ОМ Василів СО Гнатуш

Львівський національний університет імені Івана Франка біологічний факультет кафедра мікробіології вул Грушевського 4 м Львів 79005 Україна

ВПЛИВ СПОЛУК ПЕРЕХІДНИХ МЕТАЛІВ НА АКТИВНІСТЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗИ СІРКОВІДНОВЛЮВАЛЬНИХ

БАКТЕРІЙ DESULFUROMONAS ACETOXIDANSСупероксиддисмутаза як один із ензимів антиоксидантної системи захисту клітин ка-

талізує дисмутацію супероксидного аніон-радикалу (О2-) з утворенням О2 та Н2О2 Дослід-

жено вплив сполук перехідних металів зокрема FeSO4 FeCl3 MnCl2 NiCl2 та CoCl2 на ак-тивність супероксиддисмутази сірковідновлювальних бактерій Desulfuromonas acetoxidans Максимальну активність досліджуваного ензиму спостерігали за впливу 10 мМ NiCl2 20 мМ CoCl2 і MnCl2 відповідно на другу добу та за впливу 10 мМ FeCl3 і FeSO4 на третю добу культивування порівняно з контролем Збільшення часу культивування та концентрації сполуки металу в середовищі зумовлювали пригнічення активності супероксиддисмутази

Ключові слова супероксиддисмутаза сіркобактерії Desulfuromonas acetoxidans пе-рехідні метали Ni2+ Co2+ Fe3+ Fe2+ Mn2+

Перехідні метали зокрема іони Кобальту Нікелю Феруму та Мангану у низьких концентраціях необхідні для нормального функціонування клітин мікроорганізмів Вони є кофакторами багатьох ензимів Зокрема нікельвмісними ензимами є уреаза ацетил-КоА-декарбоксилаза NiFe-гідрогеназа деякі супероксиддисмутази тощо [12] Кобальтвмісні ензими головно залучені у регуляцію процесів трансамінування амінокислот а також Кобальт входить до складу багатьох біологічно активних спо-лук зокрема вітаміну B12 [14] Окиснені Ферум та Манган є джерелом енергії для мікроорганізмів здатних до процесів Fe3+- чи Mn4+ minus дисиміляційної редукції [9] Ці елементи мають важливе значення у забезпеченні функціонування мембранних транспортних систем та підтриманні клітинного циклу Проте за високих концент-рацій перехідні метали зумовлюють токсичний вплив на клітини живих організмів у результаті чого порушуються їхня структура та біохімічні властивості Одним із наслідків негативного впливу високих концентрацій металів є утворення активних метаболітів кисню (АМК) [1]

Утворення високотоксичних радикалів кисню таких як супероксид аніон перок-сид водню та гідроксильний радикал у клітинах зумовлює окисний стрес що спри-чиняє загибель мікроорганізмів Супероксидний радикал кисню ndash один із найоснов-ніших АМК що володіє як відновлюючими так і окиснюючими властивостями Го-ловно він взаємодіє з іонами металів та FeS-кластерами [5] Супероксидний аніон утворюється внаслідок одноелектронного відновлення молекулярного кисню або шляхом одноелектронного окиснення гідроген пероксиду [8]

Супероксиддисмутаза як один із ензимів антиоксидантної системи захисту клі-тин каталізує дисмутацію супероксидного аніон-радикалу (О2

-) з утворенням О2 та Н2О2 Більшість штамів мікроорганізмів що володіють супероксиддисмутазною (СОД) активністю також мають каталазну активність у результаті чого утворений пероксид гідрогену розщеплюється з утворенням води та кисню [1 15]

Desulfuromonas acetoxidans ndash безбарвні грамнегативні облігатно анаеробні сірко-бактерії класу part - Proteobacteria [10] що населяють збагачені сполуками Сульфуру водні середовища Вони забезпечують відновну ланку метаболізму сірки внаслідок утворення гідроген сульфіду у процесі дисиміляційної сульфурредукції Сірко- та сульфатвідновлювальні бактерії відіграють важливу роль у збереженні екологічної сталості навколишнього середовища Вони здатні контролювати переміщення ме-талів у водних осадах шляхом утворення важкорозчинних сульфідів металів Над-мірні концентрації токсичних іонів металів у середовищі загрожують нормальному

copy IcircIgrave Acircagraventildeegraveeumlsup3acirc NtildeIcirc Atildeiacuteagraveograveoacuteoslash 2013


існуванню живих організмів Процес що здійснюється за участю бактерій відновної ланки циклу Сульфуру відображає ефективний механізм біологічної ремедіації дов-кілля від надмірного забруднення солями важких металів та гідроген сульфіду як кінцевого токсичного продукту їхньої життєдіяльності Він полягає у спонтанному вилученні цими бактеріями металів і H2S з навколишнього середовища шляхом біо-осадження метал сульфідів [4]

Вважають що лише у несприятливих умовах зокрема за впливу токсичних спо-лук якими можуть бути високі концентрації іонів перехідних металів у облігатно анаеробних мікроорганізмів синтез ензимів антиоксидантного захисту індукується киснем чи його похідними На даний час активність супероксиддисмутази у строго анаеробних сірковідновлювальних бактерій вивчена недостатньо

Метою нашої роботи було дослідити вплив сполук перехідних металів зокрема FeSO4 FeCl3 MnCl2 NiCl2 та CoCl2 на активність супероксиддисмутази сірковід-новлювальних бактерій Desulfuromonas acetoxidans

Матеріали і методи Досліджували бактерії Desulfuromonas acetoxidans виді-лені з водойм Яворівського сіркового родовища одержані в чистій культурі та іден-тифіковані на кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка [3]

Активність супероксиддисмутази у клітинах бактерій визначали спектрофото-метрично при довжині хвилі 405 нм за рівнем інгібування відновлення 235-три-фенілтетразолію хлористого (235-ТТХ) до формазану червоного кольору

У ряд проб вносили різні концентрації рибофлавіну та піддавали впливу УФ-вип-ромінювання ближнього спектру В результаті цього відбувалось фотовідновлення рибофлавіну що одразу окиснювався під впливом кисню з одночасним утворенням супероксид-аніону Подальша взаємодія утвореного активного метаболіту кисню з 235-ТТХ супроводжувалась відновленням даної сполуки з утворенням формазану червоного кольору [6] Даний процес пригнічувався у результаті супероксиддисму-тазної активності

Активність супероксиддисмутази у клітинах сірковідновлювальних бактерій визначали в умовних одиницях активності на 1 мг клітинного протеїну За 1 умов-ну одиницю приймали таку концентрацію протеїну що забезпечувала 50 інгібу-вання утворення формазану [13] З метою визначення даної концентрації протеїну його очищували в безклітинних екстрактах шляхом діалізу в 20 мМ калій-фосфат-ному буфері рН=75 та вносили в стоковий розчин у концентрації 10 50 100 та 200 мкг мл (у перерахунку на його сумарну концентрацію в клітинах) До складу стокового розчину входили (у перерахунку на 10 мл) 05 М калій-фосфатний бу-фер ndash 1 мл 0028 мг рибофлавінумл ndash 65 мл 3 мгмл 235-ТТХ ndash 1 мл Н2О ndash 15 мл ТЕМЕД ndash 32 мкл

Концентрацію протеїну в клітинах визначали за методом Лоурі [11] З метою визначення активності досліджуваного ензиму в клітинах D acetoxidans

за впливу різних концентрацій солей Феруму Мангану Нікелю та Кобальту бактерії вирощували протягом чотирьох днів у модифікованому середовищі Постгейта С [2 7] із внесенням від 05 до 25 мМ FeSO4 FeCl3times6H2O MnCl2times4H2O NiCl2times6H2O та CoCl2times6H2О У контроль сполук металів не вносили Після другої третьої та чет-вертої діб вирощування відбирали клітини вирощені за різних концентрацій до-сліджуваних сполук металів та одержували безклітинні екстракти Для цього клі-тини відмивали 09 розчином NaCl руйнували на ультразвуковому гомогенізаторі УЗДНndash2Т при 22 кГц протягом 5 хв при 0оС Уламки клітин відокремлювали цен-трифугуванням при 7000g за температури +4˚С протягом 30 хв Отриманий діалі-зований безклітинний екстракт у концентрації 10 50 100 та 200 мкг бактерійного протеїнумл вносили в стоковий розчин та отримували калібрувальні криві зміни різниці світлопоглинання проб із різною концентрацією клітинного протеїну до і після опромінення їх УФ протягом 14 хв для кожної досліджуваної концентрації металу На основі отриманих результатів визначали концентрацію протеїну при якій


відновлення 235-ТТХ інгібується на 50 (1 умовну одиницю активності суперок-сиддисмутази) та перераховували активність досліджуваного ензиму на 1 мг клітин-ного протеїну Далі визначали активність супероксиддисмутази у клітинах бактерій D acetoxidans (ум од акт мг протеїну) за впливу від 05 до 25 мМ досліджуваних сполук металів протягом чотирьох днів культивування

Статистичну достовірність отриманих результатів визначали на основі коефіцієн-та детермінації R2 експоненціальної кривої другого роду типу

y = ax times exp (-xt1) + y0де у - маса клітинного протеїну в мг що відповідає 1 ум од активності супероксиддисмутази х - світлопоглинання проби що відповідає такій концентрації протеїну при якій 235-ТТХ відновлюється на 50 (1 ум од активності) а t1 y0 ndash параметри рівнянняДану залежність розвrsquoязували для кожної отриманої калібрувальної кривої Ко-

ефіцієнт детермінації набував значень 095 lt R2 lt 099 що дозволяє стверджувати точність підбору рівняння регресії та достовірність отриманих даних

Результати та їх обговорення З метою визначення мінімальної концентрації рибофлавіну що за впливу УФ здатна забезпечити утворення достатньої кількості супероксид-аніону для запуску відновлення 235-ТТХ з утворенням формазану чер-воного кольору було використано 5 проб із різною концентрацією рибофлавіну в кожній (табл 1)

Таблиця 1Розчини 1 проба 2 проба 3 проба 4 проба 5 пробарозчин І 14 мл 14 мл 14 мл 14 мл 14 млрозчин ІІ 26 мл 20 мл 15 мл 10 мл 05 млрозчин ІІІ - 06 мл 11 мл 16 мл 21 млрозчин IV 13 мкл 13 мкл 13 мкл 13 мкл 13 мкл

Примітка laquo-raquo ndash розчин ІІІ не вносили у пробуде Розчин І 2 мл 05 М К-Ф буферу pH=75-78 2 мл 235-ТТХ (3мгмл) 3 мл Н2ОРозчин ІІ 015 мг рибофлавінумлРозчин ІІІ Н2ОРозчин ІV ТЕМЕД (NNNN-тетраметилетилендиамін)

Проби опромінювали ультрафіолетом із використанням УФ-лампи ОБН-150 до появи червоного забарвлення та отримували залежність між концентрацією рибоф-лавіну в пробах та змінами різниці їх світлопоглинання виміряних на спектрофото-метрі СФ-46 при 405 нм до і після дії на них УФ-випромінювання (рис 1)

0 002 004 006 008 0100

05

10

15

20

25

Рис 1 Зміни різниці світлопоглинання проб до і після дії на них УФ залежно від внесеної концентрації рибофлавіну


Було встановлено що мінімальна концентрація рибофлавіну при опроміненні якої УФ спостерігається відновлення 235-ТТХ становить 0028 мгмл Для дослід-ження лінійності окиснення рибофлавіну за дії УФ зразок у співвідношенні розчин І розчин ІІ розчин ІІІ розчин ІV = 14 мл 075 мл 185 мл 14 мкл опромінювали УФ протягом 2 5 10 та 15 хв Отримали часову залежність змін різниці світлопогли-нання проб виміряних при 405 = ג нм до і після опромінення їх УФ (рис 2)

0 2 4 6 8 10 12 14 16042

043

044

045

046

047

Рис 2 Часова залежність зміни різниці світлопоглинання проб зі сталою концентрацією (0028 мгмг) рибофлавіну до і після дії на них УФ

Досліджено активність супероксиддисмутази у безклітинних екстрактах сір-ковідновлювальних бактерій D acetoxidans за впливу різних концентрацій кобальт (ІІ) хлориду нікель (ІІ) хлориду ферум (ІІ) сульфату ферум (ІІІ) хлориду та манган (ІІ) хлориду протягом чотирьох діб культивування

Встановлено що за внесення NiCl2times6H2O в концентрації 10 мМ у культуральне середовище активність супероксиддисмутази в безклітинних екстрактах сірковід-новлювальних бактерій D acetoxidans була максимальною на другу добу вирощу-вання та становила 34 ум од акт мг протеїну (рис 3 а) За даного впливу вона збільшилась у 33 рази порівняно з контролем Зростання концентрації Ni2+ у се-редовищі від 15 до 25 мМ зумовлювало підвищення активності досліджуваного ензиму на 51 та 30 відповідно на другу добу порівняно з контрольними зразками На третю та четверту доби культивування максимальна активність супероксиддис-мутази даних бактерій була виявлена за внесення 05 мМ нікель (ІІ) хлорид гексагід-рату Отримані результати ймовірно можна пояснити тим що на початкових етапах впливу за низьких концентрацій Ni2+ відбувається підвищення активності суперок-сиддисмутази для видалення супероксидного радикалу як побічного продукту фізіо-логічної та біохімічної активності клітин досліджуваних бактерій оскільки Нікель може бути кофактором супероксидисмутази [12] Зі збільшенням тривалості впливу та концентрації солі металу активність ензиму інгібується що ймовірно повrsquoязано з пригніченням антиоксидантної системи клітин як захисного механізму проти не-гативного впливу ксенобіотиків

За впливу CoCl2 активність супероксиддисмутази безклітинних екстрактів D acetoxidans була максимальною на другу добу культивування за концентра-ції 20 мМ досліджуваної солі металу і становила 4437 ум од актмг протеїну (рис 3 б)

При підвищені концентрації кобальт (ІІ) хлориду від 05 до 20 мМ активність досліджуваного ензиму збільшилась у 21-41 рази відповідно протягом другої доби культивування порівняно з контрольними зразками Протягом третьої та четвертої діб за даного впливу солі металу активність супероксиддисмутази пригнічувалась порівняно з другою добою культивування проте була вищою порівняно з контроль-ними зразками


K 05 10 15 20 255

10

15

20

25

30

35

NiCl2

2 3 4

(а)

K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2 3 4

CoCl2 (б)

Рис 3 Вплив нікель (ІІ) хлориду (а) та кобальт (ІІ) хлориду (б) на активність супероксиддисмутази в безклітинних екстрактах D acetoxidans протягом

чотирьох діб вирощування (095 lt R2 lt 099)

Отже на початкових етапах впливу Кобальт стимулює активність досліджувано-го ензиму Тривалий вплив даної солі металу ймовірно призводить до інтенсивного пригнічення активності антиоксидантної системи захисту досліджуваних бактерій

При внесенні різних концентрацій FeSO4 максимальна активність супероксид-дисмутази безклітинних екстрактів бактерій D аcetoxidans була зафіксована на тре-тю добу культивування за концентрації 10 мМ досліджуваної солі металу та стано-вила 1395 ум од актмг протеїну (рис 4) Зі збільшенням часу культивування та підвищенням концентрації ферум (ІІ) сульфату в середовищі активність досліджува-ного ензиму знижувалась Очевидно тривалий вплив високих концентрацій FeSO4 зумовлює пригнічення активності антиоксидантної системи захисту даних бактерій Проте порівняно з впливом інших досліджуваних сполук перехідних металів ак-тивність супероксиддисмутази була невисокою за даних умов Це ймовірно обумо-влено низькою токсичністю досліджуваної солі металу щодо сірковідновлювальних бактерій D аcetoxidans

Встановлено що за внесення FeCl3times6H2О в ростове середовище активність су-пероксиддисмутази у безклітинних екстрактах досліджуваних бактерій була макси-мальною за концентрації 10 мМ солі металу на третю добу культивування і стано-вила 2669 ум од актмг протеїну (рис 4)


K 05 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

2 3 4

FeSO4

(а)

K 05 10 15 20 25

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

2 3 4

FeCl3 (б)

Рис 4 Вплив ферум (ІІ) сульфату (а) та ферум (ІІІ) хлориду (б) на активність супероксиддисмутази в безклітинних екстрактах D acetoxidans протягом


Збільшення концентрації ферум (ІІІ) хлориду від 15 до 25 мМ у культураль-ному середовищі призвело до збільшення активності супероксиддисмутази у 2 та 17 разів відповідно порівняно з контролем на другу добу культивування Протягом третьої доби активність досліджуваного ензиму суттєво знижувалась що ймовірно є результатом пригнічення функціонування захисних систем клітини зі збільшенням тривалості впливу даної солі металу що є сильним прооксидантом на досліджувані бактерії

За внесення MnCl2times4H2O максимальну активність супероксиддисмутази (3874 ум од актмг протеїну) безклітинних екстрактів досліджуваних бактерій було зафіксовано на другу добу культивування за концентрації 20 мМ солі Манга-ну (ІІ) у середовищі (рис 5)

За даного впливу активність досліджуваного ензиму зросла у 36 разів порівня-но з контролем На третю добу культивування максимальну активність СОД спос-терігали за внесення 15 мМ манган (ІІ) хлориду в культуральне середовище а на четверту добу ndash за впливу 10 мМ цієї сполуки За даних умов активність ферменту підвищилась відповідно у 28 та 27 разів порівняно з контролем Збільшення кон-центрації MnCl2 в середовищі зумовлювало зниження активності досліджуваного ензиму протягом третьої та четвертої діб Високі концентрації Мангану зокрема 20


та 25 мМ при тривалому впливі пригнічували активність СОД у безклітинних екс-трактах сірковідновлювальних бактерій D acetoxidans

K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4

MnCl2 Рис 5 Вплив манган (ІІ) хлориду на активність супероксиддисмутази

в безклітинних екстрактах D acetoxidans протягом чотирьох діб вирощування (095 lt R2 lt 099)

Висновок Отже дослідження впливу сполук перехідних металів зокрема FeSO4 FeCl3 MnCl2 NiCl2 та CoCl2 на активність супероксиддисмутази сірковід-новлювальних бактерій D acetoxidans протягом чотирьох діб культивування пока-зало що максимальна активність ензиму спостерігається за внесення в середовище 10 мМ NiCl2 20 мМ CoCl2 та MnCl2 відповідно на другу добу та за впливу 10 мМ FeSO4 і FeCl3 на третю добу культивування порівняно з контролем Встановлено що активність супероксиддисмутази безклітинних екстрактів досліджуваних бактерій змінюється залежно від концентрації сполуки перехідного металу в середовищі та тривалості її дії Збільшення часу культивування та концентрації сполук даних ме-талів в середовищі зумовлювали пригнічення активності досліджуваного ензиму

Висловлюємо щиру подяку доктору біологічних наук старшому науковому спів-робітнику лабораторії молекулярної генетики прокаріотів Інституту біології кліти-ни НАН України Борецькому Юрію Романовичу за допомогу в проведенні даних досліджень

ОМ Василив СА Гнатуш

Львовский национальный университет имени Ивана Франко Львов

ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ НА АКТИВНОСТЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ СЕРОВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ

DESULFUROMONAS ACETOXIDANS

Р е з ю м еСупероксиддисмутаза как один из энзимов антиоксидантной системы защиты клеток

катализирует дисмутацию супероксидного анион-радикала (О2-) с образованием О2 та Н2О2

Исследовано влияние соединений переходных металлов в частности FeSO4 FeCl3 MnCl2 NiCl2 и CoCl2 на активность супероксиддисмутазы серовосстанавливающих бактерий Desulfuromonas acetoxidans Максимальную активность исследуемого энзима наблюдали под влиянием 10 мМ NiCl2 20 мМ CoCl2 и MnCl2 на вторые сутки и под влиянием 10 мМ FeCl3 и FeSO4 на третьи сутки культивирования сравнительно с контролем Увеличение времени культивирования и концентрации соединения металла в среде вызывало подавление актив-ности супероксиддисмутазы

К л ю ч е в ы е с л о в а серобактерии Desulfuromonas acetoxidans переходные металлы Ni2+ Co2+ Fe3+ Fe2+ Mn2+


O M Vasyliv SO HnatushIvan Franko Lviv National University Lviv

INFLUENCE OF TRANSITION METAL COMPOUNDS ON SUPEROXIDE DISMUTASE ACTIVITY OF SULFUR REDUCING DESULFUROMONAS

ACETOXIDANS BACTERIA S u m m a r y

Superoxide dismutase as one of the enzymes of cellsrsquo antioxidant defensive system catalyzes superoxide anion-radical (О2

-) dismutation with О2 and Н2О2 forming The infl uence of such transition metal compounds as FeSO4 FeCl3 MnCl2 NiCl2 and CoCl2 on superoxide dismutase activity of sulfur-reducing Desulfuromonas acetoxidans bacteria has been investigated Maximal activity of the investigated enzyme has been observed accordingly under the infl uence of 10 mМ of NiCl2 20 mМ of CoCl2 and MnCl2 on the second day and under the infl uence of 10 mМ of FeCl3 and FeSO4 respectively on the third day of growth in comparison with control samples An increase of incubation time and concentration of metal compound in the medium caused the inhibition of superoxide dismutase activity

The paper is presented in UkrainianK e y w o r d s sulfur bacteria Desulfuromonas acetoxidans transition metals Ni2+ Co2+ Fe3+

Fe2+ Mn2+ T h e a u t h o r lsquos a d d r e s s Vasyliv OM Ivan Franko Lviv National University 4

Hrushevsky St Lviv 79005Ukraine

Меньшикова ЕБ Ланкин ВЗ Зенков НК Бондарь ИА Кругових НФ Труфакин ВА1 Окислительный стресс Прооксиданты и антиоксиданты ndash М Слово 2006 ndash 556 сРозанова ЕП2 Методы культивирования и идентификации анаэробных бактерий восстанавливающих серу и ее окисленные соединения ndash M Институт микробиологии АН СССР 1979 ndash С 123ndash136Чайка О Перетятко Т Гудзь С 3 Сірковідновлювальні бактерії водойм Язівського сіркового родовища Науковий вісник Ужгородського університету Серія біологічна ndash 2010 ndash 28 ndash C 1ndash4Barton L Hamilton W 4 Sulfate-Reducing Bacteria Environmental and Engineered Systems ndash Cambridge University Press 2007 ndash 558 pBartosz G5 Reactive oxygen species Destroyers or messengers Biochemical Pharmacology ndash 2009 ndash 77 ndash P 1303ndash1315Bernas T Dobrucki JW6 The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts MTT and CTC Archives of Biochemistry and Biophysics ndash 2000 ndash 380 N 1 ndash P 108ndash116Biebl H Pfennig N7 Growth of sulfate-reducing bacteria with sulfur as electron acceptor Arch Microbiol ndash 1977 ndash 112 ndash P 115ndash117Djordjevicrsquo V8 B Free radicals in cell biology International Review of Cytology ndash 2004 ndash 237 ndash P 57ndash89 Eric E Derek R9 Dissimilatory Fe (III)-reduction by the marine microorganism Desulfuromonas acetoxidans Аpplied and Environmental Microbiology ndash1993 ndash 59 N 3ndash P 734ndash742 Garity G Winters M Searles D10 Taxonomic Outline of the Procariotic Genera Bergeyrsquos Manual of Systematic Bacteriology ndash Second edition ndash Springer-Verlag 2001 ndash 41 p Lowry OH Rosebrough NJ Farr AL Randall RJ11 Protein determination with the Folin phenol reagent J Biol Chemistry ndash1951 ndash 193 ndash P 265ndash275 Murlooney SB Hausinger RP12 Nickel uptake and utilization by microorganisms FEMS Microbiology Reviews ndash 2003 ndash 27 ndash P 239ndash261 Pynyaha YuV Boretsky YuR Fedorovych DV Fayura LR Levkiv AI13 et al Defi ciency in frataxin homologue YFH1 in the yeast Pichia guilliermondii leads to misregulation of iron acquisition and ribofl avin biosynthesis and affects sulfate assimilation Biometals ndash 2009 ndash 22 ndash P 1051ndash1061 Schmidt T Schlegel H14 Nickel and cobalt resistance of various bacteria isolated from soil and highly polluted domestic and industrial wastes FEMS Microbiology Ecology ndash 1989 ndash 62 ndash P 315ndash328 15 Vasyliv O Hnatush S Effect of transition metal compounds on catalase activity of sulfur-reducing bacterial Desulfuromonas acetoxidans cells Visnyk of Lviv National University Series Biology ndash 2011ndash 57 ndash Р 207ndash215



УДК 5768620193

МА Борецкая1 ОС Суслова2

1Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украины ул Академика Заболотного 154 Киев МСП ДО 3680

2УНЦ laquoИнститут Биологииraquo КНУ им Тараса Шевченко ул Академика Глушкова 2

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКЗОПОЛИМЕРНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЛАНКТОНА И БИОПЛЕНКИ

STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA 22МОпределены оптимальные методы выделения экзополимерного комплекса

Stenotrophomonas maltophilia 22М синтезируемые в условиях планктона и биопленки на поверхности малоуглеродистой стали Для изучения состава экзополимера (углеводов и белков) желательно использовать разные физические и химические методы в зависимос-ти от формы роста бактерий

Так для планктонной формы роста наиболее эффективным было взаимодействие с ионообменной смолой (95 мкгмл) для определения максимального количества углеводов и воздействие нагреванием для определения белка (39 мкгмл) Для экзополимера биопленки с целью получения максимального количества углеодов рекомендуется использовать на-гревание ( 30 мкгмл) и центрифугирование (35 мкгмл) Определения белка в экзополимере биопленки рекомендуется проводить после обработки нагреванием (375 мкгмл) и цент-рифугированием (3 75 мкгмл)

Ключевые слова экзополимерный комплекс биопленка коррозионноактивные бак-терии

Микробные популяции на твердых поверхностях способны к образованию вы-сокоорганизованных структур ndash биопленок Процесс такого формирования начина-ется с этапа перехода свободно плавающих планктонных форм к прикрепленным С помощью слизистой капсулы бактерии адгезируются к субстрату и формируют микро- и макроколонии Согласно данным литературы состав экзополимера план-ктонных клеток и клеток биопленки отличается [9] Слизистый матрикс защищает биопленку от негативных факторов окружающей среды (биоцидов атак фагов фи-зико-химического воздействия) [8 10]

Для качественного и количественного анализа экзополимера (ЭПК) применяют широкий спектр физических и химических методов Среди физических методов ши-рокое применение нашли нагревание центрифугирование фильтрация ультразву-ковая обработка [5] Химические включают экстракцию химическими реагентами такими как этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА) NaOH NaOH-формамид уксусная кислота [9] Анализ литературы показывает необходимость предваритель-ного подбора соответствующего метода выделения ЭПК для анализа тех или иных его компонентов Так по данным Pan X et al [11] наиболее эффективным методом для отделения общего экзополимерного комплекса от клеток применялась обра-ботка ЭДТА Для максимального выделения углеводов в составе ЭПК по данным Tapia J M et al эффективно использовался метод нагревания и центрифугирования [12]

Изучение состава экзополимерного комплекса биопленок также важно для разра-ботки методов защиты от микробно индуцированной коррозии Stenotrophomonas maltophilia является неотъемлемым компонентом коррозионноактивного сооб-щества и природным ассоциантом ацидофобных тионовых бактерий Thiobacillus thioparus Согласно проведенным ранее исследованиям формирование биопленки ассоциацией Smaltophilia и T thioparus на поверхности малоуглеродистой стали более активное а скорость коррозии значительно выше по сравнению с монокуль-турой T thioparus [2] Предполагается что регулировка продукции гетеротрофными бактериями Smaltophilia слизистого экзополимера и его состава поможет сущест-

copy IgraveAgrave Aacuteicircetharingoumlecircagraveyuml IcircNtilde Ntildeoacutentildeeumlicircacircagrave 2013


венно влиять на коррозионные процессы в грунтах Для изучения механизмов дан-ного процесса необходимо подобрать оптимальный метод выделения ЭПК а также определить способ максимального выделения отдельных его компонентов

Целью нашей работы было сравнительное изучение оптимальных физичес-ких и химических методов для экстракции ЭПК клеток биопленки и планктона Smaltophilia 22М

Материалы и методы Объекты исследования В эксперименте использовал-ся штамм Stenotrophomonas maltophilia 22M выделенный из-за туннелей киевского метрополитена на глубине залегания палеогенных и неогенных слоев грунта [3] Изучали ЭПК биопленки сформированной поверхности малоуглеродистой стали

Подготовка стальных пластин Подготовка стальных пластин марки ВСтЗСП (40times15 мм) проводилась согласно литературным данным [1]

Культивирование Smaltophilia 22M и получение биопленки и планктона Обра-ботанные пластины погружали в среду Старки 2 (в г1000 мл H2O KH2PO4 -4 K2HPO4 -4 Na2S2O3 ndash 10 MgSO4 ndash 01 CaCl2 ndash 01 NH4Cl ndash 01 FeCl3 ndash 002 MnSO4 ndash 002) инокулировали 2-х суточной культурой Smaltophilia 22M Культивировали при температуре 28 0С в течении 4 суток

После культивирования клетки биопленки и экзополимерный матрикс снимали со стальных пластин с помощью ультразвука 22 кГц в течении 2 мин на ледяной по-душке Планктонные клетки отбирали из культуральной жидкости Для осаждения продуктов коррозии и солей питательной среды образцы биопленки и планктона центрифугировали при 15 rpm (revolutions per minute) 15 мин (Eppendorf Cenrifuge 5810R USA) при температуре 5 0С После центрифугирования оптическую плот-ность супернатанта планктона и биопленки приводили к единому показателю 02 (КФК-3-01 Россия) кювета 15 мм λ 540 нм относительно дистилированой воды)

Выделение экзополимерного комплекса Экзополимерный комплекс экстрагиро-вали из бактериальных культур используя пять методов 2 химических (воздействие NaOH и формальдегида в комплексе с NaOH) 3 физических (влияние ионообмен-ной смолы нагревания центрифугирования)

Для отделения ЭПК от клеток биопленки и планктона применяли следующие методы (на 10 мл культуральной жидкости)

Воздействие раствором NaOH (2 мл 1н NaOH) при температуре 40С 3 часа Воздействие 40 раствором формальдегида (20 мкл) экспозиция 1 час при 40С

с последующим добавлением 1М NaOH (28 мл) экспозиция 3 часаВзаимодействие с ионообменной смолой КУ2+ (35 г) 2 часа температура 40С

при постоянном помешиванииВыдерживание культуральной жидкости в запаянных ампулах 1 час при 700СПосле обработки вышеуказанными методами образцы центрифугировали 30 мин

при 119 rpm (Eppendorf Cenrifuge 5810R USA) и температуре 40С При таких же условиях центрифугировали 10 мл необработанной культуральной

жидкости как биопленки так и планктона Супернатант фильтровали через мембранные фильтры 022 мкм (Syringe Filter

with 02 μm Supor Membrane PALL Life Science) Фильтрат диализировали против дистилированой воды (1 л 10 мл образца) используя диализные трубки с диаметром пор 3500 MWCO (Sigma USA) 24 часа

Определение углеводного и белкового компонентов ЭПК Общее количество уг-леводов определялось фенол-серным методом стандарт minus глюкоза λ 490 нм кювета 15 мм [6] Общее количество белка minus методом Bradford (стандарт ndash бычий альбумин (Sigma USA) λ 590 нм кювета 15 мм [4] Оптическую плотность определяли с помощью спектрофотометра КФК-3-01 (Россия)

Результаты и их обсуждение Было использовано пять методов экстракции ЭПК сформированных клетками гетеротрофного спутника коррозионноактивных бактерий цикла серы Smaltophilia 22M разных форм роста в присутствии малоугле-родистой стали


Методы воздействия нагреванием и центрифугирование без дополнительной об-работки оказались наиболее эффективными для определения углеводов в экзополи-мерном матриксе биопленки S maltophilia 22M Так количество углеводов выде-ленное этими методами составляло 30 мкгмл и 35 мкгмл соответственно (рис 1)

Рис 1 Содержание общего количества углевода в экзополимерном комплексе Stenotrophomonas maltophilia 22M разных форм роста при воздействии NaOH (1) NaOH с формалином (2) ионообменной смолой (3) нагреванием (4)

центрифугированием без обработки (5) Следует отметить что использование тех же методов для выделения компонен-

тов экзополимера планктона привело к получению результатов в среднем ниже чем в варианте с экзополимером биопленки (рис 1) Наиболее эффективным методом считали влияние ионообменной смолы (95 мкгмл)

Обработка выбранными методами с целью выделения и оценки общего белка в ЭПК показала что наиболее эффективным методом для определения состава мат-рикса биопленки является влияние физических методов ndash нагревание (375 мкгмл) и центрифугирование (375 мкгмл) (рис 2) Для ЭПК планктона наибольший пока-затель был отмечен при воздействии нагреванием (39 мкгмл)

Таким образом для проведения качественного изучения его состава ЭПК необ-ходимо максимально извлечь все его составляющие применяя различные методы

Следует отметить значительную разницу во влиянии одних и тех же методов экстракции на ЭПК разного происхождения По-видимому это связано с тем что клетки планктона пребывают в свободном движении тогда как клетки биоплен-ки вынуждены находиться в контакте не только с поверхностью но и по данным Flemming H-C [7] формируют очень прочные связи друг с другом образуя конг-ломераты

При определении общего белка в ЭПК биопленки Smaltophilia 22M рекоменду-ется использовать физические методы нагревание и центрифугирование Для план-ктонной формы роста minus нагревание и обработка 1н NaOH


Рис 2 Содержание общего количества белка в экзополимерном комплексе Stenotrophomonas maltophilia 22M разных форм роста при воздействии NaOH (1) NaOH с формалином (2) ионообменной смолой (3) нагреванием (4)

центрифугированием без обработки(5) Необходимо учитывать особенности формы роста микроорганизмов при выделе-

нии ЭПК биопленки так как степень разрушения связей между клетками клетками и поверхностью может существенно сказаться на качестве и количестве выделенно-го ЭПК Таким образом в данной работе отмечено значительную разницу в эффек-тивности некоторых методов в зависимости от формы роста

Так как экзополимерный комплекс является важным компонентом в механизме формировании биопленки и переход от планктонной формы роста к биопленочной является ключевым в коррозионоактивных процессах minus этот комплекс требует бо-лее детального изучения

МО Борецька1 ОС Суслова2

1Інститут мікробіології та вірусології ім ДК Заболотного НАН України Київ2Київський національний університет ім Тараса Шевченка Україна

МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ ЕКЗОПОЛМЕРНОГО КОМПЛЕКСУ ПЛАНКТОНУ ТА БІОПЛІВКИ STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA 22М

Р е з ю м еВизначені оптимальні методи виділення екзополімерного комплексу Stenotrophomonas

maltophilia 22M що синтезуються в умовах планктону та біоплівки на поверхні маловугле-цевої сталі Для вивчення складу екзополімеру (вуглеводів та білків) бажано використовувати різні фізичні та хімічні методи залежно від форми росту Так для планктонної форми росту найбільш ефективною була взаємодія з іонообмінною смолою (95 мкгмл) для визначення максимальної кількості вуглеводів і вплив нагріванням для визначення білку (39 мкгмл) Для екзополімеру біоплівки з метою отримання максимальної кількості вуглеводів бажано використовувати нагрівання (30 мкгмл) та центрифугування (35 мкгмл) Визначення білку в екзополімері рекомендується проводити після обробки нагріванням (375 мкгмл) та центри-фугуванням (375 мкгмл)

Ключові слова екзополімерний комплекс біоплівка корозійноактивні бактерії


M O Boretska 1 OS Suslova 2

1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine Kyiv2Тaras Shevchenko Kyiv National University

METHODS FOR EXTRACTION OF EXOPOLYMERIC COMPLEX IN PLANKTON AND BIOFILM GROWTH MODE OF STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA 22M

S u m m a r yThe optimal methods for the extraction of exopolymeric complex (EPS) of Stenotrophomonas

maltophilia 22M was determined That EPS was synthesized in plankton and biofi lm growth mode on the mild steel surface It is desirable to use different physical and chemical methods for studying the EPS composition (carbohydrates and proteins) depending on the bacteria growth mode In this way the interaction with ion exchange resin was the most effective for plankton growth mode to determine the maximum amount of carbohydrates (95 μgml) and the impact of heating to determine protein (39 μg ml) For EPS biofi lm in order to obtain maximum amount of carbohydrate it is desirable to use heating (30 μgml) and centrifugation (35 μgml) It is recommended to determine protein in the biofi lm EPS after treatment with heating (375 μgml) and centrifugation (3 75 μgml)

The paper is presented in RussianK e y w o r d s exopolymeric complex biofi lm corrosion active bacteria T h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Boretska MO Zabolotny Institute of Microbiology and

Virology National Academy of Sciences of Ukraine 154 Acad Zabolotny St Kyiv MSP D03680 Ukraine

1 Асауленко ЛГ Пуріш ЛМ Козлова ІП Етапи формування біоплівки сульфідвідновлю-вальнми бактеріями Мікробіол журн ndash 2004 ndash 66 3 ndash С 72ndash79 2 Борецька МО Козлова ІП Вплив екзополімерів біоплівки на швидкість мікробної корозії маловуглецевої сталі Там само ndash 2007 ndash 69 4 ndash С 40ndash44 3 Протасова МО Собко ВМ Козлова ІП Адгезія і колонізація поверхні скла Thiobacillus thioparus та Stenotrophomonas maltophilia та їх бінарною культурою Там само ndash 2005 ndash 67 6 ndash С 57-63 4 Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem ndash 1976 ndash 72 ndash P 248ndash254 5 Comte S Guibaud G Baudu M Effect of extraction method on EPS from activated sludge An HPSEC investigation J Hazard Mater ndash140 (1-2) ndash Р 127ndash129 6 Dubois M Gilles KA Hamilton JK Rebers PA Smith F Calorimetric method for determination of sugars and related substances Anal Chem ndash 1956 ndash28 N 3 ndashP350ndash356 7 Flemming H-C Neu TR Wozniak D J The EPS matrix the rdquohouse of biofi lm cellrdquo J Bacteriol ndash 2007 ndash 189 N 22 ndash P 7945ndash7947 8 Gehrke T Telegdi J Thierry D Importance of extracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching Appl аnd Environ Microbiol ndash 1998 ndash 64 N 7 ndash Р 2743ndash2747 9 Melanie J Brown John N Lester Comparison of Bacterial Extracellular Polymer Extraction Methods Ibid ndash 40 N 21980 ndash P 179ndash185 10 OrsquoTool G Kaplan HB Kolter R Biofi lm formation as microbial development Annu Rev Microbiol ndash 2000 ndash 54 N 6 ndash P 49ndash79 11 Pan X Liu J Zhang D Li L Song W Yang J A comparison of fi ve extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofi lm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fl uorescence spectroscopy Water SA ndash 2010 ndash 36 N 1 ndash P 111ndash115 12 Tapia J M Munoz J A Gonzaacute lez F Blaacute zquez M L Malki M Ballester A Extraction of extracellular polymeric substances from the acidophilic bacterium Acidiphilium 32Sup (5) Water Sci and Tech ndash WST ndash 2009 ndash 59 N 10 ndash P 1959ndash1963



УДК 5798411 579262 570176АБ Балко ОИ Балко ЛВ Авдеева

Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украины ул Академика Заболотного 154 Киев ГСП Д 03680 Украина

ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНКИ ШТАММАМИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA УКРАИНСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВИсследовано биопленкообразование в стационарной системе на стекле трех коллекцион-

ных штаммов P aeruginosa выделенных из организма человека Показано что исследуемые микроорганизмы характеризуются трехэтапным формированием биопленки начальным образованием дальнейшей частичной деградацией и повторным накоплением Интенсив-ность биопленкообразования коррелирует с выживаемостью микроорганизмов в ее соста-ве что можно адекватно оценить с помощью метода laquoсмываraquo Образованию биопленки P aeruginosa присущи штаммовые отличия определяющие дальнейшие закономерности ее развития

Ключевые слова Pseudomonas aeruginosa биопленкообразование стационарная сис-тема

Микроорганизмы вида Pseudomonas aeruginosa рассматриваются как одни из основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний [8] Инфекции вы-званные данными возбудителями характеризируются длительным течением и сложностью терапии что связано с природной иили приобретенной устойчивос-тью P aeruginosa к используемым антибиотикам [11] Способность к образованию биоплёнки существенно увеличивает их устойчивость к действию различных анти-микробных средств [4] Тем не менее P aeruginosa рассматриваются не только как клинически важные микроорганизмы но и как один из модельных объектов для изу-чения биопленкообразования [13] Исследование закономерностей формирования биопленки P aeruginosa не только расширит общее понимание этого явления но и позволит создать адекватную стратегию для предупреждения ее образования [5]

Поэтому целью нашей работы было изучение формирования биоплёнки коллекционными штаммами Pseudomonas aeruginosa

Материалы и методы Исследование формирования биоплёнки проводили на выделенных из организма человека трех коллекционных штаммах Pseudomonas aeruginosa УКМ В-1 (АТСС 10145) УКМ В-12 (ССМ 1500) и УКМ В-900 (ATCC 9027) любезно предоставленных д-р биол наук внс Киприановой ЕА из Ук-раинской коллекции микроорганизмов (УКМ Институт микробиологии и виру-сологии им ДК Заболотного НАН Украины) Динамику образования биоплёнки P aeruginosa изучали в модификации по собственной методике в стационарной сис-теме на стекле [1] Для этого в бюксы 30times50 мм и объёмом 20 мл вносили покровные стёкла 18times18 мм и 2 мл суспензии микроорганизмов содержащей 2times106 КОЕмл Культивирование осуществляли при 37 ordmС на протяжении 7 суток при этом каждые 24 часа из бюксов отбирали покровные стёкла Последние промывали 2-3 раза в 09 растворе NaCl фиксировали 10 мин в 96 растворе этанола и окрашивали генциан-виолетом в течение 10 мин Размеры образованной биоплёнки определяли c помощью светловой микроскопии с использованием микроскопа Micromed XC-2610 при общем увеличении times600 и дальнейшей ультрамикрофотографии препаратов цифровой фотокамерой Nicon CoolPix 5100 Полученные растровые изображения обрабатывали с использованием программы TotalLab TL120 показатель биоплен-кообразования рассчитывали по площади поверхности соответствующих образова-ний

При определении сформированной биопленки указанным методом не учиты-вается один из наиболее значимых ее компонентов ndash количество жизнеспособных микроорганизмов Поэтому для более детального изучения биопленкообразования одновременно с методом количественного подсчета структур было также использо-copy AgraveAacute Aacuteagraveeumlecircicirc IcircEgrave Aacuteagraveeumlecircicirc EumlAcirc Agraveacircaumlaringaringacircagrave 2013


вано метод laquoсмываraquo minus определение в составе бактериальной биоплёнки количества жизнеспособных клеток Для этого отмытые от планктонной формы бактерий об-разцы помещали в бюксы с 5 мл 09 раствора NaCl и в течение 45 мин поддавали интенсивному механическому отделению клеток биопленки от поверхности стекла на магнитной мешалке В полученной суспензии из смытой в раствор биопленочной формы бактерий определяли титр [2] который указывал на количество жизнеспо-собных клеток псевдомонад в составе биопленки

Результаты Исследование жизнеспособности клеток P aeruginosa УКМ В-900 в составе биопленки показало что максимальное их накопление обнаруживается на 1 сутки культивирования и составляет 41times106 КОЕмл (рис 1 А) В течение последующего периода наблюдения количество клеток в смывах характеризова-лось убывающей логарифмической зависимостью и на 7 сутки их титр составлял 6times101 КОЕ мл Для P aeruginosa УКМ В-1 количество жизнеспособных клеток в со-ставе биопленки достигало максимальных значений на вторые сутки культивирова-ния (рис 1 Б) При этом титр микроорганизмов в смытой суспензии был несколько ниже такого у штамма УКМ В-900 и составлял 82times105 КОЕмл После достижения максимальных значений количество жизнеспособных клеток P aeruginosa УКМ В-1 равномерно уменьшалось и на конечном этапе наблюдения в смыве обнаружи-валось 7times101 КОЕмл микроорганизмов Следует отметить что несмотря на более медленное нарастание количества жизнеспособных клеток P aeruginosa УКМ В-1 в биопленочной форме особенности выживания микроорганизмов исследованных штаммов в составе биопленки характеризовались существенным сходством

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

Рис 1 Количество жизнеспособных клеток в составе биоплёнки исследованных штаммов А minus P aeruginosa УКМ В-900 Б minus P aeruginosa УКМ В-1

В minus P aeruginosa УКМ В-12 Здесь и дальше n ndash количество смытых клеток Т ndash длительность наблюдения


Анализ жизнеспособности клеток P aeruginosa УКМ В-12 в формируемой ими биопленке выявил некоторые особенности не характерные описанным ранее штам-мам Максимальное увеличение количества бактерий УКМ В-12 minus до 55times106 КОЕ мл наблюдали в смывах на первые сутки культивирования (рис 1 В) Однако в течение дальнейших двух суток титр клеток практически не изменялся Некоторое снижение количества микроорганизмов было отмечено только на 4 сутки культивирования тогда как на 7 сутки в составе биопленки все еще обнаруживалось достаточно вы-сокое количество бактерий minus 35times104 КОЕмл Следует отметить что на конечном этапе наблюдения количество жизнеспособных клеток в биопленочной форме этого штамма составляло более половины от исходных показателей а у P aeruginosa УКМ В-1 и УКМ В-900 уменьшалось практически до минимально выявляемых значений Таким образом полученные данные свидетельствуют о том что в составе биоплен-ки клетки P aeruginosa УКМ В-12 характеризуются высшей а у штаммов УКМ В-1 и УКМ В-900 соответственно низшей способностью к выживанию

В дальнейшем у исследуемых микроорганизмов определяли количественные показатели биопленкообразования Так для P aeruginosa УКМ В-900 образование максимального количества биопленки которая покрывала почти 50 поверхности стекла наблюдалось на первые сутки культивирования (рис 2 А) Тем не менее уже на следующие сутки ее площадь резко сокращалась до 229 мм2 после чего ука-занный уровень поддерживался на протяжении дальнейшего периода наблюдения Незначительное увеличение количества биопленки до 526 мм2 наблюдали лишь на 7 сутки культивирования Биопленкообразование у P aeruginosa УКМ В-1 по сравне-нию с таким у вышеупомянутого штамма характеризовалось некоторыми особен-ностями (рис 2 Б) В этом случае площадь биопленки равномерно увеличивалась и достигала максимума minus 172 мм2 на 4 сутки наблюдения В дальнейшем как и у штамма УКМ В-900 было отмечено значительное сокращение ее количества прак-тически до нулевых значений которое поддерживалось на этом уровне в течение последующих 48 часов Повторное увеличение площади биопленки до 1715 мм2 у P aeruginosa УКМ В-1 было отмечено на 8 сутки культивирования (данные на гра-фике не показаны) Эта особенность а также общая динамика формирования био-пленки с начальным накоплением и дальнейшей резкой деградацией указывают на сходство процесса биопленкообразования у штаммов УКМ В-900 и УКМ В-1

Наблюдение за P aeruginosa УКМ В-12 показало что формирование биопленки этим штаммом носит довольно неравномерный характер (рис 2 В) Так на пер-вые сутки культивирования площадь биоплёнки составляла 663 мм2 в дальнейшем незначительно уменьшалась а на третьи сутки ndash повторно увеличивалась уже до 914 мм2 Этот период очевидно следует рассматривать как первый этап накопле-ния биопленки В последующие двое суток у P aeruginosa УКМ В-12 наблюдалось уменьшение количества биопленки в среднем до 32 мм2 Можно отметить что пери-од частичной деградации у штамма УКМ В-12 был относительно коротким и менее выраженным по сравнению с такими у описанных выше микроорганизмов На ко-нечном этапе наблюдения у P aeruginosa УКМ В-12 отмечали повторное увеличе-ние количества биопленки до 1121 мм2 Таким образом биопленкообразованию ис-следованных штаммов P aeruginosa характерны некоторые общие закономерности исходное образование переходящее в частичную деградацию за которой следует повторное ее накопление При этом описанная динамика прослеживается у изучен-ных штаммов несмотря на их довольно выраженные штаммовые отличия

Следует отметить что на протяжении всего периода наблюдения клетки P aeruginosa УКМ В-12 формировали биоплёнку которая покрывала не больше 30 поверхности стекла Однако резких колебаний с уменьшением ее площади практически до нулевых значений характерных штаммам УКМ В-900 и УКМ В-1


также не отмечалось Поэтому общее количество образованной за весь период на-блюдения биопленки у P aeruginosa УКМ В-12 было наибольшим несколько низ-шие показатели выявлялись у штамма УКМ В-1 а P aeruginosa УКМ В-900 характе-ризовались минимальным ее накоплением Можно отметить что при интенсивном биопленкообразовании показатели выживаемости микроорганизмов также выявля-лись на высоком уровне а при менее выраженном ndash были соответственно низкими что указывает на корреляционную связь между этими процессами

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

Рис 2 Формирование биоплёнки исследованными штаммами А minus P aeruginosa УКМ В-900 Б minus P aeruginosa УКМ В-1 В minus P aeruginosa

УКМ В-12 S ndash площадь образованной биоплёнки

Обсуждение Наблюдаемые нами закономерности согласуются с данными опи-санными в работах других исследователей Так согласно Moratoacute J Codony F Mas J [9] микроорганизмы в природной среде способны образовывать на стеклянных образцах биопленку которая также характеризуется двумя максимумами накопле-ния и промежуточным периодом уменьшения ее количества Аналогичная динамика формирования биопленки P aeruginosa была описана в работе Barraud N Hassett DJ Hwang S-H et al [3] В то же время Stewart PS [12] исследующий на мо-дели P aeruginosa значение биопленки в устойчивости микроорганизмов к анти-биотикам указывал на постепенное нарастание количества бактерий в ее составе которое несколько уменьшалось только на 10 сутки наблюдения В другом случае Purevdorj-Gage B Costerton W J Stoodley P [13] для двух диких и одного мутан-тного штаммов P aeruginosa выявляли образование ими биопленки покрывающей


100 поверхности образца начиная со вторых суток и вплоть до конца исследова-ния Возможно выявленные отличия связаны с использованием в указанных работах системы проточного культивирования когда состав среды регулярно обновляется а микроорганизмы в составе биопленки не испытывают голодания и угнетения роста продуктами собственного метаболизма В использованной нами стационарной сис-теме указанные факторы очевидно существенным образом влияют на формирова-ние биопленки Это возможно является причиной выявленных отличий но тем не менее приближает условия эксперимента к естественным

Рассматривая описанное нами трехэтапное образование биопленки особый ин-терес представляет последний этап ее накопления Среди возможных причин по-добного явления можно отметить наличие в бактериальной популяции клеток-пер-систеров способных активироваться при гибели большинства микроорганизмов в составе биопленки [7] В нашем случае активация персистеров очевидно является маловероятной поскольку на этапе вторичного накопления биопленки повышение количества жизнеспособных клеток в смывах не обнаруживали Иными причинами вторичного накопления биопленки могут быть активация матрикспродуцирующих клеток [7] переход микроорганизмов из планктонной в биопленочную форму су-ществования [10] либо одновременное массовое осаждение на стекле нежизнеспо-собных клеток Остается также невыясненной причина увеличения площади био-пленки у P aeruginosa УКМ В-1 на 4 сутки культивирования когда количество жиз-неспособных микроорганизмов в ее составе начиная с 3 суток уменьшается Таким образом описанная особенность биопленкообразования исследованных штаммов требует более тщательного изучения

В проведенных нами исследованиях было показано существенные штаммовые отличия биопленкообразования у микроорганизмов одного вида Похожие резуль-таты относительно неоднородности формирования биопленки разными штаммами P aeruginosa выявляли также Wang EW Jung JY Pashia ME et all [14] К подоб-ным выводам приходят Lee B Haagensen JAJ Ciofu O et all [6] изучавшие осо-бенности биопленкообразования у клинических изолятов P aeruginosa Анализируя возможные причины выявленных нами штаммовых отличий при образовании био-пленки P aeruginosa и соответственно выживаемости микроорганизмов в ее соста-ве было обращено внимание на место их первичного выделения Соответственно данным Американской и Чешской коллекций типовых культур микроорганизмы P aeruginosa УКМ В-900 (ATCC 9027) были выделены из внешнего уха человека УКМ В-1 (АТСС 10145) minus из культуры крови а бактерии УКМ В-12 (ССМ 1500) minus из дыхательных путей человека Можно предположить что интенсивная циркуляция воздуха небольшое количество секрета и обилие лимфоидной ткани в дыхательных путях [15] вызывает необходимость поддерживать биопленку на невысоком уровне в течение длительного времени Высокоагрессивная для бактерий среда крови [15] очевидно требует образования значительно большего количества биопленки необ-ходимой для защиты микроорганизмов и дальнейшей диссеминации по кровотоку Отсутствие существенного влияния иммунной системы макроорганизма и относи-тельная защищенность от воздействия физических факторов внешней среды позво-ляют рассматривать кожные покровы внешнего уха человека как наиболее laquoбезопас-ныеraquo из указанных биотопов для микроорганизмов Данные условия очевидно не требуют от бактерий образования высокоустойчивой биопленки Можно отметить что предложенные теоретические особенности биопленкообразования находят от-ражение в динамике ее накопления исследуемыми штаммами P aeruginosa в экспе-риментальных условиях Исходя из этого сделано предположение что в процессе


первичной адаптации к условиям существования бактерии вырабатывают особые закономерности формирования биопленки которые очевидно определенным обра-зом сохраняются и в дальнейшем проявляются даже при смене среды обитания

Таким образом биопленкообразование P aeruginosa УКМ В-900 УКМ В-1 и УКМ В-12 в стационарной системе на стекле характеризуется трехэтапностью ко-торая заключается в исходном формировании биопленки ее частичной деградации и дальнейшем повторном накоплении Образованию биопленки определенным об-разом соответствует выживаемость микроорганизмов в ее составе которую можно адекватно оценить с помощью метода laquoсмываraquo Биопленкообразованию P aeruginosa присущи штаммовые отличия которые возможно зависят от места их первичного выделения и определяют дальнейшие закономерности формирования биопленки

ОБ Балко ОI Балко ЛВ Авдєєва


ФОРМУВАННЯ БІОПЛІВКИ ШТАМАМИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA УКРАЇНСЬКОЇ КОЛЕКЦІЇ МІКРООРГАНІЗМІВ

Р е з ю м еДосліджено біоплівкоутворення у стаціонарній системі на склі трьох колекційних штамів

P aeruginosa виділених з організму людини Показано що досліджувані мікроорганізми ха-рактеризуються трьохетапним формуванням біоплівки початковим утворенням подальшою частковою деградацією і повторним накопиченням Інтенсивність біоплівкоутворення коре-лює із виживанням мікроорганізмів у її складі що можна адекватно оцінити за допомогою методу laquoзмивуraquo Утворенню біоплівки P aeruginosa характерні штамові відмінності які виз-начають подальші закономірності її розвитку

Ключові слова Pseudomonas aeruginosa біоплівкоутворення стаціонарна система

AB Balko OI Balko LV Avdeeva


BIOFILM FORMATION BY PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS OF UKRAINIAN COLLECTION OF MICROORGANISMS

S u m m a r yThe biofi lm formation of three P aeruginosa collection strains isolated from human body

was investigated in stationary system on glass It was shown that biofi lm formation of these microorganisms has three stages initial formation the further partial degradation and repeated accumulation The intensity of biofi lm formation correlates with survival rate of microorganisms in its structure that may be estimated by means of the laquowashoutraquo method The strain differences are typical of P aeruginosa biofi lm formation and determine further regularities of its development

The paper is presented in Russian K e y w o r d s Pseudomonas aeruginosa biofi lm formation stationary systemT h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Balko AB Zabolotny Institute of Microbiology and Virology


1 Балко ОБ Авдєєва ЛВ Вплив температурного фактора на особливості формування біоплівки бактеріями виду Pseudomonas aeruginosa Медицина сьогодні і завтра ndash 2009 ndash 3-4 ndash С 23ndash27

2 Климнюк СІ Ситник ІО Творко МС Широбоков ВП Практична мікробіологія ndash Тернопіль Укрмедкнига 2004 ndash 440 с


3 Barraud N Hassett DJ Hwang S-H Rice SA Kjelleberg S Webb JS Involvement of nitric oxide in biofi lm dispersal of Pseudomonas aeruginosa J Bacteriol ndash 2006 ndash 188 N 21 ndash P 7344ndash7353

4 Hoslashiby N Bjarnsholt T Givskov M Molin S Ciofu O Antibiotic resistance of bacterial biofi lms Int J Antimicrob Agents ndash 2010 ndash 35 N 4 ndash P 322-332

5 de Kievit T R Quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofi lms Environ Microbiol ndash 2009 ndash 11 N 2 ndash P 279ndash288

6 Lee B Haagensen JAJ Ciofu O Andersen JB Hoslashiby N Molin S Heterogeneity of biofi lms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fi brosis J Clin Microbiol ndash 2005 ndash 43 N 10 ndash P 5247ndash5255

7 Loacutepez D Vlamakis H Kolter R Biofi lms Cold Spring Harb Perspect Biol ndash 2010 ndash 2 N 7 ndash P a000398

8 Lyczak JB Cannon C Pier GB Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection lessons from a versatile opportunist Microb Infect ndash 2000 ndash 2 N 9 ndash P 1051ndash1060

9 Moratoacute J Codony F Mas J Microscopy techniques applied for monitoring the development of aquatic biofi lms Current Issues on Multidisciplinary Microscopy Research and Education ndash Badajoz Spain FORMATEX 2004 ndash P 93ndash100

10 Purevdorj-Gage B Costerton W J Stoodley P Phenotypic differentiation and seeding dispersal in non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa biofi lms Microbiology ndash 2005 ndash 151 N 5 ndash Р 1569ndash1576

11 Rossolini GM Mantengoli E Treatment and control of severe infections caused by multiresistant Pseudomonas aeruginosa Clin Microbiol Infect ndash 2005 ndash 11 N 4 ndash P 17ndash31

12 Stewart PS Biofi lm accumulation model that predicts antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa biofi lms Antimicrob Agents Chemother ndash 1994 ndash 38 N 5 ndash P 1052ndash1058

13 Stoodley P Sauer K Davies DG Costerton JW Biofi lms as complex differentiated communities Annu Rev Microbiol ndash 2002 ndash 56 ndash P 187ndash209

14 Wang EW Jung JY Pashia ME Nason R Scholnick S Chole RA Otopathogenic Pseudomonas aeruginosa strains as competent biofi lm formers Arch Otolaryngol Head Neck Surg ndash 2005 ndash 131 N 11 ndash P 983ndash989

15 Wheelis ML Principles of modern microbiology ndash Sudbury Mass Jones and Bartlett Publishers 2008 ndash 496 p



УДК 582288 577151ИН Курченко

Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украины ул Академика Заболотного 154 Киев ГСП Д03680 Украина

ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ РАЗНЫХ ТРОФИЧЕСКИХ

ГРУПППроведено сравнительное изучение полигалактуроназной активности 85 сапрофитных

фитопатогенных и эндофитных штаммов Fusarium poae Alternaria alternata Penicillium funiculosum и Mycelia sterilia Установлено что в целом ферментативная активность штаммов Mycelia sterilia и P funiculosum была значительно выше чем штаммов A alternata и F poae Большинство изученных штаммов проявляли средний уровень полигалактурона-зной активности Высокая активность была характерна лишь для эндофитных штаммов F poae P funiculosum и Mycelia sterilia Не установлено четкой зависимости уровня поли-галактуроназной активности изученных штаммов от скорости линейного роста времени культивирования а также вида и органа растения-хозяина из которых они были выделены Наличие полигалактуроназы у доминирующих и часто встречающихся видов эндофитных грибов болотных растений Полесья Украины свидетельствует о том что эндофитные мик-роскопические грибы играют существенную роль в гидролизе пектиновых веществ расти-тельных тканей а также миграции минеральных элементов в болотных экосистемах

Ключевые слова микроскопические грибы фитопатогены сапрофиты эндофиты полигалактуроназная активность

Связи грибов с растениями очень древние и весьма разнообразные их можно свести к двум главным типам взаимоотношения грибов с живыми растениями и деструкция мертвых растений Грибы характеризуются осмотрофным типом пита-ния причем для паразитов симбионтов и сапротрофов в большинстве случаев рас-тительными тканями Гидролитические ферменты грибов нацелены на разложение углеводов ndash строительного материала и запасных веществ растений [1]

Клеточные стенки растений состоят из полисахаридов крахмала (амилоза и амилопектин) целлюлозы гемицеллюлозы пектиновых веществ и соединений не углеводного характера к которым можно отнести лигнин кутин суберин фосфоли-пиды белки воски и минеральные соединения

Пектиновые вещества ndash это гетерополисахариды состоящие из основной цепи частично метилэтерифицированного α-l4-D-гaлактуронана [8 16] Пектины обычно сосредоточены в срединной пластинке имеют коллоидные свойства и могут связы-вать большое количество воды Их основная биологическая роль сводится к сохра-нению структурной целостности компонентов растительной клетки

Ряд авторов отмечают наличие у эндофитов сложного комплекса ферментов ndash целлюлаз гемицеллюлаз полифенолоксидаз полигалактуроназ разлагающих рас-тительные ткани [1 10] что позволило предположить возможность функциониро-вания сложной трофической цепи между сфагновыми мхами сосудистыми растени-ями и эндофитными грибами

Полигалактуроновые комплексы сфагновых мхов связывают большую часть ми-неральных элементов в том числе К+ и 137Cs+ которые становятся доступными для сосудистых растений в результате действия полигалактуроназы эндофитных микро-мицетов [22] Это имеет важно для обмена калия и миграции 137Cs+ в олиготрофных болотных экосистемах в целом [6 17] Поэтому определение полигалактуроназной активности эндофитных грибов имеет большое значение для установления их роли в переносе элементов минерального питания в том числе ионов К+ и Cs+ в системе laquoгриб-эндофит ndash растение-хозяинraquo

При изучении видового состава эндофитных грибов развивающихся во мхах кустарничках порядка Ericales и других травянистых и древесных растениях ме-зоолиготрофных и олиготрофных болот Ровенской и Житомирской областей нами copy EgraveIacute Ecircoacuteethdividearingiacuteecircicirc 2013


выявлены общие для этих растений виды грибов-эндофитов [5] Для дальнейших исследований были отобраны виды эндофитных грибов относящиеся к доминиру-ющим и часто встречающимся а для сравнения ndash штаммы соответствующих ви-дов микроскопических грибов известных как патогены растений и сапрофиты су-ществующие в почве Ceratocystis sp Mycelia sterilia (orange) Mycelia sterilia (dark green) Mycelia sterilia (dark red) Fusarium poae Penicillium funiculosum Alternaria alternata Ранее нами были изучены ферментативные активности ряда гидролаз мик-роскопических грибов отмеченных выше видов разных трофических групп [2ndash5] Целью настоящего исследования было сравнительное изучение полигалактурона-зной активности сапрофитных фитопатогенных и эндофитных штаммов микроско-пических грибов для выявления ее роли в патологическом процессе и механизмах сосуществования растений и микроскопических грибов

Материалы и методы Объектами исследований были 85 штаммов Fusarium poae (25) Alternaria alternata (30) Penicillium funiculosum (15) и Mycelia sterilia (15) из коллекции культур микроскопических грибов отдела физиологии и системати-ки микромицетов Института микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украины Сапрофиты F poae были выделены из ризосферы овса и лесных почв Киевской области фитопатогенные ndash из зерна пшеницы семян эхинацеи и стебля льна в Киевской области эндофитные ndash из разных органов растений клюквы сабельника и других болотных растений сфагновых болот Житомирской и Ровенс-кой областей в 1997ndash2007 гг (табл 1) Фитопатогенные штаммы A alternata были выделены из корней сосны зерна озимой пшеницы томатов и перца в Житомирс-кой Херсонской и Киевской областях эндофиты ndash из разных органов сфагновых и зеленых мхов эрикоидных кустарничков травянистых и древесных растений сфаг-новых болот Житомирской и Ровенской областей в 1999ndash2009 гг (табл 2) Сапро-фитные штаммы P funiculosum были выделены из черноземов Днепропетровской и Запорожской областей лесных почв Житомирской и Киевской областей садовой почвы в Херсонской области а также ризосферы ячменя в Днепропетровской эн-дофитные ndash из разных органов болотных растений в Житомирской и Ровенской об-ластях в 1999ndash2006 гг (табл 3) В работе использовали только эндофитные штаммы Mycelia sterilia (15) которые выделялись с высокой частотой встречаемости из тра-вянистых и древесных растений сфагновых болот Полесья Украины в 1999ndash2004 гг (табл 4) поскольку Mycelia sterilia из других местообитаний могли впоследствии оказаться другими видами [5]

Культуры изученных грибов предварительно выращивали на картофельно-глю-козном агаре в чашках Петри Для посева на чашки с агаризованной средой с пек-тином (5 гл) использовали инокулюм (3 х 3 мм) с края колонии Инокулированные чашки заклеивали пленкой laquoParafi lmraquo для сохранения влажности питательной сре-ды с пектином и инкубировали при 26 plusmn 2оС в течение 3 ndash 14 сут

Скорость линейного роста грибов определяли на агаризованной питательной среде с яблочным пектином Дважды в сутки измеряли диаметр грибной колонии в трех направлениях На основе полученных данных определяли радиальную ско-рость роста (Kr) по формуле [7]

Kr = R ndash Rt ndash tt o

o

где Ro minus радиус колонии в момент времени to Rt minus радиус колонии в момент tФерментативную активность определяли качественным методом [19] О полига-

лактуроназной активности судили по величине зоны просветления которую опре-деляли как разницу между средним радиусом зоны просветления среды и средним радиусом колонии гриба По этому параметру полученные данные были разделены нами на три группы активности низкая ndash le 2 мм средняя ndash 21ndash69 мм высокая ndash ge 7 мм Зоны активности полигалактуроназы фотографировали цифровой камерой Nikon MH-60 (Япония) (рис 1)


Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Excel

Рис 1 Полигалактуроназная активность изученных штаммов

микроскопических грибов А) низкая Б) высокая

Результаты Установлено что штаммы F poae отличались самой высокой ско-ростью линейного роста среди всех изученных (табл 1) В общем скорость роста эндофитных штаммов была ниже чем у фитопатогенов и почти вдвое меньше чем у сапрофитов Диапазон варьирования этого признака у фитопатогенных штаммов (0051 plusmn 0001 ndash 0227 plusmn 0032) был больше чем у эндофитных (0078 plusmn 0016 ndash 0154 plusmn 0025) и сапрофитных (0123 plusmn 0019 ndash 0231 plusmn 0043) Скорость роста штаммов F poae всех трофических групп на средах с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) кси-ланом и крахмалом была выше чем на среде с пектином однако диапазон изменчи-вости этого признака почти вдвое превышал таковой на среде с пектином особенно у фитопатогенов [2 4]

Величина скорости роста штаммов P funiculosum на среде с пектином была ниже чем штаммов F poae диапазон ее варьирования был шире у эндофитных штаммов (0080 plusmn 0012 ndash 0136 plusmn 0017) (табл 1 3)

Таблица 1

Скорость линейного роста и динамика полигалактуроназной активностиштаммов Fusarium poae разных трофических групп

Штамм Источник выделения Кr ммчас на среде с пектином

Активность (зона мм)3 сут 5 сут 7 сут

Фитопатогенные штаммы50657 Зерно пшеницы 0206 plusmn 0024 15 17 2050668 Зерно пшеницы 0170 plusmn 0022 05 08 1250673 Зерно пшеницы 0171 plusmn 0022 22 15 0850674 Зерно пшеницы 0162 plusmn 0010 17 25 2250675 Зерно пшеницы 0128 plusmn 0013 0 0 5250693 Зерно пшеницы 0051 plusmn 0001 08 07 0550694 Зерно пшеницы 0134 plusmn 0012 18 12 0850697 Семена эхинацеи 0227 plusmn 0032 12 07 1250701 Стебель льна 0171 plusmn 0029 30 53 0550704 Колос пшеницы 0118 plusmn 0023 42 40 57

Сапрофитные (почвенные) штаммы50660 Лесная почва под липой 0128 plusmn 0025 20 13 1850661 Лесная почва под липой 0131 plusmn 0007 0 10 0550699 Лесная почва под липой 0141 plusmn 0033 12 13 2250700 Лесная почва под ивой 0129 plusmn 0022 07 12 22


Продолжение табл 150702 Лесная почва 0156 plusmn 0019 09 17 5350703 Ризосфера овса 0231 plusmn 0043 05 15 1550705 Лесная почва под орешником 0123 plusmn 0019 17 18 32

Эндофитные штаммы50685 Корень клюквы 0140 plusmn 0031 08 17 2250686 Лист сабельника 0137 plusmn 0009 10 18 1550687 Стебель осоки 0078 plusmn 0016 12 22 0250688 Лист клюквы 0149 plusmn 0008 09 17 1250689 Стебель сабельника 0154 plusmn 0025 17 118 2550690 Стебель камыша 0132 plusmn 0015 12 0 050691 Лист камыша 0116 plusmn 0011 08 0 050692 Корень камыша 0152 plusmn 0017 10 38 23

Примечание приведены средние значения этого параметра в динамике роста жирным шрифтом отмечены максимальные значения

Таблица 2Скорость линейного роста и динамика полигалактуроназной активности

штаммов Alternaria alternata выделенных из разных местообитанийШтамм Источник выделения Кr ммчас на среде

с пектиномАктивность (зона мм)

3 сут 7 сут 10 сутФитопатогенные штаммы

16762 Зерно пшеницы 0036 plusmn 0006 10 38 3516765 Зерно пшеницы 0051 plusmn 0014 0 13 0316817 Корень сосны 0070 plusmn 0003 25 28 5816818 Зерно пшеницы 0134 plusmn 0011 02 07 0716819 Плоды томата 0066 plusmn 0009 0 28 2016820 Плоды томата 0031 plusmn 0009 13 12 0816827 Плоды томата 0041 plusmn 0007 03 25 2216821 Плоды перца 0087 plusmn 0008 07 07 2316822 Плоды перца 0048 plusmn 0008 15 18 016823 Плоды томата 0054 plusmn 0007 27 15 0216824 Плоды томата 0073 plusmn 0006 0 0 0

Эндофитные штаммы16796 Ветка березы 0039 plusmn 0002 03 03 016797 Стебель андромеды 0031 plusmn 0004 32 35 3016798 Стебель фиалки 0045 plusmn 0003 17 37 3316799 Хвоя сосны 0047 plusmn 0012 12 15 0216800 Лист калгана 0063 plusmn 0019 62 32 0216801 Стебель сабельника 0083 plusmn 0007 02 23 1516815 Стебель молинии 0040 plusmn 0005 33 60 5316816 Почка березы 0018 plusmn 0005 0 25 3316828 Верхушка сфагнума 0055 plusmn 0023 08 07 016829 Корень клюквы 0047 plusmn 0022 22 32 2016830 Лист андромеды 0032 plusmn 0004 10 0 0716831 Хвоя сосны 0062 plusmn 0007 28 28 0516832 Стебель пушицы 0057 plusmn 0007 03 07 016833 Лист сфагнума 0129 plusmn 0031 10 37 5716834 Стебель осоки 0079 plusmn 0021 15 25 4516835 Лист клюквы 0089 plusmn 0028 03 18 1716836 Стебель дрозеры 0045 plusmn 0007 32 68 3516837 Стебель клюквы 0045 plusmn 0004 07 55 3816838 Верхушка кукушкина льна 0041 plusmn 0006 08 22 17




сапрофитных и эндофитных штаммов Penicillium funiculosum



Сапрофитные штаммы16783 Садовая почва 0127 plusmn 0013 15 27 6319789 Чернозем 0099 plusmn 0015 20 23 2316790 Чернозем 0105 plusmn 0002 20 08 1016791 Лесная почва 0106 plusmn 0017 27 43 5316792 Чернозем 0110 plusmn 0012 25 28 1516793 Чернозем 0113 plusmn 0013 23 27 2016794 Чернозем 0116 plusmn 0011 40 25 1816825 Ризосфера ячменя 0132 plusmn 0012 22 25 1516826 Лесная почва 0125 plusmn 0011 32 40 28

Эндофитные штаммы16784 Стебель клюквы 0106 plusmn 0011 02 15 3016785 Лист пушицы 0098 plusmn 0008 07 23 1816786 Стебель пушицы 0103 plusmn 0005 05 23 1416787 Лист сабельника 0136 plusmn 0017 17 37 8316788 Стебель клюквы 0080 plusmn 0012 08 20 1716795 Лист клюквы 0098 plusmn 0014 18 23 20


Штаммы Alternaria alternata практически не отличались по скорости линейного роста от штаммов P funiculosum (табл 2 3) Следует отметить что диапазон ва-рьирования скорости линейного роста эндофитных штаммов A alternata (0018 plusmn 0005 ndash 0129 plusmn 0031) был в 2 раза больше чем фитопатогенных (0031 plusmn 0009 ndash 0134 plusmn 0011) Скорость роста штаммов A alternata на средах с КМЦ ксиланом и крахмалом была значительно выше чем на среде с пектином особенно у эндо-фитных диапазон ее изменчивости превышал таковой на среде с пектином в 17 ndash 27 раза у фитопатогенных штаммов и в 40ndash45 раза у эндофитных [2 3]

Штаммы Mycelia sterilia росли медленнее всех изученных на среде с пектином однако диапазон варьирования этого признака был самым широким (варьирование в 34ndash64 раза) (табл 1ndash4)

Таким образом скорость линейного роста на среде с пектином штаммов F poae была максимальной а штаммов Mycelia sterilia ndash минимальной В общем скорость роста эндофитных штаммов изученных видов была ниже а диапазон варьирования шире чем у фитопатогенов и сапрофитов

Для преобладающего количества исследованных фитопатогенных и сапрофит-ных (почвенных) штаммов F poae был характерен средний уровень полигалакту-роназной активности (зона просветления среды составляла 21ndash69 мм) (табл 1 рис 2) У эндофитных штаммов F poae была выявлена несколько другая законо-мерность ndash активность полигалактуроназы варьировала в более широких пределах чем у штаммов других трофических групп половина изученных штаммов проявила низкий и 375 ndash средний уровень активности Только у одного из эндофитных штаммов F poae 50689 выделенного из стебля сабельника был отмечен высокий уровень активности (зона 118 мм) (табл 1 рис 2) Для большинства сапрофитных и половины фитопатогенных штаммов F poae полигалактуроназная активность воз-растала пропорционально времени культивирования однако для большинства эндо-фитных штаммов такая зависимость не была отмечена



эндофитных штаммов Mycelia sterilia выделенных из разных органовболотных растений



Mycelia sterilia (orange)16839 Лист сабельника 0036 plusmn 0009 17 125 16716840 Лист лапчатки 0068 plusmn 0016 0 22 12016841 Стебель молинии 0026 plusmn 0002 03 22 4816842 Стебель клюквы 0088 plusmn 0020 40 15 52

Mycelia sterilia (dark green)16843 Лист андромеды 0072 plusmn 0080 0 38 1216844 Стебель андромеды 0027 plusmn 0009 0 115 9216845 Стебель клюквы 0083 plusmn 0009 0 25 1816846 Корень вербейника 0079 plusmn 0011 58 50 1016847 Стебель осоки 0070 plusmn 0014 80 150 2716848 Верхушка сфагнума 0013 plusmn 0001 07 03 80

Mycelia sterilia (dark red)16849 Корень клюквы 0047 plusmn 0006 17 63 9816850 Стебель клюквы 0019 plusmn 0002 123 165 8516851 Корень березы 0035 plusmn 0008 98 07 10516852 Лист осоки 0056 plusmn 0006 0 23 0516853 Лист клюквы 0086 plusmn 0008 0 15 22


Рис 2 Полигалактуроназная активность изученных микроскопических грибов разных трофических групп

Большинство изученных фитопатогенных и эндофитных штаммов A alternata как и штаммы F poae проявляли среднюю полигалактуроназную активность (табл 2 рис 2) У 545 фитопатогенных штаммов отмечена средняя полигалактуроназная активность у 364 ndash низкая а у штамма 16824 выделенного из плодов томатов она вообще не была отмечена Большинство эндофитных штаммов (684 ) также имели среднюю полигалактуроназную активность а 316 ndash низкую У половины


фитопатогенных штаммов A alternata она увеличивалась в зависимости от времени культивирования однако у большинства эндофитных штаммов ndash не зависела от вре-мени культивирования

У штаммов P funiculosum в целом зарегистрирована более высокая полигалак-туроназная активность чем у штаммов A alternata и F poae Для всех почвенных сапрофитов этого вида был характерен средний уровень активности эндофиты P funiculosum оказались более активными ndash наряду со средним уровнем у штамма P funiculosum 16787 выделенного из листьев сабельника отмечали высокой уровень активности (табл 3 рис 2) Только у трети изученных сапрофитных и эндофитных штаммов P funiculosum полигалактуроназная активность возрастала с увеличением времени культивирования

Изученные эндофитные штаммы Mycelia sterilia (orange) Mycelia sterilia (dark green) и Mycelia sterilia (dark red) проявили максимальную среди всех изученных штаммов полигалактуроназную активность примерно половина штаммов прояви-ла средний а другая ndash высокий уровень полигалактуроназной активности (табл 4 рис 2) Только у штаммов Mycelia sterilia (orange) ферментативная активность за-висела от времени культивирования а для штаммов Mycelia sterilia (dark green) и Mycelia sterilia (dark red) такая зависимость не обнаружена

Установлено что полигалактуроназная активность изученных штаммов Mycelia sterilia и P funiculosum в общем была значительно выше чем у штаммов A alternata и F poae (табл 1 ndash 4) У 84 из 85 изученных штаммов было отмечено наличие поли-галактуроназной активности большинство штаммов всех видов проявили средний ее уровень Следует подчеркнуть что высокая активность отмечена только у десяти эндофитных штаммов ndash F poae 50689 P funiculosum 16787 и 8 штаммов Mycelia sterilia (табл 1 3 4 рис 2) Не установлено четкой зависимости уровня полига-лактуроназной активности изученных микроскопических грибов от скорости их ли-нейного роста времени культивирования а также вида и органа растения-хозяина (табл 1ndash4)

Обсуждение Как правило первый контакт патогенов с растениями-хозяевами происходит на поверхности растений Проникновению возбудителей в паренхима-тозные ткани способствует разрушение внутренних слоев клеточных стенок состо-ящих из целлюлозы пектина гемицеллюлозы и структурных белков а также сре-динной пластинки которая состоит в основном из пектиновых веществ Гидролиз каждого из этих веществ зачастую обусловлен действием комплекса секретируемых патогеном ферментов [8 12 20 21 23]

Расщепляющие пектин ферменты в основном продуцируют грибы и бакте-рии Среди них следует отметить микроскопические грибы родов Mucor Rhizopus Aspergillus Penicillium Fusarium Alternaria и др [8 9 15 18 21 23]

Грибы синтезирующие пектолитические ферменты минерализуют раститель-ные остатки те способствуют круговороту органических веществ в природе Для почвенных сапрофитов принимающих участие в почвообразующих процессах ха-рактерно наличие полигалактуроназной активности [1 8 20]

Результатом расщепления пектиновых веществ удерживающих вместе расти-тельные клетки является их разжижение и соответственно ослабление клеточной стенки Это приводит к мацерации растительных тканей те нарушению их целос-тности и разделению на отдельные клетки Ослабление клеточных стенок и маце-рация тканей несомненно способствуют проникновению патогена в клетки тканей растений Пектолитические ферменты обеспечивают патогенов источниками пита-ния внутри инфицированных тканей Вследствие образованных ними остатков рас-тительных полимеров они могут быть вовлечены в индукцию процесса закупорки сосудов при вилте Существует мнение что отмирание клеток растения является результатом ослабления первичной клеточной стенки под действием пектолитичес-ких ферментов в результате чего она не может поддерживать осмотически хрупкий протопласт и предотвращать его разрушение [8 12]


Известно что пектолитические ферменты участвуют в возникновении многих грибных и бактериальных заболеваний растений Патогены продуцируют комплек-сы пектиназ и их изоферментов [8 12] Так при черной гнили канталупы (мускус-ной дыни) вызванной грибом Didymella bryoniae наблюдается корреляция между величиной участков гниющей ткани растения и общей полигалактуроназной актив-ностью гриба [8 23]

После короткого периода биотрофного роста возбудитель антракноза Colletotrichum lindemuthianum развивается в клетках листьев вызывая серьезные изменения клеточной стенки и гибель протопластов Базовый уровень эндополи-галактуроназы увеличивается в несколько раз при распространении гриба в тканях растения-хозяина Фермент вызывает интенсивное разложение пектиновых веществ первичной клеточной стенки и матрикса срединной пластинки с высвобождением пектиновых фрагментов и их накоплением в межклеточных пространствах и агре-гированной цитоплазме инфицированных клеток хозяина [9 15]

При некоторых антракнозах вызванных видами рода Colletotrichum гриб про-дуцирует пектинлиазу являющуюся ключевым фактором вирулентности в развитии заболевания [21] Некоторые пектинразрушающие ферменты способны влиять на вирулентность патогенов у разных растений-хозяев те на степень специализации патогена Пектинразрушающие ферменты продуцируются прорастающими спорами и вероятно действуя в комплексе с другими гидролазами фитопатогенов способс-твуют проникновению в растение-хозяин [8 12 15 20]

При заражении корней пшеницы грибом Gaeumannomyces graminis var tritici продуцируются эндополигалактуроназа и β-глюкозидаза [14] При изучении обра-зования целлюлозолитических и пектолитических ферментов разными видами рода Fusarium в связи с их патогенностью для проростков кукурузы установлено что степень патогенности грибов зависит не от целлюлазной а именно от полигалакту-роназной активности возбудителя [18]

Активность пектинразрушающих ферментов грибов обнаруживали в экстрактах из здоровых яблок и яблок пораженных различными гнилями При гнилях вызван-ных Sclerotinia fructigena и Botrytis cinerea активность полигалактуроназы была низкой или вообще отсутствовала а при поражении P expansum активность этого фермента была очень высокой Экстракты из каждого вида гнилей обладали очень высокой пектинэстеразной активностью и содержали галактуроновую кислоту при этом ни в одном из них не выявлена целлюлазная активность [11]

Пектиназы Verticillium albo-atrum в частности эндопектинлиазы являются фак-торами вирулентности гриба но не определяют его патогенность поскольку коло-низация растений-хозяев может продолжаться и в отсутствие этих ферментов [15]

Таким образом расщепляющие пектин ферменты фитопатогенных микроорга-низмов относят к числу патогенных факторов однако четкой зависимости между активностью образования пектиназ и вирулентностью фитопатогенов не установ-лено [8 20]

Для олиготрофных сфагновых болот особое значение имеет полигалактурона-за эндофитных грибов расщепляющая полигалактуроновые соединения сфагно-вых мхов Именно с этими химическими соединениями у сфагновых мхов связана большая часть минеральных элементов в том числе К+ и 137Cs+ которые становятся доступными для сосудистых растений благодаря действию полигалактуроназы эн-дофитных микромицетов [22] В клеточных оболочках сфагновых мхов происходит ионизация слабой кислотной обменной связи полигалактуроната что обусловливает специфическую избирательность связывания одновалентных катионов [13] Высо-кую ионообменную способность сфагнумов определяет именно ионизация цепочек полигалактуроната [22] что имеет принципиально важное значение для обмена и миграции К+ и 137Cs+ у представителей биоты олиготрофных болотных экосистем в целом [6 17] Поэтому важное значение для установления роли эндофитных грибов в переносе элементов минерального питания в том числе ионов К+ и 137Cs+ в сис-теме laquoгриб-эндофит ndash растение-хозяинraquo имеет изучение их полигалактуроназной активности


Нами установлено что в целом полигалактуроназная активность изученных штаммов Mycelia sterilia и P funiculosum была значительно выше чем у штаммов A alternata и F poae Большинство штаммов изученных видов проявили средний уровень полигалактуроназной активности Высокая активность была характерна только для эндофитных штаммов Наличие полигалактуроназы у доминирующих и часто встречающихся видов эндофитных грибов болотных растений Полесья Ук-раины свидетельствует о том что эндофитные микроскопические грибы играют су-щественную роль в гидролизе пектиновых веществ растительных тканей а также миграции минеральных элементов в болотных экосистемах

ІМ Курченко

Інститут мікробіології і вірусології ім ДК Заболотного НАН України КиївПОЛІГАЛАКТУРОНАЗНА АКТИВНІСТЬ МІКРОСКОПІЧНИХ ГРИБІВ

РІЗНИХ ТРОФІЧНИХ ГРУП

Р е з ю м еПроведено порівняльне вивчення полігалактуроназної активності 85 сапрофітних фіто-

патогенних та ендофітних штамів Fusarium poae Alternaria alternata Penicillium funiculosum і Mycelia sterilia Встановлено що загалом ферментативна активність штамів Mycelia sterilia і P funiculosum була значно вищою ніж штамів A alternata та F poae Більшість вивчених штамів проявляли середній рівень полігалактуроназної активності Висока активність була характерною лише для ендофітних штамів F poae P funiculosum і Mycelia sterilia Не вста-новлено чіткої залежності рівня полігалактуроназної активності вивчених штамів від швид-кості лінійного росту терміну культивування а також виду й органу рослини-хазяїна з яких вони були виділені Наявність полігалактуронази у домінуючих видів та видів що часто зус-трічаються ендофітних грибів болотних рослин Полісся України свідчить про те що ендо-фітні мікроскопічні гриби відіграють суттєву роль в гідролізі пектинових речовин рослинних тканин а також міграції мінеральних елементів в болотних екосистемах

Ключові слова мікроскопічні гриби фітопатогени сапрофіти ендофіти полігалакту-роназна активність

IN Kurchenko

Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences of Ukraine KyivPOLYGALACTURONASE ACTIVITY OF MICROSCOPIC FUNGI OF

DIFFERENT TROPHIC GROUPS

S u m m a r yA comparative study of polygalacturonase activity of 85 saprophytic plant pathogenic and

endophytic strains of Fusarium poae Alternaria alternata Penicillium funiculosum and Mycelia sterilia was conducted It was established that in general polygalacturonase activity of Mycelia sterilia and P funiculosum strains was signifi cantly higher than that of A alternata and F poae strains The majority of the studied strains showed a middle level of polygalacturonase activity High activity was characteristic of only endophytic F poae P funiculosum and Mycelia sterilia strains The dependence of polygalacturonase activity of the studied strains on their rate of linear growth cultivation time as well as species and organs of host plants which they were isolated from was not established The polygalacturonase presence in the dominant and common species of endophytic fungi of the bog plants of Ukrainian Polesie suggests that endophytic microscopic fungi play an important role in the hydrolysis of pectic substances of plant tissues as well as in migration of mineral elements in wetland ecosystems

The paper is presented in RussianK e y w o r d s microscopic fungi plant pathogens saprophytes endophytes polygalacturonase

activityT h e a u t h o rs a d d r e s s IN Kurchenko Institute of Microbiology and Virology National

Academy of Sciences of Ukraine 154 Acad Zabolotny St Kyiv MSP D 03680 Ukraine


Дьяков ЮТ1 Грибы и их значение в жизни природы и человека Соросовский образователь-ный журнал ndash 1997 ndash 3 ndash С 38ndash45Курченко ИН2 Амилолитическая активность видов Fusarium Lk Fr и Alternaria Nees Fr Мікробіол журн ndash 2012 ndash 74 3 ndash С 36ndash43Курченко ІМ Соколова ОВ Жданова НМ Яринчин АМ Йовенко ОМ 3 Порівняльне вив-чення целюлазної та ксиланазної активностей у фітопатогенних та ендофітних штамів гри-бів Alternaria alternata (Fr) Keissler Там само ndash 2008 а ndash 70 4 ndash С 25ndash30Курченко ІМ Соколова ОВ Жданова НМ Яринчин АМ Йовенко ОМ4 Целюлазна та ксила-назна активності грибів роду Fusarium Lk Fr що належать до різних трофічних груп Там само ndash 2008 б ndash 70 5 ndash С 27ndash35Курченко ИН Соколова ЕВ Орлов АА Жданова НН5 Эндофитные микромицеты высших растений и их экологическая роль в круговороте 137Cs в биогеоценозах сфагновых болот Ук-раинского Полесья Прикладная радиоэкология леса Под ред ВП Краснова ndash Житомир 2007 ndash С 359ndash412Орлов ОО Долін ВВ 6 Біогеохімія цезію-137 у лісоболотних екосистемах Українського Полісся За ред акад НАН України ЕВ Соботовича ndash К Наук думка 2010 ndash 198 сПерт С Дж7 Основы культивирования микроорганизмов и клеток ndash М Мир 1978 ndash 331 сAgrios8 GN Plant Pathology ndash New York Academic Press 2005 ndash 922 pBenhamou N Lafi tte C Barthe JP Esquerreacute-Tugayeacute MT 9 Cell surface interactions between bean leaf cells and Colletotrichum lindemuthianum Cytochemical aspects of pectin breakdown and fungal endopolygalacturonase accumulation Plant Physiol ndash 1991 ndash 97 N 1 ndash Р 234ndash244Cairney JWG Burke RM10 Extracellular enzyme activities of the ericoid mycorrhizal endophyte Hymenoscyphus ericae (Read) Korf et Kernan their likely roles in decomposition of dead plant tissue in soil Plant and soil ndash 1998 ndash 205 N 1 ndash P 181ndash192Cole M Wood RKS11 Pectic enzymes and phenolic substances in apples rotted by fungi Annals of Botany ndash 1961 ndash 25 N 4 ndash P 435ndash452Collmer A Keen NT 12 The role of pectic enzymes in plant pathogenesis Annu Rev Phytopathol ndash 1986 ndash 24 ndash P 383ndash409Dainty J Richter C13 Ion behavior in Sphagnum cell walls Advances in Bryology ndash Vol 5 ndash Biology of Sphagnum ndash BerlinndashStuttgart 1993 ndash P 107ndash 127Dori S Solel Z Barash I14 Cell-wall-degrading enzymes associated with take-all disease of wheat 14th Congr Isr Phytopathol Soc Bet Dagan Febr 15ndash16 1993 Phytoparasitica ndash 1993 ndash 21 N 2 ndash C 143Durrands PK Cooper RM 15 The role of pectinases in vascular wilt disease as determined by defi ned mutants of Verticillium albo-atrum Physiol Mol Plant Pathol ndash 1988 ndash 32 N 3 ndash Р 363ndash371Fogarty WM Ward O P 16 Pectic substances and pectolytic enzymes Process Biochem ndash 1972 ndash 7 N 8 ndash P 13ndash17Malmer N17 Mineral nutrients in vegetation and surface layers of Sphagnum dominated peat-forming systems Advances in Bryology ndash V 5 ndash Biology of Sphagnum ndash Berlin-Stuttgart J Kramer 1993 ndash P 223ndash248Manka M18 Cellulolytic and pectolytic activity of Fusarium isolates pathogenic to corn seedlings Acta microbiol pol ndash 1981 ndash 30 N 1 ndash P 25ndash32Molitoris HP Schaumann K19 Physiology of marine fungi A screening program for marine fungi The Biology of Marine Fungi Eds Moss ST ndash Cambridge Cambrige University Press 1986 ndash P 35ndash47Petrini O Ouellette GB20 Host Wall Alterations by Parasitic Fungi ndash St Paul Minnesota United States APS Press 1994 ndash 160 pPrusky D McEvoy JL Leverentz B Conway WS21 Local modulation of host pH by Colletotrichum species as a mechanism to increase virulence Mol Plant-Microbe Interact ndash 2001 ndash 14 N 9 ndash P 1105ndash1113Richter C Dainty J22 Ion behavior in Sphagnum cell walls ndash IV Selective cation binding by Sphagnum russowii cell walls Canadian Journal of Botany ndash 1990 ndash 68 N 4 ndash P 773ndash781Zhang JX Bruton BD23 Relationship of developmental stage of cantaloupe fruit to black rot susceptibility and enzyme production by Didymella bryoniae Plant Disease ndash 1999 ndash 83 N 11 ndash P 1025ndash1032



УДК 615330154861207ЛН Чуркина ЛВ Авдеева СИ Войчук ЛВ Ярошенко


ИЗМЕНЧИВОСТЬ СВОЙСТВ PSEUDOMONAS BATUMICI 1720

ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯИзучена изменчивость свойств и антибиотической активности а также выживае-

мость клеток Pseudomonas batumici 1720 ndash продуцента батумина (антистафилококково-го антибиотика) после длительного хранения под слоем вазелинового масла Исследованы основные культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства мутант-ного штамма Показано что хранение под вазелиновым маслом позволяет сохранить вы-сокий уровень антибиотической активности синтез батумина продуцентом составлял 150 мгл При этом происходит снижение выживаемости клеток на два порядка через 5 лет хранения Сформулированы условия поддержания штамма

Ключевые слова Pseudomonas batumici хранение антибиотическая активность жизнеспособность

Антибиотик батумин был выделен из штамма почвенных бактерий Pseudomonas batumici в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины [6] Недостатком природного штамма-продуцента был низкий уровень биосинтеза антибиотика (20-25 мгл) Для промышленного производства необходимо увеличение уровня биосин-теза антибиотика Комбинированным мутагенезом (УФ облучением и нитрозогуа-нидином) был получен мутантный штамм Pseudomonas batumici 17 c повышенной биосинтетической активностью [3] Этот штамм использовался для наработки ба-тумина в условиях полупромышленного производства Одним из условий успеш-ного поддержания биосинтетической активности и жизнеспособности продуцентов антибиотиков является подбор методов хранения способствующих сохранению всех свойств штаммов В коллекциях культур микроорганизмов исходные свойства штаммов поддерживаются преимущественно путем субкультивирования хранения под слоем вазелинового масла в лиофильно высушенном состоянии при низких и ультранизких температурах [2] Тем не менее известно что даже при содержании микроорганизмов в анабиотическом состоянии не удается достичь полной стабили-зации свойств культур Это объясняется влиянием факторов окружающей среды на биологические структуры клеток в период хранения в результате чего происходит изменение физиолого-биохимических особенностей продуцентов обусловленное возникновением диссоциантов и биосинтетической активностью Поэтому целью настоящего исследования было изучение таксономических признаков жизнеспособ-ности и антибиотической активности мутантного штамма Pseudomonas batumici 17 при длительном хранении под слоем вазелинового масла

Материалы и методы Объекты исследования Использовали высокоактив-ный вариант Pseudomonas batumici 1720 который был выделен нами при рассе-ве мутантного штамма Pseudomonas batumici 17 Пробирки с 5-7 мл полужидкого МПА (МПА содержащий 05 агара) инокулировали культурой Pseudomonas batumici 1720 инкубировали 48 час при 26 0C далее наслаивали в каждую про-бирку 2-3 мл стерильного вазелинового масла после чего хранили при комнатной температуре 5 лет Контролем служил исходный штамм P batumici УКМ В-303 У штаммов 1720 и УКМ В-303 изучали морфологические и культуральные свойства наличие оксидазы (окисление диметилпарафенилендиамина) [7] способность ис-пользовать различные органические соединения в качестве единственного источни-ка углерода на агаризованной среде Козера [8] Содержание источников углерода в среде составляло 01

Электронная микроскопия Клетки отмывали от остатков питательной среды трижды центрифугированием (5000g 5 мин) и ресуспендировали в 01М фосфатном copy EumlIacute timesoacuteethecircegraveiacuteagrave EumlAcirc Agraveacircaumlaringaringacircagrave NtildeEgrave Acircicirceacutedivideoacuteecirc EumlAcirc szligethicircoslasharingiacuteecircicirc 2013


буфере Соренсона (рН 72) Полученную суспензию наносили на медные сеточки покрытые формварной пленкой и через 10 мин излишки суспензии убирали фильтро-вальной бумагой Сеточки трижды промывали водой и просушивали при комнатной температуре Образцы анализировали методом трансмиссионной электронной микро-скопии с помощью микроскопа JEM-1400 (Jeol Япония) при напряжении 80 кВ [5]

Определение чувствительности к широкому спектру антибиотиков исходного и мутантного штаммов Pseudomonas batumici проверяли диск-диффузионным мето-дом Керби-Бауэра [9]

Жизнеспособность клеток после 2-х и 5-ти лет хранения а также до хранения определяли методом подсчета колоний при рассеве на МПА

Для изучения изменчивости антибиотической активности бактерии Pseudomonas batumici 1720 инокулировали в синтетическую среду [3] и культивировали на ка-чалке (220 обмин) в пробирках при температуре 25 0С (72 ч) Активность клонов P batumici по синтезу батумина проверяли методом диффузии в агар используя в качестве тест-культуры высокочувствительный к батумину штамм Staphylococcus aureus 209Р (УКМ В-918 АТСС 6538Р) В зависимости от диаметра зоны задержки роста стафилококков клоны P batumici условно разделяли на малоактивные (МА) ndash зона 5-20 мм активные (А) ndash 20-30 мм с повышенной активностью (ПА) ndash 30-40 мм высокоактивные (ВА) ndash 40-60 мм

Концентрацию антибиотика в культуральной жидкости определяли количест-венно спектрофотометрическим методом [4]

Результаты и обсуждение Сравнительное изучение морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств мутантного штамма Pseudomonas batumici 1720 и исходного штамма P batumici В-303 показало что оба штамма на МПА об-разуют круглые прозрачные колонии клетки ndash грамотрицательные палочки имеют от 1 до 5 жгутиков оксидазоположительные строгие аэробы используют глюкозу только по окислительному пути Изученные штаммы P batumici не образовывали поли-β-оксимасляную кислоту

Электронно-микроскопические исследования показали что размер клеток му-тантного штамма больше чем исходного и составляет для Pseudomonas batumici 1720 ndash 39 times 10 plusmn 02 мкм для исходного штамма P batumici В-303 ndash 30 times 09 мкм (рис 1)

a b

Рис 1 Электронная микроскопия мутантного штамма Pseudomonas batumici 1720 (a) и исходного laquoдикого штаммаraquo P batumici В-303 (b)

При первичном описании штамма-продуцента батумина ndash нового антистафило-коккового антибиотика [1] было показано наличие пигмента феназиновой группы ndash феназин-1-карбоновой кислоты У мутантного штамма P batumici 17 с повышенной биосинтетической активностью отсутствовала способность пигментообразования

На синтетической среде Козера оба штамма (1720 и В-303) в качестве единс-твенного источника углерода использовали органические соединения разнообраз-ного химического строения в том числе углеводы (d-глюкозу l-арабинозу d-ман-нозу d-галактозу d-фруктозу) органические кислоты среди них метаболиты цикла


Кребса (янтарную малоновую α-кетоглютаровую аконитовую яблочную) поли-спирты и гликоли (маннит инозит глицерин) аминокислоты (α-аланин изолейцын валин орнитин цитруллин пролин гистидин) азотистые соединения (саркозин) В отличие от дикого штамма мутантный штамм Pseudomonas batumici 1720 в про-цессе длительного хранения утратил способность усваивать фумарат никотиновую кислоту бензоат Na капрат как единственные источники углерода

Мутантный штамм как и исходный после хранения под слоем вазелиново-го масла остался чувствительным к таким аминогликозидным антибиотикам как стрептомицин канамицин неомицин тетрациклин и резистентным к антибиотикам пенициллинового ряда ndash бензилпенициллин ампициллин ристомицин а также к рифампицину линкомицину полимиксину (табл)

ТаблицаЧувствительность к антибиотикам исходного и мутантного штаммов

Pseudomonas batumici

Штаммы

P b

atum

ici

бензилпени

циллин

ампи

циллин

оксаци

ллин

карбениц

иллин

стрептом

ицин

канамиц

ин

неом

ицин

моном

ицин

гентам

ицин

тетрацик

лин

левомиц

етин

эритромиц

ин

олеандом

ицин

ристом

ицин

рифам

пици

н

линком

ицин

полимиксин

Зоны задержки роста мм В-303 10 8 6 6 28 30 28 27 30 30 30 15 6 6 15 6 617 13 10 6 6 28 30 25 28 30 30 32 20 6 6 12 6 6

Поскольку стабильность уровня синтеза антибиотиков имеет важное практи-ческое значение нами была проведена работа по изучению изменчивости клонов штамма-продуцента батумина при его хранении на полужидком МПА под слоем вазелинового масла

Ранее нами было показано что популяция мутантного штамма P batumici 17 имеет следующее распределение клонов по степени антибиотической активности МА ndash 31plusmn21 А ndash 93plusmn25 ПА ndash443plusmn14 ВАndash 433plusmn28 [3] Для изучения дальнейшей возможности хранения продуцента батумина под слоем вазелинового масла нами при многократных рассевах мутантного штамма P batumici 17 был выде-лен высокоактивный вариант P batumici 1720 В популяции этого варианта отсутс-твовали малоактивные и активные клоны а доминировали клоны с повышенной ак-тивностью (308plusmn31 ) и высокоактивные (692plusmn34 ) Такое соотношение клонов в популяции обеспечивало синтез батумина на уровне 170 мгл Через год хранения наблюдалась аналогичная картина Использованный метод хранения на этом этапе не влиял на стабильность синтеза антибиотика Однако через 24 месяца проявилась тенденция к незначительному уменьшению удельного веса высокоактивных клеток Наблюдалось расщепление клеток в популяции по антибиотической активности у 671plusmn21 клонов сохранялась способность задержки роста тест-культуры до 50-60 мм (диаметр зоны) у 329 plusmn19 клонов ndash до 35-40 мм После 60 месяцев хране-ния проверка клонов P batumici 1720 показала неодинаковый уровень биосинтеза антибиотика отдельными клетками В популяции по-прежнему доминировали вы-сокоактивные (649plusmn31 ) клоны хотя тенденция к уменьшению их удельного веса очевидна Клоны с повышенной активностью составляли 351plusmn24 (рис 2)

Таким образом уровень антибиотической активности P batumici 1720 незначи-тельно изменился после 5-ти лет хранения под слоем вазелинового масла Синтез батумина продуцентом составлял 150 мгл Поэтому данный метод может быть ис-пользован для сохранения уровня активности продуцента батумина P batumici


0

10

20

30

40

50

60

70

12 24 60

Рис 2 Изменчивость степени активности клонов P batumici 1720 после различных сроков хранения под слоем вазелинового масла

Результаты исследований позволяют сформулировать условия поддержания штамма при долгосрочном хранении под слоем вазелинового масла высокоактив-ного варианта P batumici 1720 следует использовать полужидкий МПА а посевной материал готовить только из предварительно отобранных высокоактивных колоний с диаметром зоны задержки роста тест-культур 60 мм

Следующим этапом нашей работы было определение жизнеспособности клеток P batumici 1720 при хранении под слоем вазелинового масла После 12 месяцев хранения наблюдалась тенденция к снижению количества жизнеспособных клеток Так через 24 месяца количество жизнеспособных клеток снизилось на один поря-док после 60 месяцев ndash на два порядка (рис 3) но даже при таком показателе в полужидком МПА присутствуют не менее (21plusmn02)middot107 клетокмл

12 24 60

Рис 3 Количество жизнеспособных клеток P batumici 1720 (в к начальному количеству) после различных сроков хранения под слоем

вазелинового масла

Таким образом уровень антибиотической активности высокоактивного варианта P batumici 1720 практически не изменился после 5 лет хранения под слоем вазе-линового масла при этом число жизнеспособных клеток в популяции снизилось на два порядка Этот метод является благоприятным для поддержания активности штамма-продуцента батумина


ЛМ Чуркіна ЛВ Авдеєва СІ Войчук ЛВ Ярошенко

Інститут мікробіології і вірусології ім ДК Заболотного НАН України КиївМІНЛИВІСТЬ ВЛАСТИВОСТЕЙ

PSEUDOMONAS BATUMICI 1720 ПІСЛЯ ТРИВАЛОГО ЗБЕРІГАННЯ Р е з ю м е

Вивчена мінливість властивостей і антибіотичної активності а також виживання клітин Pseudomonas batumici 1720 ndash продуцента батуміну (антистафілококового антибіотика) після тривалого зберігання під шаром вазелінової оливи Досліджені основні культурально-мор-фологічні і фізіолого-біохімічні властивості мутантного штаму Показано що зберігання під вазеліновою оливою дозволяє зберегти високий рівень антибіотичної активності синтез ба-туміну продуцентом складав 150 мгл При цьому через 5 років зберігання відбувається зни-ження виживання клітин на два порядки Сформульовані умови підтримки штаму

Ключові слова Pseudomonas batumici зберігання антибіотична активність життєздат-ність

LN Churkina LV Avdeeva S I Voychuk LV Yaroshenko

Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine KyivPSEUDOMONAS BATUMICI 1720 PROPERTIES VARIABILITY AFTER

LONG-TERM STORAGES u m m a r y

Variability of properties and antibiotic activity as well as cells survival of Pseudomonas batumici 1720 ndash the producer of batumin (antistaphylococcal antibiotic) after long-term storage under vaseline oil layer have been studied The main culture-morphological and physiological biochemical properties of the mutant strain have been investigated It has been shown that storage under vaseline oil allows to preserve high level of antibiotic activity batumin synthesis by the producer was 150 mgl Therewith the survival of cells decreases by two orders during 5 years of storage The conditions of strain maintenance have been formulated

The paper is presented in RussianK e y w o r d s Pseudomonas batumici storage antibiotic activity variabilityT h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Churkina LN Zabolotny Institute of Microbiology and

Virology National Academy of Sciences of Ukraine154 Acad Zabolotny St Kyiv MSP D 03680 Ukraine

1 Кіпріанова ОА Бойко ОІ Рабінович АС Айзенман БЮ Комплекс антибіотичних речовин утворюваних Pseudomonas species Мікробіол журн ndash 1974 ndash 36 6 ndash С 781ndash783

2 Сидякина ТМ Консервация микроорганизмов в коллекциях культур Методы Проблемы Пер-спективы ndash Пущино 1991 ndash С 81ndash159

3 Смирнов ВВ Чуркина ЛН Перепныхатка В И Муквич НС Гарагуля АД Киприанова ЕА Кравец АН Довженко СА Получение высокоактивного штамма-продуцента антиста-филококкового антибиотика батумина Прикладная биохимия и микробиология ndash 2000 ndash 36 1 ndash С 55ndash58

4 Чуркина ЛН Кравец АН Клочко ВВ Влияние индуцирующих и селективных агентов на биосинтез нового антистафилококкового антибиотика батумина Биополимеры и клетка ndash 2007 ndash 23 2 ndash C 108ndash114

5 Bozzola JJ Conventional Specimen Preparation Techniques for Transmission Electron Microscopy of Cultured Cells Electron Microscopy Methods and Protocols 2nd ed Ed by John Kuo ndash 2007 ndash P 1ndash18

6 Esipov SE Kiprianova EA Batumin a novel antibiotic produced by Pseudomonas batumici nov sp 3187 5th Int Conf on Chemical Synthesis of Antibiotics and Related Microbial Products ndash Hungarian Acad Sci Budapest 1996 ndash Abstr ndash P 14

7 Kovacz N Identifi cation of P piocianea by the oxidase reaction Nature ndash 1956 ndash N 178 ndash P703

8 Stanier R Palleroni N Doudoroff M The aerobic Pseudomonas a taxonomic study J Gen Microbiol ndash 1966 ndash 43 N 2 ndash P 159ndash271

9 Vandepitte J Engback K Piot P Heuck CC Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии Пер с англ ndash М Медицина 1994



УДК 57961 57052 61201712ПП Брехлічук ВО Петров ВВ Баті ОБ Левчук НВ Бойко

Ужгородський національний університет Українавул Підгірна 46 Ужгород 88000

БІОЛОГІЧНА ДЕКОНТАМІНАЦІЯ ВІДБИТКІВ ВИГОТОВЛЕНИХ ІЗ РІЗНИХ СТОМАТОЛОГІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Досліджено мікробну контамінацію відбитків виготовлених із альгінатного (Упін) і силіконового (Спідекс) матеріалів без і з додаванням коригуючої маси в експериментах на добровольцях Показано що найбільш здатними до виживання на поверхні відбитків є бак-терії родів Streptococcus і Staphylococcus кількість яких залежала від матеріалу використа-ного для їх отримання Серед ізольованих мікроорганізмів переважали штами стійкі до дії антибіотиків Бактеріальні препарати на основі бацил ndash біоспорин і субалін а також деякі екстракти їстівних рослин фруктів і ягід можуть бути використані для деконтамінації відбитків отриманих із різного стоматологічного матеріалу

Ключові слова відбитковий матеріал мікробна контамінація бактеріальні препарати екстракти їстівних рослин фруктів і ягід

Актуальною задачею стоматологічної практики є ефективний мікробіологічний контроль спрямований на зменшення ризиків передачі збудників вірусних бак-теріальних і грибкових інфекцій [7 9] Згідно з літературними даними вміст мік-роорганізмів у слині коливається від 105 до 1010 КУОмл причому близько 50 цієї кількості представлена патогенною і умовно-патогенною мікробіотою Відбитки як і зубні протези можуть бути джерелом інфекції для стоматологів медичних сес-тер зубних техніків [1] Основні труднощі в знезараженні відбитків повrsquoязані з тим що застосовувані способи і засоби дезінфекції повинні володіти високою протимік-робною активністю і водночас не впливати на властивості матеріалу з якого вони виготовлені Нараховується не більше десятка активнодіючих речовин що входять до складу сучасних засобів дезінфекції Найчастіше в стоматології застосовуються хлорактивні засоби органічної і неорганічної природи похідні глутарового альдегі-ду фенолу йодофори сполуки надоцтової кислоти формальдегід тощо Найбільш досконалою формою хлорактивних засобів яка дозволяє зменшити токсичний вплив хлору на людину в момент готування робочих розчинів є таблетки Хлореффект (Росія) Хлорсепт (Ірландія) Пюржавель (Росія) Жавель солід (Франція) Пресепт (США) а також хлорактивні засоби у вигляді композицій у комплексі з поверхнево-активними речовинами ndash Спорокс Доместос (Росія) Клорілли (Франція) Речовини з групи четвертинних амонієвих сполук використовуються в стоматології у поєднан-ні з альдегідами і є ефективними щодо більшості бактерій і вірусів однак не діють на збудники туберкульозу і спорові мікроорганізми [5] Інші препарати ndash Бланізол Лізоформін-спеціаль Аеродезин 2000 Хоспізент-спрей характеризуються широким спектром антимікробних властивостей однак їхній вплив на структуру відбитку є недостатньо вивченим [8]

Раніше нами доведено задовільну протимікробну ефективність Сіласепту [3] і відсутність негативного впливу на матеріал відбитків ldquoSpeedexrdquo (Швейцарія) ldquoBisicordquo (Німеччина) Exa ldquolencerdquo PUTTI і GC (Японія) за умови їх 30 і 60 хвилинної експозиції у 10 і 20 розчині дезінфектанту (рlt005) [2]

Метою даної роботи було визначення рівнів мікробної контамінації відбитків отриманих із альгінатного і силіконового стоматологічного матеріалу видового складу і антибіотикорезистентності мікроорганізмів виділених із поверхні відбит-ків а також антимікробних властивостей аеробних спороутворюючих бактерій що входять до складу пробіотичних препаратів субаліну і біоспорину і деяких рослин-них екстрактів щодо мікроорганізмів домінуючих на поверхні відбитківcopy IumlIuml Aacuteetharingotildeeumlsup3divideoacuteecirc AcircIcirc Iumlaringograveethicircacirc AcircAcirc Aacuteagraveogravesup3 IcircAacute Eumlaringacircdivideoacuteecirc IacuteAcirc Aacuteicirceacuteecircicirc 2013


Матеріали і методи Контамінацію виготовлених відбитків зубів після 5 хв екс-позиції у ротовій порожнині відносно здорових осіб (20 у кожній групі) досліджува-ли шляхом висіву змивів з їх поверхонь на хромогенні поживні середовища (Bio-Rad США) Для експрес діагностики золотистих стафілококів використовували латексні моноклональні сироватки Pastorex reg Staph-Plus для групової ідентифікації різних видів стрептококів та ентерококів ndash Pastorex reg Strept латекс тест

Остаточну видову належність ізолятів визначали за допомогою біохімічних напівавтоматичних тест-систем API (Biomerieux Франція) ENTERO і ANAERO (Lachema Чеська Республіка)

Для домінуючих за чисельністю ізолятів встановлювали чутливість до ванкомі-цину амоксициліну цефтріаксону оксациліну гентаміцину цефотаксиму еритро-міцину ципрофлоксацину офлоксацину рифампіцину ампіциліну цефуроксиму амікацину тетрацикліну цефтазидіму цефокситиму меропенему диско-дифузій-ним методом за Бауер-Кірбі [10] Наявність бета-лактамаз розширеного спектру дії (БЛРС) у ентеробактерій виявляли за допомогою ESBL-тесту [12]

Антимікробні властивості біопрепаратів на основі бацил (біоспорину і субалі-ну) вивчали методом одночасної обробки відбитків суспензією їх основних культур (титр інокуляту 109 КУОмл) і асоціацією ізольованих мікроорганізмів (сумарний титр 1010 КУОмл) Антимікробну активність стерильних екстрактів одержаних із гомогенатів свіжих їстівних рослин (щавлю кропу редьки) фруктів і ягід (сливи гранату чорниць кизилу) і водного екстракту сідерітісу щодо досліджуваних шта-мів мікроорганізмів визначали методом сумісного культивування [4]

Результати та їх обговорення Обовrsquoязковою умовою відбору осіб для тестуван-ня контамінації відбитків була стоматологічно підтверджена відсутність у ротовій порожнині запальних патологічних процесів і карієсу Не дивлячись на це нами у обстежених осіб виявлено порушення мікробного ценозу ротової порожнини які характеризувались виділенням із слини у 60ndash70 випадків стрептококів майже у 55 випадків ndash стафілококів а також у 10 ndash ентеробактерій і у 30 minus дріжд-жоподібних грибів роду Candida Стрептококи були представлені видами розміще-ними тут у порядку спадання частоти їх виділення S salivarius S mitis S mutans S pneumoniae S agalacticae стафілококи ndash S epidermidis і S saprophyticus З сли-ни 20 осіб ізольовано S aureus асоціації зазначених мікроорганізмів виявлено у 60 випадків

Більшість мікроорганізмів було ізольовано в етіологічно значимих кількостях (згідно з наказом МОЗ 535 ldquoПро уніфікацію мікробіологічних (бактеріологічних) методів дослідження застосовуваних у клініко-діагностичних установахrdquo) що свід-чило про наявність у обстежених осіб дисбактеріозу порожнини рота

Нами встановлено що інтенсивність контамінації відбитків типовими представ-никами мікробіоти ротової порожнини залежала від матеріалу з якого вони отри-мувались Так відбитки з альгінатного матеріалу Упін містили на своїй поверхні меншу кількість мікроорганізмів порівняно з силіконовими відбитками Спідекс (табл 1) Найменша кількість (102ndash104 КУОмл) мікроорганізмів виявлена у випадку застосування коригуючої маси що можливо повrsquoязано з її антимікробними влас-тивостями Найбільшу кількість мікробних клітин (106ndash108 КУОмл) виявлено на відбитках з матеріалу Спідекс

В результаті визначення чутливості досліджуваних ізолятів до антибіотиків від-повідно до рекомендацій EUCAST встановлено що штами S mitis були стійкими до цефтриаксону цефатоксиму ампіциліну цефуроксиму і меропенему S agalactiae і S salivarius ndash до ванкоміцину S pneumoniae ndash до ампіциліну і тетрацикліну S aureus ndash оксациліну гентаміцину еритроміцину рифампіцинуампіциліну тетра-цикліну цефокситиму S saprophyticus ndash ампіциліну і ципрофлоксацину (табл 2) Штами K pneumoniae проявляли стійкість до більшості тестованих антибіотиків


за винятком амікацину і цефуроксиму що свідчить про продукцію бета-лактамаз розширеного спектру дії

Раніше показано що 30 хв обробка контамінованого відбиткового матеріалу де-зінфектантом Сілосепт у рекомендованих і навіть збільшених концентраціях при-зводить до нетривалого зменшення рівнів мікробної контамінації [3] тому нами випробувано біологічні засоби знезараження ndash бактеріологічні препарати і рослинні екстракти

Табли

ця 1

Частота

виділення

мікроорганізмів

і їх

асоціацій

із поверхні дослідж

уваних

відбитків

Кількість

осіб

відсоток

Альгінатний

матеріал Уп

інТи

тр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток

Силіконовий

матеріал Спідекс

Титр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток


відбиток

із

коригуючою

масою

Титр

КУО

мл

Ізольовані

мікроорганізми

210

S sa

livar

ius

12middot

104

525

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

86

30S

saliv

ariu

s2

2middot10

4

315

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is3

1middot10

33

15S

saliv

ariu

sK

pne

umon

iae

54middot

106

315

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

4

315

S e

pide

rmid

isSt

r m

itis

33middot

105

420

S sa

livar

ius

Can

dida

16middot

106

210

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is2

8middot10

4

210

S e

pide

rmid

is1

1middot10

52

10S

epi

derm

idis

26middot

106

210

S e

pide

rmid

is1

6middot10

6

15

S a

gala

ctia

e1

8middot10

41

5S

aga

lact

iae

28middot

104

15

S a

gala

ctia

e3

4middot10

2

315

S m

itis

15middot

104

420

Str

miti

s3

2middot10

62

10S

miti

s2

6middot10

4

420

S a

ureu

s2

4middot10

54

20S

pne

umon

iae

Can

dida

14middot

106

15

S p

neum

onia

e1

1middot10

4

15

Cor

yneb

acte

rium

spp

18middot

102

420

S m

utan

sS

sapr

ophy

ticus

19middot

108

15

Sm

utan

s1

1middot10

2


Табли

ця 2

Чутливість бактеріальни

х ізолятів

до антибіотик

ів

Ан

тибіотики

Скорочення

Streptococcus mitis

Streptococcus agalactiae

Streptococcus salivarius

Staphylococcus aureus

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus mutans

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus saprophyticus

K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

1Ва

нком

іцин

ВА20

Sge1

510

Rlt1

38

Rlt1

50

--

22S

ge16

1020

--

10-

-16

--

2Ам

оксици

лін

АМО

0-

-14

--

6-

-0

-нд

12-

-14

16-

-14

--

16R

lt17

3Цеф

тріаксон

ЦФА

15R

lt27

0-

-0

Rlt2

70

--

0-

-0

0-

-11

--

0R

lt20

4Оксацилін

ОКС

0-

-0

--

0-

-0

--

22S

ge20

00

--

0-

-0

--

5Гентам

іцин

ГЕН

17-

-8

--

17-

-12

Rlt1

821

--

88

Rlt2

28

--

8R

lt14

6Цеф

отаксим

ЦФТ

20R

lt23

10-

-0

Rlt2

310

--

22-

-10

10-

-10

--

10R

lt17

7Ер

итроміци

нЕР

И0

--

0-

-0

--

10R

lt18

0-

-0

0R

lt18

0-

-0

--

8Цип

рофл

оксаци

нЦИ

П20

--

18-

-0

--

16R

lt20

22S

Rge5

0lt18

1818

Rlt2

018

Rlt2

018

Rlt1

9


Табл

2 (пр

одовжен

ня)


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

9Офл

оксаци

нОФЛ

0-

-0

--

0-

-20

Sge2

0-

SR

ge50lt

150

0R

lt20

0-

-0

Rlt1

910

Рифа

мпіцин

РИФ

0-

-12

Rlt1

56

--

0R

lt23

20S

Rge2

2lt17

1212

Rlt2

312

--

12-

-11

Ампіци

лін

АМП

0R

lt15

0-

-0

Rlt1

50

--

0R

lt20

00

--

0R

lt15

0R

lt14

12Цефуроксим

ЦФР

12R

lt26

25-

-0

Rlt2

614

--

20-

2525

--

25-

-25

Sge1

813

Амікацин

АМК

0-

-20

--

20-

-0

Rlt1

60

--

2020

SR

ge22lt

1920

--

20S

ge13

14Тетрацик

лін

ТЕТ

0-

-0

Rlt2

00

--

0R

lt19

0R

lt20

00

Rlt1

90

--

0-

-15

Цеф

тазидім

ЦФД

6-

-8

--

14-

-10

--

14-

-15

16-

-17

--

0R

lt19

16Цеф

окситим

ЦФК

0-

-14

--

0-

-14

Rlt2

221

--

1414

-нд

14-

нд14

-нд

17Меропенем

МПН

16R

lt25

20-

-10

Rlt2

50

--

30-

-20

20-

-20

--

20S

Rge2

2lt16

Примітка

ЗЗР

ndash зони

затрим

ки росту

в мм

які

корелюють

з чутливістю

даного мікроорганізму

до вказаних

препаратів

SR

ndash S

ensi

tive

Res

ista

nt ndash

чутливийрезистентний

штам

ЗЗР(

EUC

AST

) ndashзони

затрим

ки росту

в мм

згідно

з EU

CA

ST

ldquo-rdquo

ndash антибіотик

не застосовується

до даного

штаму

нд

ndash немає

даних

щодо застосування

антибіотика

до даного

штаму

Виявлено резистентність

до оксациліну

OR

SA (o

xaci

llinr

esis

tant

S a

ureu

s = M

RSA

)

Дані E

UC

AST

щодо стійкості чутливості S

trept

ococ

cusm

utan

s є суперечливими


Обробка трьох типів відбиткових матеріалів суспензією штамів бацил регідра-тованих із біопрепаратів біоспорин і субалін в сумарній концентрації 109 КУОмл забезпечувала антимікробну ефективність стосовно більшості мікробних ізолятів за винятком штамів MRSA (ORSA) S aureus K pneumoniae і Candida spp

Свіжі екстракти їстівних рослин фруктів і ягід та водна витяжка із сідерітісу (мурсальський чай) характеризувались вибірковою протимікробною дією яка зале-жала перш за все від штамових особливостей мікроорганізмів а також від розве-дення екстракту і часу експозиції Лише деякі із екстрактів пригнічували ріст MRSA S aureus K pneumoniaeі Candida spp (табл 3) виявляючи як бактеріостатичну так і бактерицидну активність не впливаючи суттєво (за винятком екстрактів гранату) на кількість трьох штамів бацил які є основою досліджуваних біопрепаратів Незначне зменшення титрів бацил ndash із 108 до 106 КУОмл спостерігали через 24 год їх куль-тивування в мясо-пептонному бульйоні з додаванням екстракту кизилу Екстракти гранату редьки кизилу і чорниць характеризувались бактерицидною дією стосовно штаму MRSA (ORSA) витяжка кропу і сідерітісу інгібувала ріст штаму кандид тоді як екстракти щавлю і слив пригнічували ріст штамів S aureus і K pneumoniae однак не штаму MRSA (ORSA)

Таким чином нами показано що мікробіологічне забруднення відбитків у сто-матологічній практиці значною мірою залежить від поверхні матеріалу з якого вони виготовлені Не дивлячись на те що на сьогодні в стоматологічній практиці засто-совуються ефективні дезінфікуючі засоби з широким спектром антимікробної ак-тивності (Гембар Акватон-10 тощо) [6] актуальність пошуку методів знезараження відбиткових матеріалів альтернативних до хімічних є очевидною [11] Так рівень мікробної контамінації відбитків можна зменшити при використанні коригуючої пасти що має антимікробні властивості або обробкою суспензією пробіотичних штамів бацил або екстрактами рослин із протимікробною активністю Перспектив-ними є роботи з використання гідрогелів як потенційних нанорозмірних систем до-ставки ліків [13] для вивчення придатності їх застосування як носія бактерій роду Bacillus і рослинних екстрактів із протимікробною активністю щодо мікроорганіз-мів що заселяють відбиткові матеріали

Таблиця 3Протимікробна активність екстрактів їстівних рослин і ягід щодо мікроорганізмів ізольованих з поверхні відбитків

з п

Рослинний екстракт

Мікроорганізм Кількість мікроорганізмів (КУОмл) залежно від часу їх експозиції в екстракті

24 год 48 год 72 год1 Щавель Saureus

C albicans15middot106

75middot10620middot104

25middot10400

2 Гранат MRSA 0 0 03 Редька MRSA

S aureus35middot108


5middot10300

4 Сливи чорні S aureusMRSAK pneumoniae

12middot106

11middot108

27middot107

018middot108

91middot104

025middot104

05 Чорниці (афини) S aureus

MRSA25middot108



06 Кизил S aureus

MRSA51middot105


011middot106

07 Кріп MRSA



010middot102

08 Сідерітіс C albicans 26middot106 18middot104 32middot102


ПП Брехличук ВА Петров ВВ Бати ОБ Левчук НВ Бойко

ГВУЗ laquoУжгородский национальный университетraquo

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕКОНТАМИНАЦИЯ ОТТИСКОВ ИЗГОТОВЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ

МАТЕРИАЛОВ

Р е з ю м еИсследована микробиологическая контаминация оттисков изготовленных из альгинатно-

го (Упин) и силиконового материалов (Спидекс) без и с добавлением корригирующей массы в экспериментах на добровольцах Показано что наиболее приспособленными к выживанию на поверхности оттисков являются бактерии родов Streptococcus и Staphylococcus однако их титры различаются в зависимости от материала использованного для получения оттиска Среди изолированных микроорганизмов преобладают штаммы устойчивые к антибиотикам Бактериальные препараты на основе бацилл ndash биоспорин и субалин а также некоторые экстракты съедобных растений фруктов и ягод могут быть использованы в стоматологии для деконтаминации оттисков полученных при использовании различных материалов

К л ю ч е в ы е с л о в а материал оттисков микробная контаминация бактериальные препараты экстракты съедобных растений фруктов и ягод

P P Brekhlichuk V O Petrov V V Bati O B Levchuk N V Boyko

Uzhhorod National University

BIOLOGICAL DECONTAMINATION OF THE IMPRINTS OBTAINED FROM DIFFERENT DENTAL MATERIALS

S u m m a r yMicrobiological contamination of the imprints made of alginate (ldquoYpeenrdquo) and silicone material

(ldquoSpeedexrdquo) with and without the correction supplement has been investigated Streptococcus and Staphylococcus have been estimated to be the most survivable species on the imprint surface however their concentration differ depending on the type of imprintsrsquo material The strains resistant to antibiotics dominated among all the isolated microorganisms Bacterial preparations based on Bacillus ndash Biosporin and Subalin and some extracts of edible plants fruits and berries can be used in dentistry for the decontamination of imprints obtained by the use of different materials

The paper is presented in Ukrainian K e y w o r d s imprints microbiological contamination bacterial preparations extracts of

edible plants fruits and berries

T h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Brekhlichuk P P Uzhhorod National University 46 Pidhirna St Uzhhorod Zakarpatsrsquoka Oblast Ukraine

Алекссев ВА 1 Дезинфекция оттиска ndash забота не только врача но и зубного техника Современная стоматология ndash 2005 ndash 3 ndash С 65ndash66Брехлічук ПП Клітинська ОВ 2 Аналіз обrsquoємної усадки силіконових відбитків при стерилізації хімічним методом Вісник проблем біології і медицини ndash 2012 ndash Вип 3 ndash 1 (94) ndash С 194ndash198Брехлічук ПП Петров ВО Переста ЮЮ Какурін ЮВ Коваль ГМ3 Дезінфектанти в стоматологічній практиці ефективність особливості і результати застосування Biomedical and Biosocial Anthropology ndash 2010 ndash P 139ndash144


Егоров НС 4 Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности ndash М Высш шк 1965 ndash 212 сИванова ЕБ5 Отечественные дезинфицирующие средства на основе четвертичных аммониевых соединений Гигиена и санитария minus 2000 minus 3 minus С 19minus22Куцевляк СВ6 Обґрунтування дезінфекційних заходів у терапевтичній стоматології автореф дис hellip канд мед наук ndash Київ 2006 ndash 22 сСемина НА7 Внутрибольничные инфекции как проблема биобезопасности Вестник Рос АМН minus 2002 minus 10 minusС 48minus50Шандала МГ 8 Состояние и перспективы разработки новых дезинфектологических технологий Эпидемиология и инфекционные болезни minus 2000 minus 2 minus С 4minus7Юшманова ТН Образцов ЛЮ9 Обеспечение санитарно-эпидемической безопасности пациентов стоматологических учреждений Эпидемиология и инфекционные болезни minus 2000 minus 2 minus С 4minus7 EUCAST Clinical Breakpoint Table V 20 valid from 01012012 Режим доступу на сайті 10 wwweucastorg Koval H Peresta Yu 11 Benefi cial microfl ora as protective factor of oro-maxilo- facial infl ectional diseases caused by opportunistic pathogens 1st Congress of biomedicine in oro-maxillofacial area 6th Trilateral Slovak-Czech-Poland meeting (8minus10 October 2009) minus Kosice 2009 minus P 14minus20 Pitout J D Reisbig M D Venter E C Church D L Hanson N D 12 Modifi cation of the double-disk test for detection of enterobacteriaceae producing extended-spectrum and AmpC beta-lactamases J Clin Microbiol 2003 ndash 41 N 8 ndash P 3933ndash3935 Saboktakin M R13 Hydrogels as potential nano-scale drug delivery systems Biopolymers ndash 2010 ndash P 575ndash596



УДК 57845788157984212ФИ Товкач СН Мороз НА Король ЮВ Файдюк АИ Кушкина

Институт микробиологии и вирусологии им ДК Заболотного НАН Украиныул Академика Заболотного 154 Киев ГСП Д03680 Украина

ПОЛИВАЛЕНТНОСТЬ БАКТЕРИОФАГОВ ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ПЛОДОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ ПОРАЖЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫМ

ОЖОГОМ Обнаружены и описаны фаговые популяции которые появляются вследствие патологи-

ческого процесса обусловленного Erwinia amylovorа и сопровождают развитие ожога при вегетации айвы груши и яблони в Закарпатском регионе Украины Фаговые изоляты из по-раженных айвы и груши содержат разные поливалентные вирулентные фаги которые спо-собны размножаться на штаммах бактерий ассоциированных с растениями E amylovorа E rdquohorticolardquo и Pantoea agglomerans Изоляты E amylovorа из мест поражения растений ожогом которые выделяли одновременно с фагами являются устойчивыми к вирусной ин-фекции Эту особенность пока трудно объяснить однако замечено что фагоустойчивость может кардинально изменяться при диссоциации лизогенизации и мутагенезе эрвиний в ла-бораторных условиях Исследование фаговых популяций показывает что они гетерогенны и очевидно могут включать не только поливалентные но и специфические вирусы

Последующее изучение биологии и молекулярной генетики чистых линий изолированных фагов позволит приблизиться к пониманию места и роли бактериофагов в сети сложных взаимоотношений бактериальный патоген ndash растение

Ключевые слова бактериальный ожог Erwinia amylovora энтеробактерии полива-лентные бактериофаги экология

В природе существуют два типа бактериофагов ndash специфические и поливалент-ные Фаги первого типа инфицируют ограниченное число штаммов одного и того же вида бактерий Поливалентные фаги могут заражать и репродуцироваться в клетках не только различных штаммов и видов но родов и групп бактерий [3 6] Преодо-ление вирусом межродовых границ является уникальным явлением в его основе лежит ряд сложных механизмов [8 9 10]

Поливалентность имеет фундаментальное значение для вирусологии так как некоторые особо опасные инфекции персистируют в окружающей среде за счет расширения круга хозяев для соответствующих вирусов [7] С другой стороны ее практическая значимость для биологического контроля численности микробных по-пуляций не вызывает сомнения

Несмотря на их фундаментальную и практическую важность бактериофаги с широким кругом хозяев в современной научной литературе описываются редко а экспериментальные модели для изучения фаговой поливалентности пока не раз-работаны В данной работе мы попытались обнаружить и описать поливалентные фаги узкой экологической ниши ограниченной плодовыми деревьями и Erwinia amylovora (Burill 1882) Winslow et al 1920 в период появления симптомов бактери-ального ожога

Материалы и методы Возбудители бактериального ожога плодовых деревьев были выделены из пораженных деревьев айвы (Cydonia oblonga Mill) груши (Pyrus communis L) и яблони (Malus domestica Borkh) в Ужгородском районе Закарпатс-кой области во время активной вегетации растений на протяжении мая ndash сентября 2012 г

Патогенные свойства изолятов определяли методом Уайта на незрелых плодах груши а также искусственным заражением здоровых побегов груши [11] Для иден-тификации бактерий изучали их фенотипические свойства общепринятыми мето-дами [11] сравнивая с типовым штаммом E аmylovora а также в соответствии с Bergeys Manual of Systematic Bacteriology [5] При идентификации проводили так-же реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой полученной к E аmylovora 9057 и 8507 любезно предоставленной ЛМ Яковлевойcopy OcircEgrave Ograveicircacircecircagravedivide NtildeIacute Igraveicircethicircccedil IacuteAgrave Ecircicircethicirceumluuml THORNAcirc Ocircagraveeacuteaumlthornecirc AgraveEgrave Ecircoacuteoslashecircegraveiacuteagrave 2013


Бактериофаги изолировали из того же пораженного материала (подсохшие поч-ки сухие листья ветки) экстракцией в жидкую среду LB (500 мг на 3 мл) длитель-ность которой составляла 18 часов при 4о С

В качестве негативного контроля использовали ветки груши из Винницкой об-ласти без явных симптомов ожога и других признаков заболевания

В работе использовали типовой штамм E аmylovora (Eam) 9057 (АТСС 15580) выделенный из груши R Lelliot в 1959 г и штамм этой бактерии К8 (АТСС 29850) изолированный из груши JE Crosse в 1958 г ndash оба из Великобритании Штаммы E аmylovora Л4 Л6 и Л7 выделены МИ Лукач в период 1999-2000 гг в Черновицкой области из пораженных деревьев груши штаммы К4 и К5 изолированы из плодовых растений НИ Клинковой в 1989 г на юге СССР Амиловороподобные бактерии чер-ного бактериоза бука лесного Erwinia ldquohorticolardquo(Eho) 60 120 и 450 и возбудители черного бактериоза яблони Eldquohorticolardquo 43I 43II и 23a выделены КИ Бельтюковой в 1968ndash1969 гг [1] Все указанные бактерии получены авторами из коллекции фи-топатогенных бактерий Института микробиологии и вирусологии НАН Украины Искусственно лизогенизированные производные штаммов Eldquohorticolardquo 450 и 60 ndash 450(59) 450(49) и 60(59Е105) ndash а также диссоцианты штамма 60 были получены ранее при изучении лизогении с участием умеренных фагов 59 49 и Е105 [4] Му-танты штаммов 60 43I и 43II устойчивые к налидиксовой кислоте выделены при выполнении данной работы

Штаммы Pantoea agglomerans (Pag) EH1 282-1 282-2 97-1 97-2 g150 и g157 а также Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum (Pcc) Ec153s Ec153b и J2 предоставлены проф ЮК Фомичевым из Белорусского государственного универ-ситета Штаммы Pcc 8982 и 8447 были получены из коллекции фитопатогенных бактерий ИМВ НАНУ лабораторные штаммы Escherichia coli CR63 C1a BE и К12 а также бактериофаги 59 49 Е105 и FE44 ndash из отдела молекулярной генетики бак-териофагов ИМВ НАНУ

Эксперименты проводили на основе стандартных фаговых методов описанных нами ранее [2 4]

Результаты Бактерии изолированные из пораженных ожогом плодовых деревь-ев представляли собой грамотрицательные неспорообразующие подвижные пере-трихиальные палочки образующие на пластинках картофельного агара мелкие по-лупрозрачные кремово-белые колонии с приподнятым центром и ровными краями На среде Кинг Б флуоресцирующий пигмент не образуют оксидазоотрицательные каталазоположительные факультативные анаэробы Все изоляты способны проду-цировать леван но не образуют индол и сероводород не редуцируют нитраты Ис-пользуют цитрат утилизируют с образованием кислоты глюкозу рибозу трегалозу фруктозу сахарозу галактозу целлобиозу арабинозу ксилозу маннит сорбит под-щелачивают лакмусовую сыворотку разжижают желатин Не ферментируют лак-тозу мальтозу рамнозу раффинозу и дульцит не растут при 39deg С и в 5 NaCl не образуют пектолитических ферментов

Все изоляты патогенны в тесте Уайта на незрелых плодах груши и вызывают поражение побегов груши при искусственном заражении суспензией бактерий Бак-терии дают положительную реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой полученной к E аmylovora 9057 и 8507

Таким образом по фенотипическим и патогенным свойствам выделенные нами из разных растений-хозяев изоляты представляют собой гомогенную группу сход-ную с типовым штаммом E аmylovora и соответствуют характеристикам этого вида согласно Bergeys Manual of Systematic Bacteriology [5]

В последующих исследованиях использовали три основных штамма E аmylovora МА МГ и МЯ которые были изолированы из пораженных айвы груши и яблони соответственно В контрольном исследовании (груша из Винницкой области ndash ус-ловное обозначение ТГ) патогена обнаружено не было


После перекрестного титрования вирусных изолятов из тех же трех видов по-раженного материала и контроля которые были обозначены как рМА рМГ рМЯ и рТГ (контрольный образец) с помощью двухслойных агаровых чашек нам не уда-лось обнаружить признаков фаголизиса указанных штаммов E amylovora Повтор-ная экстракция фагов из растительного материала и проверка фагочувствительности штаммов не привели к положительным результатам ndash указанные штаммы остава-лись устойчивыми к вирусам

Поэтому далее в качестве индикаторных для идентификации фагов исполь-зовали музейные штаммы E rdquohorticolardquo P agglomerans E amylovora E coli и P carotovorum subsp carotovorum

Для того чтобы определить поливалентную природу и максимально учесть раз-нообразие бактериофагов в симптомных поражениях плодовых растений фитопато-геном E amylovora в этой работе не использовали таких стандартных процедур как получение чистой линии фага или его обогащение с помощью применения какого-либо одного чувствительного штамма

Как видно из табл 1 вирусы полученные экстракцией из двух образцов пора-женной айвы (рМА1 и рМА2) образцов груши (рМГ) и яблони (рМЯ) образуют отде-льные негативные колонии на газонах многих штаммов E rdquohorticolardquo всех исполь-зованных штаммов P agglomerans и только одного из десяти штаммов E amylovora Изолят рМА1 оказался наиболее активным на этих штаммах содержащиеся в нем фаги лизировали 8 из 10-ти штаммов Eho Eam и Pag Он характеризовался срав-нительно высокими значениями титра которые достигали 104 БОЕмл Инфекция поддерживалась нормально при повторном пассировании фагов Другой крайний случай представлял изолят из пораженной яблони рМЯ Фаги этого образца ин-фицировали единственный штамм ndash Eho 60-1n который однако не поддерживал фаговой инфекции при последующих пассажах

Таблица 1Чувствительность штаммов E ldquohorticolardquo P agglomerans и E amylovora

к фагам выделеных из айвы (рМА1 рМА2) груши (рМГ) и яблони (рМЯ) пораженных бактериальным ожогом

Индикатор Изолят фага (первичная популяция фага)Родвид Штамм Фаза

роста рМА1 рМА2 рМГ рМЯ

Eho

60-3m Ex - 20 x 102 - -

60-1n Ex 40 x 102 - 36 x 103 60 x 102

60 (59 E105) Ex - - 40 x 103 -

43I Ex 60 x 103 - - -

43II Ex 32 x 103 60 x 102 - -

Pag

g150Ex 55 x 103 - - -

St 45 x 103 - - -

g157Ex 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

St 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

97 - 1 Ex 14 x 104 - 57 x 103 -

97 - 2 St 20 x 103 - 15 x 103 -

Eam K8 Ex 80 x 103 - - - Примечание laquo raquo ndash здесь и в табл 2 и 3 ldquoEhordquo означает E ldquohorticolardquo ldquoPagrdquo ndash

P agglomerans и ldquoEamrdquo ndash E amylovora laquo raquo ndash для проверки эффективности посева фаг высевали на газон бактериальных клеток находящихся в экспоненциальной (Ex) или стационарной (St) фазе роста laquo - raquo ndash отсутствие отдельных фаговых бляшек на бактериальном газоне индикатора


Изоляты рМА2 и рМГ инфицировали 3 и 4 штамма соответственно и последу-ющее реинфицирование ими чувствительных бактерий в отличие от рМЯ давало позитивные результаты

Титр фагов рМГ был в среднем на порядок выше чем таковой рМА2 оба изолята отличались кругом чувствительных хозяев за исключением Pag g157 на котором эти изоляты давали негативные фаговые колонии (табл 1)

Фаги всех четырех изолятов образуют прозрачные негативные колонии на га-зонах чувствительных культур (рисунок) их морфология в случае рМА2 часто не очень четко выражена что затрудняет учет количества бляшкообразующих единиц Отсутствие лизогенизации скорее всего свидетельствует о наличии в образцах ви-рулентных вирусов Доказательство вирулентности бактериофагов было получено также при их титровании на бактериальных клетках одного и того же индикатора находящихся в экспоненциальной (Ex) и стационарной (St) фазах роста Общеизвес-тно что лизогенизация всегда приводит к падению эффективности посева при на-сыщении культуры Поскольку эффективность посева на ЕхSt ndash парах индикаторов не изменяется (табл 1) фаги очевидно являются литическими При титровании на газоне культуры Eho 43ІІ вокруг прозрачных бляшек рМА1 и особенно рМГ наблю-даются мутные широкие ореолы Хотя причина образования ореолов неизвестна по аналогии [12] можно допустить что она связана с фаговым ферментом способным деполимеризовать экзополисахаридную капсулу клеток указанного штамма В отли-чие от опытных образцов контрольный изолят рТГ не проявил фаговой активности на всех испытанных культурах

Рис 1 Негативные колонии образуемые фагами изолята рМА1 на штаммах P agglomerans g150 (A) g157 (Б) и 97-1 (В)

Анализ первичных фаговых популяций показывает что обнаруженные нами бактериальные вирусы появляются вследствие патогенного процесса с участием E amylovora которая является возбудителем ожога айвы груши и яблони

Интересно что изоляты из этих растений включают различные фаги которые отличаются не только по кругу чувствительных хозяев эффективности посева (ЭП) на различных индикаторах (табл 1 и см далее) а также по морфологии и размеру негативных колоний

Как видно из табл 1 изолированные фаги наиболее эффективно высеваются на штаммах P agglomerans причем на штамме g157 три изолята рМА1 рМА2 и рМГ дают негативные колонии В последующих исследованиях определяли эффектив-ность посева указанных изолятов реклонированных на штаммах Pаg

Как и следовало ожидать фаги размножались наиболее эффективно на бактери-ях использованных для реклонирования ndash эффективность посева на Pаg g157 g150 и 97-1 достигала единицы (табл 2)


Таблица 2

Эффективность посева реклонированных бактериофаговФаг Eho Eam Pag

60-3m 60-1n 43I 43II L4 K8 97-1 97-2 g150 g157pMA1g157 005 008 005 005 005 018 007 007 007 100pMA1g150 010 - 001 007 022 025 084 056 100 081pMA197-1 012 - 020 012 007 008 100 063 080 080рМГg157 - 008 - 008 - - - 001 006 100pMA2g157 0004 - 006 0004 0004 004 009 005 007 100

Примечание laquo - raquo ndash негативные колонии не обнаружены

Показатель эффективности посева находился в пределах 0004 ndash 100 Наимень-шие его значения характеризуют изолят pMA2g157 тогда как для изолята pMA197-1 показательны достаточно высокие значения ЭП Уменьшение эффективности посе-ва pMA1g150 pMA197-1 и pMA2g157 на штаммах Eho по сравнению с таковой на Pag скорее всего связано со смешанными фаговыми популяциями или с разнород-ностью фаговой популяции которая может состоять из различных фаговых вариантов Сравнительно однородными являются фаговые популяции изолятов pMA1g157 и рМГg157 которые имеют незначительные различия в ЭП при их высеве на боль-шинство испытанных штаммов (табл 2)

Для последующего исследования поливалентности фагов выделенных из мест поражений бактериальным ожогом полученные изоляты были размножены на некоторых индикаторных штаммах фитопатогенных бактерий E ldquohorticolardquo и E amylovora К8 (табл 3) Изолят рМА1 полученный через два пассажа на штамме Eho 60-3m характеризовался явной гетерогенностью которая проявлялась через на-личие бляшек двух типов Он был назван рГЕТ Изолят рМА1 проклонированный один раз на штамме Eho 60-3m был гомогенным и проявлял большую активность на штамме Eam K8 чем рГЕТ Оба изолята были обозначены римскими цифрами І и II соответственно Два новых варианта изолята рМГ III и IV полученные на штаммах E horticola 60-1n и 43II соответственно существенно не отличались друг от друга Изолят V содержал фаги рМА2 наработанные на Eho 60-3m а изолят VI ndash фаги рМА1 полученные на E amylovora К8

Для изолятов I ndash VI адаптированных к репродукции на новых хозяевах умерен-ных фагов 59 49 и Е105 а также поливалентного бактериофага FE44 определяли способность инфицировать представителей 4-х родов энтеробактерий (табл 3) Для этого опыта было использовано более 40 штаммов

Установлено что изоляты I ndash VI эффективно заражают штаммы P agglomerans E rdquohorticolardquo и E amylovora С учетом показателя эффективности посева (табл 1 и 2) можно утверждать что фаги представляющие эти изоляты можно отнести к поливалентным При этом интересным является тот факт что данные вирусы наибо-лее часто и с большей эффективностью поражают штаммы P agglomerans

Умеренные фаги 59 и 49 являются узкоспецифичными [4] тогда как умеренный фаг Е105 также проявляет поливалентность преодолевая родовую границу и зара-жая 50 и 100 процентов представителей E rdquohorticolardquo и P agglomerans соответс-твенно К инфицированию типичным поливалентным фагом FE44 чувствительны как E rdquohorticolardquo так и E coli Что касается P carotovorum то ни один из использо-ванных в работе изолятов и чистых фагов не проявляет инфекции на штаммах этой фитопатогенной бактерии

Представленные в табл 3 данные подтверждают широкое распространение по-ливалентных бактериофагов в пораженных ожогом растениях Эти вирусы оче-видно можно обозначить как группоспецифичные так как они инфицируют виды энтеробактерий которые сосуществуют в составе микробных сообществ в узкой экологической нише


Несмотря на то что поливалентные бактериофаги были выделены в пери-од массовой эпидемии бактериального ожога восприимчивость к ним основного возбудителя E amylovora отсутствовала Для объяснения этого необычного фак-та исследовали изменение фагочувствительности у амиловороподобной бактерии E ldquohorticolardquo 60 которая является универсальным индикатором для всех использо-ванных в работе фагов (табл 3)

Таблица 3Частота () инфицирования энтеробактерий фаговыми изолятами

и чистыми линиями фагов

Изолятфаг Вид энтеробактерииPag Eho Eam Eco Pcc

I [рГЕТ60-3m] 100 88 20 0 0II [рМА160-3m] 100 69 50 0 0III [рМГ60-1n] 100 50 0 0 0IV [рМГ43II] 100 59 0 0 0

V [рМА260-3m] 86 88 0 0 0VI [рМА2K8] 100 69 50 0 0

59 0 33 0 0 049 0 36 0 0 0

E105 100 50 0 0 0FE44 X 53 0 100 0

Количество штаммов 7 15-18 10 4 5 Примечание laquoхraquo ndash данные не получены

Исходная форма этого штамма 60-1n которая как было установлено с помощью визуальных наблюдений представляет собой S-форму и проявляет максимальную чувствительность к 6-ти фаговым штокам (І ndash VI) и пяти индивидуальным фагам ndash 59 49 Е105 FE44 и FE4460 (табл 4) Диссоциант этого штамма 60-3m отобран-ный как R-форма по неизвестным причинам теряет чувствительность к фагам 59 49 и Е105 а также к фагам содержащимся в штоках III и IV Фаги 59 и Е105 не про-являют своей активности по отношению к лизогену 60 (59 Е105) Это обусловлено лизогенной конверсией [5] вследствие которой скорее всего эта бактерия теряет чувствительность и к фагам из штоков II и VI а также становится малочувствитель-ной к фаговому штоку I

Исходя из полученных данных о фагочувствительности у E ldquohorticolardquo 60 мож-но говорить как об очень переменчивом показателе фенотипа Это положение под-тверждается и тем что некоторые мутации в частности в локусе отвечающем за устойчивость клеток к действию налидиксовой кислоты могут приводить к ее кар-динальному изменению Большинство из таких мутантов теряют чувствительность к умеренным фагам 49 и 59 а также поливалентному фагу FE44 (табл 4)

Исходя из представленных результатов можно допустить что устойчивость к фагам у штаммов E amylovora выделенных одновременно с ними из мест ожогово-го поражения растений может находиться на различных стадиях в зависимости от метастабильного состояния бактериальной популяции в данный момент времени Фагочувствительность скорее всего формируется как в лабораторных так и в ес-тественных условиях за счет процессов диссоциации лизогенизации и мутагенеза

Таблица 4Фагочувствительность штаммов E horticola 60

Штаммы E horticola 60

ФагиI II III IV V VI 59 49 E105 FE44 60

60 ndash 1n +t +t + + +t +t + + + + +60 ndash 1nNalr + + + + +t +t - - + - -

60 ndash 3m + + - - +t + - - - + +60(59 E105) +t - + + +t - - + - + +

Примечание +t ndash означает наличие непрозрачных бляшек


Обсуждение результатов Первичная популяция любого фага может быть рас-смотрена как тот его изолят который обнаружен в соответствующей экологической нише вместе со своей бактерией-хозяином в определенный период времени Такая популяция вероятнее всего будет разнородной и кроме основного фага будет вклю-чать другие контаминирующие ее фаги а также различные фаговые варианты и мутантные формы В последующем может быть проведено обогащение искомого фага с помощью одного чувствительного бактериального штамма и в конечном итоге получение чистой вирусной линии после ряда последовательных пассажей Эта двухэтапная процедура является общепринятой в классической бактериофагии однако ее применение затрудняет выделение поливалентных фагов и приводит как правило к получению специфических вирусов те вирусов с ограниченным кругом бактерий-хозяев С другой стороны обогащение основной фаговой популяции зна-чительно сужает сферу исследований делает маловероятным обнаружение бактери-альных вирусов полезных для биоконтроля патогенных микробов

Для оценки первичных фаговых популяций ассоциированных с E amylovorа мы разработали модельную систему на основе набора индикаторных энтеробактерий ко-торые имеют отношение к бактериальным заболеваниям древесных растений (ожог плодовых ndash E amylovorа и черный бактериоз бука и плодовых ndash E rdquohorticolardquo) или сопровождают эти заболевания как эпифиты или эндофиты (P agglomerans) В эту систему были включены также три умеренных фага (59 49 и E105) и один полива-лентный вирулентный бактриофаг (FE44) которые способны репродуцироваться в клетках E rdquohorticolardquo 60 и 450

Использование предложенной системы позволило установить ряд важных зако-номерностей

Первичные фаговые популяции включают бактериофаги которые появляются вследствие патологического процесса обусловленного E amylovorа и сопровожда-ют развитие ожога при вегетации зараженных растений Фаговые изоляты поражен-ных ожогом айвы и груши содержат поливалентные вирулентные фаги которые эф-фективно размножаются на штаммах E amylovorа E rdquohorticolardquo и P agglomerans В последнем случае эффективность их посева и частота инфицирования достигает 100-ного максимума Поскольку эти фаги не инфицируют представителей таких энтеробактерий как Escherichia и Pectobacterium можно считать что их полива-лентность распространяется только на бактерии ассоциированные с растениями и носит групповой характер Фаговые изоляты пораженных айвы груши и ябло-ни включают вирусы которые отличаются морфологией негативных колоний кру-гом хозяев и эффективностью посева То что эти фаги характеризуются частица-ми различных морфотипов показано также с помощью электронной микроскопии (данные не представлены) Этот факт свидетельствует о сложности бактериальных консорциумов которые являются уникальными в случае каждого вида растения и имеют сложную динамику развития при патогенезе Наличие полной устойчивости к изолированным фагам у штаммов E amylovora выделенных одновременно с ними из мест поражения растений ожогом пока трудно объяснить однако она понятна в терминах высокой вирулентности при патогенезе Возможно это свойство утрачи-вается бактерией в связи с естественными процессами диссоциации лизогенизации и мутагенеза Исследование фаговых популяций показывает что они гетерогенны и очевидно могут включать не только поливалентные но и специфические вирусы

Последующее изучение физиологии и молекулярной генетики чистых линий фа-гов позволит приблизиться к пониманию места и роли бактериофагов в сети слож-ных взаимоотношений E amylovora ndash растение


ФІ Товкач СМ Мороз НА Король ЮВ Файдюк АІ Кушкіна


ПОЛІВАЛЕНТНІСТЬ БАКТЕРІОФАГІВ ІЗОЛЬОВАНИХ З ПЛОДОВИХ ДЕРЕВ УРАЖЕНИХ БАКТЕРІАЛЬНИМ ОПІКОМ

Р е з ю м еВиявлено та описано фагові популяції що зrsquoявляються внаслідок патологічного процесу

обумовленого Erwinia amylovorа і супроводжують розвиток опіку в процесі вегетації айви груші та яблуні в Закарпатському регіоні України Фагові ізоляти з уражених айви і груші містять різні полівалентні вірулентні фаги які здатні розмножуватися на штамах бактерій асоційованих із рослинами ndash E amylovorа E ldquohorticolardquo і Pantoea agglomerans Ізоляти E amylovorа з місць ураження рослин опіком які виділяли одночасно з фагами є стійкими до вірусної інфекції Цю особливість поки складно пояснити проте було помічено що фа-гостійкість може кардинально змінюватися при дисоціації лізогенізації та мутагенезі ервіній в лабораторних умовах Дослідження фагових популяцій показує що вони гетерогенні і оче-видно можуть включати не лише полівалентні але і специфічні віруси

Наступне вивчення біології та молекулярної генетики чистих ліній ізольованих фагів доз-волить наблизитися до розуміння місця і ролі бактеріофагів у системі складних відносин бак-теріальних патогенів з рослинами

Ключові слова бактеріальний опік Erwinia amylovora ентеробактерії полівалентні бактеріофаги екологія

FІ Tovkach SM Moroz NA Korol IV Faidiuk AI Kushkina

Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine Kyiv

POLYVALENCE OF BACTERIOPHAGES ISOLATED FROM FRUIT TREES AFFECTED BY BACTERIAL FIRE BLIGHT

S u m m a r yPhage populations appearing as a result of a pathogenic process caused by Erwinia amylovorа

have been discovered and described They accompany bacterial fi re blight development in the process of quince pear and apple trees vegetation in Zakarpattya region of Ukraine Phage isolates of the affected pear and quince include polyvalent virulent phages able to develop on bacterial strains associated with plants ndash E amylovorа E ldquohorticolardquo and Pantoea agglomerans E amylovorа isolated from the plant tissues affected by the fi re blight and detected at the same time as phages proved to be resistant to the viral infection It is hard to explain now this characteristic however it was noticed that resistance to phages can change drastically in case of dissociation lysogenization and mutagenesis of erwinia in laboratory conditions Phage population study shows that they are heterogeneous and can obviously include not only polyvalent but also specifi c viruses

Further studies of biology and molecular genetics of pure lines of isolated phages will help to get closer to understanding the place and role of bacteriophages in the complicated network of relations between bacterial pathogens and plants

The paper is presented in RussianK e y w o r d s fi re blight Erwinia amylovora enterobacteria polyvalent bacteriophages

ecology

T h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Tovkach FІ Zabolotny Institute of Microbiology and Virology National Academy of Sciences of Ukraine 154 Acad Zabolotny St Kyiv MSP D03680 Ukraine


Бельтюкова КГ Гвоздяк РИ Пастушенко ЛТ Зуйкова НФ1 Erwinia horticola sp nova ndash новий збудник захворювання бука та плодових дерев Мікробіол журн ndash 1972 ndash 34 1 ndash С 104ndash106Товкач ФИ2 Изучение фагоустойчивости с помощью умеренного бактериофага ZF40 Микробиология ndash 2002 ndash 71 1 ndash С 82ndash88Товкач ФИ3 Молекулярно-биологические свойства вирулентного бактериофага FE44 Доповіді Національної академії наук України ndash 2002 ndash 6 ndash С 175ndash178Товкач ФИ Шевченко ТВ Горб ТЕ Муквич НС Романюк ЛВ4 Сравнительное изучение умеренных эрвиниофагов 49 и 59 Микробиол журн ndash 2002 ndash 64 2 ndash Р 65ndash81Bergeys Manual of Systematic Bacteriology Volume 2 The Proteobacteria Part B The 5 Gammaproteobacteria Brenner DJ Krieg NR Staley JR (Vol Eds) Garrity GM (Ed-Ch) ndash USA Springer 2005 ndash 1106 pBorn Y Fieseler L Marazzi J Lurz Duffy В Loessner MJ6 Novel virulent and broad-host-range Erwinia amylovora bacteriophages reveal a high degree of mosaicism and a relationship to Enterobacteriaceae phages Appl Environ Microbiol ndash 2011 ndash 77 N 17 ndash P5945ndash5954 Davison A J Benko M Harrach B 7 Genetic content and evolution of adenoviruses J Gen Virol ndash 2003 ndash 84 ndash Р 2895ndash2908Hoskisson PA Smith MCM8 Hypervariation and phase variation in the bacteriophage lsquoresistomersquo Curr Opinion Microbiol ndash 2007 ndash 10 ndash P 396ndash400Kruger DH Hansen S Reuter M9 The ocr+ gene function of bacterial viruses T3 and T7 counter-acts the Salmonella typhimurium DNA restriction systems SA and SB J Virol ndash 1983 ndash 45 N 5 ndash P 1147ndash1149Łobocka MB Rose DJ Plunkett G Rusin M Samojedny A Lehnherr H Yarmolinsky MB 10 Blattner FR Genome of Bacteriophage P1 JBacteriol ndash 2004 ndash 186 N 21 ndash P 7032ndash7068 Methods in Phytobacteriology Eds Klement Z Rudolph K Sands DC ndash Budapest Akadeacutemiai 11 Kaidoacute 1990 ndash 568 pSchnabel EL Jones AL12 Isolation and characterization of fi ve Erwinia amylovora bacteriophages and assessment of phage resistance in strains of Erwinia amylovora Appl Eviron Microbiol ndash 2001 ndash 67 N 1 ndash P 59ndash64

Отримано 1309 2012


УДК 63564 5783 620187

ЛТ Міщенко АА Дуніч ОІ Данілова ВП Поліщук

Київський національний університет імені Тараса Шевченкавул Володимирська 6413 Київ 01601 Україна

ВЛАСТИВОСТІ ТОМАТНИХ ІЗОЛЯТІВ М- ТА Y-ВІРУСІВ КАРТОПЛІ В УКРАЇНІ

Обстежено 27 сортів томатів (Lycopersicon esculentum Mill) із різних областей України на наявність вірусної інфекції та виявлено раніше неописані симптоми захворювання для цієї культури В ході проведених досліджень встановлено що ці хвороби викликані М- та Y-віру-сами картоплі Це перше повідомлення про інфікування рослин томатів в Україні вказаними вірусами Застосовуючи комплекс методів вивчено деякі з біологічних та фізико-хімічних властивостей збудників Виявлено відмінності томатних ізолятів МВК та YВК від відомих по морфології та масі структурного білка

Ключові слова Lycopersicon esculentum Mill М-вірус картоплі Y-вірус картоплі рос-лини-індикатори морфологія вірусів структурні білки

В Україні томати ndash одна з найпопулярніших овочевих культур Плоди і продукти його переробки користуються великим попитом завдяки смаковим якостям вмісту вітамінів біологічно активних і мінеральних речовин В середньому на одну осо-бу в Україні виробляється 174 кг плодів томата що становить 446 від норми споживання рекомендованої Київським НДІ гігієни харчування [11] Причому недобір у виробництві спостерігається у всіх природно кліматичних зонах навіть у Степовій ndash найбільш придатній для вирощування томата з високою товарністю та якістю плодів

Вірусні хвороби рослин спричиняють значне зниження врожайності сільсько-господарських культур погіршення якості продукції а також швидке виродження сортів що ускладнює забезпечення сталого виробництва конкурентоспроможної сільськогосподарської продукції як основи продовольчої та національної безпеки України [3] Рослини томатів пошкоджуються різноманітними шкідниками а також уражуються збудниками грибної бактеріальної та вірусної етіології Введення ін-тенсивних технологій нових сортів і гібридів активний обмін і переміщення насін-нєвого і садивного матеріалу сприяє поширенню інфекції в нові географічні регіони і індукують процеси зміни видового складу патогенів

На сьогоднішній день на овочевих культурах зареєстровано близько сотні вірусів різної таксономічної приналежності які розрізняються за своїми біологічними фі-зико-хімічними і серологічними властивостями шляхами передачі [20] Зареєстро-вано що на території нашої країни культура томатів інфікується декількома віруса-ми а саме вірус огіркової мозаїки (ВОМ) вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) вірус мrsquoякої плямистості перцю (ВМПП) вірус погримковості тютюну (ВПТ) вірус мо-заїки томату (ВМТ) та вірус кільцевої плямистості тютюну (ВКПТ) вірус мозаїки турнепсу (ВМТ) Необхідно зазначити що контамінованим виявилося і насіння то-матів оскільки в ньому одночасно було виявлено 4 різні віруси такі як вірус мrsquoякої плямистості перцю вірус тютюнової мозаїки вірус кільцевої плямистості тютюну та вірус погримковості тютюну [10] Окрім моноінфекції часто спостерігається та-кож змішана інфекція Переважна більшість цих вірусів швидко розповсюджується на великі території завдяки ефективним шляхам передачі ndash комахи-переносники насіння та шляхом контакту між рослинами

Є дані про те що серед різноманітних вірусних хвороб томатів найчастіше зус-трічаються рослини з симптомами у вигляді мозаїк ниткоподібності листків внут-рішнього некрозу плодів які викликає ВТМ-інфекція іноді разом із Х-вірусом кар-топлі (ХВК) [5] Істотну роль у розвитку захворювань томатів у польових умовах відіграють збудники вірус огіркової мозаїки вірус аспермії томатів вірус плямис-copy EumlOgrave Igravesup3ugravearingiacuteecircicirc AgraveAgrave Aumloacuteiacutesup3divide Icircsup2 Aumlagraveiacutesup3eumlicircacircagrave AcircIuml Iumlicirceumlsup3ugraveoacuteecirc 2013


того вrsquoянення томатів тощо Дані патогени спричинюють масове зниження урожаю та погіршення товарного виду та якості плодів

Надійний захист овочевих культур від вірусних інфекцій може забезпечити тіль-ки комплекс заходів який визначається видовим складом вірусів переносників а також їх біоекологічними характеристиками Для обмеження розповсюдження ін-фекції та шкодочинності захворювання до господарсько незначного рівня потрібне дотримання норм профілактики на всіх етапах технологічного процесу в тому числі використання здорового посадкового і насіннєвого матеріалу

Однак інформація стосовно поширення і видового різноманіття вірусів що ура-жують рослини томатів на території України є дуже обмеженою та не містить нових даних Тому необхідним є вивчення видового складу вірусів та шляхів їх поширен-ня яке надасть можливість певною мірою лімітувати ареал даних вірусів і як наслі-док зменшити втрати врожаю культури Вивчення етіології захворювань дозволить розробити ефективні методи захисту та зберегти генофонд томатів шляхом відбору стійких до вірусів сортів

Зважаючи на вищесказане метою даної роботи було провести моніторинг вірусів що уражують рослини томатів (Lycopersicon esculentum Mill) у відкритому ґрунті на території України та вивчити деякі з їх властивостей

Матеріали і методи Рослинні зразки відбирали шляхом візуального обстеження полів томатів у Київській Полтавській Харківській і Кіровоградській областях на наявність симптомів вірусної етіології [8]

Виділення вірусів із уражених рослин томатів проводили згідно з Ніколаєвою [7] у нашій модифікації

Біологічне тестування здійснювали шляхом механічної інокуляції рослин-ін-дикаторів у фазі двох справжніх листків очищеними вірусними препаратами Як рослини-індикатори слугували Lycopersicon esculentum Mill Datura stramonium L D metel L Nicotiana tabacum L сортів Імунний і Трапезон N glutinosa Gomphrena globosa L Solanum nigrum L Chenopodium album Chenopodium quinoа Willd Chenopodium amaranticolor Coste et Reyen Phaseolus vulgaris L сорту Пінто [1]

Морфологію вірусних часток вивчали методом електронної мікроскопії Негатив-не контрастування очищених вірусних препаратів проводили 2 розчином фосфор-новольфрамової кислоти протягом 2 хв [12] Препарати досліджували за допомогою електронних мікроскопів JEM 1230 (JEOL Японія) та ЕМ-125 (Суми Україна)

Для визначення молекулярної маси капсидних білків виділених вірусів прово-дили електрофорез за Laemmli в 14 поліакриламідному розділяючому та 5 концентруючому (стартовому) гелях [18] Електрофорез проводили у комерційному апараті для вертикального електрофорезу VE-10 (ТОВ laquoХеликонraquo Росія) при 40 мА протягом 15 год Фарбування гелю здійснювали протягом ночі розчином Cumassis blue R-250 (ldquoSigmardquo США) Для визначення молекулярних мас структурних біл-ків вірусів використовували набір маркерних білків LMW (ldquoPharmaciardquo Швеція ) 1160 кДа 662 кДа 450 кДа 350 кДа 250 кДа 184 кДа

Ідентифікацію вірусів здійснювали за допомогою твердофазного імунофермен-тного аналізу (сендвіч-варіант) з використанням комерційних тест-систем фірми LOEWE Німеччина Результати реакції реєстрували на рідері Termo Labsystems Opsis MR (США) із програмним забезпеченням Dynex Revelation Quicklink при дов-жинах хвиль 405630 нм За достовірні приймали значення що перевищували нега-тивний контроль у три рази [14]

Виділення сумарної РНК проводили за стандартною методикою [6] Полімераз-ну ланцюгову реакцію проводили за допомогою ампліфікатора laquoGeneAmp 2400raquo (Applied Biosystems) Використовували специфічні олігонуклеотидні праймери PVМ1 (5rsquo taactgcagatgccgtcttg 3rsquo) PVМ2 (5rsquo tgcgatgtctttgtgcgtat 3rsquo) Реакція прохо-дила за стандартних умов 1 година при 37 ordmС Отриману кДНК розводили удвічі ТЕ-буфером Після проведення ПЛР продукти реакції розділяли електрофорезом у


1 -му агарозному гелі Після завершення електрофорезу гель забарвлювали 1 -м розчином бромового етидію

Статистичний аналіз експериментальних даних проводили за параметричними критеріями нормального розподілу варіант стандартне відхилення середніх значень ndash за загальноприйнятою методикою з використанням компrsquoютерної програми управ-ління базами даних MS EXCEL 2000 [2]

Результати та їх обговорення У 2005-2011 рр проводили обстеження рослин томатів різних сортів (Lycopersicon esculentum Mill) вирощених у відкритому ґрун-ті на ураження їх вірусами В результаті були виявлені такі симптоми захворюван-ня світло-жовта і хлоротична мозаїки ниткоподібність листкової пластинки буґ-ристість пухирчастість зморшкуватість та сильна деформація листків Але значну увагу привернули симптоми скручування листків у вигляді laquoчовника вгоруraquo які раніше не були описані та вивчені (рис 1)

Рис 1 Симптоми скручування листків томатів у вигляді laquoчовника вгоруraquo а ndash сорт Амурская заря б ndash сорт Хурма вг ndash гібрид Соляроссо F1

д ndash сорт Ликурич е ndash сорт Early north

Саме з такими симптомами і були відібрані рослини томатів для подальших до-сліджень

Інфекційна природа даних симптомів на томатах була підтверджена серією екс-периментальних інфікувань на здорові молоді рослини томатів

Вивчення біологічних властивостей вірусів проводили методом біологічного тес-тування Серед усіх взятих рослин-індикаторів на ураження соком з хворих томатів прореагували Datura metel D stramonium та Chenopodium quinoа На Datura metel (18-та доба) утворювалися локальні некрози у кількості 20-40 шт на 1 листок які були світло-коричневого кольору з темно-коричневим ореолом розмірами 2-8 мм більшість із них локалізувалися біля жилок (рис 2)

На 18-й день після інокуляції на листках Ch quinoа утворилося від 10 до 35 ло-кальних некрозів на один листок світло-коричневого кольору з темно-коричневим ореолом розмірами 2-9 мм у діаметрі А рослини Datura stramonium на 14-й день прореагували появою системної реакції у вигляді жовто-зеленої мозаїки листкової пластинки пожовтіння та скручування молодих листків (рис 2)

Із хворих рослин томатів були отримані очищені вірусні препарати які були до-сліджені за допомогою електронної мікроскопії (ЕМ) Результати показали наявність


у рослинах більшості сортів із симптомами laquoчовник вгоруraquo ниткоподібних вірусних часток двох розмірів ndash 780 plusmn 20 times13 нм та 620 plusmn 20 times 13 нм (рис 3)

Рис 2 Реакція на рослинах-індикаторах Datura metel (А) D stramonium (Б) і Chenopodium quinoа (В) після інокуляції соком хворих рослин томатів

зліва ndash контроль справа ndash дослід

Рис 3 Електронограма вірусних часток виявлених у листках томатів

із симптомами laquoчовник вгоруraquo гібрид Соляроссо F1 Полтавська обл 2011 р JEM-1230 з приставкою

Окрім листків у роботі досліджували плоди і насіння хворих томатів у резуль-таті чого встановлено що і вони місять вірусні частки нитковидної форми розміра-ми 560plusmn 20 times13 нм (рис 4а) і 630plusmn 20 times12 нм (рис 4б)


Рис 4 Електронограма вірусних часток виявлених у плодах і насінні томатів а ndash плоди сорту Воронежский ранний б ndash насіння сорту Дары Заволжья

За морфологією виявлені нами віруси схожі до Y- та М-вірусів картоплі (YВК та МВК) які представляють собою ниткоподібні вірусні частки [20] Це припущення підтверджується даними наукової літератури в яких йдеться про виявлення МВК на рослинах томатів у Європі та про те що цей вірус завжди виявлявся в комплексі з ВОМ або Y-вірусом картоплі [1519] Крім того деякими авторами показано що схожі до виявлених нами симптомів (скручування листків томатів) викликає YВК [21]

З метою діагностики вірусів був проведений ІФА з використанням антитіл до Y- і МВК У всіх протестованих зразках рослин томатів були ідентифіковані саме ці віруси Це перше повідомлення про інфікування рослин томатів на території Украї-ни Y- і М-вірусами картоплі Аналіз також показав що рослини уражені як комплек-сом YВК+МВК так і моноінфекцією На 10-ти сортах томатів детектовано змішану інфекцію (YВК+МВК) (табл 1)

Таблиця 1

Перелік сортів томатів які уражені змішаною інфекцією YВК+МВКСорт Місце відбору зразків Рік відбору зразків

Хурма Київська обл 2011Новичек Полтавська обл 2010Соляроссо F1 Полтавська обл 2005 2011Пародист Полтавська обл 2010Любимый Полтавська обл 2010W2BHW Полтавська обл 2010Ouson Полтавська обл 2010Амурская заря Полтавська обл 2008-2010Маестро Полтавська обл 200870В 5907 Полтавська обл 2008Особливу увагу привернув той факт що у рослинах із симптомами скручуван-

ня листків ідентифіковано два віруси Y- і МВК а в безсимптомних ndash тільки МВК (рис 5)

Можна зробити висновок що симптоми скручування листкових пластинок на томатах викликаються Y-вірусом картоплі що є важливою діагностичною ознакою виявленого нами захворювання на цій культурі Наші результати підтверджуються даними літератури в яких наголошується про те що YВК спричинює скручуван-ня листків помідорів [21] а МВК-інфекція на цих рослинах є безсимптомною [15 17]

Результати ІФА показали що 13 сортів досліджуваних томатів інфіковані М-віру-сом картоплі (табл 2)


0

05

1

15

2

25

405630

Рис 5 Вміст антигенів МВК та YВК у рослинах томатів сорту Хурма

Таблиця 2

Перелік сортів томатів які уражені М-вірусом картопліСорт Місце відбору зразків Рік відбору зразків

Хурма (безсимптомні рослини) Київська обл 2011Дары Заволжья Полтавська обл 2008-2010Ликурич Харківська обл 2010Д-83 Донбас Полтавська обл 2009Д-82 Фатима Полтавська обл 2010Д-47 Воронежский ранний Полтавська обл 2009Д-65 Регіони Полтавська обл 2010Д-29 Харківська обл 2010Д-70 Харківська обл 2010Д-45 Харківська обл 2010Д-3 Харківська обл 2010Підмосковні ранні Київська і Полтавська обл 2011Деборао Кіровоградська обл 2011

З усіх протестованих сортів рослин томатів 5 були інфіковані YВК Early north (Харківська обл 2010) Дружба (Полтавська обл 2010) Рання любов (Полтавсь-ка обл 2009) Колокола (Полтавська обл 2009) Яблунька Росії (Полтавська обл 2011)

Y-вірус картоплі належить до роду Potyvirus найбільшого за кількістю представ-ників та найбільш значимим так як більшість вірусів в ньому є економічно важли-вими Відомо що УВК на рослинах томатів викликає різноманітні симптоми найпо-ширеніші із них ndash прижилкова мозаїка на листках слабка плямистість та деформація листкової пластинки Однак автори Chowfl a et al зазначають що симптоми цього захворювання на польових рослинах можуть бути дещо іншими та проявлятися у вигляді темно-коричневих некрозів слабкої крапчастості та деформації листків Жодних симптомів на плодах хворих рослин не відмічено [13] Наші дослідження показали що томатний ізолят YВК в Україні викликає схожі симптоми захворюван-ня а саме скручування листків та зморшкуватість рослини

Окрім цих вірусів усі зразки томатів були перевірені на наявність Х-вірусу кар-топлі та вірусу скручування листків картоплі які за даними літератури є широко розповсюдженими на картоплі та томатах [4] Результат ІФА виявився негативним що свідчить про відсутність антигенів цих вірусів у досліджуваних нами рослинах томатів


Результати ІФА були підтверджені методом полімеразної ланцюгової реак-ції (ПЛР) Аналіз результатів показав наявність продукту ампліфікації розміром 276 пн що відповідає кДНК до РНК М -вірусу картоплі (рис 6)

3 4 5 - + 1 2

Рис 6 Електрофореграма продуктів ЗТ-ПЛР визначення М-вірусу картоплі у рослинах томатів треки 1 ndash сорт Ликурич 2 ndash сорт Воронежский ранний 3 ndash сорт Дары Заволжья 4 ndash сорт Донбас 5 ndash сорт Фатима М ndash маркер ДНК

100 200 300 400 500 (кб) К+ ndash позитивний контроль (276 пн) К- ndash негативний контроль

Таким чином результати ПЛР як і ІФА свідчать про наявність МВК у рослинах томатів сортів Дары Заволжья Воронежский ранний Ликурич Донбас і Фатима

Відомо що ізоляти одного вірусу можуть відрізнятися за розмірами вірусних часток колом чутливих рослин точкою температурної інактивації масою капсидно-го білка та іншими властивостями [9] Проведена нами ідентифікація вірусів надала змогу порівняти біологічні властивості виявлених нами томатних ізолятів МВК та YВК з відомими Так за даними літератури ці віруси викликають появу локальної реакції на декількох рослинах-індикаторах із різних родин в тому числі і на Datura metel та Ch quinoa [20] Нами зrsquoясовано що томатні ізоляти МВК і YВК не відрізня-ються від відомих за колом діагностичних рослин-індикаторів для томатного ізоля-ту МВК ndash це Datura metel (місцеві некрози) для YВК ndash Ch quinoa (некрози) Окрім чутливих рослин до біологічних властивостей вірусів відноситься також морфоло-гія і розміри віріонів За нашими даними виділені ізоляти МВК та YВК мають ха-рактерну для поті- та карлавірусів ниткоподібну форму і відрізняються від відомих картопляних ізолятів своїми розмірами

Для вивчення фізико-хімічних властивостей виявлених вірусів був проведений електрофорез білків Аналіз капсидних білків вірусів виділених з рослин томатів показав наявність двох пептидів із молекулярною масою 32plusmn1 кДа і 29plusmn1 кДа Ці два білки подібні за молекулярною масою до типових представників Potyviridae і Carlaviridae На нашу думку такі результати співпадають із даними Grieco F et al Zitter T Provvidenti R [15 21] які повідомляють про можливу участь даних вірусів у появі симптомів скручування листків у вигляді laquoчовникаraquo

У результаті досліджень встановлено що структурний білок томатного ізоляту МВК має молекулярну масу 32plusmn1 кДа За даними літератури МВК містить капсид-ний білок молекулярною масою 33 кДа [20] Отже у ході проведених досліджень показано що виділений нами томатний ізолят MВК має білок у своєму складі такої ж маси як і в роботах інших авторів що говорить про їх однакові фізико-хімічні властивості Відомо що до YВК входить капсидний білок молекулярна маса якого близько 30 кДа [20] За даними інших авторів маса цього поліпептиду YВК складає


296 кДа [16] Отже томатному ізоляту YВК виділеному нами з рослин вирощених за умов України характерна дещо інша молекулярна маса структурного білка

Зважаючи на отримані нами результати щодо обстеження томатів на наявність вірусів поява нових захворювань в умовах відкритого ґрунту потребує безперервно-го вірусологічного контролю селекції томатів та їх гібридів на комплексну стійкість до найбільш шкодочинних патогенів

Щоб ефективно боротися з хворобою треба знати природу збудника його біо-логічні властивості При визначенні інфекційного агента необхідно застосовувати широкий набір вірусологічних методів наприклад методів відбору рослинного ма-теріалу виділення та очищення вірусів електронно-мікроскопічні фізичні імуно-логічні молекулярні Вивчення властивостей виявлених нами вірусів та шляхів їх передачі надасть можливість певною мірою лімітувати їх ареал і як наслідок змен-шити втрати врожаю культури

ЛТ Мищенко АА Дунич ЕИ Данилова ВП Полищук

Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко

СВОЙСТВА ТОМАТНЫХ ИЗОЛЯТОВ М- И Y-ВИРУСОВ КАРТОФЕЛЯ В УКРАИНЕ

Р е з ю м еОбследовано 27 сортов томатов (Lycopersicon esculentum Mill) из разных областей Украи-

ны на наличие вирусной инфекции и обнаружены ранее неописанные симптомы заболевания для данной культуры В процессе исследований показано что эти болезни вызваны М- и Y-ви-русами картофеля Это первое сообщение об инфицировании растений томатов указанными вирусами в Украине Некоторые биологические и физико-химические свойства возбудителей были изучены с использованием целого комплекса методов Выявлены отличия томатных изолятов МВК и УВК от известных по морфологии и массе структурного белка

Ключевые слова Lycopersicon esculentum Mill М-вирус картофеля Y-вирус картофеля растения-индикаторы морфология вирусов структурные белки

LT Mishchenko AA Dunich OI Danilova Polischuk VP

Taras Shevchenko Kyiv National University

PROPERTIES OF POTATO VIRUS M AND POTATO VIRUS Y ISOLATES IN UKRAINE

S u m m a r y

Monitoring of viruses of tomato plants (Lycopersicon esculentum Mill) was carried out Twenty-seven varieties of tomatoes from different regions of Ukraine were tested for the virus presence New symptoms which had not been described before were revealed It was found out that the diseases were caused by Potato virus M and Potato virus Y This is the fi rst report about the infection of tomato plants with such viruses in Ukraine Some biological physical and chemical properties of the pathogens are studied Differences between PVM PVY and the known isolates were found in morphology and molecular weight of structural protein

The paper is presented in UkrainianK e y w o r d s Lycopersicon esculentum Mill Potato virus M Potato virus Y indicator plants

virus morphology structural proteins T h e a u t h o rrsquos a d d r e s s Mishchenko LT Taras Shevchenko Kyiv National University

Educational and Scientifi c Centre Institute of Biology 6413 Volodymyrska St Kyiv 01601 Ukraine


1 Бойко АЛ Практикум із загальної вірусології ndash Київ Видавничо-поліграфічний центр ldquoКиївський університетrdquo 2000 ndash 269 с

2 Лакин ГФ Биометрия ndash [3-е изд перераб и доп] ndash М Высшая школа 1980 ndash С 2933 Міщенко ЛТ Вірусні хвороби озимої пшениці ndash Київ Фітосоціоцентр 2009 ndash 352 с 4 Мищенко ЛТ Данилова ЕИ Чигрин АВ Электронно-микроскопические исследования

вирусов вызывающих скручивание листьев томата открытого грунта в Лесостепи Украи-ны Интегрированная защита растений стратегия и тактика ndash Минск Несвиж 2011 ndash С 543ndash546

5 Міщенко ЛТ Чигрин АВ Янішевська ГС Виявлення вірусів на томатах за умов відкритого і закритого ґрунту Таврійський науковий вісник ndash 2010 ndash Вип 71 Ч 3 ndash С 45ndash50

6 Мельничук МД Антіпов ІО Спиридонов ВГ Молекулярна діагностика та ідентифікація X- Y- M- S- L- вірусів картоплі (Solanum tuberosum L) методом полімеразної ланцюгової реакції (Методичні рекомендації) ndash Видавничий центр НАУ Київ 2008 ndash 22 с

7 Николаева ОВ Новиков ВК Каграманов ВН Определение M- и S-вирусов картофеля ме-тодом иммуноферментного анализа Сельскохозяйственная биология ndash 1985 ndash 2 ndash С 96ndash101

8 Пересипкін В Ф Марков І Л Шелестова В С Практикум із основ наукових досліджень у захисті рослин ndash Київ 2000 ndash 164 с

9 Поліщук ВП Будзанівська ІГ Рижук СМ Патика ВП Бойко АЛ Моніторинг вірусних інфекцій рослин в біоценозах України ndash Київ Фітосоціоцентр 2001 ndash 220 с

10 Руднєва ТО Бисов АС Шевченко ТП Діагностика вірусів у насіннєвому матеріалі рослин родини Solanaceae Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва 4 Всеук-раїнська науково-практична конференція молодих учених (Сколе 1ndash4 червня 2010 р) Тези доп ndash Сколе 2010 ndash С 220ndash221

11 Ручкін ОВ Рудь АМ Рівень споживання та сегменти ринків овочів Міжнародний науко-во-виробничий журнал laquoЕкономіка АПКraquo ndash 2002 ndash Вип 97 ndash С 98ndash101

12 Салига ЮТ Снітинський ВВ Електронна мікроскопія біологічних обrsquoєктів ndash Львів 1999 ndash 152 с

13 Chowfl a SC Sharma PK Thakur PD Viruses infecting tomato and their management Diseases of Horticultural Crops Vegetables Ornamentals and Mushrooms ndash New Delhi 1999 ndash P 158ndash184

14 Clark M F Adams A N Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses J Gen Virology ndash 1977 ndash 34 ndash P 574ndash586

15 Grieco F Gallitelli D Franco A Potato virus M in tomato crops in Southern Italy J Plant Pathology ndash 1997 ndash 78 N 1 ndash P 45ndash49

16 Hay J M Fellowes A P Timmerman G M Nucleotide sequence of the coat protein gene of a necrotic strain of potato virus Y from New Zealand Archives of Virology ndash 1989 ndash 107 N 1-2 ndash P 111ndash122

17 Hooker W J Compendium of potato diseases ndash American Phytopatological Society 1981 ndash 125 р

18 Laemmli U K Cleavage of structural proteins during assemblу of the head of bacteriophage T4 U K Laemmli Nature ndash 1970 ndash 227 N 15 ndash P 608ndash685

19 Loebenstein G Berger P Brunt A A Lawson R H Virus and Virus-Like Diseases of Potatoes and Production of Seed-Potatoes ndash Kluwer Academic Press 2001 ndash 463 p

20 Virus taxonomy Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Eds C M Fauquet M A Mayo J Maniloff U Desselberger and L A Ball ndash London Academic Press 2006 ndash 1259 p

21 Zitter T A Provvidenti R Virus Diseases and Disorders of Tomato Vegetable MD Online ndash 1984 ndash 10 ndash P 735ndash740



THORNacircsup3eumlaringiquest sup3 aumlagraveograveegrave

БОЙКО АНАТОЛІЙ ЛЕОНІДОВИЧ(до 75-річчя з дня народження)

доктор біологічних наук професор академік Національної академії аграрних наук і Академії наук вищої школи України заслужений діяч науки і техніки України

ndash відомий вірусолог еколог біотехнолог Народився 11 березня 1938 р смт Кор-нин Попельнянського району Житомирської обл Доктор біологічних наук (1983) професор (1984) академік НААН (1993) академік АН ВШ України (відділення біо-логії) (1995) лауреат премії ім ДК Заболотного НАН України (1997) заслужений діяч науки і техніки України (2004) лауреат відзнаки Ярослава Мудрого АНВШУ (2004) лауреат Державної премії України (2005) Закінчив Житомирський сільсь-когосподарський інститут (1962) З 1963 по 1978 року ndash аспірант співробітник Ін-ституту мікробіології та вірусології ім ДК Заболотного НАН України з 1978 по 2004 ndash завідувач кафедри вірусології Київського національного університету ім Та-раса Шевченка З 2004 ndash професор кафедри У 1997 р ndash експерт Європейської комісії ldquoІнкокопернікусrdquo (Брюсель) Виступав науковим консультантом із питань вірусоло-гії в наукових центрах та університетах Угорщини Польщі Вrsquoєтнаму США Чехо-словаччини та ін В 1984-1995 рр АЛ Бойко був науковим керівником лабораторії екології і токсикології біологічного факультету Київського національного універси-тету імені Тараса Шевченка У 1967 р захистив кандидатську дисертацію (під керів-ництвом члена-кореспондента АН УРСР СМ Московця) 1983 р докторську а в 1984 р йому було присвоєно вчене звання професора кафедри вірусології У 1993 р обрано дійсним членом (академіком) Української академії аграрних наук

Наукові дослідження повrsquoязані зі структурою та функціями вірусів за різних екологічних ситуацій вивченням нових вірусів рослин (вперше отримав результати з седиментаційних властивостей морфолого-структурної будови і локалізації цих вірусів у клітині) бактерій риб розробленням біотехнологій Він та його учні від-


крили ряд нових положень у поведінці вірусів при дії на них радіації геліокосмофі-зичних факторів у поширенні вірусів у грибах та ін

Професор АЛБойко зробив вагомий вклад у розвиток науки зокрема вперше здійснив перенесення генів рослинних вірусів у клітини пухлин ссавців виявив явище чутливості вірусів до їхніх РНК і ДНК до постійного магнітного поля що розширює уявлення стосовно їх компліментарності Здобутком ученого і його уч-нів є створення новітніх біотехнологій оздоровлення від вірусів понад 500 сортів клонів рослин які впроваджено в АПК України Фундаментальні енциклопедичні знання галузей біології дали йому можливість передбачити які саме домінуючі на-укові напрями досліджень актуально розвивати на перспективу в галузі загальної вірусології і біобезпеки

Створив наукову школу Під його керівництвом підготовлено більше 33 кан-дидатів та докторів наук він та його учні виконують роботи з космічної біології (НАН України НАСА minus США) екологічного стану довкілля Ним підготовлено та створено наукову школу ldquoСтруктура та функція вірусів за різних екологічних умовrdquo сотні спеціалістів і магістрів вірусологів які спеціалізувались на кафедрі вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка Автор понад 450 наукових праць зокрема ldquoЭкология вирусов растенийrdquo (К 1990) ldquoВи-русы и вирусные заболевания хмеля и розы эфиромасличнойrdquo (К 1976) ldquoМате-матичні моделі в дослідженні вірусів рослинrdquo (К 2001) ldquoFundamental and applied problems in phytovirologyrdquo Inter conf ndash 1994 (Vice Chair) ldquoBioresourses and virusesrdquo II International conference 1998 (Chairman Organising Commettee) ldquoStudying of the infl uence of Phytovirus of Plantsrsquo Organism in Condions of Ecological Instability and its Estimation by Mathematical Modelling in CEIS System In book BScholz-Reiter H-D Staglmank A Nothe Ed Process Modelling ndash Berlin 1999 (співавт) та ін

Праця АЛ Бойко на благо людей і науки відзначена високими державними наго-родами почесними грамотами Президій НАН і НААН України Кабінету Міністрів України його обрано заслуженим професором КНУ ім Тараса Шевченка він є ла-уреатом премії НААН та лауреатом регіонального конкурсу Міжнародної академії рейтингових технологій і соціології Золота фортуна - 2012 має зарубіжні дипло-ми сертифікати

Сьогодні АЛ Бойко є членом спеціалізованих вчених рад Товариства мікробіо-логів України членом редколегій фахових наукових журналів керівником аспіран-тів та докторантів читає лекції в Національному університеті біоресурсів і приро-докористування а також студентам фізикам кібернетикам

Наші вітання Анатолію Леонідовичу з ювілеєм йдуть із непідробленою щирістю і бажанням здоровrsquoя творчих успіхів і теплоти від учнів співробітників Інституту мікробіології і вірусології НАН України Інституту біології Київського Національ-ного університету

Колективи Інституту мікробіології і вірусологіїім ДК Заболотного НАН України

Інституту біології та кафедри вірусологіїКиївського Національного університету ім Тараса Шевченка

Товариство мікробіологів України

редколегія і редакція laquoМікробіологічного журналуraquo


СВІТЛОЇ ПАМrsquoЯТІ АНАТОЛІЯ ЯКОВИЧА ЦИГАНЕНКА

(25061929 ndash 29112012 рр)

29 листопада 2012 року на 84-му році пішов з життя Анатолій Якович Циганенко ndash відомий вчений-мікробіолог видатний організатор вищої медичної освіти СРСР та України

Анатолій Якович був яскравою людиною неперевершеною особистістю настав-ником та вчителем з великої літери

Анатолій Якович Циганенко народився 25 червня 1929 року в селі Кочубеївка Чутівського району Полтавської області

У 1948 році після закінчення Миргородської середньої школи 3 Анатолій Яко-вич поступив на перший курс санітарно-гігієнічного факультету Харківського ме-дичного інституту з яким надалі повrsquoязано його становлення як людини педагога вченого керівника

З 1954 по 1956 р він навчався в аспірантурі на кафедрі мікробіології з 1956 року працював асистентом з 1959 року ndash доцентом З 1971 по 2012 рік АЯ Циганенко був завідувачем кафедри мікробіології вірусології та імунології Харківського націо-нального медичного університету

Великий організаторський талант і прогресивні ідеї щодо подальшого розвитку навчального процесу дозволили Анатолію Яковичу протягом багатьох років плідно працювати на найвищих посадах у вузі З 1964 по 1986 рік він був проректором з навчальної роботи а в 1986-2005 роках minus ректором Харківського державного медич-ного університету з 2005 року ndash почесний ректор ХНМУ

Співробітниками кафедри під керівництвом професора АЯ Циганенка виконана серія наукових робіт із вивчення комбінованої дії антибіотиків та біостимуляторів при гнійних інфекціях

Анатолій Якович одним із перших в Україні розпочав наукові дослідження у сфері спрямованого транспорту антибіотиків за допомогою ліпосом розшифруван-ня молекулярно-генетичних механізмів колективної поведінки бактерій

Науковий доробок Анатолія Яковича Циганенка складають 525 наукових робіт 34 монографії 28 авторських свідоцтв на винаходи і патенти 32 методичні реко-мендації Результати досліджень були оприлюднені і одержали позитивну оцінку на понад 100 міжнародних і вітчизняних конгресах зrsquoїздах симпозіумах та конферен-ціях АЯ Циганенко є автором 23 підручників і навчальних посібників


Анатолій Якович був дуже чуйною людиною Ніяка проблема викладача спів-робітника або студента не залишала його байдужим До останніх днів його життя до нього йшли люди за порадою або допомогою

АЯ Циганенко був блискучим лектором Лекції прочитані Анатолієм Якови-чем памrsquoятають та багато років згадують випускники медичного університету різ-них років

Славний трудовий шлях у організаторській та науково-педагогічній діяльності Анатолія Яковича отримав високе Урядове та громадянське визнання він був докто-ром медичних наук професором мав почесне звання laquoЗаслужений працівник вищої школи УРСРraquo (1979) був обраний дійсним членом Академії наук Вищої школи Ук-раїни (1995) Української академії наук національного прогресу (1993) Міжнародної Академії компrsquoютерних наук і систем (1993) Нью-Йоркської Академії наук (1996) почесним членом Варшавської Академії медицини (1998) академіком Всесвітньої Академії медичних наук імені Альберта Швайцера (1999) Він був також почесним академіком Української медичної стоматологічної академії (1995) Тернопільського державного медичного університету (2011) та Харківського інституту мікробіології та імунології ім ІІМечникова НАМН України (2012)

Анатолія Яковича було нагороджено радянським орденом ldquoЗнак пошаниrdquo Почес-ною відзнакою Президента України ndash орденом ldquoЗа заслугиrdquo ΙΙΙ ступеня (1996) ор-деном ldquoЗа заслугиrdquo ΙΙ ступеня (1999) орденом ldquoЗа заслугиrdquo Ι ступеня (2004) знаком ldquoВідмінник освіти Україниrdquo почесною грамотою Президії Верховної Ради України орденом ldquoЗа розвиток науки і освітиrdquo орденом ldquoЗа трудові досягненняraquo ΙV ступе-ня золотою медаллю ndash ldquo10 років незалежності Україниrdquo визнано Харківrsquoянином ХХ століття та Харківrsquoянином 2002 року 6 медалями та іншими нагородами

Анатолій Якович Циганенко був засновником та багаторічним головним редакто-ром наукових журналів ХНМУ laquoМедицина сьогодні і завтраraquo та laquoЕкспериментальна і клінічна медицинаraquo з 2005 року до кінця життя ndash почесним головним редактором з 2010 р ndash головою редакційної ради протягом останніх 20-ти років ndash членом редак-ційної ради laquoМікробіологічного журналуraquo

Співробітники та студенти Харківського національного медичного університе-ту все медичне товариство мікробіологи вірусологи паразитологи та імунологи України сумують через втрату Анатолія Яковича Циганенка якого ми назавжди запамrsquoятаємо оптимістичною енергійною та чуйною людиною

Ректорат та громадські організації Харківського національного медичного університету

Правління Харківської обласної філії товариства мікробіологів епідеміологів та паразитологів України

Редколегія журналу


CONTENTS

Experimental Works

Smirnova GF Pidgorskyi VS Metabolism Features of Bacteria Resistant to High Concentrations of Chromate

Pirog TP Shevchuk TA Antonyuk SI Kravchenko YeYu Iutynska HO Effect of Univalent Cations on Synthesis of Surfactants by Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241

Patyka V P Symochko L Y Soil Microbiological Monitoring of Natural and Transformed Ecosystems in the Transcarpathian Region of Ukraine

Gritsay RV Antipov IO Varbanets LD Identifi cation of 16S RNA and PagL Genes of Ralstonia solanacearum

Vasyliv OM Hnatush SO Infl uence of Transition Metal Compounds on Superoxide Dismutase Activity of Sulfur Reducing Desulfuromonas acetoxidans Bacteria

Boretskaya MA Suslova OS Methods for Extraction of Exopolymeric Complex of Plancton and Biofi lm Growth Mode of Stenotrophomonas maltophilia 22M

Balko AB Balko OI Avdeeva LV Biofi lm Formation by Pseudomonas aeruginosa Strains of Ukrainian Collection of Microorganisms

Kurchenko IN Polygalacturonase Activity of Microscopic Fungi of Different Trophic Groups

Churkina LN Avdeeva LV Voychuk S I Yaroshenko LV Pseudomonas batumici 1720 Properties Variability after Long-Term Storage

Brekhlichuk P P Petrov V O Bati V V Levchuk O B Boyko N V Biological Decontamination of the Imprints Obtained from Different Dental Materials

Tovkach FІ Moroz SM Korol NA Faidiuk YV Kushkina AI Polyvalence of Bacteriophages Isolated from Fruit Trees Affected by Bacterial Fire Blight

Mishchenko LT Dunich AA Danilova OI Polischuk VP Properties of Potato Virus M and Potato Virus Y Isolates in Ukraine

Jubilees and DatesBoyko Anatoliy Leonidovych On His 75th Birthday

Blessed Memory of Anatoliy Yakovych Tsyganenko

3

10

21

32

37

45

50

57

67

72

89

98

100

80

ДО УВАГИ ЧИТАЧІВ

Стаття авторів LP Babenko LM Lazarenko LM Shynkarenko VV Mokrozub VS Pidgorskyi MJa Spivak надрукована в Мікробіологічному журналі 6 2012 р помилково з технічних причин



УДК57922+6618881+661877























minus ClO4minusWO4










Таблица 1


штамма




50 100 200 50 100 200 Mо6+ V5+ Cl5+ Cl7+

53 + + + + + - -54 + + + + - -59 + + + + - -61 + + + + + + - -64 + + + + - -51 + + + - -69 + + + + + - -58 + + + + + + + - -43 + + - -67 + + + + + + - -45 + + + - -85 + plusmn + + - -86 + + + + + + - -131 + + + + - -132 + + + + + - -101 + + + + - -68 + + + + + + + + - -

151 + + + + - -152 + + + + - -70 + + + + + + + + - -






















































Таблица 1


Фермент





















Таблица 2





25 50 100 25 50 100 25 50 100





















Таблица 3


Фер-мент




25 50 100 25 50 100 25 50 100

НАДФ

+ -глутамат



ФЕП

-синтетаза


ФЕП

-карбокси-

киназа


ФЕП

-карбок-

силаза


Изоцитрат

-лиаза







Таблица 4



среде 1с KNO3

















Таблица 5























































































Показник















H=ΣPiln Pi










варі-анту




103


106


106

Педотро-фи

106


Azoto-bacter

1 500 17 707 233 168 432 80

2 600 20 430 261 188 364 68

3 700 20 346 287 200 322 60

4 800 21 293 324 226 314 58

5 900 25 166 370 296 218 54

6 1000 26 130 380 312 196 50

7 1100 28 122 394 365 183 41

НІР05 - 032 054 041 018 032 067










варі-анту





1 500 020 023 0602 600 031 044 0843 700 037 057 0934 800 050 077 1075 900 094 180 1316 1000 118 240 1507 1100 129 300 150








м



106


103



ту 106


терії106


106

Azoto-bacter

1 0 080 64 079 258 441 14

2 50 168 40 096 189 322 18

3 100 242 32 131 113 295 26

4 50 (оп) 197 29 138 124 264 20

5 100 (оп) 246 25 156 115 286 44







м



106


103


106




106

Azoto-bacter

1 5 388 103 124 317 378 19

2 50 567 80 167 287 293 26

3 100 1102 62 195 231 222 52

4 50 (к) 606 44 221 207 203 39

5 100 (к) 1651 28 266 189 124 63














ФА Висота


ФА




















Висота



добу






























Висота













м



50 (оп) 34 54 1х10-6 50 (к) 19 24 1х10-6 500 0 1 -100 (оп) 32 75 1х10-7 100 (к) 13 20 1х10-6 1000 0 0 -






































































УДК 5771523 579258

























1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -









1 2 3 4 5 6 -






























































0 002 004 006 008 0100

05

10

15

20

25




0 2 4 6 8 10 12 14 16042

043

044

045

046

047







K 05 10 15 20 255

10

15

20

25

30

35

NiCl2

2 3 4

(а)

K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2 3 4

CoCl2 (б)







K 05 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

2 3 4

FeSO4

(а)

K 05 10 15 20 25

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

2 3 4

FeCl3 (б)








K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4

























УДК 5768620193









































































0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n










S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7




























































o









Таблица 1


































































IN Kurchenko





























a b









Штаммы

P b

atum

ici


циллин

ампи

циллин

оксаци

ллин

карбениц

иллин

стрептом

ицин

канамиц

ин

неом

ицин

моном

ицин

гентам

ицин

тетрацик

лин

левомиц

етин

эритромиц

ин

олеандом

ицин

ристом

ицин

рифам

пици

н

линком

ицин







0

10

20

30

40

50

60

70

12 24 60




12 24 60















































Табли

ця 1

Частота

виділення


і їх

асоціацій


уваних

відбитків

Кількість

осіб

відсоток



інТи

тр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток



Титр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток


відбиток

із


масою

Титр

КУО

мл



210

S sa

livar

ius

12middot

104

525

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

86

30S

saliv

ariu

s2

2middot10

4

315

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is3

1middot10

33

15S

saliv

ariu

sK

pne

umon

iae

54middot

106

315

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

4

315

S e

pide

rmid

isSt

r m

itis

33middot

105

420

S sa

livar

ius

Can

dida

16middot

106

210

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is2

8middot10

4

210

S e

pide

rmid

is1

1middot10

52

10S

epi

derm

idis

26middot

106

210

S e

pide

rmid

is1

6middot10

6

15

S a

gala

ctia

e1

8middot10

41

5S

aga

lact

iae

28middot

104

15

S a

gala

ctia

e3

4middot10

2

315

S m

itis

15middot

104

420

Str

miti

s3

2middot10

62

10S

miti

s2

6middot10

4

420

S a

ureu

s2

4middot10

54

20S

pne

umon

iae

Can

dida

14middot

106

15

S p

neum

onia

e1

1middot10

4

15

Cor

yneb

acte

rium

spp

18middot

102

420

S m

utan

sS

sapr

ophy

ticus

19middot

108

15

Sm

utan

s1

1middot10

2


Табли

ця 2


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

1Ва

нком

іцин

ВА20

Sge1

510

Rlt1

38

Rlt1

50

--

22S

ge16

1020

--

10-

-16

--

2Ам

оксици

лін

АМО

0-

-14

--

6-

-0

-нд

12-

-14

16-

-14

--

16R

lt17

3Цеф

тріаксон

ЦФА

15R

lt27

0-

-0

Rlt2

70

--

0-

-0

0-

-11

--

0R

lt20

4Оксацилін

ОКС

0-

-0

--

0-

-0

--

22S

ge20

00

--

0-

-0

--

5Гентам

іцин

ГЕН

17-

-8

--

17-

-12

Rlt1

821

--

88

Rlt2

28

--

8R

lt14

6Цеф

отаксим

ЦФТ

20R

lt23

10-

-0

Rlt2

310

--

22-

-10

10-

-10

--

10R

lt17

7Ер

итроміци

нЕР

И0

--

0-

-0

--

10R

lt18

0-

-0

0R

lt18

0-

-0

--

8Цип

рофл

оксаци

нЦИ

П20

--

18-

-0

--

16R

lt20

22S

Rge5

0lt18

1818

Rlt2

018

Rlt2

018

Rlt1

9


Табл

2 (пр

одовжен

ня)


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

9Офл

оксаци

нОФЛ

0-

-0

--

0-

-20

Sge2

0-

SR

ge50lt

150

0R

lt20

0-

-0

Rlt1

910

Рифа

мпіцин

РИФ

0-

-12

Rlt1

56

--

0R

lt23

20S

Rge2

2lt17

1212

Rlt2

312

--

12-

-11

Ампіци

лін

АМП

0R

lt15

0-

-0

Rlt1

50

--

0R

lt20

00

--

0R

lt15

0R

lt14


ЦФР

12R

lt26

25-

-0

Rlt2

614

--

20-

2525

--

25-

-25

Sge1

813

Амікацин

АМК

0-

-20

--

20-

-0

Rlt1

60

--

2020

SR

ge22lt

1920

--

20S

ge13

14Тетрацик

лін

ТЕТ

0-

-0

Rlt2

00

--

0R

lt19

0R

lt20

00

Rlt1

90

--

0-

-15

Цеф

тазидім

ЦФД

6-

-8

--

14-

-10

--

14-

-15

16-

-17

--

0R

lt19

16Цеф

окситим

ЦФК

0-

-14

--

0-

-14

Rlt2

221

--

1414

-нд

14-

нд14

-нд


МПН

16R

lt25

20-

-10

Rlt2

50

--

30-

-20

20-

-20

--

20S

Rge2

2lt16

Примітка

ЗЗР

ndash зони

затрим

ки росту

в мм

які

корелюють





SR

ndash S

ensi

tive

Res

ista

nt ndash


штам

ЗЗР(

EUC

AST

) ndashзони

затрим

ки росту

в мм

згідно

з EU

CA

ST

ldquo-rdquo



до даного

штаму

нд

ndash немає

даних



до даного

штаму



OR

SA (o

xaci

llinr

esis

tant

S a

ureu

s = M

RSA

)

Дані E

UC

AST


trept

ococ

cusm

utan







з п






25middot10400


S aureus35middot108


5middot10300


12middot106

11middot108

27middot107

018middot108

91middot104

025middot104


MRSA25middot108




MRSA51middot105


011middot106

07 Кріп MRSA



010middot102






















































Eho

60-3m Ex - 20 x 102 - -

60-1n Ex 40 x 102 - 36 x 103 60 x 102

60 (59 E105) Ex - - 40 x 103 -

43I Ex 60 x 103 - - -

43II Ex 32 x 103 60 x 102 - -

Pag

g150Ex 55 x 103 - - -

St 45 x 103 - - -

g157Ex 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

St 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

97 - 1 Ex 14 x 104 - 57 x 103 -

97 - 2 St 20 x 103 - 15 x 103 -













Таблица 2
















V [рМА260-3m] 86 88 0 0 0VI [рМА2K8] 100 69 50 0 0

59 0 33 0 0 049 0 36 0 0 0

E105 100 50 0 0 0FE44 X 53 0 100 0









60 ndash 3m + + - - +t + - - - + +60(59 E105) +t - + + +t - - + - + +























ecology






УДК 63564 5783 620187












































Таблиця 1







0

05

1

15

2

25

405630


Таблиця 2








3 4 5 - + 1 2




















S u m m a r y














































(25061929 ndash 29112012 рр)






















УДК57922+6618881+661877























minus ClO4minusWO4










Таблица 1


штамма




50 100 200 50 100 200 Mо6+ V5+ Cl5+ Cl7+

53 + + + + + - -54 + + + + - -59 + + + + - -61 + + + + + + - -64 + + + + - -51 + + + - -69 + + + + + - -58 + + + + + + + - -43 + + - -67 + + + + + + - -45 + + + - -85 + plusmn + + - -86 + + + + + + - -131 + + + + - -132 + + + + + - -101 + + + + - -68 + + + + + + + + - -

151 + + + + - -152 + + + + - -70 + + + + + + + + - -






















































Таблица 1


Фермент





















Таблица 2





25 50 100 25 50 100 25 50 100





















Таблица 3


Фер-мент




25 50 100 25 50 100 25 50 100

НАДФ

+ -глутамат



ФЕП

-синтетаза


ФЕП

-карбокси-

киназа


ФЕП

-карбок-

силаза


Изоцитрат

-лиаза







Таблица 4



среде 1с KNO3

















Таблица 5























































































Показник















H=ΣPiln Pi










варі-анту




103


106


106

Педотро-фи

106


Azoto-bacter

1 500 17 707 233 168 432 80

2 600 20 430 261 188 364 68

3 700 20 346 287 200 322 60

4 800 21 293 324 226 314 58

5 900 25 166 370 296 218 54

6 1000 26 130 380 312 196 50

7 1100 28 122 394 365 183 41

НІР05 - 032 054 041 018 032 067










варі-анту





1 500 020 023 0602 600 031 044 0843 700 037 057 0934 800 050 077 1075 900 094 180 1316 1000 118 240 1507 1100 129 300 150








м



106


103



ту 106


терії106


106

Azoto-bacter

1 0 080 64 079 258 441 14

2 50 168 40 096 189 322 18

3 100 242 32 131 113 295 26

4 50 (оп) 197 29 138 124 264 20

5 100 (оп) 246 25 156 115 286 44







м



106


103


106




106

Azoto-bacter

1 5 388 103 124 317 378 19

2 50 567 80 167 287 293 26

3 100 1102 62 195 231 222 52

4 50 (к) 606 44 221 207 203 39

5 100 (к) 1651 28 266 189 124 63














ФА Висота


ФА




















Висота



добу






























Висота













м



50 (оп) 34 54 1х10-6 50 (к) 19 24 1х10-6 500 0 1 -100 (оп) 32 75 1х10-7 100 (к) 13 20 1х10-6 1000 0 0 -






































































УДК 5771523 579258

























1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -









1 2 3 4 5 6 -






























































0 002 004 006 008 0100

05

10

15

20

25




0 2 4 6 8 10 12 14 16042

043

044

045

046

047







K 05 10 15 20 255

10

15

20

25

30

35

NiCl2

2 3 4

(а)

K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2 3 4

CoCl2 (б)







K 05 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

2 3 4

FeSO4

(а)

K 05 10 15 20 25

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

2 3 4

FeCl3 (б)








K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4

























УДК 5768620193









































































0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n










S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7




























































o









Таблица 1


































































IN Kurchenko





























a b









Штаммы

P b

atum

ici


циллин

ампи

циллин

оксаци

ллин

карбениц

иллин

стрептом

ицин

канамиц

ин

неом

ицин

моном

ицин

гентам

ицин

тетрацик

лин

левомиц

етин

эритромиц

ин

олеандом

ицин

ристом

ицин

рифам

пици

н

линком

ицин







0

10

20

30

40

50

60

70

12 24 60




12 24 60















































Табли

ця 1

Частота

виділення


і їх

асоціацій


уваних

відбитків

Кількість

осіб

відсоток



інТи

тр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток



Титр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток


відбиток

із


масою

Титр

КУО

мл



210

S sa

livar

ius

12middot

104

525

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

86

30S

saliv

ariu

s2

2middot10

4

315

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is3

1middot10

33

15S

saliv

ariu

sK

pne

umon

iae

54middot

106

315

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

4

315

S e

pide

rmid

isSt

r m

itis

33middot

105

420

S sa

livar

ius

Can

dida

16middot

106

210

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is2

8middot10

4

210

S e

pide

rmid

is1

1middot10

52

10S

epi

derm

idis

26middot

106

210

S e

pide

rmid

is1

6middot10

6

15

S a

gala

ctia

e1

8middot10

41

5S

aga

lact

iae

28middot

104

15

S a

gala

ctia

e3

4middot10

2

315

S m

itis

15middot

104

420

Str

miti

s3

2middot10

62

10S

miti

s2

6middot10

4

420

S a

ureu

s2

4middot10

54

20S

pne

umon

iae

Can

dida

14middot

106

15

S p

neum

onia

e1

1middot10

4

15

Cor

yneb

acte

rium

spp

18middot

102

420

S m

utan

sS

sapr

ophy

ticus

19middot

108

15

Sm

utan

s1

1middot10

2


Табли

ця 2


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

1Ва

нком

іцин

ВА20

Sge1

510

Rlt1

38

Rlt1

50

--

22S

ge16

1020

--

10-

-16

--

2Ам

оксици

лін

АМО

0-

-14

--

6-

-0

-нд

12-

-14

16-

-14

--

16R

lt17

3Цеф

тріаксон

ЦФА

15R

lt27

0-

-0

Rlt2

70

--

0-

-0

0-

-11

--

0R

lt20

4Оксацилін

ОКС

0-

-0

--

0-

-0

--

22S

ge20

00

--

0-

-0

--

5Гентам

іцин

ГЕН

17-

-8

--

17-

-12

Rlt1

821

--

88

Rlt2

28

--

8R

lt14

6Цеф

отаксим

ЦФТ

20R

lt23

10-

-0

Rlt2

310

--

22-

-10

10-

-10

--

10R

lt17

7Ер

итроміци

нЕР

И0

--

0-

-0

--

10R

lt18

0-

-0

0R

lt18

0-

-0

--

8Цип

рофл

оксаци

нЦИ

П20

--

18-

-0

--

16R

lt20

22S

Rge5

0lt18

1818

Rlt2

018

Rlt2

018

Rlt1

9


Табл

2 (пр

одовжен

ня)


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

9Офл

оксаци

нОФЛ

0-

-0

--

0-

-20

Sge2

0-

SR

ge50lt

150

0R

lt20

0-

-0

Rlt1

910

Рифа

мпіцин

РИФ

0-

-12

Rlt1

56

--

0R

lt23

20S

Rge2

2lt17

1212

Rlt2

312

--

12-

-11

Ампіци

лін

АМП

0R

lt15

0-

-0

Rlt1

50

--

0R

lt20

00

--

0R

lt15

0R

lt14


ЦФР

12R

lt26

25-

-0

Rlt2

614

--

20-

2525

--

25-

-25

Sge1

813

Амікацин

АМК

0-

-20

--

20-

-0

Rlt1

60

--

2020

SR

ge22lt

1920

--

20S

ge13

14Тетрацик

лін

ТЕТ

0-

-0

Rlt2

00

--

0R

lt19

0R

lt20

00

Rlt1

90

--

0-

-15

Цеф

тазидім

ЦФД

6-

-8

--

14-

-10

--

14-

-15

16-

-17

--

0R

lt19

16Цеф

окситим

ЦФК

0-

-14

--

0-

-14

Rlt2

221

--

1414

-нд

14-

нд14

-нд


МПН

16R

lt25

20-

-10

Rlt2

50

--

30-

-20

20-

-20

--

20S

Rge2

2lt16

Примітка

ЗЗР

ndash зони

затрим

ки росту

в мм

які

корелюють





SR

ndash S

ensi

tive

Res

ista

nt ndash


штам

ЗЗР(

EUC

AST

) ndashзони

затрим

ки росту

в мм

згідно

з EU

CA

ST

ldquo-rdquo



до даного

штаму

нд

ndash немає

даних



до даного

штаму



OR

SA (o

xaci

llinr

esis

tant

S a

ureu

s = M

RSA

)

Дані E

UC

AST


trept

ococ

cusm

utan







з п






25middot10400


S aureus35middot108


5middot10300


12middot106

11middot108

27middot107

018middot108

91middot104

025middot104


MRSA25middot108




MRSA51middot105


011middot106

07 Кріп MRSA



010middot102






















































Eho

60-3m Ex - 20 x 102 - -

60-1n Ex 40 x 102 - 36 x 103 60 x 102

60 (59 E105) Ex - - 40 x 103 -

43I Ex 60 x 103 - - -

43II Ex 32 x 103 60 x 102 - -

Pag

g150Ex 55 x 103 - - -

St 45 x 103 - - -

g157Ex 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

St 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

97 - 1 Ex 14 x 104 - 57 x 103 -

97 - 2 St 20 x 103 - 15 x 103 -













Таблица 2
















V [рМА260-3m] 86 88 0 0 0VI [рМА2K8] 100 69 50 0 0

59 0 33 0 0 049 0 36 0 0 0

E105 100 50 0 0 0FE44 X 53 0 100 0









60 ndash 3m + + - - +t + - - - + +60(59 E105) +t - + + +t - - + - + +























ecology






УДК 63564 5783 620187












































Таблиця 1







0

05

1

15

2

25

405630


Таблиця 2








3 4 5 - + 1 2




















S u m m a r y














































(25061929 ndash 29112012 рр)































minus ClO4minusWO4










Таблица 1


штамма




50 100 200 50 100 200 Mо6+ V5+ Cl5+ Cl7+

53 + + + + + - -54 + + + + - -59 + + + + - -61 + + + + + + - -64 + + + + - -51 + + + - -69 + + + + + - -58 + + + + + + + - -43 + + - -67 + + + + + + - -45 + + + - -85 + plusmn + + - -86 + + + + + + - -131 + + + + - -132 + + + + + - -101 + + + + - -68 + + + + + + + + - -

151 + + + + - -152 + + + + - -70 + + + + + + + + - -






















































Таблица 1


Фермент





















Таблица 2





25 50 100 25 50 100 25 50 100





















Таблица 3


Фер-мент




25 50 100 25 50 100 25 50 100

НАДФ

+ -глутамат



ФЕП

-синтетаза


ФЕП

-карбокси-

киназа


ФЕП

-карбок-

силаза


Изоцитрат

-лиаза







Таблица 4



среде 1с KNO3

















Таблица 5























































































Показник















H=ΣPiln Pi










варі-анту




103


106


106

Педотро-фи

106


Azoto-bacter

1 500 17 707 233 168 432 80

2 600 20 430 261 188 364 68

3 700 20 346 287 200 322 60

4 800 21 293 324 226 314 58

5 900 25 166 370 296 218 54

6 1000 26 130 380 312 196 50

7 1100 28 122 394 365 183 41

НІР05 - 032 054 041 018 032 067










варі-анту





1 500 020 023 0602 600 031 044 0843 700 037 057 0934 800 050 077 1075 900 094 180 1316 1000 118 240 1507 1100 129 300 150








м



106


103



ту 106


терії106


106

Azoto-bacter

1 0 080 64 079 258 441 14

2 50 168 40 096 189 322 18

3 100 242 32 131 113 295 26

4 50 (оп) 197 29 138 124 264 20

5 100 (оп) 246 25 156 115 286 44







м



106


103


106




106

Azoto-bacter

1 5 388 103 124 317 378 19

2 50 567 80 167 287 293 26

3 100 1102 62 195 231 222 52

4 50 (к) 606 44 221 207 203 39

5 100 (к) 1651 28 266 189 124 63














ФА Висота


ФА




















Висота



добу






























Висота













м



50 (оп) 34 54 1х10-6 50 (к) 19 24 1х10-6 500 0 1 -100 (оп) 32 75 1х10-7 100 (к) 13 20 1х10-6 1000 0 0 -






































































УДК 5771523 579258

























1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -









1 2 3 4 5 6 -






























































0 002 004 006 008 0100

05

10

15

20

25




0 2 4 6 8 10 12 14 16042

043

044

045

046

047







K 05 10 15 20 255

10

15

20

25

30

35

NiCl2

2 3 4

(а)

K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2 3 4

CoCl2 (б)







K 05 10 15 20 252

4

6

8

10

12

14

2 3 4

FeSO4

(а)

K 05 10 15 20 25

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

2 3 4

FeCl3 (б)








K 05 10 15 20 25

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4

























УДК 5768620193









































































0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7

log n










S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7

S 2

0

36

72

108

144

180

216

252

288

324

0 1 2 3 4 5 6 7




























































o









Таблица 1


































































IN Kurchenko





























a b









Штаммы

P b

atum

ici


циллин

ампи

циллин

оксаци

ллин

карбениц

иллин

стрептом

ицин

канамиц

ин

неом

ицин

моном

ицин

гентам

ицин

тетрацик

лин

левомиц

етин

эритромиц

ин

олеандом

ицин

ристом

ицин

рифам

пици

н

линком

ицин







0

10

20

30

40

50

60

70

12 24 60




12 24 60















































Табли

ця 1

Частота

виділення


і їх

асоціацій


уваних

відбитків

Кількість

осіб

відсоток



інТи

тр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток



Титр

КУО

мл

Кількість

осіб

відсоток


відбиток

із


масою

Титр

КУО

мл



210

S sa

livar

ius

12middot

104

525

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

86

30S

saliv

ariu

s2

2middot10

4

315

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is3

1middot10

33

15S

saliv

ariu

sK

pne

umon

iae

54middot

106

315

S sa

livar

ius

S a

ureu

s1

5middot10

4

315

S e

pide

rmid

isSt

r m

itis

33middot

105

420

S sa

livar

ius

Can

dida

16middot

106

210

S sa

livar

ius

S e

pide

rmid

is2

8middot10

4

210

S e

pide

rmid

is1

1middot10

52

10S

epi

derm

idis

26middot

106

210

S e

pide

rmid

is1

6middot10

6

15

S a

gala

ctia

e1

8middot10

41

5S

aga

lact

iae

28middot

104

15

S a

gala

ctia

e3

4middot10

2

315

S m

itis

15middot

104

420

Str

miti

s3

2middot10

62

10S

miti

s2

6middot10

4

420

S a

ureu

s2

4middot10

54

20S

pne

umon

iae

Can

dida

14middot

106

15

S p

neum

onia

e1

1middot10

4

15

Cor

yneb

acte

rium

spp

18middot

102

420

S m

utan

sS

sapr

ophy

ticus

19middot

108

15

Sm

utan

s1

1middot10

2


Табли

ця 2


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

1Ва

нком

іцин

ВА20

Sge1

510

Rlt1

38

Rlt1

50

--

22S

ge16

1020

--

10-

-16

--

2Ам

оксици

лін

АМО

0-

-14

--

6-

-0

-нд

12-

-14

16-

-14

--

16R

lt17

3Цеф

тріаксон

ЦФА

15R

lt27

0-

-0

Rlt2

70

--

0-

-0

0-

-11

--

0R

lt20

4Оксацилін

ОКС

0-

-0

--

0-

-0

--

22S

ge20

00

--

0-

-0

--

5Гентам

іцин

ГЕН

17-

-8

--

17-

-12

Rlt1

821

--

88

Rlt2

28

--

8R

lt14

6Цеф

отаксим

ЦФТ

20R

lt23

10-

-0

Rlt2

310

--

22-

-10

10-

-10

--

10R

lt17

7Ер

итроміци

нЕР

И0

--

0-

-0

--

10R

lt18

0-

-0

0R

lt18

0-

-0

--

8Цип

рофл

оксаци

нЦИ

П20

--

18-

-0

--

16R

lt20

22S

Rge5

0lt18

1818

Rlt2

018

Rlt2

018

Rlt1

9


Табл

2 (пр

одовжен

ня)


х ізолятів


ів

Ан

тибіотики


Streptococcus mitis








K pneumoniae

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

ЗЗР

SR

ЗЗР(EUCAST)

9Офл

оксаци

нОФЛ

0-

-0

--

0-

-20

Sge2

0-

SR

ge50lt

150

0R

lt20

0-

-0

Rlt1

910

Рифа

мпіцин

РИФ

0-

-12

Rlt1

56

--

0R

lt23

20S

Rge2

2lt17

1212

Rlt2

312

--

12-

-11

Ампіци

лін

АМП

0R

lt15

0-

-0

Rlt1

50

--

0R

lt20

00

--

0R

lt15

0R

lt14


ЦФР

12R

lt26

25-

-0

Rlt2

614

--

20-

2525

--

25-

-25

Sge1

813

Амікацин

АМК

0-

-20

--

20-

-0

Rlt1

60

--

2020

SR

ge22lt

1920

--

20S

ge13

14Тетрацик

лін

ТЕТ

0-

-0

Rlt2

00

--

0R

lt19

0R

lt20

00

Rlt1

90

--

0-

-15

Цеф

тазидім

ЦФД

6-

-8

--

14-

-10

--

14-

-15

16-

-17

--

0R

lt19

16Цеф

окситим

ЦФК

0-

-14

--

0-

-14

Rlt2

221

--

1414

-нд

14-

нд14

-нд


МПН

16R

lt25

20-

-10

Rlt2

50

--

30-

-20

20-

-20

--

20S

Rge2

2lt16

Примітка

ЗЗР

ndash зони

затрим

ки росту

в мм

які

корелюють





SR

ndash S

ensi

tive

Res

ista

nt ndash


штам

ЗЗР(

EUC

AST

) ndashзони

затрим

ки росту

в мм

згідно

з EU

CA

ST

ldquo-rdquo



до даного

штаму

нд

ndash немає

даних



до даного

штаму



OR

SA (o

xaci

llinr

esis

tant

S a

ureu

s = M

RSA

)

Дані E

UC

AST


trept

ococ

cusm

utan







з п






25middot10400


S aureus35middot108


5middot10300


12middot106

11middot108

27middot107

018middot108

91middot104

025middot104


MRSA25middot108




MRSA51middot105


011middot106

07 Кріп MRSA



010middot102






















































Eho

60-3m Ex - 20 x 102 - -

60-1n Ex 40 x 102 - 36 x 103 60 x 102

60 (59 E105) Ex - - 40 x 103 -

43I Ex 60 x 103 - - -

43II Ex 32 x 103 60 x 102 - -

Pag

g150Ex 55 x 103 - - -

St 45 x 103 - - -

g157Ex 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

St 60 x 103 10 x 102 75 x 103 -

97 - 1 Ex 14 x 104 - 57 x 103 -

97 - 2 St 20 x 103 - 15 x 103 -













Таблица 2
















V [рМА260-3m] 86 88 0 0 0VI [рМА2K8] 100 69 50 0 0

59 0 33 0 0 049 0 36 0 0 0

E105 100 50 0 0 0FE44 X 53 0 100 0









60 ndash 3m + + - - +t + - - - + +60(59 E105) +t - + + +t - - + - + +























ecology






УДК 63564 5783 620187












































Таблиця 1







0

05

1

15

2

25

405630


Таблиця 2








3 4 5 - + 1 2




















S u m m a r y














































(25061929 ndash 29112012 рр)




















Documents

ÍÀÖ²ÎÍÀËÜÍÀ ÀÊÀÄÅÌ²ß ÍÀÓÊ ÓÊÐÀ¯ÍÈlibrary.nuft.edu.ua/ebook/file/MB_2_2013.pdf · 2017. 11. 13. · issn 0201-8462. Ì³êðîá³îë. æóðí., 2013,