Embed Size (px)
Citation preview
저 시-비 리- 경 지 2.0 한민
는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게
l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.
다 과 같 조건 라야 합니다:
l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 된 허락조건 명확하게 나타내어야 합니다.
l 저 터 허가를 면 러한 조건들 적 되지 않습니다.
저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.
것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.
Disclaimer
저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.
비 리. 하는 저 물 리 목적 할 수 없습니다.
경 지. 하는 저 물 개 , 형 또는 가공할 수 없습니다.
학 사 학 논문
방암·난소암에
BRCA1/BRCA2 돌연변이 검출 한
차 대 염기 열 분 법 임상 용
2016 2월
울대학 대학원
학과 검사 학 공
이 승 준
i
국
: 국내 통계에 르면 난소 여 에 생하는
각각 2번째, 10번째 한 이다. BRCA1 BRCA2
자 돌연변이는 난소 병 험도를 5
이상 높이는 것 있다. 상 자들 각각 5.6 Kb,
10.3 Kb 크 를 가지고 있 며, 립 자 이질 보일
뿐만 니라 돌연변이 부 도 없다. 이러한 이 BRCA1
BRCA2 자는 검사 해 이 용이하지 다. 본 연구에 는
통 인 검사법인 Sanger sequencing multiplex ligation-
dependent probe amplification (MLPA) 체할 있는 법인
next-generation sequencing (NGS) 이용한 자
임상 용 가능 검토하고자 한다.
법: 울 학 병원 분자 검사실에 시행한 Sanger
sequencing MLPA BRCA1 BRCA2 자에
돌연변이가 인 50명 자 (9명 엑손 결손 41명
돌연변이)를 분 상 하 다. 평가 상인 자 3종
TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR Plus Ion
AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel이었 며, MiSeq Ion
torrent PGM 이용하여 염 열 분 시행하 다.
결과: 염 열 분 에 있어 Sanger sequencing 했
TruSeq Custom Amplicon 100%, BRCA Tumor MASTR
ii
Plus는 99.6%, Ion AmpliSeq BRCA panel 99.2% 민감도를
보 다. 양 결과는 BRCA Tumor MASTR Plus에 만 133건
보고 었다. Copy number variation 분 이용한 엑손 결손
여부 에 있어 TruSeq Custom Amplicon 100%, BRCA
Tumor MASTR Plus 88.9%, Ion AmpliSeq BRCA panel
40% 민감도를 보 다. 특히 TruSeq Custom Amplicon 9명
자 8명에 엑손 결손 범 지 하게 하 다.
결 : 본 연구에 는 NGS 법 이용한 자 우 한
분 능 지니고 있 인하 다. 분 고리즘 보 한다면
Sanger sequencing MLPA를 체할 있 것 단 다.
라 NGS BRCA1/2 자
난소 진단하는데 있어 용한 검사 략 생각 다.
----------------------------------------------------------------------------------------------
주요어: ·난소 , 차 염 열 분 법, 자
, BRCA1, BRCA2
학 번: 2014-21147
iii
목 차
국 ......................................................................................i
목차 ........................................................................................... iii
목 ...................................................................................... iv
그림 목 ................................................................................... v
약어 ........................................................................................... vi
........................................................................................... 1
연구 재료 법 ..................................................................... 3
1. 연구 상 .......................................................................... 3
2. DNA 추출 ....................................................................... 3
3. Library Preparation and Targeted Sequencing ............. 4
4. 데이 분 ..................................................................... 4
결과 ........................................................................................... 9
1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene ............. 9
2. Copy number variation analysis of BRCA1 gene .......... 11
고찰 ......................................................................................... 32
참고 헌 .................................................................................. 36
.................................................................................. 38
iv
목
Table 1. Patient list of three gene panel studies .................... 7
Table 2. Analytic performance of sequence analysis using
gene panels ............................................................................ 15
Table 3. False negative variant cases in gene panels .......... 16
Table 4. False positive variant cases in gene panels ........... 17
Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel
studies .................................................................................... 18
Table 6. Analytical performance of exon deletion
prediction using gene panel ................................................... 20
Table 7. Prediction of exon deletion range using gene
panel ....................................................................................... 21
v
그림 목
Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by
gene panel .............................................................................. 22
Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion
by Z-score ............................................................................ 23
Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S01 ....... 24,25
Figure 4. Prediction of exon deletion in patient S02 ....... 26,27
Figure 5. Prediction of exon deletion in patient S03 ....... 28,29
Figure 6. Prediction of exon deletion in patient S04 ....... 30,31
vi
약 어
CNV Copy number variation
MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification
NGS Next-generation sequencing
PCR Polymerase chain reaction
- 1 -
등 본부에 시한 국내 통계에 르면
난소 여 에 생하는 에 2번째, 10번째 많
차지한다. 2012 한 해 동 생자 는
16,521명이었 며, 난소 생자 는 2,167명이었다.
난소 5-10%는 인 것 보고 어
있다(1). , 난소 원인 자 가장 인
것 BRCA1 (17q21; OMIM *113705) BRCA2 (13q12.3;
OMIM *600185) 자이다. 이들 자는 이스
15% 도를 명한다(2). 이들 자에 돌연변이가 양 인
경우, 일생 동 병 50%-80%이며 난소
병 20%-40% 이다(3-5).
BRCA1 자는 23개 엑손 구 어 있 며 크 는 5.6
Kb 이다. 돌연변이뿐만 니라 엑손 결손 복도 견 다.
BRCA2 자는 27개 엑손 이루어 있 며 크 는 10.3
Kb BRCA1 자 2 에 해당한다. 그리고 BRCA1
자 는 달리 엑손 결손 복이 거 찰 지 는다.
자 모 돌연변이가 하는 부 는 없는 것이 특징이다.
재 지 진 는 BRCA1 BRCA2 자에 각각
1706개 1446개 돌연변이가 보고 어 있다.
BRCA1 BRCA2 자를 분 하 해 통
사용 어 검사 법 Sanger sequencing이 일 이다. 개별
엑손별 PCR 시행하고 각각 증폭산 직 염 열
분 시행하는 법이다. 엑손 결손 복 인하
- 2 -
해 는 multiplex ligation-dependent probe amplification
(MLPA) 또는 량 PCR 사용하고 있다. 해당 자들 크 가
큰 편이고, 엑손 개 도 많 상 검사법들 시간 인 이 많이
소요 다. 이를 극복하 해 근 next-generation
sequencing (NGS) 법 이용하 는 시도가 많이 이루어지고
있다.
본 연구에 는 염 열 분 해 사용 인 Sanger
sequencing 체할 있는 법인 NGS 자
임상 용해보고 용 평가하고자 한다. 그 외에 엑손
결실 복 인하 해 시행 인 MLPA 하여
자 임상 용 가능 검토하고자 한다.
- 3 -
연구 재료 법
1. 연구 상
연구 상 울 학 병원 분자 검사실 BRCA1
BRCA2 자 검사가 뢰 었 자 잔여검체 용에 동
한 경우만 포함하 며, 돌연변이 양 인 50명 하 다. 41명
돌연변이가, 나 지 9명 엑손 결손이 인 경우 다. 본
해당 검사항목이 뢰 면 해당 자 모든 엑손에 해
Sanger sequencing MLPA를 시행하 다. 다만 17명 가족 내
돌연변이가 인 경우라 특 범 에 한 분 만 시행한 사
다. 본 연구는 울 학 병원 학연구 리심 원회
(institutional review board)에 연구승인(IRB No. H-1511-
103-722) 다.
2. DNA 추출
연구에 참여한 자 말 EDTA 진공튜 에 채 하 고,
조사 지침 라 Puregene® DNA purification kit (Gentra
Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 채 한 말 에
체 DNA를 추출하 다. NanoDrop 2000c
Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA,
USA)를 이용하여 DNA 농도 도를 인하 다. DNA 도
- 4 -
는 A260/A280 이 1.8에 2.0사이임 인하고 검사를 시
행하 다.
3. Library Preparation and Targeted Sequencing
본 연구에 사용 자 3가지 종 며, 각 에 포
함 자 명단 Table 1과 같다. 첫번째 TruSeq Custom
Amplicon (Illumina, San Diego, CA, USA)는 50명 자 체를
상 실험 진행하 며 MiSeq (Illumina, San Diego, CA,
USA) 이용하여 염 열분 시행하 다. 번째 BRCA
Tumor MASTR Plus (Multiplicom, Niel, Belgium) 46명 자
(9명 엑손 결손 사 포함)를 상 실험 진행하 며
MiSeq 염 열분 시행하 다. 번째 Ion AmpliSeq
BRCA1 and BRCA2 panel (Life Technologies, Carlsbad, CA,
USA)는 30명 자 (5명 엑손 결손 사 포함)를 상 하
고 Ion torrent PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)
염 열분 시행하 다. Libarary preparation 부
targeted sequencing 지 과 조사 지침에 라 시행하
다.
4. 데이 분
4.1. Sequence analysis
- 5 -
MiSeq에 얻어진 본 데이 를 MiSeq Reporter (Illumina)
NextGENe software version 2.4 (SoftGenetics, State College,
PA)를 이용하여 분 하 다. Genome Reference Consortium
Human genome build 37 (GRCh37) 맵핑 하 다.
BRCA1 BRCA2 자 염 열 각각 NM_007294.3
NM_000059.3 하 고, 분 범 는 엑손 coding
region 그 주변 20 bp 지 포함하 다. 1000 Genome database,
dbSNP135 Exome Aggregation Consortium 자료를 이용하
여 다 여부를 인하 다. 이미 보고 어 있는 돌연변이인지를
인하 해 는 Breast Cancer Information Core Database
(BIC database; http://research.nhgri.nih.gov/bic/) Human
Gene Mutation Database (HGMD; http://www.hgmd.cf.ac.uk)를
이용하 다.
4.2. Copy number variation analysis
BRCA1 자 Copy number variation (CNV)를 하
해 depth에 한 자료를 규분포를 이용하여 분 하 다.
엑손 결손이 거 없는 것 진 BRCA2 자에 한
평균 depth를 이용하여 입 핵산 양 보 하 다. 보
BRCA1 자 depth에 한 데이 엑손 결손이 없는 41명
자 데이 를 규분포 하 고, 이를 하여 나
지 9명 자 데이 규분포 내에 를 인하
- 6 -
다. 종 얻어진 각 엑손에 한 Z-score를 분 하여 엑손
결손 범 를 인하 다. 보 인 한 2개 엑손
Z-score 평균값 용하여 결손 범 를 하는데 용하 다.
CNV 분 법에 해 IBM SPSS Statistics 22 (IBM, Chicago, IL,
USA)를 이용하여 ROC 곡 그 분 능 평가하 다.
- 7 -
Table 1. Patient list of three gene panel studies
Patient TruSeq Custom
Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus
Ion AmpliSeq
S01 Y Y Y
S02 Y Y Y
S03 Y Y Y
S04 Y Y Y
S05 Y Y Y
S06 Y Y N
S07 Y Y N
S08 Y Y N
S09 Y Y N
S10 Y Y Y
S11 Y Y N
S12 Y Y N
S13 Y Y Y
S14 Y Y Y
S15 Y Y Y
S16 Y Y Y
S17 Y Y Y
S18 Y Y N
S19 Y Y N
S20 Y Y Y
S21 Y Y Y
S22 Y Y Y
S23 Y Y N
S24 Y Y Y
S25 Y Y N
S26 Y Y Y
S27 Y Y Y
S28 Y Y Y
S29 Y Y Y
S30 Y Y Y
S31 Y Y N
S32 Y Y N
S33 Y Y N
S34 Y Y N
S35 Y Y Y
- 8 -
S36 Y Y N
S37 Y Y N
S38 Y Y N
S39 Y Y Y
S40 Y Y Y
S41 Y Y N
S42 Y Y Y
S43 Y Y Y
S44 Y Y Y
S45 Y Y N
S46 Y Y Y
S47 Y N Y
S48 Y N Y
S49 Y N Y
S50 Y N N
Total number of patient included
50 46 30
- 9 -
결 과
1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene
키트 종 분 이프라인과는 하게 Sanger sequencing
결과 달리 자 에 추가 보고 BRCA2 자
염 변이가 있었다. c.4563A>G (rs206075; Variant allele
frequency, 99.96%), c.6513G>C (rs206076; Variant allele
frequency, 56.28%) c.7397T>C (rs169547; Variant allele
frequency, 99.86%)가 해당 염 변이이다. 이는 GRCh37에
해당 염 가 BRCA2 자 염 열인
NM_000059.3과 달라 같이 보고 것 염 변이 분
통계에 는 외하 다. 상 3종 염 변이를 외하고 50명
자에 Sanger sequencing 인 염 변이 개 는
289개 며, 각 자 별 상이 는 자에 해
염 열분 결과 일 도를 하 다.
자 S17 경우 c.922_924delinsT를 원인 돌연변이 가지고
있는 경우이었다. BIC 데이 베이스에는 c.922_923delAG가
등재 어 있었다. 존 Sanger sequencing 결과 는 보고
돌연변이인 c.922_923delAG c.924C>T가 편
립 자에 존재하는 것인지 니면 c.922_924delinsT인지를
구분할 없었다. 이번 연구를 통해 얻어진 자 결과
c.922_924delinsT가 실함 실 인할 있었다 (Fig. 1).
- 10 -
1.1. TruSeq Custom Amplicon
상 자인 50명에 Sanger sequencing 인
염 변이는 289개 다. 분 이프라인 2가지를
사용하 며 Illumina 분 플랫폼인 MiSeq Reporter
NextGENe이었다. MiSeq Reporter 경우 검출한 염 변이는
289개 분 민감도는 100%에 해당하며, 양 사 는 없었다
(Table 2). NextGENe 경우 1건 사 가 있어
분 민감도는 99.7%에 해당하 다. 사 는 자 S20
BRCA1 자에 보고 c.1511G>A 다 (Table 3). 해당
염 변이 allele frequency는 20% 미만이었다. 양 사 는
자 S15에 보고 c.468_469delTA 자 S46에 보고
c.3463dupG 다 (Table 4).
1.2. BRCA Tumor MASTR Plus
상 자인 46명에 Sanger sequencing 인
염 변이는 263개 다. MiSeq Reporter 경우 검출한
염 변이는 261개 분 민감도는 99.2%에 해당하 다. 양
사 는 145건이었다 (Table 2). 사 는 2건 모
틀이동 돌연변이 며, 자 S33 BRCA2 자 돌연변이인
c.3744_3747delTGAG 자 S40 BRCA1 자 돌연변이인
c.5496_5506delinsA 다 (Table 3). 이들 모 20% 미만
allele frequency를 보여 검출 지 다. 양 사 145건
모 8종 염 변이 며, BRCA2 자에만 분포하고 있었다
(Table 4). NextGENe 경우 263개 염 변이 262개를
검출하여 99.6% 분 민감도를 보 다. 사 1건 자
- 11 -
S33 BRCA2 자 돌연변이인 c.3744_3747delTGAG 며,
20%미만 allele frequency 인해 검출하지 못 했다. 양
사 는 모 133건 6종 염 변이 며, BRCA2 자에만
분포하고 있었다.
1.3. Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel
상 자인 30명에 Sanger sequencing 인
염 변이는 257개 며, 분 플랫폼 Ion Reporter를
사용하 다. 257개 염 변이 255개를 검출하여 99.2%
분 민감도를 보 다 (Table 2). 사 2건 자 S17
BRCA1 자 돌연변이인 c.922_924delinsT 자 S40
BRCA1 자 돌연변이인 c.5496_5506delinsA 며, variant
calling 인해 검출하지 못 했다 (Table 3). 양 사 는
존재하지 다 (Table 4).
2. Copy number variation analysis of BRCA1 gene
MLPA에 엑손 결손 보인 자는 9명이었다. BRCA1
자 1번 엑손 non-coding 부 분 상에
외하 며, 그 외 범 인 엑손 2-23번에 한 자
엑손 단 결손에 한 분 능 평가하 해 ROC 곡
분 시행하 고 결과는 Fig. 2 같다. 각 자 곡
래 역 TruSeq 1.000, Ion AmpliSeq 0.998 Multiplicom
0.987 이었다.
2.1. TruSeq Custom Amplicon
50명 자들에 해 BRCA2 자 depth를 분 하 다.
- 12 -
평균값 2519X, 편차는 573X 나타났 며, 변동계 는
22.7% 이었다. 이를 이용하여 BRCA1 자 depth를
보 하 며, 결손이 없는 자들 데이 를 하여
규분포 를 시행한 뒤 Z-score를 산출하 다. ROC
곡 상에 민감도 특이도 합이 가장 큰 지 각각 100%
99.6%이었 며, 해당하는 Z-score 범 는 -2.55부 -
2.61이었다. 일 많이 쓰이는 cut-off인 Z-score -3.0
용하여 결손 여부 그 범 를 해보 다. 각 자 엑손
결손 여부는 단 하나 엑손에 라도 결손 시사하는 소견이 있는
경우를 양 분 하 다. 분 상인 자 50명 엑손
결손 시사하는 소견 보인 자는 12명이었다 (Table 5). 엑손
결손 여부를 에 있어 분 능 민감도 100% 특이도
92.7%이었다 (Table 6). 9명 자 8명에 결손 범 를
하게 하는 분 능 보 다 (Table 7). 각 사 별
인해보면 자 S01 경우 엑손 2-23번 결손이 하게
인 었다 (Fig. 3A). 자 S02 S03 경우 각각 엑손 10-
12번 엑손 17-18번 결손이 하게 인 었다 (Fig. 4A &
5A). 하지만 자 S04 경우 엑손 7번과 9번이 cut-off를 약간
상회하는 소견 보여 결손 범 에 있어 일부 차가
있었다 (Fig. 6A). 차를 보 하 해 인 한 2개 엑손 Z-
score 평균값 산출하여, 해당 값이 -3 미만인 경우 인 엑손이
모 결손 범 에 해당한다고 하 다. 이 결과를 결손 여부
범 를 하는데 용하 , 9명 자에 모 한
결과를 도출할 있었다.
- 13 -
2.2. BRCA Tumor MASTR Plus
46명 자들에 해 BRCA2 자 depth를 분 하 다.
평균값 6087X, 편차는 1288X 나타났 며, 변동계 는
21.2% 이었다. 이를 이용하여 BRCA1 자 depth를
보 하 며, 결손이 없는 자들 데이 를 하여
규분포 를 시행한 뒤 Z-score를 산출하 다. ROC
곡 상에 민감도 특이도 합이 가장 큰 지 각각 96.1%
95.6%이었 며, 해당하는 Z-score 범 는 -1.83부 -
1.85 다. 분 한 같이 Z-score -3미만 cut-off를
용하여 실 자 결손 여부 그 범 를 해보 다. 분
상인 자 46명 엑손 결손 시사하는 소견 보인 자는
10명이었다 (Table 5). 엑손 결손 여부를 에 있어
분 능 민감도 88.9% 특이도 94.6%이었다 (Table 6). 9명
자 결손 범 를 하게 한 사 는 없었다 (Table 7).
각 사 별 인해보면 자 S01 경우 엑손 2, 3, 7, 10, 12,
14-17, 19-22번 결손만 하게 하 다 (Fig. 3B).
자 S02에 는 결손이 하게 엑손이 없었다 (Fig. 4B).
자 S03 경우 엑손 17번 결손만이 하게 인 었 며,
자 S04 경우 엑손 2, 3, 7, 10번 결손만이 하게 인 어
상당한 차가 있었다 (Fig. 5B & 6B).
2.3. Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel
30명 자들에 해 BRCA2 자 depth를 분 하 다.
평균값 1746X, 편차는 126X 나타났 며, 변동계 는 7.2%
- 14 -
이었다. 이를 이용하여 BRCA1 자 depth를 보 하 며,
결손이 없는 자들 데이 를 하여 규분포 를
시행한 뒤 Z-score를 산출하 다. ROC 곡 상에 민감도
특이도 합이 가장 큰 지 각각 98.0% 99.4%이었 며,
해당하는 Z-score 범 는 -1.54부 -1.68이었다. Z-score -
3미만 cut-off를 용하여 실 자 결손 여부 그 범 를
했 , 분 상인 자 30명 엑손 결손 시사하는
소견 보인 자는 2명이었다 (Table 5). 엑손 결손 여부를
에 있어 분 능 민감도 40.0% 특이도 100%이었다
(Table 6). 5명 자 결손 범 를 하게 한 사 는
1건이었다 (Table 7). 각 사 별 인해보면 자 S01 경우
엑손 2, 3, 5, 7, 10, 13-23번 결손이 하게 인 었다 (Fig.
3C). 자 S02 S04 경우 하게 결손이 엑손
없었다 (Fig. 4C & 6C). 자 S03에 는 엑손 17-18번 결손이
하게 인 었다 (Fig. 5C).
- 15 -
Table 2. Analytic performance of sequence analysis using gene panels
TruSeq Custom Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus Ion AmpliSeq
MiSeq reporter NextGENe MiSeq reporter NextGENe Ion Reporter
Total variants reported in Sanger sequencing
289 289
263 263
257
True positive variants 289 288
261 262
255
False negative variants 0 1
2 1
2
False positive variants 0 2
145 133
0
Analytic sensitivity % 100.0 99.7
99.2 99.6
99.2
PPV % 100.0 99.3 64.3 66.3 100.0
PPV, positive predictive value
- 16 -
Table 3. False negative variant cases in gene panels
Patient Gene NT change AA change Classification Gene panel (Analysis platform) Cause
S17 BRCA1 c.922_924delinsT p.Ser308* Pathogenic Ion AmpliSeq (Ion Reporter) Variant calling
S20 BRCA1 c.1511G>A p.Arg504His VUS TruSeq (NextGENe) Low allele frequency
S33 BRCA2 c.3744_3747delTGAG p.Ser1248Argfs*10 Pathogenic Multiplicom (Miseq Reporter) Multiplicom (NextGENe)
Low allele frequency Low allele frequency
S40 BRCA1 c.5496_5506delinsA p.Val1833Serfs*7 Pathogenic Multiplicom (Miseq Reporter) Ion AmpliSeq (Ion Reporter)
Low allele frequency Variant calling
NT, nucleotide; AA, amino acid; VUS, variant of uncertain significance
- 17 -
Table 4. False positive variant cases in gene panels
Total number of the patients
Gene NT change Gene panel (Analysis platform) Cause
1 BRCA1 c.3463dupG TruSeq (NextGENe) Amplification error
1 BRCA2 c.468_469delTA TruSeq (NextGENe) Amplification error
30 BRCA2 c.1964C>G BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error
13 BRCA2 c.3869G>A BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error
30 BRCA2 c.68-7delT BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error
2 BRCA2 c.7504C>T BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error
28 BRCA2 c.8830A>T BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error
30 BRCA2 c.10121C>T BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error
29 BRCA2 c.1151C>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
29 BRCA2 c.1964C>G BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
27 BRCA2 c.2138A>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
5 BRCA2 c.3869G>A BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
21 BRCA2 c.4068G>A BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
26 BRCA2 c.7504C>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
5 BRCA2 c.8830A>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error
3 BRCA2 c.10121C>T BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error NT, nucleotide
- 18 -
Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel studies
Patient MLPA TruSeq Custom Amplicon
BRCA Tumor MASTR Plus
Ion AmpliSeq
S01 Y Y Y Y
S02 Y Y N N
S03 Y Y Y Y
S04 Y Y Y N
S05 Y Y Y N
S06 Y Y Y N/A
S07 Y Y Y N/A
S08 Y Y Y N/A
S09 Y Y Y N/A
S10 N N N N
S11 N N N N/A
S12 N N N N/A
S13 N Y N N
S14 N N N N
S15 N N N N
S16 N N N N
S17 N N N N
S18 N N Y N/A
S19 N N N N/A
S20 N N N N
S21 N N N N
S22 N N N N
S23 N N N N/A
S24 N N N N
S25 N N N N/A
S26 N N N N
S27 N N N N
S28 N N N N
S29 N N N N
S30 N N N N
S31 N N N N/A
S32 N N N N/A
S33 N Y N N/A
S34 N N N N/A
S35 N N N N
- 19 -
S36 N N N N/A
S37 N N N N/A
S38 N N N N/A
S39 N N N N
S40 N N N N
S41 N Y N N/A
S42 N N N N
S43 N N N N
S44 N N N N
S45 N N N N/A
S46 N N Y N
S47 N N N/A N
S48 N N N/A N
S49 N N N/A N
S50 N N N/A N/A
MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not
applicable
- 20 -
Table 6. Analytical performance of exon deletion prediction using gene panel
TruSeq Custom
Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus
Ion AmpliSeq
Total number of patient included
50 46 30
True positive 9 8 2
False negative 0 1 3
False positive 3 2 0
True negative 38 35 25
Analytic sensitivity (%) 100.0 88.9 40.0
Analytic specificity (%) 92.7 94.6 100.0
PPV (%) 75.0 80.0 100.0
NPV (%) 100.0 97.2 89.3
PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value
- 21 -
Table 7. Prediction of exon deletion range using gene panel
Patient MLPA TruSeq Custom Amplicon*
BRCA Tumor MASTR Plus*
Ion AmpliSeq*
S01 1-23 2-23 2, 3, 7, 10, 12, 14-17, 19-22 2, 3, 5, 7, 10, 13-23
S02 10-12 10-12 None None
S03 17-18 17-18 17 17-18
S04 1-13 2-6, 8, 10-13 2, 3, 7, 10 None
S05 1-13 2-13 2, 3, 10 None
S06 1-13 2-13 2, 3, 7, 10 N/A
S07 1-13 2-13 2, 3, 7, 10, 12 N/A
S08 1-13 2-13 2, 3, 7, 10, 12 N/A
S09 1-13 2-13 2, 3, 10, 11 N/A * Exon 1 was not included in prediction of exon deletion range
MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not applicable
- 22 -
Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by gene panel
- 23 -
Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion by Z-score
- 24 -
Continued.
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(A)
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(B)
- 25 -
Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S01, (A) TruSeq
Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent
two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1
and BRCA2 panel.
-5
-4.5
-4
-3.5
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(C)
- 26 -
Continued.
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(A)
-3.5
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(B)
- 27 -
Figure 4. Prediction of exon deletion in patient S02, (A) TruSeq
Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent
two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1
and BRCA2 panel.
-3.5-3
-2.5-2
-1.5-1
-0.50
0.51
1.52
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(C)
- 28 -
Continued.
-6-5-4-3-2-10123
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(A)
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(B)
- 29 -
Figure 5. Prediction of exon deletion in patient S03, (A) TruSeq
Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent
two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1
and BRCA2 panel.
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(C)
- 30 -
Continued.
-20
-15
-10
-5
0
5
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(A)
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(B)
- 31 -
Figure 6. Prediction of exon deletion in patient S04, (A) TruSeq
Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent
two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1
and BRCA2 panel.
-3.5
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
0 5 10 15 20 25
Z-s
core
Exon
(C)
- 32 -
고 찰
본 연구에 는 NGS 법 이용한 자 이 Sanger
sequencing 결과에 했 사한 분 민감도(99.2%-
100%)를 가지고 있 인하 다. TruSeq Custom Amplicon
경우 조자 권장 분 플랫폼인 MiSeq Reporter를 이용하면
하게 일 하는 염 열분 결과를 얻 있었다. BRCA
Tumor MASTR Plus 경우 NextGENe 이용하여 분 할 경우
가장 우 한 결과를 보 나, 1건 사 다 양
사 를 보여 분 플랫폼 가 필요하다고 생각 다. Ion
AmpliSeq BRCA panel 조사 권장 분 플랫폼인 Ion
Reporter를 사용하 , 99.2%라는 분 민감도를 보 고 이는
사 2건 이었다. 2건 사 는 모 indel이라는
공통 이 있었 며, 분 과 variant calling에 가 있었
것 인 었 에 이를 보 한다면 분 민감도를 개 할
있 것 다. 타 다른 연구에 도 BRCA1/2 자
이 Sanger sequencing에 해 동등하거나 우월한 분 능
보 다고 보고 있다(6-9).
자 S17 사 에 보 듯이 NGS 법 립 자
분리가 필요한 경우 raw data를 인하여 한 독이 가능하다.
Sanger sequencing 경우 립 자를 분리하여 분 하
해 는 별도 실험 계가 필요할 뿐만 니라 독에도
어 움이 많다. 하지만 NGS 법 각각 amplicon read가
하나 립 자를 하 에 복잡한 염 변이를
- 33 -
인하는데 용할 있다. Read length 이가 다면
structural variation 지도 분 할 있는 장 이 있다(10).
본 연구에 는 NGS 데이 depth를 이용하여 CNV를
분 하 다. 규분포를 이용하여 Z-score를 산출하 고, 이를
통해 엑손 단 결손 해보 다. ROC 곡 에 얻어진
곡 래 역 0.987-1.000 매우 우 한 분 능 보 다.
다만 이를 엑손 단 결손 이 닌 자 단 용해야
하 에 실 검사법 는 다소 낮 진 분 능 보 다.
3가지 자 가장 우 한 분 능 보인 것 TruSeq
Custom Amplicon이었 며 엑손 결손 여부를 하는데 있어
100% 민감도를 보 다. 이는 존에 쓰이는 자 용량
검사법인 MLPA를 시행하 에 별검사 용하는데 합한
검사법임 미한다. 별검사 없이 MLPA를 시행했 경우
41건 사 를 모 포함해야겠지만, 별검사 용했다고
가 하면 41건 양 사 는 단 3건이었 에 불필요한 MLPA
시행 건 를 획 일 있 것 상 다. 상
만 용했 9명 자 8명에 한 결손 범 를
하 고, 나 지 1명에 는 결손 범 에 일부 가
있었다.
에 한 같이 TruSeq Custom Amplicon 엑손
결손 에 있어 우 하지만 일부 를 내포하고 있었다. 이를
보 하 해 인 한 2개 엑손 Z-score 평균값 산출하여
추가 용하 , 결손 여부 결손 범 에 있어
100% 일 도를 보할 있었다. 실 검사실에 CNV 분
- 34 -
시행함에 있어 (1) 단일 엑손 Z-score 결손 여부를
하고, (2) 2개 이상 연속 엑손 결손이 있는 경우 인 한
2개 엑손 Z-score 평균값 결손 범 를 한다면 MLPA를
체할 있 것 상 다.
본 연구에 다루어진 2가지 자 이외에도 에
여러 자들이 있다. p53 PTEN 돌연변이는
종양 증후군과 어 있 며, 병 험도를 매우 높인다.
그 외에도 CHEK2, ATM, NBS1, RAD50, BRIP PALB2
돌연변이는 험도를 2 가량 높이는 것 보고 어
있다(11). 이런 병 험도에 여러 자들 한꺼번에
평가한 연구보고가 있다(9, 12). 그 에도 항 학 료 후 후에
해 분 하여 특 규명한 연구보고도 있다(13, 14).
이 같이 BRCA1 BRCA2 자 이외에도 자 병
험도 후 여러 자들이 보고 어 있 므
자 분 범 를 장하여 용하는 것도 임상
요할 것 생각 다.
본 연구에 는 난소 병 주요 자인
BRCA1/2에 한 자 이 존 검사 법인 Sanger
sequencing 체할 있다는 가능 인하 다. 불어
CNV 검출에 있어 도 용한 보를 획득할 있다는 사실도
인하 고, MLPA 시행에 별검사 용할 있는
가능 인하 다. 병 후 자들
포함하여 용한다면 임상 용한 보를 한꺼번에
공할 있 것이며, 이는 난소 진단
- 35 -
료에 있어 맞춤 학 나 가는 좋 회가 것
생각 다.
- 36 -
참 고 헌
1. Cancer Genome Atlas N. Comprehensive molecular portraits of
human breast tumours. Nature. 2012;490(7418):61-70.
2. Couch FJ, Nathanson KL, Offit K. Two decades after BRCA: setting
paradigms in personalized cancer care and prevention. Science.
2014;343(6178):1466-70.
3. Chen S, Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2
penetrance. J Clin Oncol. 2007;25(11):1329-33.
4. Mavaddat N, Peock S, Frost D, Ellis S, Platte R, Fineberg E, et al.
Cancer risks for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: results from
prospective analysis of EMBRACE. J Natl Cancer Inst. 2013;105(11):812-22.
5. Risch HA, McLaughlin JR, Cole DE, Rosen B, Bradley L, Fan I, et
al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer
penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J Natl Cancer Inst.
2006;98(23):1694-706.
6. Dacheva D, Dodova R, Popov I, Goranova T, Mitkova A, Mitev V, et
al. Validation of an NGS Approach for Diagnostic BRCA1/BRCA2 Mutation
Testing. Molecular diagnosis & therapy. 2015;19(2):119-30.
7. D'Argenio V, Esposito MV, Telese A, Precone V, Starnone F,
Nunziato M, et al. The molecular analysis of BRCA1 and BRCA2: Next-
generation sequencing supersedes conventional approaches. Clinica chimica
acta; international journal of clinical chemistry. 2015;446:221-5.
8. Kapoor NS, Curcio LD, Blakemore CA, Bremner AK, McFarland
RE, West JG, et al. Multigene Panel Testing Detects Equal Rates of
Pathogenic BRCA1/2 Mutations and has a Higher Diagnostic Yield Compared
- 37 -
to Limited BRCA1/2 Analysis Alone in Patients at Risk for Hereditary Breast
Cancer. Ann Surg Oncol. 2015;22(10):3282-8.
9. Judkins T, Leclair B, Bowles K, Gutin N, Trost J, McCulloch J, et al.
Development and analytical validation of a 25-gene next generation
sequencing panel that includes the BRCA1 and BRCA2 genes to assess
hereditary cancer risk. BMC cancer. 2015;15:215.
10. Liu B, Conroy JM, Morrison CD, Odunsi AO, Qin M, Wei L, et al.
Structural variation discovery in the cancer genome using next generation
sequencing: computational solutions and perspectives. Oncotarget.
2015;6(8):5477-89.
11. Walsh T, King MC. Ten genes for inherited breast cancer. Cancer
Cell. 2007;11(2):103-5.
12. Easton DF, Pharoah PD, Antoniou AC, Tischkowitz M, Tavtigian SV,
Nathanson KL, et al. Gene-panel sequencing and the prediction of breast-
cancer risk. The New England journal of medicine. 2015;372(23):2243-57.
13. Lips EH, Michaut M, Hoogstraat M, Mulder L, Besselink NJ,
Koudijs MJ, et al. Next generation sequencing of triple negative breast cancer
to find predictors for chemotherapy response. Breast Cancer Res.
2015;17(1):134.
14. Park K, Choi MK, Jung HH, Do IG, Lee KH, Ahn T, et al. Molecular
characterization of patients with pathologic complete response or early failure
after neoadjuvant chemotherapy for locally advanced breast cancer using next
generation sequencing and nCounter assay. Oncotarget. 2015;6(27):24499-
510.
- 38 -
Abstract
Introduction: According to domestic statistics, breast and ovarian cancer are
2nd and 10th most common cancer in females. Mutations of BRCA1 and
BRCA2 gene increase the risk of hereditary breast and/or ovarian cancer in
women five times. These genes have 5.6 Kb and 10.3 Kb size respectively,
and have allelic heterogeneity without mutation hot spot. Therefore
mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 gene have been challenging. The
objective of this study is to evaluate clinical usefulness of gene panel using
next-generation sequencing for replacement of Sanger sequencing and
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA).
Methods: This study enrolled 50 BRCA1 and BRCA2 gene mutation positive
patients (9 exon deletion cases and 41 point mutation cases), which were
confirmed by Sanger sequencing and MLPA in Molecular Diagnostics
Laboratory, Seoul National University Hospital. We included 3 gene panels,
which were as follows, TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR
Plus, and Ion AmpliSeq BRCA panel. We performed next-generation
sequencing using MiSeq and Ion torrent PGM and compare the results with
traditional methods.
Results: In comparison to Sanger sequencing, TruSeq Custom Amplicon
revealed 100% analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 99.6%, and
Ion AmpliSeq BRCA panel 99.2%. False positive variants were reported in
only BRCA Tumor MASTR Plus. With regard to prediction of exon deletion
using copy number variation analysis, TruSeq Custom Amplicon revealed 100%
analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 88.9%, and Ion AmpliSeq
- 39 -
BRCA panel 40%. Especially TruSeq Custom Amplicon estimated precisely
exon deletion range 8 of 9 patients.
Conclusions: This study suggested gene panel using NGS technology have
excellent analytical performance. If analytic algorithm is complemented
appropriately, gene panel could replace Sanger sequencing. Furthermore gene
panel provide useful information for prediction of CNV analysis. And it was
able to support the screening of gene dose analysis. Considering cost and time
in addition to analytic performance, BRCA1/BRCA2 gene panel is useful test
strategy for diagnosis of hereditary breast and/or ovarian cancer.
----------------------------------------------------------------------------------
Keywords: Hereditary breast and/or ovarian cancer, Next-generation
sequencing, Gene panel, BRCA1, BRCA2
Student number: 2014–21147
