朝陽科技大學

應用化學系生化科技研究所

博士論文

牛樟芝純化物對人類泌尿道癌症的作用及其機轉之研究

The Effects and Underlying Mechanisms of the

Pure Compounds Isolated from Antrodia cinnamomea on

Human Urinary Tract Malignancies

指導教授曾耀銘教授

共同指導教授徐士蘭教授

研究生裘坤元

中華民國 105 年 1 月

朝陽科技大學應用化學系生化科技研究所

Biochemical Science and Technology

Department of Applied Chemistry

Chaoyang University of Technology

博士論文

Thesis for the Degree of PhD

牛樟芝純化物對人類泌尿道癌症的作用及其機轉之研究

The Effects and Underlying Mechanisms of the

Pure Compounds Isolated from Antrodia cinnamomea on

Human Urinary Tract Malignancies

指導教授曾耀銘(Yew-Min Tzeng)

共同指導教授徐士蘭(Shih-Lan Hsu)

研究生裘坤元(Kun-Yuan Chiu)

中華民國 105 年 1 月

January 2016

I

論文摘要

牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）是台灣特有的菌菇具有抗發炎

抗氧化及抗血管增生等功能台灣民間常用牛樟芝來治療肝癌肺癌及乳

癌等但相關的研究及作用機制仍有許多不清楚之處本研究在探討牛樟

芝的純化合物 Antrocin 及 Antcin H 對於泌尿道的兩種癌症膀胱癌及腎癌

的作用及其機轉結果發現高濃度 Antrocin 處理時膀胱癌細胞會發生死

亡現象其機轉是透過提高 FasDR5及 Bax 的表現和促進 Caspases 3

Caspases 8及 Caspases 9 的活性經由內在及外在路徑造成細胞凋亡

（apoptosis）若將膀胱癌細胞處理以低濃度非致死劑量的 Antrocin可顯

著地抑制癌細胞生長移動（migration）和侵襲（invasion）其機轉為抑

制磷酸化 FAK（focal adhesion kinase）和磷酸化 paxillin 的活化同時可

觀察到 Antrocin 可減少 FAK 和 paxillin 在癌細胞邊緣的分佈繼而抑制癌

細胞產生偽足運動從而降低其侵襲能力另外發現 Antrocin 會提昇癌細

胞上皮附著分子 E-cadherin 的表現和減少 Vimentin 的表現進一步更觀察

到 Antrocin 可降低膀胱癌細胞中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases

MMPs）的表現其中又以 MMP-2 的表現受抑制最為明顯另外發現以

Antrocin 處理的膀胱癌細胞中磷酸化 ERK 和 c-Fos 表現量降低染色質

免疫沉澱法（chromatin immunoprecipitation assay）分析之結果顯示 Antrocin

II

降低 c-Fos 與 MMP-2 上游 DNA 啟動位點上的結合能力此結果可能就是

Antrocin 抑制 MMP-2 表現的機制之一本研究論文中另一部分是探討

Antcin H 處理腎細胞癌的機轉發現 Antcin H 可抑制腎癌細胞生長其處

理 48 小時的 IC50為 170μM在非致死劑量（低於 100μM）的 Antcin H 處

理下細胞遷移和侵襲的能力也顯著降低這種抑制作用導因於抑制 FAK

和 Src 激酶活性抑制 paxillin 磷酸化和 vimentin 的表現進而破壞偽足形

成調昇 TIMP 家族的表現並抑制 MMP 家族的表現而其中又以 MMP-7

的表現量被抑制得最顯著從螢光素酶報告基因檢測 (reporter luciferase

assay)的數據表示Antcin H 除了抑制 MMP-7 的啟動子活性外也同時抑

制 c-FosAP-1 和 CEBP-β 對 MMP-7 基因的轉錄活性此外Antcin H 強烈

抑制ERK12的活性並且抑制癌細胞內的 c-FosAP-1和CEBP-β與MMP-7

上游啟動子結合位點的結合力總而言之本論文之研究是第一個發現

Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲以及 Antcin H 對人類腎癌細胞

之抗遷移和抗侵襲作用我們的發現提供Antrocin作為膀胱癌的替代療法

以及 Antcin H 可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之實證數據

關鍵字 Antrocin Antcin H 膀胱癌 腎癌 基質金屬蛋白酶

轉移侵襲作用 Focal adhesion kinase

III

ABSTRACT

Antrodia cinnamomea a famous medicinalmushroomknownas Niuchang

chih in Taiwan exhibits anti-inflammatory anti-oxidative anti-angiogenic and

hepatic protection properties Several in vitro studies demonstrate the

anti-cancer effects of Antrodia cinnamomea on hepatoma lung cancer as well

as breast cancer In this study the effects of two active compoundAntrocinand

Antcin H isolated from Antrodia cinnamomea against urological malignancies

both bladder cancer and renal cell carcinoma (RCC) were examined Our study

showed that treatment with cytotoxic concentration of Antrocin induced both

intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human bladder cancer 5637 cells

evidenced by increase of Fas DR5 Bax expression and caspase-3 -8 and -9

activation Exposure to non-cytotoxic concentrations of antrocin significantly

inhibited cell growth migration and invasion which was associated with

decreased phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and paxillin

Antrocin also reduced subcellular distribution of FAK and paxillin at the focal

adhesion contacts of the cell periphery site and disrupted the formation of

filopodia and lamellipodia Moreover Antrocin increased

epithelial-to-mesenchymal transition-related gene E-cadherin and decreased

vimentin expression Real time-PCR analysis showed that Antrocin

downregulated the expression of mRNA of several matrix metalloproteinases

(MMPs) including MMP-2 Also the phosphorylation of ERK and c-Fos were

attenuated by Antrocin Data from chromatin immunoprecipitation assay

demonstrated that antrocin decreased the DNA binding activity of c-Fos to the

upstreamenhancer region of MMP-2 promoter an action likely to result in

reducing MMP-2 expression Next the anti-cancer effects of antcin H were

IV

investinged in human renal carcinoma786-0 cells The results showed that antcin

Hsignificantly inhibited the growth of RCC 786-0 cells the IC50 value (for 48 h)

of antcin H was 170 μM Besides the migration and invasion of 786-0 cells

were also drastically suppressed by antcin H under non-cytotoxic concentrations

(lt 100 μM) these events were accompanied by the inhibition of FAK and Src

kinase activities decreases of paxillin phosphorylation and vimentin expressions

impairment of focal contact and lamellipodium formation and up-regulation of

tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) as well as down-regulation of

several MMPs especially MMP-7 expression Data from the reporter luciferase

assay showed that antcin H repressed the MMP-7 promoter activity in parallel

to inhibition of c-FosAP-1 and CEBP-β transactivation properties Moreover

antcin H strongly suppressed the activity of ERK12 and decreased the binding

ability of CEBP-βand c-Fos on the upstreamenhancer region of MMP-7

promoter Overall this is the first study demonstrates that Antrocin inhibited the

migration and invasion of bladder cancer cells as well as the anti-migratory and

anti-invasive effects of the Antcin H on RCC 786-0 cells Our findings provide

the evidence that Antrocin may be the substitutional therapy of bladder cancer

while Antcin H may have the potential for application on treating metastatic

RCC

Key wordAntrocin Antcin H Bladder cancer Renal cancer

Focal adhesion kinase Matrix metalloproteinase Metastasis

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

朝陽科技大學應用化學系生化科技研究所

Biochemical Science and Technology

Department of Applied Chemistry

Chaoyang University of Technology

博士論文

Thesis for the Degree of PhD

牛樟芝純化物對人類泌尿道癌症的作用及其機轉之研究

The Effects and Underlying Mechanisms of the

Pure Compounds Isolated from Antrodia cinnamomea on

Human Urinary Tract Malignancies

指導教授曾耀銘(Yew-Min Tzeng)

共同指導教授徐士蘭(Shih-Lan Hsu)

研究生裘坤元(Kun-Yuan Chiu)

中華民國 105 年 1 月

January 2016

I

論文摘要

牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）是台灣特有的菌菇具有抗發炎

抗氧化及抗血管增生等功能台灣民間常用牛樟芝來治療肝癌肺癌及乳

癌等但相關的研究及作用機制仍有許多不清楚之處本研究在探討牛樟

芝的純化合物 Antrocin 及 Antcin H 對於泌尿道的兩種癌症膀胱癌及腎癌

的作用及其機轉結果發現高濃度 Antrocin 處理時膀胱癌細胞會發生死

亡現象其機轉是透過提高 FasDR5及 Bax 的表現和促進 Caspases 3

Caspases 8及 Caspases 9 的活性經由內在及外在路徑造成細胞凋亡

（apoptosis）若將膀胱癌細胞處理以低濃度非致死劑量的 Antrocin可顯

著地抑制癌細胞生長移動（migration）和侵襲（invasion）其機轉為抑

制磷酸化 FAK（focal adhesion kinase）和磷酸化 paxillin 的活化同時可

觀察到 Antrocin 可減少 FAK 和 paxillin 在癌細胞邊緣的分佈繼而抑制癌

細胞產生偽足運動從而降低其侵襲能力另外發現 Antrocin 會提昇癌細

胞上皮附著分子 E-cadherin 的表現和減少 Vimentin 的表現進一步更觀察

到 Antrocin 可降低膀胱癌細胞中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases

MMPs）的表現其中又以 MMP-2 的表現受抑制最為明顯另外發現以

Antrocin 處理的膀胱癌細胞中磷酸化 ERK 和 c-Fos 表現量降低染色質

免疫沉澱法（chromatin immunoprecipitation assay）分析之結果顯示 Antrocin

II

降低 c-Fos 與 MMP-2 上游 DNA 啟動位點上的結合能力此結果可能就是

Antrocin 抑制 MMP-2 表現的機制之一本研究論文中另一部分是探討

Antcin H 處理腎細胞癌的機轉發現 Antcin H 可抑制腎癌細胞生長其處

理 48 小時的 IC50為 170μM在非致死劑量（低於 100μM）的 Antcin H 處

理下細胞遷移和侵襲的能力也顯著降低這種抑制作用導因於抑制 FAK

和 Src 激酶活性抑制 paxillin 磷酸化和 vimentin 的表現進而破壞偽足形

成調昇 TIMP 家族的表現並抑制 MMP 家族的表現而其中又以 MMP-7

的表現量被抑制得最顯著從螢光素酶報告基因檢測 (reporter luciferase

assay)的數據表示Antcin H 除了抑制 MMP-7 的啟動子活性外也同時抑

制 c-FosAP-1 和 CEBP-β 對 MMP-7 基因的轉錄活性此外Antcin H 強烈

抑制ERK12的活性並且抑制癌細胞內的 c-FosAP-1和CEBP-β與MMP-7

上游啟動子結合位點的結合力總而言之本論文之研究是第一個發現

Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲以及 Antcin H 對人類腎癌細胞

之抗遷移和抗侵襲作用我們的發現提供Antrocin作為膀胱癌的替代療法

以及 Antcin H 可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之實證數據

關鍵字 Antrocin Antcin H 膀胱癌 腎癌 基質金屬蛋白酶

轉移侵襲作用 Focal adhesion kinase

III

ABSTRACT

Antrodia cinnamomea a famous medicinalmushroomknownas Niuchang

chih in Taiwan exhibits anti-inflammatory anti-oxidative anti-angiogenic and

hepatic protection properties Several in vitro studies demonstrate the

anti-cancer effects of Antrodia cinnamomea on hepatoma lung cancer as well

as breast cancer In this study the effects of two active compoundAntrocinand

Antcin H isolated from Antrodia cinnamomea against urological malignancies

both bladder cancer and renal cell carcinoma (RCC) were examined Our study

showed that treatment with cytotoxic concentration of Antrocin induced both

intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human bladder cancer 5637 cells

evidenced by increase of Fas DR5 Bax expression and caspase-3 -8 and -9

activation Exposure to non-cytotoxic concentrations of antrocin significantly

inhibited cell growth migration and invasion which was associated with

decreased phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and paxillin

Antrocin also reduced subcellular distribution of FAK and paxillin at the focal

adhesion contacts of the cell periphery site and disrupted the formation of

filopodia and lamellipodia Moreover Antrocin increased

epithelial-to-mesenchymal transition-related gene E-cadherin and decreased

vimentin expression Real time-PCR analysis showed that Antrocin

downregulated the expression of mRNA of several matrix metalloproteinases

(MMPs) including MMP-2 Also the phosphorylation of ERK and c-Fos were

attenuated by Antrocin Data from chromatin immunoprecipitation assay

demonstrated that antrocin decreased the DNA binding activity of c-Fos to the

upstreamenhancer region of MMP-2 promoter an action likely to result in

reducing MMP-2 expression Next the anti-cancer effects of antcin H were

IV

investinged in human renal carcinoma786-0 cells The results showed that antcin

Hsignificantly inhibited the growth of RCC 786-0 cells the IC50 value (for 48 h)

of antcin H was 170 μM Besides the migration and invasion of 786-0 cells

were also drastically suppressed by antcin H under non-cytotoxic concentrations

(lt 100 μM) these events were accompanied by the inhibition of FAK and Src

kinase activities decreases of paxillin phosphorylation and vimentin expressions

impairment of focal contact and lamellipodium formation and up-regulation of

tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) as well as down-regulation of

several MMPs especially MMP-7 expression Data from the reporter luciferase

assay showed that antcin H repressed the MMP-7 promoter activity in parallel

to inhibition of c-FosAP-1 and CEBP-β transactivation properties Moreover

antcin H strongly suppressed the activity of ERK12 and decreased the binding

ability of CEBP-βand c-Fos on the upstreamenhancer region of MMP-7

promoter Overall this is the first study demonstrates that Antrocin inhibited the

migration and invasion of bladder cancer cells as well as the anti-migratory and

anti-invasive effects of the Antcin H on RCC 786-0 cells Our findings provide

the evidence that Antrocin may be the substitutional therapy of bladder cancer

while Antcin H may have the potential for application on treating metastatic

RCC

Key wordAntrocin Antcin H Bladder cancer Renal cancer

Focal adhesion kinase Matrix metalloproteinase Metastasis

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

I

論文摘要

牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）是台灣特有的菌菇具有抗發炎

抗氧化及抗血管增生等功能台灣民間常用牛樟芝來治療肝癌肺癌及乳

癌等但相關的研究及作用機制仍有許多不清楚之處本研究在探討牛樟

芝的純化合物 Antrocin 及 Antcin H 對於泌尿道的兩種癌症膀胱癌及腎癌

的作用及其機轉結果發現高濃度 Antrocin 處理時膀胱癌細胞會發生死

亡現象其機轉是透過提高 FasDR5及 Bax 的表現和促進 Caspases 3

Caspases 8及 Caspases 9 的活性經由內在及外在路徑造成細胞凋亡

（apoptosis）若將膀胱癌細胞處理以低濃度非致死劑量的 Antrocin可顯

著地抑制癌細胞生長移動（migration）和侵襲（invasion）其機轉為抑

制磷酸化 FAK（focal adhesion kinase）和磷酸化 paxillin 的活化同時可

觀察到 Antrocin 可減少 FAK 和 paxillin 在癌細胞邊緣的分佈繼而抑制癌

細胞產生偽足運動從而降低其侵襲能力另外發現 Antrocin 會提昇癌細

胞上皮附著分子 E-cadherin 的表現和減少 Vimentin 的表現進一步更觀察

到 Antrocin 可降低膀胱癌細胞中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases

MMPs）的表現其中又以 MMP-2 的表現受抑制最為明顯另外發現以

Antrocin 處理的膀胱癌細胞中磷酸化 ERK 和 c-Fos 表現量降低染色質

免疫沉澱法（chromatin immunoprecipitation assay）分析之結果顯示 Antrocin

II

降低 c-Fos 與 MMP-2 上游 DNA 啟動位點上的結合能力此結果可能就是

Antrocin 抑制 MMP-2 表現的機制之一本研究論文中另一部分是探討

Antcin H 處理腎細胞癌的機轉發現 Antcin H 可抑制腎癌細胞生長其處

理 48 小時的 IC50為 170μM在非致死劑量（低於 100μM）的 Antcin H 處

理下細胞遷移和侵襲的能力也顯著降低這種抑制作用導因於抑制 FAK

和 Src 激酶活性抑制 paxillin 磷酸化和 vimentin 的表現進而破壞偽足形

成調昇 TIMP 家族的表現並抑制 MMP 家族的表現而其中又以 MMP-7

的表現量被抑制得最顯著從螢光素酶報告基因檢測 (reporter luciferase

assay)的數據表示Antcin H 除了抑制 MMP-7 的啟動子活性外也同時抑

制 c-FosAP-1 和 CEBP-β 對 MMP-7 基因的轉錄活性此外Antcin H 強烈

抑制ERK12的活性並且抑制癌細胞內的 c-FosAP-1和CEBP-β與MMP-7

上游啟動子結合位點的結合力總而言之本論文之研究是第一個發現

Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲以及 Antcin H 對人類腎癌細胞

之抗遷移和抗侵襲作用我們的發現提供Antrocin作為膀胱癌的替代療法

以及 Antcin H 可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之實證數據

關鍵字 Antrocin Antcin H 膀胱癌 腎癌 基質金屬蛋白酶

轉移侵襲作用 Focal adhesion kinase

III

ABSTRACT

Antrodia cinnamomea a famous medicinalmushroomknownas Niuchang

chih in Taiwan exhibits anti-inflammatory anti-oxidative anti-angiogenic and

hepatic protection properties Several in vitro studies demonstrate the

anti-cancer effects of Antrodia cinnamomea on hepatoma lung cancer as well

as breast cancer In this study the effects of two active compoundAntrocinand

Antcin H isolated from Antrodia cinnamomea against urological malignancies

both bladder cancer and renal cell carcinoma (RCC) were examined Our study

showed that treatment with cytotoxic concentration of Antrocin induced both

intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human bladder cancer 5637 cells

evidenced by increase of Fas DR5 Bax expression and caspase-3 -8 and -9

activation Exposure to non-cytotoxic concentrations of antrocin significantly

inhibited cell growth migration and invasion which was associated with

decreased phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and paxillin

Antrocin also reduced subcellular distribution of FAK and paxillin at the focal

adhesion contacts of the cell periphery site and disrupted the formation of

filopodia and lamellipodia Moreover Antrocin increased

epithelial-to-mesenchymal transition-related gene E-cadherin and decreased

vimentin expression Real time-PCR analysis showed that Antrocin

downregulated the expression of mRNA of several matrix metalloproteinases

(MMPs) including MMP-2 Also the phosphorylation of ERK and c-Fos were

attenuated by Antrocin Data from chromatin immunoprecipitation assay

demonstrated that antrocin decreased the DNA binding activity of c-Fos to the

upstreamenhancer region of MMP-2 promoter an action likely to result in

reducing MMP-2 expression Next the anti-cancer effects of antcin H were

IV

investinged in human renal carcinoma786-0 cells The results showed that antcin

Hsignificantly inhibited the growth of RCC 786-0 cells the IC50 value (for 48 h)

of antcin H was 170 μM Besides the migration and invasion of 786-0 cells

were also drastically suppressed by antcin H under non-cytotoxic concentrations

(lt 100 μM) these events were accompanied by the inhibition of FAK and Src

kinase activities decreases of paxillin phosphorylation and vimentin expressions

impairment of focal contact and lamellipodium formation and up-regulation of

tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) as well as down-regulation of

several MMPs especially MMP-7 expression Data from the reporter luciferase

assay showed that antcin H repressed the MMP-7 promoter activity in parallel

to inhibition of c-FosAP-1 and CEBP-β transactivation properties Moreover

antcin H strongly suppressed the activity of ERK12 and decreased the binding

ability of CEBP-βand c-Fos on the upstreamenhancer region of MMP-7

promoter Overall this is the first study demonstrates that Antrocin inhibited the

migration and invasion of bladder cancer cells as well as the anti-migratory and

anti-invasive effects of the Antcin H on RCC 786-0 cells Our findings provide

the evidence that Antrocin may be the substitutional therapy of bladder cancer

while Antcin H may have the potential for application on treating metastatic

RCC

Key wordAntrocin Antcin H Bladder cancer Renal cancer

Focal adhesion kinase Matrix metalloproteinase Metastasis

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

II

降低 c-Fos 與 MMP-2 上游 DNA 啟動位點上的結合能力此結果可能就是

Antrocin 抑制 MMP-2 表現的機制之一本研究論文中另一部分是探討

Antcin H 處理腎細胞癌的機轉發現 Antcin H 可抑制腎癌細胞生長其處

理 48 小時的 IC50為 170μM在非致死劑量（低於 100μM）的 Antcin H 處

理下細胞遷移和侵襲的能力也顯著降低這種抑制作用導因於抑制 FAK

和 Src 激酶活性抑制 paxillin 磷酸化和 vimentin 的表現進而破壞偽足形

成調昇 TIMP 家族的表現並抑制 MMP 家族的表現而其中又以 MMP-7

的表現量被抑制得最顯著從螢光素酶報告基因檢測 (reporter luciferase

assay)的數據表示Antcin H 除了抑制 MMP-7 的啟動子活性外也同時抑

制 c-FosAP-1 和 CEBP-β 對 MMP-7 基因的轉錄活性此外Antcin H 強烈

抑制ERK12的活性並且抑制癌細胞內的 c-FosAP-1和CEBP-β與MMP-7

上游啟動子結合位點的結合力總而言之本論文之研究是第一個發現

Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲以及 Antcin H 對人類腎癌細胞

之抗遷移和抗侵襲作用我們的發現提供Antrocin作為膀胱癌的替代療法

以及 Antcin H 可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之實證數據

關鍵字 Antrocin Antcin H 膀胱癌 腎癌 基質金屬蛋白酶

轉移侵襲作用 Focal adhesion kinase

III

ABSTRACT

Antrodia cinnamomea a famous medicinalmushroomknownas Niuchang

chih in Taiwan exhibits anti-inflammatory anti-oxidative anti-angiogenic and

hepatic protection properties Several in vitro studies demonstrate the

anti-cancer effects of Antrodia cinnamomea on hepatoma lung cancer as well

as breast cancer In this study the effects of two active compoundAntrocinand

Antcin H isolated from Antrodia cinnamomea against urological malignancies

both bladder cancer and renal cell carcinoma (RCC) were examined Our study

showed that treatment with cytotoxic concentration of Antrocin induced both

intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human bladder cancer 5637 cells

evidenced by increase of Fas DR5 Bax expression and caspase-3 -8 and -9

activation Exposure to non-cytotoxic concentrations of antrocin significantly

inhibited cell growth migration and invasion which was associated with

decreased phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and paxillin

Antrocin also reduced subcellular distribution of FAK and paxillin at the focal

adhesion contacts of the cell periphery site and disrupted the formation of

filopodia and lamellipodia Moreover Antrocin increased

epithelial-to-mesenchymal transition-related gene E-cadherin and decreased

vimentin expression Real time-PCR analysis showed that Antrocin

downregulated the expression of mRNA of several matrix metalloproteinases

(MMPs) including MMP-2 Also the phosphorylation of ERK and c-Fos were

attenuated by Antrocin Data from chromatin immunoprecipitation assay

demonstrated that antrocin decreased the DNA binding activity of c-Fos to the

upstreamenhancer region of MMP-2 promoter an action likely to result in

reducing MMP-2 expression Next the anti-cancer effects of antcin H were

IV

investinged in human renal carcinoma786-0 cells The results showed that antcin

Hsignificantly inhibited the growth of RCC 786-0 cells the IC50 value (for 48 h)

of antcin H was 170 μM Besides the migration and invasion of 786-0 cells

were also drastically suppressed by antcin H under non-cytotoxic concentrations

(lt 100 μM) these events were accompanied by the inhibition of FAK and Src

kinase activities decreases of paxillin phosphorylation and vimentin expressions

impairment of focal contact and lamellipodium formation and up-regulation of

tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) as well as down-regulation of

several MMPs especially MMP-7 expression Data from the reporter luciferase

assay showed that antcin H repressed the MMP-7 promoter activity in parallel

to inhibition of c-FosAP-1 and CEBP-β transactivation properties Moreover

antcin H strongly suppressed the activity of ERK12 and decreased the binding

ability of CEBP-βand c-Fos on the upstreamenhancer region of MMP-7

promoter Overall this is the first study demonstrates that Antrocin inhibited the

migration and invasion of bladder cancer cells as well as the anti-migratory and

anti-invasive effects of the Antcin H on RCC 786-0 cells Our findings provide

the evidence that Antrocin may be the substitutional therapy of bladder cancer

while Antcin H may have the potential for application on treating metastatic

RCC

Key wordAntrocin Antcin H Bladder cancer Renal cancer

Focal adhesion kinase Matrix metalloproteinase Metastasis

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

III

ABSTRACT

Antrodia cinnamomea a famous medicinalmushroomknownas Niuchang

chih in Taiwan exhibits anti-inflammatory anti-oxidative anti-angiogenic and

hepatic protection properties Several in vitro studies demonstrate the

anti-cancer effects of Antrodia cinnamomea on hepatoma lung cancer as well

as breast cancer In this study the effects of two active compoundAntrocinand

Antcin H isolated from Antrodia cinnamomea against urological malignancies

both bladder cancer and renal cell carcinoma (RCC) were examined Our study

showed that treatment with cytotoxic concentration of Antrocin induced both

intrinsic and extrinsic apoptotic pathways in human bladder cancer 5637 cells

evidenced by increase of Fas DR5 Bax expression and caspase-3 -8 and -9

activation Exposure to non-cytotoxic concentrations of antrocin significantly

inhibited cell growth migration and invasion which was associated with

decreased phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and paxillin

Antrocin also reduced subcellular distribution of FAK and paxillin at the focal

adhesion contacts of the cell periphery site and disrupted the formation of

filopodia and lamellipodia Moreover Antrocin increased

epithelial-to-mesenchymal transition-related gene E-cadherin and decreased

vimentin expression Real time-PCR analysis showed that Antrocin

downregulated the expression of mRNA of several matrix metalloproteinases

(MMPs) including MMP-2 Also the phosphorylation of ERK and c-Fos were

attenuated by Antrocin Data from chromatin immunoprecipitation assay

demonstrated that antrocin decreased the DNA binding activity of c-Fos to the

upstreamenhancer region of MMP-2 promoter an action likely to result in

reducing MMP-2 expression Next the anti-cancer effects of antcin H were

IV

investinged in human renal carcinoma786-0 cells The results showed that antcin

Hsignificantly inhibited the growth of RCC 786-0 cells the IC50 value (for 48 h)

of antcin H was 170 μM Besides the migration and invasion of 786-0 cells

were also drastically suppressed by antcin H under non-cytotoxic concentrations

(lt 100 μM) these events were accompanied by the inhibition of FAK and Src

kinase activities decreases of paxillin phosphorylation and vimentin expressions

impairment of focal contact and lamellipodium formation and up-regulation of

tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) as well as down-regulation of

several MMPs especially MMP-7 expression Data from the reporter luciferase

assay showed that antcin H repressed the MMP-7 promoter activity in parallel

to inhibition of c-FosAP-1 and CEBP-β transactivation properties Moreover

antcin H strongly suppressed the activity of ERK12 and decreased the binding

ability of CEBP-βand c-Fos on the upstreamenhancer region of MMP-7

promoter Overall this is the first study demonstrates that Antrocin inhibited the

migration and invasion of bladder cancer cells as well as the anti-migratory and

anti-invasive effects of the Antcin H on RCC 786-0 cells Our findings provide

the evidence that Antrocin may be the substitutional therapy of bladder cancer

while Antcin H may have the potential for application on treating metastatic

RCC

Key wordAntrocin Antcin H Bladder cancer Renal cancer

Focal adhesion kinase Matrix metalloproteinase Metastasis

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

IV

investinged in human renal carcinoma786-0 cells The results showed that antcin

Hsignificantly inhibited the growth of RCC 786-0 cells the IC50 value (for 48 h)

of antcin H was 170 μM Besides the migration and invasion of 786-0 cells

were also drastically suppressed by antcin H under non-cytotoxic concentrations

(lt 100 μM) these events were accompanied by the inhibition of FAK and Src

kinase activities decreases of paxillin phosphorylation and vimentin expressions

impairment of focal contact and lamellipodium formation and up-regulation of

tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) as well as down-regulation of

several MMPs especially MMP-7 expression Data from the reporter luciferase

assay showed that antcin H repressed the MMP-7 promoter activity in parallel

to inhibition of c-FosAP-1 and CEBP-β transactivation properties Moreover

antcin H strongly suppressed the activity of ERK12 and decreased the binding

ability of CEBP-βand c-Fos on the upstreamenhancer region of MMP-7

promoter Overall this is the first study demonstrates that Antrocin inhibited the

migration and invasion of bladder cancer cells as well as the anti-migratory and

anti-invasive effects of the Antcin H on RCC 786-0 cells Our findings provide

the evidence that Antrocin may be the substitutional therapy of bladder cancer

while Antcin H may have the potential for application on treating metastatic

RCC

Key wordAntrocin Antcin H Bladder cancer Renal cancer

Focal adhesion kinase Matrix metalloproteinase Metastasis

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

V

略字表

FAK Focal adhesion kinase

AIF Apoptosis inducing factor

ANOVA Analysis of variance

AP-1 Activating protein-1

Apaf-l Apoptotic protease activating factor-l

CEBPCCAATenhancer-binding proteins

DAPI 4rsquo6rsquo-Diamidino-2-phenylindole

ECM Extracellular matrix

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ERK Extracellular-regulated kinase

FAK Focal adhesion kinase

FADD Fas-associated death dormain

Fas Fas receptor

FasL Fas ligand

MMP Matrix metalloproteinase

mRNA Messenger RNA

NFκB Nuclear factor-kappa B

PBS Pulbeccorsquos phosphate buffered saline

RCC Renal cell carcinoma

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TGF-β Transforming growth factor-β

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinase

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

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Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

VI

誌謝

從醫學院畢業時從未想過自己有朝一日會有念頭修習博士學位

轉眼二十多年時光在忙碌的臨床工作中快速消失也未能在學術的領域

中更上一層樓感謝家母和徐士蘭博士的鼓勵和勸誘才在四十歲中旬

鼓起勇氣挑戰博士班的學程

感謝曾耀銘老師和徐博士對我耐心及熱忱地解說和指導讓離開學術

研究已久的我能輕易對複雜的研究計劃通盤了解謝謝內人及子女包

容我多出來的生活規劃也要感謝醫院裡的長官徐中平主任和程千里主

任平時對我學習的關心和加油打氣謝謝陳靖棻老師廖雅芳老師和張

清安老師為我介紹許多未曾接觸的知識領域讓修習的過程生動有趣

在我的研習過程中一直完全配合並積極參與的玉葉是我最要感恩的貴

人而從未忘記時時提醒我的秋香也讓我無後顧之憂地順利研習謝謝

中榮研究部的同仁尤其是旗志兄和香君鍥而不捨地重複實驗數據的真

實追求讓我能有優良而值得驕傲的研究結果

再次感謝我生命中的貴人們沒有您們的耐心關懷不可能有今日成

功的我對於您們的感謝溢於言表再次由衷地感謝您們的陪伴與指導

裘坤元 謹識

民國 105年 1月

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

VII

目錄

論文摘要 I

Abstract III

略字表V

誌謝VI

目錄 VII

第一章前言1

第二章緒論3

第一節膀胱泌尿上皮癌的簡介helliphellip3

第二節腎細胞癌的簡介4

第三節細胞凋亡5

第四節癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis ) 6

第五節牛樟芝的簡介7

第三章研究動機9

第四章 材料與方法10

第一節實驗材料10

一細胞株來源及培養條件10

二實驗藥劑及試劑10

第二節實驗方法11

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

VIII

一生長抑制測定11

二胱天蛋白酶活性測定11

三傷口癒合實驗helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12

四遷移和侵襲實驗helliphelliphellip12

五酶譜分析12

六免疫印跡分析helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

七RNA的萃取和real time-PCR13

八免疫螢光染色helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13

九染色質免疫沉澱法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14

十MMP-2啟動子結構和啟動子功能的測定helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15

十一西方點墨法helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

十二螢光素酶檢測helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

第三節統計分析法17

第五章結果18

第一節 Antrocin 處理膀胱泌尿上皮癌之研究18

第二節 Antcin H 處理腎細胞癌之研究22

第六章討論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28

第七章結論helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35

參考文獻37

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

IX

圖表目錄

圖一Antrocin 的化學結構式helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長hellip49

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化helliphellip50

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現51

圖六Antrocin 抑制傷口癒合51

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力52

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力52

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip53

圖十Antrocin 調控磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現helliphellip53

圖十一Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現54

圖十二在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 FAK 的分布54

圖十三在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣細胞之 lamellipodia

和絲狀偽足與磷酸化 PXN的分布55

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現55

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性56

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

X

現56

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖57

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合

力helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip57

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化58

圖二十Antcin H 的化學結構式58

圖二十一Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長59

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移59

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現helliphellip60

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成helliphelliphellip 60

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現

量61

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合61

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑

制62

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 抑

制62

圖二十九Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip63

圖三十Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip64

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

XI

圖三十一Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性65

圖三十二Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性65

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化66

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β 的結

合位點示意圖66

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β 與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙67

圖三十六Antcin H 以劑量依賴的型態調降 c-Fos 與 CEBP-β 之結合

力68

圖三十七Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69

圖三十八Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖hellip69

圖三十九Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意

圖helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

1

第一章 前言

根據衛生福利部的統計數字自民國七十四年迄今癌症已經成為臺灣

地區十大死因之首連續達三十年之久（1）臺灣地區在邁向已開發國家的

歷程中因為環境變遷飲食及生活環境的更迭種種癌症疾病的產生

已造成國民健康最嚴重的殺手對於政府健康維護政策也是極大的挑戰

而臨床醫師及相關醫療研究單位針對癌症致病機轉及有效治療方式持續

不斷的研究也已成為現代醫療研究系統中極其重要的課題

癌症對人類生命的威脅來自於癌症細胞的兩大特質即周邊組織的

侵犯（invasion）及遠處器官的轉移（metastasis）癌症細胞產生侵犯能力

時會在細胞周圍形成突起結構擺脫細胞與細胞間固有的凝集力產生

移動能力而脫離正常組織及細胞間的束縛（2）隨後癌症細胞分泌數種溶

解酶瓦解正常的組織間質讓癌症細胞本身可以從原發位置轉移到其他

正常組織（3）在癌症細胞侵犯周圍正常組織時也可以觀察到許多細胞結

構的變化以及破壞組織結構的蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）

和一些活動激酶（kinases）分泌的增加focal adhesion kinase (FAK)即是一

種很常見的激酶其可以媒介癌症細胞產生侵犯能力也在許多高惡性度

的癌症中被發現進而被認為是一種癌症惡化的象徵（4）相對的某些小

分子化合物若能抑制 FAK 的作用即可以發現癌症細胞的遷移和侵犯能

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

2

力盡皆受其影響（5）進而達到治療癌症的目的

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

3

第二章緒論

第一節 膀胱泌尿上皮癌的簡介

膀胱泌尿上皮癌(膀胱癌)是一種高度環境因素的疾病名列全世界最好

發癌症第九位（6）台灣地區由於吸菸以及染色劑和化學藥劑的接觸復

因含馬兜鈴酸成分的中草藥使用導致膀胱癌也成為十大常見癌症之一（7）

膀胱癌因為早期即有血尿發生的現象因此絕大多數的膀胱癌在發現時

都是早期的疾患但是由於腫瘤細胞惡性潛質不同許多膀胱癌患者在疾

病診斷時即已產生組織侵犯及轉移的現象由於膀胱癌患者的多樣化臨

床表現醫界常把膀胱癌分為非侵犯型膀胱癌和肌肉侵犯型膀胱癌兩種（8）

非侵犯性膀胱癌之治療僅需藉由內視鏡經尿道刮除腫瘤即可唯此手

術方式後還會有高達三到六成的再發機率甚至在復發時進展為肌肉

侵犯型膀胱癌導致需接受膀胱全切除的機會亦高達 15（9）因此在非

侵犯型膀胱癌症病患接受內視鏡刮除術後會輔助施行膀胱內藥物灌注治

療（10）只是此類膀胱內藥物灌注治療可能有膀胱內刺激症狀膀胱炎

甚至敗血症等副作用產生並且無法完全消除腫瘤復發的疑慮（11）而肌肉

侵犯型膀胱癌的病患就必須接受根除性膀胱全切除及尿路重建的治療

而且此類患者因為疾病經由血液及淋巴系統轉移另需接受輔助性化學

藥物注射治療其中又以含白金成分藥物 Cisplatin 為最重要（12）但是此類

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

4

藥物的腎臟毒性頗高而台灣地區罹患膀胱癌的病患又多為腎功能不全

者（13）施行此類化學藥物治療會有極高的風險綜此針對台灣地區膀

胱癌患者的治療仍需發現一個有效降低表淺型腫瘤復發之機會兼可治

療嚴重肌肉侵犯型病患的有效方法

第二節 腎細胞癌的簡介

腎細胞癌是泌尿系統中最致命的癌症約有三成左右的病人終將死於

癌症本身（14）此種癌症多發生在年長者而男女比率約 32多是偶發病

例但也有 2到 3的家族遺傳傾向（14-16）由於近年影像學篩檢的普及

腎細胞癌之新增病例有逐年增加的趨勢唯因早期診斷之比率提高其死

亡率卻也因此減少（17）但依然是泌尿系統中致死率最高的癌症腎細胞

癌的可能致病因子包括抽菸肥胖高血壓及家族遺傳基因變異（1618-20）

而其臨床治療方式目前還是以手術切除為主標準的根除性腎臟切除術

必須切除包括腎臟本身及其周圍脂肪組織腎門淋巴結同側腎上腺及近

端輸尿管（21）近年由於早期診斷的病例增加手術方式傾向腎元保存的部

分切除甚至微創的手術治療（22-24）基本上腎臟癌是一種化學治療無效

的疾病（25）如果疾病發現時已合併遠處轉移最好的方法是儘可能的透過

手術方式完全切除（24）對於已經無法以外科手術切除的轉移病患則需考

慮使用免疫治療或標靶治療（25-28）但是這些類型的治療方法副作用相對

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

5

較大價格十分昂貴尚且沒有完全治癒的病例報導因此找尋一個有

效的替代治療方法且可減少臨床治療的副作用對這類病況嚴重的腎細

胞癌病患而言有其迫切之需要

第三節 細胞凋亡( apoptosis )

細胞本有自行修復的能力但是當細胞受傷無法自行修復時細胞將逐

漸走入死亡其呈現的方式有三種細胞凋亡( Apoptosis )細胞自噬

( Autophagy ) 以及細胞壞死( Necrosis )細胞凋亡過程主要為核仁縮小細

胞核和細胞膜皺縮DNA 降解細胞皺縮和聚集細胞膜磷脂醯絲胺酸受

體由胞內向胞外翻導致細胞塌陷與瓦解引發凋亡小體出現進而被巨

噬細胞吞噬（29）

目前細胞凋亡的主要途徑可分成兩種即外在路徑和內在路徑

一 外在路徑(Extrinsic pathway)

外在路徑是通過細胞膜表面凋亡受器(FasL)誘發下游的激酶活化結

合下游蛋白 FADD將 Procaspase-8 裂解活化成 Caspase-8活化的 Caspase-8

再將 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡另外活化的 Caspase-8也會裂解

出 Bid而 Bid 會活化 Bax使得粒線體電位下降導致 Bcl-2(抗凋亡蛋白)

受到抑制釋放粒線體內的 Cytochrome c引發內在路徑而形成細胞凋亡

（30）

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

6

二 內在路徑(Intrinsic pathway)

內在路徑主要是經由粒線體或是內質網所引起來調控 Bcl-2 家族蛋白

Bcl-2 家族為凋亡調控基因群其家族分子依作用功效又可分為兩種一種

是抗凋亡的如 Bcl-2Bcl-xLBcl-w 以及 Mcl-l另一種是促進凋亡的分子

如 BaxBakBadBid 和 BimBcl-2 家族調控粒線體參與的凋亡途徑

當粒線體接受到死亡刺激時Bax 轉移至粒腺體外引起膜電位下降致使

粒線體膜孔打開釋放出 Cytochrome cAIF 及 Endo GCytochrome c 會

誘導 Apaf-l 跟 proCaspase-9 結合引發 Caspase-9 的活性進而活化下游

的 Caspase-3而引起細胞凋亡（31）而 AIFEndoG 會直接進入細胞核中

對 DNA 進行裂解導致細胞凋亡

第四節 癌症的侵襲 ( Invasion ) 與轉移 ( Metastasis )

癌症對於生命體的迫害起因於組織間的侵襲 ( invasion ) 繼而發生

遠處轉移 (metastasis) 而導致個體死亡約 90 癌病死亡為腫瘤轉移所

造成因此轉移扮演了癌症病史中非常重要的角色此過程分成了數個

步驟首先癌細胞藉由淋巴或是血液循環系統滲入附近的微血管並成

功地滲出而轉移到遠端的組織或器官若能順利的逃避體內免疫系統的攻

擊（32）並且適應了新的環境即開始生長成為轉移成功的腫瘤（33）癌症

侵襲是一個重複而循環的現象起初細胞會改變自我型態進而遷移至其

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

7

他位置（34）癌細胞在遷移的過程中先由 actin 所組成的細胞骨架經極

性改變而變形成偽足再伸出偽足和胞外的基質作用藉由蛋白酶的分

泌來裂解細胞外基質產生癌細胞移動的空間並因細胞邊緣的改變

使細胞能遷移至更遠的區域（3435）上述的細胞遷移步驟適用於不同種類

及不同型態的細胞包括正常細胞與癌細胞由於癌細胞轉移是種惡化的

指標是由 DNA 突變所導致因此能不受控制的侵襲增生這些步驟都

需要不同分子的調控例如 transforming growth factorndashβ (TGF-β) 和 MMPs

（3637）

第五節 牛樟芝的簡介

自然界有許多物質從古時代就已被用來治療疾病尤其是中草藥許

多植物已被證實有抗菌抗氧化及抗腫瘤的效果（38）目前普遍作用於化學

藥物製劑的 Vinblastine 以及 Taxol即是由植物中萃取純化的抗癌活性分子

之實例（3940）事實上有超過一半以上的病患及家屬在得知罹患癌症時

皆會尋求標準醫學治療外的輔助代替治療法而其中使用最多的也是中草

藥（41）台灣原住民在多年前即發現牛樟芝（學名 Antrodia cinnamomea）

這種蕈類擁有保護並修復肝功能的功效（42）近年各類相關研究也證明

牛樟芝有抗菌抗氧化及抗發炎的效用（43-45）在許多與腫瘤相關的研究報

告中更指出牛樟芝可抑制實驗室中培養的肝癌肺癌以及乳癌細胞之

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

8

生長（46-48）在許多尋找牛樟芝中有效活性化合物的研究中發現其中至少

含有 100 種以上之化合物（47-4950-52）其中的類固醇類化合物 Antcin曾被發

現有抗發炎作用並可增強血液循環（53）另外也有研究報告顯示 Antrocin

這種倍半萜內酯單一化合物（49）可以在實驗室的環境中抑制乳癌和肺癌

的細胞活性（5455）

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

9

第三章研究動機

本篇作者身為臨床泌尿科醫師有感於泌尿系統癌症病患受疾病侵襲

的痛苦及當前癌症治療方式的有限亟望尋找新的治療方式協助病患

戰勝癌症本篇論文使用牛樟芝中分離出的純化物 Antrocin 和 Antcin H

針對泌尿科常見的膀胱泌尿上皮癌及腎臟細胞癌之作用進行探討希望在

實驗室中先瞭解這類化合物對腫瘤細胞之生長及轉移之影響並進一步

探討其可能的作用機轉企望成為未來這類癌症病例之輔助治療可行性之

臨床依據

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

10

第四章材料與方法

第一節實驗材料

一細胞株來源

本實驗使用的人類膀胱癌 5637 及腎癌 786-0 細胞皆培養在 5CO2 及

37的培養箱中其 RPMI1640 培養基中含 10 heat-inactivated 牛胎血

清2mM的L-谷氨醯胺1mM丙酮酸鈉1非必需胺基酸和 1mM HEPES

二實驗藥劑

實驗中所使用的 Antrocin 及 Antcin H皆是由朝陽科技大學生化科技

研究所的曾耀銘教授提供

台盼藍染料從 GIBCOreg （Invitrogen 公司美國）購得

RPMI-1640 培養基粉末自 Hyclone 公司（Thermo UT USA）購得

HEPESL-谷氨醯胺和丙酮酸鈉來自 Sigma Chemical Company (St

LouisMO USA)

Giemsas azur eosin methylene blue 溶液從 Merck KGaA 公司(Darmstadt

Germany)購得

ECL series HRP 化學發光底物是從 Perkin Elmer 公司(Norwalk CT USA)獲

得

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

11

Anti-β-actin anti-phosphorylated-ERK and anti-c-Fos 抗體購自 Santa Cruz 公

司(CA USA)

Anti-Vimentin anti-phosphorylated-AKT anti-phosphorylated-FAK anti-

phosphorylated-Paxillin 抗體購自 Cell Signaling 公司(Danver MA USA)

Anti-E-cadherin 抗體購自 BD Transduction 公司(San Jose CA USA)

第二節實驗方法

一生長抑制測定 (growth inhibition assay)

生長抑制是由台盼藍染料排除法測定

膀胱癌 5637 以 1times105細胞孔的數量接種到 12 孔盤培養 24 小時之後

用各種濃度 Antrocin（0255075100 和 125μgmL）處理 24 和 48

小時評估經台盼藍染色的細胞數量並估計 IC50

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估細胞數量並估計 IC50

二胱天蛋白酶活性測定 (caspase activity assay)

使用BioVision公司(Milpitas CA)提供的BioVision Caspase activity assay

kit測量胱天蛋白酶-2-3-8-9 和-12 的活性在 Antrocin 處理 48 小時

後將細胞用冷卻的裂解緩衝液裂解然後離心 30 分鐘其中的蛋白質萃

取物混合兩倍緩衝液分別加上 VDVAD-AFC（胱天蛋白酶 2）DEVD-AFC

（胱天蛋白酶 3）IETD-AFC（胱天蛋白酶 8）LEHD-AFC（胱天蛋白酶 9）

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

12

和 ATAD-AFC（胱天蛋白酶 12）的基質將混合物在 37中培養 8 小時

在 405nm 吸光度下比較 Antrocin 處理細胞與未處理的對照組其胱天蛋

白酶活性

三傷口癒合實驗 (wound healing assay)

以高密度膀胱癌細胞（1x106個細胞mL）接種在 6 孔培養板並使其附

著過夜將生長融合的細胞表面刮傷分別處理或不處理 Antrocin 達一定

時間用數位相機(IX70 Olympus)評估傷口癒合的結果

腎癌 786-0 細胞亦使用相同方法評估處理或不處理 Antcin H 後觀察傷

口癒合結果

四遷移和侵襲實驗 (migration and invasion assay)

在膀胱癌細胞體外遷移實驗中將 Antrocin 處理或未處理的細胞經胰

蛋白酶處理後接種在 trans-well 的上部腔室（孔徑8 μM Millipore 公司

Billerica MA USA)培養達一定的時間吸出培養基用 PBS 洗滌兩次

並用甲醇固定 10 分鐘用 Giemsa 溶液染色計算遷移的細胞數在體外

侵襲實驗中則在細胞接種之前將基質膠（BD Biosciences 公司San Jose

CA USA) 預塗在每個插入孔的膜上相同的方法亦使用於評估腎癌 786-0

細胞經 Antcin H 處理或不處理後遷移和侵襲能力的評估

五酶譜分析 (zymography assay)

MMP-2 的活性用明膠酶譜檢測簡言之人膀胱癌 5637 細胞用 025

13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

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性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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13

5075μgmL Antrocin 處理 24 小時然後收集培養基離心 20 分鐘將濃縮

培養基樣品進行加載和分離電泳後將凝膠用 25的 Triton X-100 的

20mM 的 Tris-HCl 緩衝液（pH75）沖洗然後用反應緩衝液（20mM 的

Tris-HClpH 值 75150 mM NaCl 5 mM CaCl2 1 mM ZnCl2) 在 37培養

過夜隨後透過 Amido black 染色和甲醇乙酸定影獲得酶譜

六免疫印跡分析 (immunoblot analysis)

將細胞在冰上通過 RIPA 緩衝液裂解 20 分鐘將裂解物以 13000rpm 離

心 30 分鐘將等量蛋白樣品經過 SDS-PAGE 分離然後轉移到聚偏二氟膜

(Millipore Billerica MA USA)上在 2BSA 阻斷後將膜與初級抗體培

育用 PBS 漂洗印跡三次與 horseradish peroxidase-conjugated 的第二抗體

培育將印跡暴露於的 ECL Plus 檢測試劑

七RNA 的萃取和 real time-PCR (RNA extraction and real time-PCR)

使用TRIzolreg 分離試劑盒(Invitrogen Carlsbad CA USA)萃取mRNA總

量使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc)將1μg

總 RNA 進行逆轉錄酶反應以 SYBR Green PCR master mix kit (Applied

Biosystems Life technologies) 和 ABI PRISM 7900 Sequence Detector

system 進行 Quantitative real-time PCR以觀察 mRNA 的表達

八免疫螢光染色 (immunofluorescence staining)

經處理後的細胞用 4多聚甲醛固定 15分鐘然後透化並同時用 01

14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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14

Trinton-X100 和 1BSA 阻斷 30 分鐘細胞孕育於適當稀釋地初級抗體中

1 小時經過 PBS 洗滌然後與 Alexa-Fluor 488-conjugated 二級抗體

(Invitrogen Carlsbad CA USA)和 Phalloidin-iFluor 647 Conjugate (AAT

Bioquestreg Inc CA)在室溫下培育 1 小時用雷射共聚焦顯微鏡(FV1000

Olympus)檢測細胞

九染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay ChIP)

細胞獲取後用 1的甲醛固定再添加甘氨酸淬滅在此之後將細胞

用 PBS 漂洗和用 SDS 裂解緩衝液裂解裂解物進行超音波處理以擊破

DNA 成 200-1000bp 的片段大小然後用 DNA-protein A agarose (Millpore

Billerica MA USA)和 normal IgG or antibody against c-Fos (Santa Cruz Inc

CA USA)在 4過夜進行免疫沉澱再用食鹽水洗滌該 DNA 經 DNA

clean-up purification Kit (Promega Madison WI USA)純化並分析在免疫沉

澱的 DNA 中通過 PCR從 MMP2 啟動子區的 DNA 序列的相對豐富區進

行分析使用的引物 (primer) 序列是5-CACAGGCCACGAGTTTGC-3

（正向）和 5-GAGAAGTAAGGTCAGG-3（反向）

在 Antcin H 處理腎癌細胞實驗中用以偵測 MMP7 啟動子區 DNA 序

列 的 PCR 引 物 則 分 別 為 在 -14 kb 區 5prime-

TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-TCATCGAAGTGAGCATCTCC-3prime（反向）在-876 to -1201 bp 區域

15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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15

5prime-CTCCAGCATATTTGGAGTGTTTCC-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CTTCCAATCACTCTGACTCTGGC-3prime（反向）在-263 to -529 bp 區域

5prime-CATCTTTCCCCTGTATGGAGAAC-3 （ 正 向 ） prime 和

5prime-GACTGCTCTCATAGGTATCATTCAGG-3prime（反向）在-138 to -288 bp 區

域 5prime-CCTGAATGATACCTATGAGAGCAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-CGAGGAAGTATTACATCGTTATTGG-3prime（反向）在+2 to -229 bp 區域

5prime-GGAGTCAATTTATGCAGCAGACAG-3prime （ 正 向 ） 和

5prime-GGTGTTTTCTGCTAGTGACTGCAG -3prime（反向）

十MMP-2 啟動子結構和啟動子功能的測定

通過 PCR 的方法使用人類膀胱癌細胞基因組 DNA 製備作為模板將

含有螢光素酶報告質粒的 MMP2 啟動子區 (包含從-1900 到 100bp) 擴增

該引物設計為在包含限制性酶 Mlu I 和 Bgl Ⅱ的位點上正向和反向引物分

別 為 5-ACGCGTTTTAGCCCACAGGCCACGAG-3 （ 正 向 ） 和

5-AGATCTCAATCCTGTATGTTTAAAGCCCC-3（反向）將 PCR 產物構

建到 pGL3 載體上並包括螢光素酶報告基因利用 Lipofectamine2000

(Invitrogen Waltham MA USA)將 5637 細胞進行轉染 MMP2 螢光素酶啟

動子載體和pRL-CMV內部對照DNA使用購自Promega（Madison WI USA)

的 Dual-Glo syste 進行螢光素酶測定螢火蟲螢光素酶值用 renilla luciferase

標準化後測量啟動子活性

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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(2011)

16

十一西方點墨法 (Western blot analysis)

將PVDF 膜 浸於甲醇活化數秒後置於Milli-Q水潤溼再將裁好的

濾紙與PVDF 膜 浸泡在transfer buffer( 25 mM Tris 192 mM glycine )中使

用適當水量之水盆將轉漬夾打開以紅色為正極置於最下方依序放入黑

色海綿濾紙PVDFmembrane電泳膠片濾紙黑色海綿最後夾上轉漬

夾以橡皮筋綑緊放入電泳槽中於 4通以400 mA電流一小時半將PVDF

膜 取出浸泡在含2 BSA之TBST buffer (2422gTris 8775g NaCl 10 ml

Tween20用 Milli-Q 水配製1公升於室溫下搖晃一至三小時以TBST

buffer搖洗3次將 TBST buffer倒掉加入一級抗體於4作用隔夜隔日

用TBST buffer搖洗3次後加入二級抗體於室溫下搖晃作用一小時後再

使 用 TBST buffer 清 洗 3 次 接 著 在 暗 房 將 PVDF 膜 與

Enhancechemi-luminescence detection kit反應後夾於透明塑膠袋中並置於壓

片夾內以X-rayfilm感光顯影再沖片顯影

十二螢光素酶檢測

為了產生螢光素酶來定位MMP-7序列中含有MluⅠ和BglⅡ限制性位點

我們設計了基因序列導入PGL3矢量上游的螢火蟲螢光素酶基因其引物是

+15至-1000 鹼基5-TGG ACGCGTTCATTTTTGGTAAGAATGGTCAT-3

（正向）和5-AGATCTTATGGTTGATTTGGTGTTTTCTGCTAG-3（反向）

導入載體後將載體進行測序以確認每個構建體插入物的方向性和完整

17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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17

性為了轉染利用Lipofectamine2000將細胞共轉染至載體DNA和含有

海腎螢光素酶基因的pRL-CMV內部對照加進治療或不治療Antrocin的孔洞

中收集細胞並以Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega

Madison WI USA)進行螢光素酶活性檢測分析

第三節統計分析法

實驗結果是經過至少三個類似模式的獨立實驗證實實驗數值又來自

三個獨立實驗（N =9）以平均值 plusmn 標準差表示結果使用單向方差分析

（ANOVA）分析與Studentrsquos t檢驗進行做統計比較統計結果之顯著性分別

設定為 plt005 plt001和 plt0001

18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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18

第五章結果

第一節 Antrocin 抑制膀胱泌尿上皮癌之生長侵襲及轉移

本實驗使用曾耀銘教授提供的 Antrocin (化學結構如圖一所示)研究其

對於實驗室中培養之人類膀胱癌 5637 細胞生長侵襲及轉移作用的抑制效

果

一Antrocin 可抑制膀胱癌細胞之生長以及促進癌細胞凋亡

以不同濃度的 Antrocin（010255075100 和 125 μgmL）處理

人類膀胱癌 5637 細胞 24 和 48 小時後用台盼藍染料排除法測定活細胞數

目如圖二顯示Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞的生長且具濃度

和時間的依存性暴露於低 Antrocin 濃度（lt75μgmL）會導致膀胱癌細胞

的生長抑制但 48 小時後亦未見細胞死亡 然而暴露於高濃度 Antrocin

（gt100μgmL）除了細胞數顯著減少之外在處理 48 小時後膀胱癌細胞

的死亡率將近 100

此外以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集（圖

三）且胱天蛋白酶被活化（胱天蛋白酶 38 和 9）（圖四）顯示 Antrocin

可誘導人類膀胱癌 5637 細胞凋亡 (apoptotic cell death)接著透過西方點

墨法分析細胞凋亡相關蛋白的表現(圖五)發現以 125μgmLAntrocin 處

理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中 Bax 蛋白FAS 和 DR5 蛋白質都有增

19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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19

加的現象同時 Bcl-2 蛋白卻相對降低這些結果暗示 Antrocin 可同時經由

活化死亡受體家族(death receptor family) 和 Bcl-2 家族兩種途徑誘導膀胱

癌細胞凋亡作用

二Antrocin 可抑制膀胱癌細胞的轉移及侵襲作用

肌肉侵犯型膀胱癌的預後較差大約有一半的患者會發展出轉移性病

灶並於 3 年之內死於疾病本身（56）因此開發新的藥劑以防止疾病進

展成肌肉侵犯型膀胱癌是迫切需要的為了檢驗 Antrocin 是否能抑制人類

膀胱癌 5637 細胞的遷移在非細胞毒性濃度 Antrocin（lt75μgmL）處理下

進行傷口癒合實驗(wound healing assay)如圖六顯示Antrocin 降低膀胱癌

細胞的活動性在 25μgmL 濃度的 Antrocin 中可抑制約 50傷口癒合

而 75μgmL 濃度的 Antrocin幾乎完全抑制傷口癒合的能力接著藉由

Boyden 小室分析(Boyden chamber analysis)發現 Antrocin 以濃度正相關的

方式抑制膀胱癌細胞的遷移作用（圖七）同時Boyden 小室分析也做為

研究 Antrocin 抑制膀胱癌細胞侵襲效果的方法其結果顯示 Antrocin 降低

膀胱癌細胞的侵襲能力（圖八）這些結果指出透過抑制膀胱癌 5637 細

胞的遷移及侵襲能力在非細胞毒性劑量下Antrocin 可能是一個強力且多

效性的膀胱癌治療藥劑

三Antrocin 可調控 FAKpaxillinE-cadherin 及 vimentin 之表現

接著我們用西方點墨法分析Antrocin對FAK和paxillin激活力的影響

20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

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20

發現人類膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受 Antrocin 的處理

濃度增加而逐步降低（圖九）這個現象可以在免疫染色下於膀胱癌細

胞膜周圍觀察到（圖十和十一）同時接受 Antrocin 處理 24 小時後發

現於膀胱癌細胞中上皮標記物 E-cadherin 會增加而間質標誌物 vimentin

相對減少（圖九）這些結果顯示 FAKpaxillinE-cadherin 和 vimentin

可能是 Antrocin 抑制人類膀胱癌 5637 細胞遷移的標的物

四Antrocin 阻礙 lamellipodia 的形成

以往的研究指出細胞前緣形成的 lamellipodia 和絲狀偽足

(filopodium) 是癌細胞在進行細胞遷移時的必要因素（57）而 FAK和 paxillin

則扮演癌細胞在進行細胞遷移時lamellipodial 和絲狀偽足的調控器（58）

我們接著在傷口癒合實驗邊緣細胞的 lamellipodia 和絲狀偽足中用免疫染

色法檢驗磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的多寡發現在 Antrocin 處理後

人類膀胱癌 5637 癒合區之邊緣細胞其 lamellipodia 和絲狀偽足之形成減

少且磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的表現也相對降低（圖十二和十三）

五基質金屬蛋白酶之 mRNA 的表現可被 Antrocin 抑制

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases MMPs）的表現是惡性腫

瘤生長侵襲和轉移的關鍵分子（59）因此這些蛋白酶被認為是癌症治療時

的重要臨床目標所以我們接著研究 Antrocin 是否能抑制 MMPs 的表現

人類膀胱癌 5637 細胞接受 75μgmLAntrocin 處理 16 小時後分離總 RNA

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

21

並進行 real time-qPCR 分析發現經 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細

胞中 MMP-1-2-8-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少（圖十四）此

外透過明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的蛋白酶活性也相對地被抑制（圖十五）

六Antrocin 可降低 ERK 的激活及 c-Fos 的表現

之前的研究發現FAK 誘導的 ERK 活化對於癌細胞產生遷移及侵襲

作用時其激化 MMPs 的表現扮演重要角色（60）為此使用抗磷酸化

ERK 免疫印跡分析檢測磷酸化 ERK 的存在如圖十六磷酸化 ERK 被發

現在人類膀胱癌 5637細胞中 然而經過 Antrocin處理的細胞磷酸化 ERK

的相對表現則較低這個結果清楚地表示Antrocin 能抑制人類膀胱癌 5637

細胞中 ERK 的激活此外另一個涉及調控 MMPs 表現存在於 ERK 下

游的轉錄因子 c-Fos在膀胱癌 5637 細胞中的表達也會被 Antrocin 抑制(圖

十六)

曾有研究顯示坐落於 MMP-2 的基因序列上游的 c-Fos 結合區若被啟

動將增加 MMP-2 的基因表達（61）圖十七顯示位於 MMP-2 啟動區上游的

c-Fos 結合區的示意圖為了瞭解 Antrocin 對於 c-Fos 蛋白調節 MMP-2 基

因表達中的影響人類膀胱癌5637細胞分別在沒有Antrocin或含有75μgmL

Antrocin 的基質中培養 16 小時然後用抗 c-Fos 染色質免疫沉澱（chromatin

immunoprecipitation ChIP）測定如圖十八顯示若使用特別設計針對

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

22

MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查會發現在未經 Antrocin

處理的人類膀胱癌 5637 細胞之表現較強然而在經過 Antrocin 處理的細

胞中其表現卻下降這些結果表示Antrocin 可以減少 c-Fos 與 MMP-2

上游啟動子的結合進而抑制 MMP-2 的表現我們還使用 MMP-2 螢光素

酶啟動子報告(luciferase promoter reporter)分析平台評估 Antrocin 對於

MMP-2 啟動子活性的影響不出所料地 MMP-2 表現的減少與 MMP-2

啟動子活性之降低是相關聯的（圖十九）這些結果表示Antrocin 透過抑

制 ERKc-Fos 的訊息傳導途徑從而調降人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-2

的表現

第二節 Antcin H 抑制腎細胞癌之生長及轉移侵襲

轉移性腎癌病患的預後不佳只有 10 至 20的轉移性腎癌患者能夠

存活 2 年以上（62）因此發展出安全又有效的藥物用於治療轉移性腎癌

有臨床上迫切的需要本項研究使用的 Antcin H是由朝陽科技大學生化

科技研究所曾耀銘教授提供Antcin H 的化學結構表示於圖二十實驗中

利用人類腎癌 786-0 細胞株探索以下實驗中細胞和分子的變化

一Antcin H 可抑制人類腎癌細胞的生長

為了檢驗 Antcin H 對細胞增殖的影響人類腎癌 786-0 細胞分別用不同

濃度的 Antcin H（20-300 μM）處理 24 和 48 小時如圖二十一所示Antcin

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

23

H 對人類腎癌 786-0 細胞的生長抑制與使用的劑量濃度成正相關低濃度

Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖而以高濃度 Antcin H (300 μM)處理則產

生細胞毒性其 48 小時 IC50是 170 μM

二Antcin H 阻礙腎癌細胞的轉移

其次使用 Boyden 小室遷移實驗探討 Antcin H 對細胞遷移的影響

如圖二十二用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理人類腎癌 786-0 細胞在

24 小時後發現產生遷移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組

減少而這種抑制現象與治療時使用的 Antcin H 濃度呈正相關性

三Antcin H 抑制與轉移相關的分子活性

前文中曾提及 FAKpaxillin 途徑在癌細胞產生細胞遷移和侵襲時扮演

關鍵的作用（4）此外上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition EMT）

也被視為是癌症細胞獲得遷移和侵襲能力時的一個必要過程（63）而喪失

E-cadherin 以及 vimentin 的增加則代表癌細胞在上皮間質轉化過程中細

胞遷移和侵襲的能力增加吾等接著用西方點墨法探索在 Antcin H 抑制

人類腎癌 786-0 細胞產生遷移作用時對 FAKpaxillin 和 E-cadherin 表現

的影響進而了解其抑制效果的分子機制如圖二十三所示在 50μM 和

100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 呈現出

與處理劑量成正相關的明顯抑制變化而這些劑量濃度可以視為 Antcin H

的抗人類腎癌 786-0 細胞遷移的濃度（圖二十二）另外vimentin 的表現

24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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24

也因 Antcin H 的處理而顯著減少然而FAK 和 paxillin 卻沒有因 Antcin H

的處理而改變而且 Antcin H 的處理組及對照組中皆無 E-cadherin 的表

現這些結果表示FAKpaxillin 和 vimentin 是 Antcin H抑制人類腎癌 786-0

細胞遷移時之標的分子

四Antcin H 減少磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 在細胞之表現及分佈

進一步我們使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗體經由免疫染色

分析法觀察在接受 100 μM 劑量 Antcin H 處理之後的人類腎癌 786-0 細胞

中磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 的分佈情形並與 vimentin 和細胞核分

別染色發現在未經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中磷酸化 FAK

和磷酸化paxillin廣泛地分佈在癌細胞周圍富含vimentin的偽足中相反的

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞中除了細胞周圍的偽足較不明顯

外磷酸化 FAK 和磷酸化 paxillin 也明顯降低（圖二十四與二十五）

五Antcin H 抑制 lamellipodia 之形成

接著我們使用傷口癒合實驗的細胞攝影評估 Anticin H 抑制癌細胞

遷移的效果發現經 Anticin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞遷移活性

有顯著的延遲（圖二十六）因為 FAK 和 paxillin 兩者皆扮演調節癌細胞

偽足形成的重要角色（64）因此使用抗磷酸化 FAK 和抗磷酸化 paxillin 抗

體的免疫染色法檢測傷口邊緣的腎癌細胞發現在未經 Anticin H 處理的

人類腎癌786-0細胞之偽足前緣有磷酸化FAK（圖二十七）和磷酸化paxillin

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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(2011)

25

（圖二十八）明顯存在的小點狀結構相反的在經 Antcin H 處理的癌細

胞之傷口前緣其磷酸化 FAK（圖二十七）和磷酸化 paxillin（圖二十八）

的數量就相對減少很多因為偽足常存在於具有高度活動力的細胞中

所以上述結果表示經 Antcin H 的處理可導致人類腎癌 786-0 細胞遷移

能力的下降

六腎癌細胞的侵襲能力及其相關分子可被 Antcin H 抑制

接著再用包覆基質膠的跨孔侵襲實驗探究 Antcin H 是否能抑制人

類腎癌 786-0 細胞的侵襲作用如圖二十九Antcin H 有效降低癌細胞的侵

襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照組由於 MMP

和 TIMP 家族成員的表現是癌症產生侵襲時的關鍵因素我們接著進行

real time-PCR 來分析 Antcin H 影響 MMP 和 TIMP 家族基因表現的效果

如圖三十的結果經 Antcin H 處理後786-0 細胞內的 MMP-2MMP-3

MMP-7 和 MMP-13 的基因表現減少 而 TIMP-3 和 TIMP-4 表現卻增加然

而 MMP-1MMP-8MMP-9MMP-10MMP-11TIMP-1 和 TIMP-2 的

基因表現則不受影響透過西方點墨法進一步檢測在 Antcin H 抑制人類

腎癌 786-0細胞遷移和侵襲作用時涉及FAK途徑活化的相關激酶如Src

FAKERK12c-Fos和 CEBP-β的表現(圖三十一)曝露於 100 μM 的 Antcin

H 後FAK 傳導途徑中的磷酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時後開

始急劇下降並且連續地被抑制達 24 小時於此同時主要的 ERK 的下

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游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

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Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

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Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

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Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

26

游轉錄因子如 c-Fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少(圖三十二）

七Antcin H 可藉由抑制 c-Fos 及 CEBP-β 的活性來降低 MMP-7 之表現

有越來越多的證據指出MMP-7 在腎細胞癌中會過度表現（58）並與癌

症發生臨床轉移導致預後不良的現象有關（6566）由於 Antcin H 處理後

人類腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表現顯著減少(圖三十)為了進一步確認

Antcin H 對 MMP-7 的抑制是發生在轉錄(transcription)階段以報告螢光素

酶檢測來評估 MMP-7 的啟動子活性如圖三十三所示Antcin H 在人類腎

癌 786-0 細胞中可抑制 MMP-7 啟動子的活性這些數據表明Antcin H

經由抑制 MMP-7 的啟動子活性來減少癌細胞中 MMP-7 的表達

值得注意的是有兩個 c-Fos AP1（c-FosRE1-67〜-59 和 c-FosRE2-981

〜-972）和四個 CEBP-β（CEBP-βRE1-55〜 - 50 CEBP-βRE2-250〜

-245 CEBP-βRE3-457〜-451 CEBP-βRE4-997〜-985）的結合位點

坐落在 MMP-7 的起始端上游（圖三十四）為了確定哪些結合位點與 Antcin

H 引發的 MMP-7 基因表達之抑制有關使用抗 c-Fos 抗體和抗 CEBP-β 抗

體來進行染色質免疫沉澱法來測定如圖三十五所見在未經 Antcin H 處

理的人類腎癌 786-0 細胞中c-Fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子上游

的兩個潛在 c-FosAP1 結合位點即 c-FosRE1 和 c-FosRE2且 c-Fos 與

c-FosRE1 的相互作用是比 c-FosRE2 更強然而經 Antcin H 處理的人類

腎癌 786-0 細胞的 c-Fos與這兩個結合位點的結合力顯著下降此外在

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

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KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

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Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

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Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

Surgical Pathology Vol 13 No 2 pp143-153 (2005)

9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

27

未經處理的細胞中CEBP-β 似乎只連結三個假定結合位點（CEBP-βRE1

CEBP-βRE2CEBP-βRE4）而經 Antcin H 處理後CEBP-β 與這些結合

位點的結合力顯著降低圖三十六的結果顯示Antcin H 以劑量依賴地型

態分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子 DNA 序列遠端

和近端的結合位點上（c-FosRE1c-FosRE2CEBP-βRE1CEBP-βRE2

和 CEBP-βRE4）這些結果闡明Antcin H 可以降低 c-Fos 和 CEBP-β 這

兩個轉錄因子進入 MMP-7 啟動子上游的反應位點最終抑制 MMP-7 基因

在人類腎癌 786-0 細胞的表現

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

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SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

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5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

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No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

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9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

28

第六章討論

異常增殖和轉移被認為是惡性腫瘤的重要特性轉移的產生是許多癌

症患者的併發症發生和邁向死亡的主要原因惡性腫瘤經由 EMT 的方式

從周圍組織遷移和侵襲到血液和淋巴循環被認為是惡性腫瘤細胞在轉移

過程早期發生的步驟（67）因此如果能開發出有效抑制癌細胞增殖遷移

和侵襲的新藥物就可能成為一種用於預防或治療轉移性癌症的潛在藥物

本研究是第一個證明 Antrocin這種從牛樟芝分離出的倍半萜內酯有抑制

人類膀胱癌 5637 細胞增殖和轉移的作用通過促進凋亡蛋白 (BaxFAS

和 DR5) 的增加並降低抗凋亡蛋白 (Bcl-2 和 Bcl-xL) 的產生確認

Antrocin 可以經由外在和內在兩種途徑誘導膀胱癌細胞的凋亡（圖三和四）

研究數據顯示誘導 5637 細胞凋亡可能是 Antrocin 對膀胱癌細胞生長抑

制的重要機制先前的研究證明Antrocin 通過 Bcl-2 家族途徑誘導人類

乳腺癌 MDA-MB-231 細胞凋亡（67）此外在非細胞毒性的濃度下Antrocin

可抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移和侵襲這種抑制作用則經由阻斷絲狀偽足

的形成和抑制 FAKpaxillin 和 ERK 的磷酸化激活同時在 Antrocin 處

理中也觀察到 c-FosMMPs 和 vimentin 的表現減少以及 E-cadherin 的

增加這些結果表明Antrocin 可能對人膀胱癌的惡化和轉移具有預防和

或治療的效果

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

The Journal of Cell Biology Vol 160 No 5 pp753-767 (2003)

5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

Surgical Pathology Vol 13 No 2 pp143-153 (2005)

9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

29

FAK 是一種細胞質內的蛋白質酪氨酸激酶位在細胞黏著接觸點上是細

胞發生遷移時相關的訊息傳達之整合器而 FAK 的信號傳導失控是癌

症形成及惡化的重要原因（4）增加 FAK 表達和 FAK 的功能與癌細胞進

展成侵入性細胞型態增加其遷移和侵襲能力有關因此調節 FAK 的功

能和表達是可以用於治療癌症的潛在標的（5） Src 和 paxillin 是 FAK 激

活後下游重要的配體和反應者當 Src 與磷酸化 FAK-Tyr925 整合時其

複合物形成再與 paxillin 共同影響細胞活動性促進遷移作用的產生（68）

此外破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用則可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（67）本研究證明 Antrocin 抑制 FAK 和 paxillin 的磷酸化這可能

導致這些分子之間相互作用的喪失並抑制膀胱癌 5637 細胞的遷移活動

癌細胞產生遷移和侵襲的早期階段中細胞膜會皺裂而產生絲狀結構稱

為 lamellipodia 和偽足其結構中含有成束的肌動蛋白絲和相關蛋白（70）

FAK 和 paxillin 是調節細胞基質粘附機制和絲狀偽足和偽足形成的關鍵蛋

白（71） FAK 負責 paxillin 的磷酸化磷酸化的 paxillin 控制肌動蛋白骨架

的形成（72）我們的結果發現在細胞群中造成傷口 16 小時後對照組中產

生遷移的細胞其偽足和 lamellipodia 明顯增加然而免疫螢光圖像（圖十

二和十三）顯示Antrocin 抑制偽足和 lamellipodia 的形成並降低磷酸化

FAK和磷酸化 paxillin在 5637細胞 Focal adhesion contact前緣的螢光表現

減少磷酸化激活的 FAK 和 paxillin進一步降低癌細胞的遷移活性這表示

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

The Journal of Cell Biology Vol 160 No 5 pp753-767 (2003)

5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

Surgical Pathology Vol 13 No 2 pp143-153 (2005)

9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

30

Antrocin 抑制膀胱癌 5637 細胞的偽足和 lamellipodia 的形成並影響傷口癒

合和遷移作用產生是透過抑制 FAK 和 paxillin 磷酸化及減少肌動蛋白

束的形成這個觀察結果與先前發現阻斷 FAK 和 paxillin 的功能將減

少偽足及 lamellipodia 形成和抑制細胞遷移的研究報告一致（73）

ERK 是許多信息傳導路徑中重要的訊息轉換者藉此維持不同的細

胞功能包括細胞死亡或存活以及許多類型癌細胞的遷移作用（74）研究

顯示 Src 可促使 FAKTyr 925 的磷酸化並誘導 ERK 的活化（74）這一連串

的交互作用可刺激腸上皮細胞的蠕動（75）一些研究指出FAK 誘導的

ERK 活化在癌細胞的侵襲中具有重要作用（7677）此外ERK 已經證明負

責提升 MMP-2 和 MMP-9 的分泌導致蛋白酶水解活性的增強以及隨之

而來的細胞侵襲作用之發生（5978）除了抑制 FAK我們也觀察到經 Antrocin

處理 5637 的細胞中ERK 和 MMPs 表達受抑制（包括 MMP-2）（圖十 A

五和十六）因此我們提出假說認為 SrcFAK-ERK-MMP 是 Antrocin 作

用的重要信號路徑藉此抑制膀胱癌 5637 細胞的侵襲作用

MMPs 被認為是癌細胞產生侵襲和轉移時裂解細胞外基質(ECM)的關

鍵酶因此MMPs 可視為對於人類癌症的診斷和治療時重要的檢測標

的MMP-2 是與癌症相關的 MMP 家族成員激活 MMP-2 能夠裂解 ECM

中的膠原蛋白gelatin纖連蛋白和核纖層蛋白（79）越來越多的證據表明

MMP-2 的過度表現在腦癌乳腺癌結腸直腸癌肺癌黑色素瘤卵

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

The Journal of Cell Biology Vol 160 No 5 pp753-767 (2003)

5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

Surgical Pathology Vol 13 No 2 pp143-153 (2005)

9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

31

巢癌胰腺癌前列腺癌和膀胱癌中都與癌病惡化和預後不良相關聯（80）

事實上MMP-2 已被認為是膀胱癌的一種重要生物標記（80）MMP-2 的表

達和活性的高低與膀胱腫瘤的惡性度和侵襲相關聯此外抑制 MMP-2

可有效降低膀胱癌細胞（81）的轉移這表明 MMP-2 是調節膀胱癌細胞惡性

度的關鍵分子在本論文的研究中我們發現在轉錄的階段中Antrocin

下調膀胱癌 5637 細胞中 MMP 家族的表達（圖十四）先前的研究顯示

MMP-2 表達的調節作用可分別在轉錄和轉譯後的階段（82）在轉錄階段

許多研究結果已揭示了 MMP-2 的 mRNA 表達是透過複雜的調控機制所

控制的例如 p53 或 c-Fos 基因（82）前述的 c-Fos 蛋白是 ERK 下游的反應

物涉及許多即時反應基因的轉錄強化作用通常與細胞活力和活動力有

關聯（83）先前的報告顯示Gallic acid 抑制 c-Fos 的磷酸化並降低其與

MMP-2 啟動子的相互作用隨後並降低白血病細胞的基因表達（61）本研究

結果顯示 Antrocin 顯著抑制 ERK 的磷酸化和降低的 c-Fos 蛋白的表達

減弱的 c-Fos蛋白和 MMP-2啟動子區域的相互作用導致MMP-2的 mRNA

表達的下調和抑制膀胱癌 5637 細胞侵襲作用

本篇論文的另一部分的研究結果是闡述另一個從牛樟芝中分離出的類

固醇類化合物 Antcin H在無細胞毒性濃度時可抑制 Src-FAK-ERK12 訊

息傳導途徑從而降低磷酸化 paxillin磷酸化 CEBP-β 和 c-Fos 的總量

並下調 vimentin 和 MMPs 的表達以及上調 TIMPs 的表達最後導致人類

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

The Journal of Cell Biology Vol 160 No 5 pp753-767 (2003)

5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

Surgical Pathology Vol 13 No 2 pp143-153 (2005)

9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

32

腎癌 786-0 細胞 lamellipodium 形成受阻損害細胞遷移和侵襲能力

前文提及破壞 FAK 和 paxillin 之間的相互作用可以阻斷癌細胞的遷移和

侵襲過程（69）我們的第二部分研究結果與這些早先的報告一致因為我

們發現Antcin H 可透過抑制 FAKSrc 和 paxillin 信號途徑顯著抑制腎

癌細胞的遷移能力此外FAKpaxillin 和肌動蛋白的骨架是調節細胞基

質形成 lamellipodium 和偽足（7171）的關鍵蛋白由於 lamellipodium 是不

同種類癌細胞產生定向遷移至關重要的細胞突起（70）因此我們闡明由

Antcin H 介導的抑制 FAK-SRC-paxillin 信號軸和 RCC 細胞遷移之作用是

伴隨著減少 lamellipodium 形成

惡性腫瘤的上皮至間質轉變(EMT)被認為是惡性腫瘤細胞在轉移過程中

早期發生的步驟（67）越來越多的證據表明FAKERK 訊息信號可以激活

EMT (84)在細胞遷移和侵襲過程中E-cadherin 的減少和 vimentin 的增加

是 EMT 現象發生的重要標記（63）E-cadherin 是正常上皮細胞的粘附分子

被認為是癌轉移的抑制基因然而甲基化和 E-cadherin 基因的缺失可能

導致 E-cadherin 無法轉錄和喪失功能是一種晚期腎細胞癌組織包括 786-0

細胞常見的事件(85)有證據支持 vimentin 是細胞活動包括上皮變化成轉

移性癌細胞中的一個關鍵細胞骨架成分下調 E-cadherin 或促進 vimentin

的表達都與癌細胞轉移有關導致癌病預後變差(86)在本研究中我們

無法在 786-0 細胞中偵測到 E-cadherin 的表現但是 Antcin H 可下調

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

The Journal of Cell Biology Vol 160 No 5 pp753-767 (2003)

5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

Journal of Urology and Nephrology Supplementum Vol 218 pp12-20 (2008)

7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

Surgical Pathology Vol 13 No 2 pp143-153 (2005)

9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

33

vimentin 的表現顯示經 Antcin H 處理的 786-0 細胞中其 EMT 作用及侵

襲能力均受抑制

文獻表明MMPs 在不同類型的惡性腫瘤中包括 RCC可調節腫瘤

的生長侵襲和轉移 (87)在許多 MMPs 中MMP-7 主要表現於惡性腫瘤

細胞中以及腫瘤細胞的侵襲前緣顯示它可能促進癌細胞破壞其周圍的

細胞外基質和基底膜(88)以往的研究指出MMP-7 在 RCC 的過度表達

與腎細胞癌的惡性行為包括侵襲遠處轉移預後差和降低患者生存率

有顯著關聯性(89)這些結果表明MMP-7 可被視為對轉移性 RCC 治療的

重要標靶藉此預防腫瘤進展和提高存活率在本研究中Antcin H 稍微

減少 MMP-2MMP-3 和 MMP-13 的基因表達但並沒有改變 MMP-1

MMP-8MMP-9MMP-10 和 MMP-11 的 mRNA 表現（數據未顯示）然

而 Antcin H 顯著降低 MMP-7 基因的表達量顯示靶向抑制 MMP-7 基因的

表達可能是 Antcin H 抑制腎癌細胞侵襲的原因文獻指出MMPs 的活

性作用受金屬蛋白酶抑製劑(TIMPs)這種轉錄調控酵素的抑制(82)TIMPs 是

MMPs 的內源性抑制劑包括 TIMP-1-2-3-4 等四個成員抑制 TIMPs

的表達已經證實與腫瘤的侵襲和轉移有關(90)我們的結果顯示Antcin H

處理的腎癌 786-0 細胞中TIMP-3 和 TIMP-4 的表達增強可能是 Antcin H

另一個抑制 MMPs 功能的潛在機制

以前的文獻指出FAKERK 信號不僅對細胞的遷移和侵襲很重要而且還

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

癌症病患另外的有效抗癌選擇

37

參考文獻

1 Chen BK and Yang CY ldquoTemporal Trend Analysis of Avoidable

Mortality in Taiwan 1971-2008 Overall Progress with Areas for Further

Medical or Public Health Investmentrdquo BMC Public Health Vol 13 pp551-582

(2013)

2 Yamaguchi H Wyckoff J and Condeelis J ldquo Cell Migration in Tumorsrdquo

Current Opinion in Cell Biology Vol 17 No 5 pp559-564 (2005)

3 Friedl P and Wolf K ldquoTumour-Cell Invasion and Migration Diversity and

Escape Mechanismsrdquo Nature Reviews Cancer Vol 3 No 5 pp362-374 (2003)

4 Hsia DA Mitra SK Hauck CR Streblow DN Nelson JA Ilic D

Huang S Li E Nemerow GR Leng J Spencer KSR Cheresh DA and

SchlaepferDD ldquoDifferential Regulation of Cell Motility and Invasion by FAKrdquo

The Journal of Cell Biology Vol 160 No 5 pp753-767 (2003)

5 Bagi CM Roberts GW and Andresen CJ ldquoDual Focal Adhesion

KinasePyk2 Inhibitor Has Positive Effects on Bone Tumorsrdquo Cancer Vol 112

No 10 pp2313-2321 (2008)

6 ParkinDM ldquoThe Global Burden of Urinary Bladder CancerrdquoScandinavian

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7 Chu H Wang M and Zhang Z ldquoBladder Cancer Epidemiology and

Genetic Susceptibilityrdquo Journal of Biomedical Research Vol 27 No 3

pp170-178 (2013)

8 MontironiR and Lopez-BeltranA ldquoThe 2004 WHO Classification of

Bladder Tumors a Summary and Commentaryrdquo International Journal of

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9 Pillai R Wang D Mayer EK and Abel P ldquoDo Standardised Prognostic

Algorithms Reflect Local Practice Application of EORTC Risk Tables for

Non-Muscle Invasive (pTapT1) Bladder Cancer Recurrence and Progression in

a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

34

參與了 MMPs 和 TIMPs 活性和基因表達的調節(60) ERK 和其下游的轉錄

因子 AP-1對於調節 MMPs 基因的表達擔負重要作用(91) AP-1 是一種

常見的轉錄激活因子是由 Jun 和 Fos 家庭分子組成的(92)此外ERK 可

將ELK-1磷酸化隨後上調 c-Fos基因表達的影響(93)已有文獻顯示MMP-7

的表達是透過 ERK12 訊號途徑進而活化調節 AP-1 的轉錄因子 c-Fos

和 c-Jun(94-96)在本研究中我們發現c-Fos 的兩個假定結合位點位於

MMP-7（圖三十四）的啟動子區與以往的研究結果一致我們的觀察提

供證據顯示Antcin H 抑制腎癌 786-0 細胞的 MMP-7 基因表達可能是通

過抑制 ERKc-Fos 信號軸除了 AP-1c-Fos我們的研究結果也顯示Antcin

H 誘導的 MMP-7 基因下調也是通過 CEBP-β 的轉錄抑制以往的研究表

明ERK 誘導的 CEBP-β 磷酸化可以激活 CEBP-β 的轉錄活性(97)我們

的研究結果表明Antcin H抑制MMP-7的表達也是通過調降ERK-CEBP-β

活性的機制在這些結果的基礎上我們闡述 Antcin H 的抗腎癌細胞侵襲

活性作用有部分是通過抑制 ERK 介導的 AP-1c-Fos 和 CEBP-β 活力來

進一步抑制 MMP-7 的表達達到預防癌症的侵襲和轉移

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

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37

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a Local CohortrdquoThe Scientific World Journal Vol 5 No 11 pp751-759

(2011)

35

第七章結論

癌症持續造成人類生命及財產的威脅更多臨床上有效且可行的治療方

法之研究探討確有其急迫的需求本研究從著名的抗癌菇菌牛樟芝中

分離純化天然化合物 Antrocin 以及 Antcin H以實驗證明這兩者分別有

效地抑制人類膀胱癌和腎臟癌細胞的生長並降低其遷移和侵襲之能力

在Antrocin處理膀胱泌尿上皮癌之研究中我們首次在學術界中提供證據

顯示 Antrocin 經由外在和內在的兩個訊息路徑誘導人膀胱癌細胞的細胞

凋亡此外Antrocin 透過抑制 ERK FAKpaxillin 和 ERK c-Fos MMP-2

的訊息路徑（圖三十七及三十八）進而抑制膀胱癌細胞產生遷移和侵襲

這些研究的結果闡述 Antrocin 抑制癌細胞增殖和轉移作用的分子機制

並提供 Antrocin 作為治療膀胱癌的可能潛力之實驗數據

在 Antcin H 處理腎細胞癌的研究中我們發現 Antcin H 可以抑制人腎

癌 768-0 細胞的遷移和侵襲Antcin H抑制 FAK有關的訊息傳導途徑（Src

FAKpaxillin 和 ERK12）進而抑制癌細胞脫離細胞間束縛力和偽足的形

成減少 vimentin 和 MMPs (尤其是 MMP-7）的表現並加強 MMPs 抑制

分子 TIMP-3 和 TIMP4 的表達此外在基因轉錄作用的階層中c-Fos 和

磷酸化的 CEBP-β 的表現以及 c-Fos 和 CEBP-β 分別結合到 MMP-7 的

DNA 啟動子區之能力在經 Antcin H 處理後都顯著地降低綜此本研

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

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(2011)

36

究亦首次提出了 Antcin H 抑制腎癌細胞的可能機制即經由抑制 FAKERK

和轉錄因子 c-Fos 和 CEBP-β 兩者來抑制腎癌 786-0 細胞中 MMP-7 的表

達（圖三十九） MMP-7 被認為是腎癌患者發生癌病轉移和預測存活的標

記若能抑制腫瘤細胞中 MMP-7 的表達和功能可以是末期腎癌治療的有

效策略我們的發現闡明 Antcin H 可能是牛樟芝中一種具有抗腫瘤能

力的化學成分分子或許具有開發成未來治療晚期轉移性腎細胞癌藥物的

潛力

總結本論文之研究於學術界中第一次提出牛樟芝萃取出的天然化合

物可以有效地抑制人類泌尿系統癌細胞的生長及擴散Antrocin 可抑制膀

胱癌細胞的遷移和侵襲而 Antcin H 擁有對人類腎癌細胞的抗遷移和抗侵

襲的效果我們的發現提供 Antrocin 作為膀胱癌的替代療法以及 Antcin H

可能有治療轉移性腎細胞癌的潛力之兩項有關應用證據期待未來經由動

物實驗以及臨床試驗進一步證明這些化合物的抗癌效果提供泌尿系統

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37

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49

附圖

圖一Antrocin 的化學結構式

24 h IC50

972 μgml 48 h IC50

784 μgml

圖二Antrocin 可抑制人類膀胱癌 5637 細胞之生長

膀胱癌細胞的數量隨 Antrocin 處理的濃度和時間增加相對受到抑

制

50

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡

以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集呈現細

胞凋亡之現象

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化

以 Antrocin 處理的膀胱癌其胱天蛋白酶 38 和 9 被活化

51

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現

以 125μgml Antrocin 處理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中Bax 蛋

白FAS和 DR5 蛋白質都有增加的現象Bcl-2 蛋白卻相對降低

圖六Antrocin 抑制傷口癒合

癒合實驗顯示Antrocin 降低膀胱癌細胞的活動性

52

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力

Boyden 小室分析發現 Antrocin 以濃度正相關的方式抑制膀胱癌細

胞的遷移作用

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力

Boyden 小室分析顯示 Antrocin 降低膀胱癌細胞的侵襲能力

53

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現

西方點墨法發現膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受

Antrocin 的處理濃度增加而逐步降低

圖十 Antrocin 改變磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 FAK 的磷酸化

受 Antrocin 的處理而降低

54

圖十一 Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下也可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 paxillin 的磷

酸化受 Antrocin 的處理而降低

圖十二Antrocin 降低癌細胞之 lamellipodia 形成及磷酸化 FAK 的分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 FAK 的表現也相對降低

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

50

圖三Antrocin 誘導細胞凋亡

以 Antrocin 處理的膀胱癌 5637 細胞其細胞核會產生凝集呈現細

胞凋亡之現象

圖四胱天蛋白酶可被 Antrocin 活化

以 Antrocin 處理的膀胱癌其胱天蛋白酶 38 和 9 被活化

51

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現

以 125μgml Antrocin 處理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中Bax 蛋

白FAS和 DR5 蛋白質都有增加的現象Bcl-2 蛋白卻相對降低

圖六Antrocin 抑制傷口癒合

癒合實驗顯示Antrocin 降低膀胱癌細胞的活動性

52

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力

Boyden 小室分析發現 Antrocin 以濃度正相關的方式抑制膀胱癌細

胞的遷移作用

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力

Boyden 小室分析顯示 Antrocin 降低膀胱癌細胞的侵襲能力

53

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現

西方點墨法發現膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受

Antrocin 的處理濃度增加而逐步降低

圖十 Antrocin 改變磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 FAK 的磷酸化

受 Antrocin 的處理而降低

54

圖十一 Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下也可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 paxillin 的磷

酸化受 Antrocin 的處理而降低

圖十二Antrocin 降低癌細胞之 lamellipodia 形成及磷酸化 FAK 的分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 FAK 的表現也相對降低

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

51

圖五Antrocin 調控細胞凋亡之相關分子之表現

以 125μgml Antrocin 處理 24 小時後的膀胱癌 5637 細胞中Bax 蛋

白FAS和 DR5 蛋白質都有增加的現象Bcl-2 蛋白卻相對降低

圖六Antrocin 抑制傷口癒合

癒合實驗顯示Antrocin 降低膀胱癌細胞的活動性

52

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力

Boyden 小室分析發現 Antrocin 以濃度正相關的方式抑制膀胱癌細

胞的遷移作用

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力

Boyden 小室分析顯示 Antrocin 降低膀胱癌細胞的侵襲能力

53

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現

西方點墨法發現膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受

Antrocin 的處理濃度增加而逐步降低

圖十 Antrocin 改變磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 FAK 的磷酸化

受 Antrocin 的處理而降低

54

圖十一 Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下也可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 paxillin 的磷

酸化受 Antrocin 的處理而降低

圖十二Antrocin 降低癌細胞之 lamellipodia 形成及磷酸化 FAK 的分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 FAK 的表現也相對降低

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

52

圖七Antrocin 可抑制癌細胞的遷移能力

Boyden 小室分析發現 Antrocin 以濃度正相關的方式抑制膀胱癌細

胞的遷移作用

圖八Antrocin 可阻礙癌細胞的侵襲力

Boyden 小室分析顯示 Antrocin 降低膀胱癌細胞的侵襲能力

53

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現

西方點墨法發現膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受

Antrocin 的處理濃度增加而逐步降低

圖十 Antrocin 改變磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 FAK 的磷酸化

受 Antrocin 的處理而降低

54

圖十一 Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下也可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 paxillin 的磷

酸化受 Antrocin 的處理而降低

圖十二Antrocin 降低癌細胞之 lamellipodia 形成及磷酸化 FAK 的分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 FAK 的表現也相對降低

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

53

圖九Antrocin 調控與轉移相關之分子的活性及表現

西方點墨法發現膀胱癌 5637 細胞中 FAK 和 paxillin 的磷酸化受

Antrocin 的處理濃度增加而逐步降低

圖十 Antrocin 改變磷酸化 FAK 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 FAK 的磷酸化

受 Antrocin 的處理而降低

54

圖十一 Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下也可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 paxillin 的磷

酸化受 Antrocin 的處理而降低

圖十二Antrocin 降低癌細胞之 lamellipodia 形成及磷酸化 FAK 的分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 FAK 的表現也相對降低

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

54

圖十一 Antrocin 調控磷酸化 PXN 在癌細胞內之分布及表現

在免疫染色下也可以於膀胱癌細胞膜周圍觀察到 paxillin 的磷

酸化受 Antrocin 的處理而降低

圖十二Antrocin 降低癌細胞之 lamellipodia 形成及磷酸化 FAK 的分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 FAK 的表現也相對降低

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

55

圖十三Antrocin 減少磷酸化 PXN 的表現及分布

在 Antrocin 處理後膀胱癌細胞癒合區邊緣之細胞其 lamellipodia

和絲狀偽足之形成減少且磷酸化 paxillin 的表現也相對降低

圖十四Antrocin 調控 MMP 家族分子之 mRNA 表現

接受 Antrocin 處理後人類膀胱癌 5637 細胞中 MMP-1-2-8

-10 和-11 的 mRNA 的表現顯著減少

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

56

圖十五Antrocin 降低 MMP-2 分解酵素之活性

明膠酶譜分析顯示經由 Antrocin 處理劑量的逐步增加MMP-2

的活性是相對地被抑制

圖十六Antrocin 抑制磷酸化 FAK磷酸化 ERK 及 c-Fos 之活性及表現

抗磷酸-ERK免疫印跡分析發現經過Antrocin處理的膀胱癌細胞

磷酸化 ERK 的相對表現較未處理者為低

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

57

圖十七位於 MMP-2 啟動區上游的 c-Fos 結合區的示意圖

圖十八Antrocin 減少 c-Fos 與 MMP-2 啟動子上對應點之接合力

使用針對 MMP-2 啟動區及其上游 c-Fos 結合區的引物檢查發現

在未經 Antrocin 處理的膀胱癌細胞之結合量較多然而在經過

Antrocin 處理的細胞中其結合量卻下降

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

58

圖十九Antrocin 抑制 MMP-2 啟動子的活化

MMP-2 螢光素酶啟動子報告分析顯示MMP-2 表現的減少與

MMP-2 啟動子活性的降低是相關聯的

圖二十 Antcin H 的化學結構式

COOH

2425

6

3

28

26

20

21

18

HO

O

11

14

1719

161

OH

O

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

59

圖二十一 Antcin H 可抑制腎癌細胞之生長

Antcin H 對人類腎癌 786-0 細胞的抑制與使用的劑量濃度成

正相關低濃度 Antcin H 抑制腎癌細胞的增殖若以高濃度

Antcin H (300 μM)處理則產生細胞毒性

圖二十二Antcin H 抑制腎癌細胞之轉移

用無細胞毒性濃度的 Antcin H 處理腎癌細胞 24 小時後產生遷

移作用的細胞數量顯著較不經藥物處理的對照組減少

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

60

圖二十三Antcin H 抑制腎癌細胞轉移相關之分子的活性表現

在 50μM 和 100 μM 劑量濃度的 Antcin H 處理下磷酸化 FAK

和磷酸化 paxillin 呈現出與處理劑量成正相關的明顯抑制變化

圖二十四Antcin H 降低磷酸化 FAK 及 lamellipodia 的形成

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 FAK 也明顯降低

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

61

圖二十五Antcin H 可改變磷酸化 PXN 在腎細胞內分布之位置及表現量

經 Antcin H 處理的人類腎癌 786-0 細胞細胞周圍的偽足較不

明顯磷酸化 paxillin 也明顯降低

圖二十六Antcin H 可抑制腎癌細胞之轉移及傷口癒合

傷口癒合實驗發現經 Anticin H 處理的腎癌細胞細胞遷移活

性有顯著的下降

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

62

圖二十七傷口癒合的磷酸化 FAK 活性及表現量可被 Antcin H 抑制

抗磷酸化 FAK 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的癌

細胞之傷口前緣其 FAK 的表現相對減少很多

圖二十八傷口前緣之磷酸化 PXN 之分布及表現受 Antcin H 之抑制

抗磷酸化 paxillin 抗體的免疫染色法發現經 Anticin H 處理的

癌細胞之傷口前緣其 paxillin 的表現相對減少很多

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

63

圖二十九 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

包覆基質膠的跨孔侵襲實驗發現 Antcin H 有效降低癌細胞的

侵襲能力產生侵襲的癌細胞數目顯著少於未經處理的對照

組

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

64

圖三十 Antcin H 抑制腎癌細胞之侵襲作用

Real time-PCR顯示曝露於Antcin H後MMP-2MMP-3MMP-7

和MMP-13的基因表現減少 而TIMP-3和TIMP-4表現卻增加

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

65

圖三十一 Antcin H 調控 ScrFAK 及 ERK 之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後FAK 傳導途徑中的磷

酸化 FAKSrc 蛋白和 ERK12 在 4 小時開始急劇下降並

且持續地被抑制達 24 小時

圖三十二 Antcin H 抑制 ScrFAK 及 ERK 訊號路徑之活性

西方點墨法發現曝露於 Antcin H 後主要的 ERK 的下游轉

錄因子如 c-fos 和磷酸化的 CEBP-β 也相應減少

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

66

圖三十三Antcin H 抑制 MMP-7 啟動子之活化

報告螢光素酶檢測顯示 Antcin H 在人類腎癌 786-0 細胞中可

抑制 MMP-7 啟動子的活性

圖三十四坐落在 MMP-7 的起始端上游的 c-Fos AP1 和 CEBP-β的結合位

點示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

67

圖三十五c-Fos 及 CEBP-β與 MMP-7 啟動子結合區之連接受 Antcin H

之阻礙

人類腎癌 786-0 細胞中c-fos 似乎是結合位於 MMP-7 的啟動子

上游的 c-FosRE1 和 c-FosRE2而 CEBP-β 似乎只連結

CEBP-βRE1CEBP-βRE2CEBP-βRE4然而經 Antcin H

處理的人類腎癌 786-0 細胞的 c-fos 和 CEBP-β與這些結合位

點的結合力顯著降低

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

68

圖三十六 Antcin H以劑量依賴的型態調降 c-Fos與CEBP-β之結合力

Antcin H 分別阻斷 c-Fos 和 CEBP-β 結合到位於 MMP-7 啟動子

DNA 序列遠端和近端的結合位點c-FosRE1c-FosRE2

CEBP-βRE1CEBP-βRE2 和 CEBP-βRE4

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

69

圖三十七 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

圖三十八 Antrocin 抑制膀胱癌細胞增殖和轉移作用的卡通繪圖

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圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖

70

圖三十九 Antcin H 抑制腎癌細胞增殖和轉移作用的分子機制示意圖