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日本 脳 炎 ウイル スの免 疫 学 的研 究-Muar株 と691004株 に対 す る

モ ノク ローナ ル抗 体 の性 状

愛媛大学医学部第一内科学教室(主 任:藤 田 繁教授,指 導 二長谷川均講師)

吉 田 真 通

(平成5年12月17日 受付)

(平成6年1月24日 受理)

Key words: Japanese encephalitis virus, monoclonal antibody,

hemagglutination inhibition test

要 旨

日本脳 炎(JE)ウ イル スは,モ ノ ク ロー ナル抗体 に よる免 疫学 的性 状 の解析 に よって4な い し5血 清

型 に大別 され る.そ れ らの うち,中 山-RFLV,北 京1,上 山の3血 清 型 につ いて は,先 に型 特異 的 モ ノ

ク ローナル抗体 が 作製 され た.本 研 究で は,JEウ イル スの血 清学 的性 状 を さ らに詳 細 に解析 す る と とも

に,分 離 ウイル スの血 清型 の同定 を正 確 に行 うた め,血 清学 的 に異 な った 赤血 球凝 集抑 制(HI)反 応 性

を示 すMuar株 と691004株 に対 す る モ ノク ローナル抗 体 を作製 し,そ れ らの 性状 を解析 した.JEウ イル

スのみ にHI反 応 性 を示 す10系 統 の抗Muar抗 体(MUAMA1～10)と,14系 統 の抗691004抗 体(69-MA

1～14)が 得 られ,1935年 か ら1979年 までに分 離 された25株 のJEウ イル スを用 いて それ らの性 状 を検 討

した.10系 統 のMUAMAは,1系 統 が株(型)特 異 的抗体,2系 統 が 中間的 反応 性 を示す 抗体 ,そ の他

の7系 統 は種 特 異的抗 体 であ った.ま た,14系 統 の69:MAは,種 々の程 度 に中間 的反 応 を示す 抗体 が5

系統,そ の他 の9系 統 は種 特異 的抗 体 で,691004株 のみ に反応 す る抗体 は得 られ なか った.従 って,本

研究 に用 いた25株 は,中 山,北 京1,上 山,Muarの4血 清型 に分類 され,691004株 は最 も反 応 性が近 い

中 山株 の一亜 型 に分類 された.ま た,作 製 した24系 統 の モ ノク ローナル 抗体 は,す べ て中和 活性 を示 し,

免疫 グ ロブ リンク ラスはIgM,kappa鎖 で あ った.

はじめに

日本脳炎(JE)は,フ ラビウイルス科 フラビウ

イルス属に含 まれるJEウ イルス感染による急性

脳炎で,東 アジアから東南アジアにかけて広 く分

布 している.JEウ イルスによる感染の多 くは不顕

性に経過 して免疫を獲得するが,一 旦発病すると

致命率が高 く,救 命しえても後遺症を残す者が多

いことから重要視 されてきた.現 在,わ が国や韓

国では,不 活化 ワクチンの普及や媒介蚊の減少に

より低流行状態 となっているが,タ イ,ネ パール,

イ ン ド,中 国 な どで は,依 然 と して 多 数 の患 者 発

生 が 報 告 され て い る1).

JEウ イ ル ス は,1935年 に わ が 国 で初 め て 分 離 さ

れ,国 際 的 標 準 株 と して 中 山株 が 用 い られ て きた.

しか し,1954年 にHaleら2)が,マ ラヤ で 分 離 さ れ

たJEウ イ ル ス は 免 疫 学 的 性 状 が 中 山株 と異 な る

こ とを報 告 し て 以来,JEウ イ ル ス 株 間 の比 較 検 討

が 種 々 の 手 法 を用 い て 多 くの研 究 者 に よ って な さ

れ て き た3)～8).私 ど も は,JEウ ィ ル ス に対 す る赤

血 球 凝 集 抑 制(HI)反 応 性 を 示 す モ ノ ク ロ ー ナル

抗 体 を 作 製 し,JEウ イ ル スの 免 疫 学 的 性 状 を 解 析

し て き た.こ れ ま で,抗 中 山-RFVL抗 体

(NARMA),抗 上 山抗 体(KAMIMA),お よび 抗

北 京1抗 体(BEGMA)を 作 製 し,1935年 か ら1979

別刷請求先:(〒791-02)愛 媛県温泉郡重信町大字志

津川

愛媛大学 医学部第一 内科学教室

吉 田 真通

感染症学雑誌 第68巻 第4号

日本脳炎 ウイルスの免疫学的研究 521

年 ま で に 分 離 され た 国 内21株,国 外4株 の 合 計25

株 のJEウ イ ル ス株 間 の 比 較 検 討 を 行 った 結 果,

4な い し5血 清 型 に大 別 され る こ とを 明 らか に し

た9)～12).

本 研 究 で は,JEウ イ ル ス の 血 清 学 的 性 状 を さ ら

に 詳 細 に解 析 す る と と もに,分 離 ウイ ル ス の血 清

型 の 同 定 を正 確 に行 うた め に,先 に モ ノ ク ロー ナ

ル 抗 体 が 作 製 され たJEウ イ ル ス と血 清 学 的 性 状

が 異 な るMuar株 と691004株 に 対 す る モ ノ ク

ロ ー ナ ル抗 体 を 作 製 し,そ れ らの 性 状 につ い て検

討 した.

材 料 と方 法

1.ウ イ ル ス株

わ が 国 で 分 離 さ れ た21株 と国外 で 分 離 さ れ た4

株 の合 計25株 のJEウ イ ル ス を 用 い た.こ れ らの

株 の 分 離 され た 年,場 所,お よび 材 料 をTable 1

に示 した.さ らに,JEウ イ ル ス 以 外 の フ ラ ビ ウ イ

ル ス に属 す るWest Nile,Murray Valley脳 炎,

ロシ ア春 夏 脳 炎,St.Louis脳 炎,Dengue-1の5種

の ウイ ル スを 用 い た.

2.モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体

モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は,長 谷 川 の 方 法9)に 準 じ

て作 製 した.す なわ ち,Muar株 と691004株 を そ れ

ぞ れ 免 疫 原 と して,細 胞 融 合 法 に よ りJEウ イ ル

ス の み にHI反 応 性 を示 す モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を

作 製 した.

2.1.免 疫 マ ウス

まず,Muar株 と691004株 の ワク チ ン を 作 製 し

た.生 後3～4日 のBALB/c系 乳 の み マ ウ ス の脳

内 に 各 株 の 感 染 乳 の み マ ウ ス脳 乳 剤 遠 心 上 清 の

10-3希 釈 液 を0.02ml接 種 し,感 染 発 症 した マ ウ ス

の 脳 を9倍 量 の 生 理 食 塩 液 で ホ モ ジ ナ イ ズ し て

10%乳 剤 を 作 製 し,遠 心 して 得 た上 清 の 一 部 に 最

終 濃 度0.05%に な る よ うに ホ ル マ リン を加 え て,

不 活 化 ワ ク チ ン を作 製 した.他 の 一 部 は生 ワ ク チ

ソ と して,使 用 時 ま で-80℃ に凍 結 保 存 した.

マ ウ スの 免 疫 は,6週 齢 のBALB/c系 雌 マ ウ ス

を用 い,こ れ らの 腹 腔 内 に不 活 化 ワ ク チ ン0.2m1

を2日 間 隔 で2回 接 種 し,2回 目の接 種 後8日 目

よ り生 理 食 塩 液 で10-3に 希 釈 し た 生 ワ ク チ ン を

0.2mlず つ5日 間 隔 で3回 腹 腔 内 に 接 種 し,脾 細

Table 1 JE virus strains used

a, CSF: Cerebrospinal fluid.

胞 採 取3日 前 に 同 量 の 生 ワ クチ ンを 静 脈 内 注 射 し

た.

2.2.HT培 地,HAT培 地

HT培 地 は,RPMI1640培 地 に20%ウ シ胎 児 血

清(FCS),2mML-グ ル タ ミン,10-4Mヒ ポ キ サ

ン チ ン,1.6×10-6Mチ ミジ ン,ペ ニ シ リンG100

μg/ml,ス トレ プ トマ イ シ ソ100μg/mlの 割 合 で

加 えた.HAT培 地 は,HT培 地 に0.4μMア ミノ

プテ リン を加 え,作 成 した.

2.3.細 胞 融 合

免 疫 マ ウス の 脾 を採 取 後 細 切 し,Eagle培 地 の

Dulbecco修 正 最 低 必 須 培 地(D'MEM)で 洗 浄 し

て,脾 細 胞 を 得 た.マ ウ ス 骨 髄 腫 細 胞 で あ るP3

×63Ag8.653細 胞(Ag8.653)を 用 様 にD'MEM

で 洗 浄 した 後,脾 細 胞 の1/10量 と な る よ うに調 製

し,脾 細 胞 とよ く混 和 し て遠 沈 し,沈 渣 に45%ポ

リエ チ レ ン グ リコ ール 液(分 子 量4,000,Sigma)

平成6年4月20日

522 吉田 真通

を1ml加 え,37℃ で7分 間 静 置 した.次 い で,D'

MEMを 徐 々 に加 え て反 応 を 止 め た 後 に遠 心 し,

上 清 を 吸 引 除 去 し た.そ の 後,HT培 地 にAg

8.653細 胞 が1×106個/mlと な る よ うに 沈 渣 を 浮

遊 させ96穴 平 底 マ イ ク ロプ レ ー ト(Falcon 3072)

に各 穴 あ た り0.05mlず つ 分 注 し,37℃ の5%炭 酸

ガ ス培 養 器 で 培 養 した.24時 間後,上 記 の 各 穴 あ

た り通 常 の2倍 量 の ア ミ ノ ブ テ リ ン を 含 ん だ

HAT培 地 を0.05mlず つ 加 え てHAT培 地 に お

きか えた.さ ら に6日 後,HAT培 地 を0.1m1ず つ

加 えて 培 養 した.

細 胞 融 合 後,細 胞 増 殖 が み られ た 穴 の 培 養 上 清

をHI試 験 で ス ク リー ニ ング し,JEウ イル ス の み

に反 応 す る コ ロ ニ ー を 限界 希 釈 法 で2回 ク ロー ニ

ン グ を 行 った.増 殖 した ハ イ ブ リ ドー マ は さ らに

大 量 培 養 し,あ らか じ め プ リス タ ン(2,6,10,

14tetramethyl pentadecane;Aldrich)0.5m1で

処 置 して お い たBALB/c系 マ ウス の腹 腔 内 に1×

107個 接 種 し,産 生 され た 腹 水 を 採 取 した.

3.HI試 験

3.1.抗 原 の 作 製

HI試 験 に 用 い た ウ イ ル ス 抗 原 は,Clarkeと

Casals13)の 蕉 糖 ・アセ トン法 に 準 じて作 製 した.す

な わ ち,感 染 発 症 した 乳 の み マ ウ ス の脳 を8.5%蕉

糖 液 で20%乳 剤 を 調 製 し,20倍 量 の冷 アセ トン を

加 え て 振 盈 混 和 した 後,350gで5分 間 遠 心 し て上

清 を捨 て,さ らに 同 様 の操 作 を1回 繰 り返 し,上

清 を 除 い た 沈 渣 を乾 燥 させ た.こ れ に 出 発 材 料 で

あ る20%乳 剤 の0.4倍 量 の 生 理 食 塩 液 を 加 え て1

夜 静 置 後,10,000gで60分 間 遠 心 して上 清 を と り,

薦 糖 ・ア セ トン(SA)抗 原 と した.

3.2.HI試 験 の方 法

HI試 験 は,ClarkeとCasals13)の 方 法 に準 じて

行 った.JEウ イ ル ス のHI試 験 はpH依 存 性 で あ

る た め,各 抗 原 の 至 適pHを 検 討 し,至 適pHで 赤

血 球 凝 集(HA)価 が8単 位/0.2mlに な る よ うに

各 抗 原 を 調 製 した.HI試 験 の 前 日に ア セ トン処

理 を した ハ イ ブ リ ドー マ産 生 腹 水 を2倍 階 段 希 釈

した 液 と調 製 したSA抗 原 を,4℃ で18～21時 間

反 応 させ た 後,各 抗 原 の至 適pHのvirus adjust-

ing diluentsに 浮 遊 させ た 生 後24時 間 以 内 の ヒ ヨ

コ赤 血 球 を 加 え て ,37℃ で1時 間 静 置 後 判 定 した.

4.中 和 試 験

中 和 試 験 に は,血 清 学 的 に異 な った 反 応 性 を示

すMuar,691004,中 山-RFVL,北 京1,JaGAr

O1,上 山,三 重44-1の7株 を抗 原 と し て用 い た.

抗 原 は,生 理 食 塩 液 で 感 染 マ ウス脳 の10%乳 剤 を

作 製 し,C6/36細 胞 で3代 継 代 し,そ の 上 清 を 用 い

た.感 染 価 は,上 清 をVero細 胞 単 層 培 養 に37℃ で

1時 間 吸 着 後,そ の上 に5%FCS,1.25%メ チ ル

セ ル ロ ー ス を加 えたD'MEMを 重 層 し,4日 後 に

プ ラ ー ク数 を 算 定 し,plaque forming unit(PFU)

を決 定 した.中 和 試 験 は,100PFUの ウ イル ス に10

倍 階 段 希 釈 した ハ イ ブ リ ドー マ 産 生 腹 水 を 加 え1

時 間 反 応 後,そ の 上 清 をVero細 胞 単 層 培 養 に

37℃ で1時 間 吸 着 させ,上 記 の 培 養 液 を重 層 後,

4日 目に プ ラ ー ク 数 を 算 定 した.そ して,対 照 と

比 較 して50%な い しそ れ 以 上 の プ ラ ー ク 数 の 減 少

を 認 め る抗 体 の 最 大 希釈 倍 数 の逆 数 を 中 和 抗 体 価

と した.

5.モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 免 疫 グ ロ ブ リン ク ラ

ス,サ ブ ク ラス の 決 定

抗 体 産 生 が認 め られ た ハ イ ブ リ ドー マ の培 養 上

清 を,50%飽 和 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム塩 析 法 に よ り約

50倍 に 濃 縮 した.抗 体 の免 疫 グ ロブ リン ク ラス,

サ ブ ク ラ ス の検 討 は,抗 マ ウ スーIgG1,IgG2a,

IgG2b,IgG3,IgM,IgA,kappa鎖 お よびlambda

鎖-家 兎 血 清(Miles)を 用 い,micro-Ouchterlony

法 で 行 った.

成 績

1.抗Muar株 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 の性 状

Muar株 に対 し てHI反 応 性 を 示 す 抗 体 産 生 ハ

イ ブ リ ドー マ を82系 統 作 製 した.そ れ ら の うち,

JEウ イル ス に は反 応 す るが,そ れ 以 外 の5種 の フ

ラ ビ ウ イ ル ス に は 反 応 しな い モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体

が10系 統 得 られ た の で,こ れ らをMUAMAと 名

付 た.こ れ ら の抗 体 を 用 い て25株 のJEウ イ ル ス

に対 す るHI試 験 の 結 果 をTable 2に 示 した.10

系 統 の抗 体 は,そ れ らの 血 清 学 的 反 応 性 に よ っ て

次 の よ うに 分 類 され た.す な わ ち,

(1)Muar株 の み にHI反 応 性 を 示 す 株(型)特

異 的 抗 体(MUAMA 1).

感染症学雑誌 第68巻 第4号

日本脳炎 ウイルスの免疫学的研究 523

Table 2 HI test of 25 JE virus strains using MUAMAs

The titer is expressed as the reciprocal of dilution.-:negative or less than 1:10

Table 3 Neutralization test of 7 representative JE virus strains using MUAMAs

The titer is expressed as the reciprocal of dilution.-:negative or less than 1:10

(2) Muar株 の他 に,691004,中 山一RFVL,中 山

-予 研 の3株 にHI反 応 性 を 示 す 抗 体(MUAMA

2).

(3)Muar株 の 他 に,691004,中 山-RFVL,中 山

-予 研,西 園,三 重44-1,Sasazaki,JaGArO1の

7株 に 対 し てHI反 応 性 を 示 す 抗 体(MUAMA

3).

(4)25株 す べ て にHI反 応 性 を 示 す7系 統 の 種

平成6年4月20日

524 吉田 真通

感染症学雑誌 第68巻 第4号

日本脳炎 ウイルスの免疫学的研究 525

Table 5 Neutralization test of 7 representative JE virus strains using 69-MAs

The titer is expressed as the reciprocal of dilution.-:negative or less than1:10

特 異 的 抗 体(MUAMA4～10).

す な わ ち,こ れ ら10系 統 の モ ノ ク ロ ー ナル 抗 体

は,Muar株 に 特 異 的 な1系 統 の抗 体,す べ て の

JEウ イル ス株 に反 応 す る7系 統 の 種 特 異 的 抗 体,

そ して そ れ らの 中 間 的 反 応 性 を 示 す2系 統 の 抗 体

で あ った.

次 い で,異 な る血 清 型 の代 表 的 な7株 に 対 す る

MUAMAの 中 和 試 験 の 結 果 をTable3に 示 し

た.MUAMA1はMuar株 の み に高 い 中 和 抗 体 価

を 示 し,MUAMA2はMuar株 の 他 に,中 山

-RFVLと691004の2株 に 高 い 中 和 抗 体 価 を 示

し,MUAMA3はMuar株 の 他 に,中 山-RFVL,

JaGArO1,691004の3株 に 中 和 反 応 を 示 した.

MUAMA4か ら10の6系 統 の抗 体 は,7株 す べ て

に 中和 反 応 を 示 し,こ れ らの 抗 体 はHI活 性 と と

もに 中 和 活 性 を 持 つ こ とが 明 らか に な った.

10系 統 の 抗 体 の 免 疫 グ ロ ブ リン ク ラス はTable

2に 示 す よ うに,い ず れ もIgM,kappa鎖 で あ っ

た.

2.抗691004株 モ ノ ク ロー ナ ル抗 体 の 性 状

691004株 に 対 す る124系 統 の 抗 体 産 生 ハ イ ブ リ

ドー マ か ら,HI試 験 でJEウ イル ス の み に 反 応 す

る 抗 体 を 産 生 す る14系 統 を 得 た の で,こ れ ら を

69-MAと 名 付 け た.Table4に こ れ ら の 抗 体 の

HI試 験 の 結 果 を示 した.

14系 統 の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 は,そ れ らの 血 清

学 的反 応 性 に よ って 次 の よ うに分 類 され た.す な

わ ち,

(1)691004株 の他 に,中 山一RFVL,中 山-予 研,

Muarの3株 に 対 してHI反 応 性 を 示 す2系 統 の

抗 体(69-MA1,2).

(2)691004株 の 他 に,中 山-RFVL,中 山一予 研,

上 山,Sekiya,望 月,西 園,Sasazaki,三 重44-1,

福 岡7101,7202,7309,7311,7452,7463,7506,

熊 本80679,ChiangMai,JaGArO2,Muarの19

株 にHI反 応 性 を示 す1系 統 の 抗 体(69-MA3).

(3)検 討 した25株 の うち,Muar株 以 外 の24株 と

HI反 応 性 を 示 す2系 統 の 抗 体(69-MA4,5).

(4)25株 す べ て とHI反 応 性 を 示 す9系 統 の 種

特 異 的 抗 体(69-MA6～14).

14系 統 の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 は,す べ て 中 山

-RFVL,中 山-予 研 の2株 と反 応 性 を 示 し,691004

株 の み に 反 応 す る株(型)特 異 的 抗 体 は 認 め られ

な か った が,こ れ らの 中 に は5系 統 の 中 間 的 な性

状 を示 す 抗 体 と9系 統 のJEウ ィ ル ス 種 特 異 的 抗

体 が 認 め られ た.

次 い で,異 な る血 清 型 の代 表 的 な7株 に 対 す る

69-MAの 中 和 試 験 の 結 果 をTable5に 示 した.

69-MA1と2は,691004株 の 他 に 中 山-RFVLと

Muarの2株,69-MA3は691004株 の 他 に 中 山

-RFVL,上 山,三 重44-1,Muarの4株,69-MA

4と5はMuar株 を取 り6株,そ し て69-MA6か ら

14の9系 統 の 抗 体 は7株 す べ て に 中 和 反 応 を 示

し,こ れ ら の抗 体 がHI活 性 と中 和 活 性 を有 す る

こ とが 明 ら か に な った.

14系 統 の 抗 体 の 免 疫 グ ロ ブ リン ク ラス はTable

4に 示 す よ うに,す べ てIgM,kappa鎖 で あ った.

考 察

1935年 か ら1979年 ま で に 国 内 各 地 で 分 離 され た

21株 と 国外 で 分 離 さ れ た4株 の 合 計25株 のJEウ

平成6年4月20日

526 吉田 真通

イル ス は,先 に 作 製 され た 中 山一RFVL,上 山,北

京1の3株 に 対 す る モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を用 い た

HI試 験 の結 果,691004株 を 除 く24株 は,中 山 型(1

群),北 京1型(II群),上 山 型(III群),Muar型

(IV群)の4血 清 型9)～11)に大 別 さ れ た.す なわ ち,

中 山一RFVLと 中 山-予 研 の2株 は 中 山 型,北 京

1,Kalinina,G.11ate,JaGAr O1,中 山-薬 検

の5株 は北 京1型,上 山,Sekiya,望 月,西 園,

Sasazaki,三 重44-1,福 岡7101,7202,7309,7311,

7452,7463,7506,熊 本80679,ChiangMai,JaGAr

O2の16株 は上 山 型,Muarの1株 はMuar型 に 分

類 さ れ た.し か し,691004株 は,抗 中 山一RFVL抗

体 に対 して,中 山 型 特 異 的 抗 体 に は反 応 し な か っ

た が,そ の 他 の抗 体 に はす べ て 反 応 した.そ し て

反 応 パ タ ー ン はIV群 と は大 き く異 な り,II群 よ り

はIII群 に 近 い反 応 性 が み られ た の で,暫 定 的 に上

山 株 をIII-1群,691004株 をIII-2群 と した.し か し,

次 い で作 製 した 抗 上 山 抗 体 で は,上 山型 特 異 的 抗

体 と反 応 せ ず,上 山 型 と中 山型 に 反 応 した 抗 体 に

も反 応 しな か った た め,北 京1型 に 分 類 され た.

さ ら に 抗 北 京1抗 体 を 作 製 し て 検 討 す る と,

691004株 は 北 京1型 特 異 的 抗 体 と反 応 せ ず,北 京

1,中 山 一RFVL,上 山 の3株 に反 応 した 抗 体 と も

反 応 が 見 られ な か った.こ れ らの 所 見 を 踏 ま え て,

本 研 究 で は,JEウ イ ル スの さ らに 詳 細 な血 清 学 的

分 類 を 検 討 す る と と もに,JEウ イ ル スの 同定 を 正

確 か つ 迅 速 に 行 う こ と を 目的 と し て,Muar株 と

691004株 に対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 を 作 製 して

25株 のJEウ イル ス とのHI反 応 性 を 検 討 した.

Muar株 は,先 に作 製 さ れ た モ ノ ク ロ ーナ ル 抗

体 に 対 し て,他 の24株 とは 大 き く異 な った 反 応 性

を示 して いた の で,独 立 した 血 清 型 の株 で あ る こ

とが 推 定 され て い た が,本 研 究 に よ るMUAMA

の 作 製 に よ って 株(型)特 異 的 抗 体 で あ る

MUAMA1が 得 られ た の で,株 特 異 的 抗 原 の 存 在

が 明 らか に な り,独 立 した 血 清 型 で あ る こ とが 直

接 証 明 され た.Muar株 は1952年 に シ ン ガ ポ ー ル

で 分 離 され た 株 で,Haleら2)が1954年 に 中 山 株 と

は 抗 原 性 が 異 な る こ とを 指 摘 した 株 の 一 つ で あ

り,私 ど もの 作 製 した モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 の 反 応

性 を み て もわ が 国 や 中 国 で 分 離 され た 株 とは 大 き

く異なってお り,土 着性に維持されていたJEウ

イルスと推測 される.

他方,691004株 にっいては,株 特異的抗体は得

られず,株(型)特 異的抗原の存在は明 らかにで

きなかった.こ の理由として二つ考 えられた.第

1に は,Hasegawaら14)が 異なる血清型の代表的

な5株 の構造蛋 白のア ミノ酸配列の比較 ならびに

2次 構造を推定 した結果をみると,特 異抗体の得

られている株はE蛋 白上に特異抗原相 当部位 を

推定できるが,691004株 については,E蛋 白上の5

ヵ所,す なわち,83,174,176,333,382番 目が,

691004株 特異的ア ミノ酸部位であるが,ほ とんど

疎水性の領域であ り,抗 原 としては認識 し難い可

能性がある.第2に は,1982年 以来,私 どもは数

多 くのモノクローナル抗体を作製してきたが,こ

れ らの抗体の中に691004株 のみに反応性を示さな

い抗体が認め られなかった9)～12).以上の ことより

691004株 特異的抗体は得られない可能性があると

考えられた.

そ して,本 研究で作製 された14系 統 のモ ノク

ローナル抗体の うち,9系 統は用いた25株 のすべ

てのJEウ イルスに反応す る種特異性を示 し,5

系統は中間的反応性を示 した.こ れらの中間的反

応性を示 した抗体は,中 山-RFVL株 には5系 統

すべてが反応 したのに対 して,上 山株 とMuar株

にはそれぞれ3系 統 北京1株 には2系 統の抗体

が反応 したにとどまった.こ れらの成績に対して,

先に作製された中山-RFVL,北 京1,上 山の3株

の抗体の691004株 に対す る反応性を検討すると,

抗中山-RFVL抗 体では型特異的抗体以外の抗体

はすべて691004株 に中山株 と同じかまたは近い価

で反応がみ られた.ま た,抗 北京1抗 体 と抗上山

抗体では,中 間的反応性を示す抗体の中では,中

山一RFVL株 に反応 したが,691004株 には反応が

みられない抗体があったが,691004株 に反応 し,

中山-RFVL株 に反応 しない抗体 はなかった.こ

れらの所見を綜合す ると,691004株 は中山株特異

的抗原 ならびに中山-RFVL株 が有す る他のい く

つかの中間的反応性を示す抗原を欠 いてはいる

が,中 山,北 京1,上 山,Muarの 血清学型の中で

は,中 山血清型に最 も近い性状を有するもの と考

感染症学雑誌 第68巻 第4号

日本脳炎 ウイルスの免疫学的研究 527

えられた.

その他のJEウ イルス株 については,先 に作製

された上山株 と北京1株 による血清学的分i類11)12)

と一致した.特 に,中 山-RFVL株 と同じ起源 とさ

れる中山-薬検株は,中 山-RFVL株 に対する株特

異的抗体に反応 しない変異株 とされたが,そ の後,

北京1に 対する型特異的抗体 と反応 し,北 京1血

清型に属することが明 らかになったが,こ の こと

は本研究の成績からも支持 された.ま た,JaGAr

O1株 とJaGAr O2株 は,1959年 に群馬県で分離さ

れた株であるが,JaGAr O1株 が北京1型 である

のに対 してJaGArO2株 は上 山型 に分類 された

が,本 研究の結果でもこのことが支持 された.

北京1株 と上山株 はMUAMA3にHI反 応性

を示 さなかったが,北 京1型 に属す るJaGAr O1

株ならびに上山型に属す る西園,Sasazaki,三 重

44-1の 各株は反応性を示 した.こ れらのことから,

同-じ血清型に属している株でも,発 現している抗

原には多少の相違があることが明らかになった.

本研究で作製された24系 統のモノクローナル抗

体について,4血 清型の うちの代表的な7株 を用

いて中和試験を行った.そ の結果,24系 統の うち,

MUAMA3を 除 く23系統の抗体は,そ れぞれHI

試験で反応性を示 した株に対 して中和反応が認め

られ,こ れらの抗体が中和活性 とHI活 性に関与

したエ ピ トープを認識 してい ることが明 らかに

なった.MUAMA3で は,三 重44-1の みがHI反

応を示 しながら中和反応を示 さなかったが,他 の

6株 のうちHI反 応を示す4株 は中和反応 を示 し

た.三 重44-1株 はHI価 も他の株よ り低 く,反応性

が多少異なっている可能性が考 えられた.

JEウ イルスは約11kbの1本 鎖RNAを 遺伝子

とし,そ の構造蛋 白のア ミノ酸配列は株間で90%

以上一致している7)14)～16).従って,JEウ イルス株

間の抗原性を比較するには,詳 細な抗原構造の違

いを識別しうるモノクローナル抗体が極めて有用

であることが示 された.私 どもは,JEウ イルスの

血清学的性状が異なる5株 の うち,先 に作製され

た中山一RFVL,上 山,北 京1の3株 に次いで,本

研究 ではMuar,691004の2株 に対 す るモ ノク

ローナル抗体を作製 したので,今 後,こ れ らの抗

体 を 用 い る こ とに よ り,JEウ イ ル ス の詳 細 な 免 疫

学 的 性 状 の 解 析 が 可 能 と な っ た が,さ ら にJEウ

イル ス の病 原 学 的 診 断,疲 学,予 防 な どの 進 歩 に

も役 立 っ もの と思 わ れ る.

謝辞 稿を終わ るにあた り,本 研究 の御指導 な らびに御

校閲を賜 った愛媛大学小林 譲名誉教授,愛 媛大学医学部

第一 内科学教室藤 田 繁教授 ならびに長谷川均 講師に深謝

致 します.

本研究の一部 は財団法人愛媛県保健医療財団の援助を頂

いた.

文 献

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Immunological Study of Japanese Encephalitis Virus -Characterization of MonoclonalAntibodies against Muar and 691004 Strains

Masamichi YOSHIDAThe First Department of Internal Medicine, School of Medicine, Ehime University

Based on our previous study using monoclonal antibodies against three Japanese encephalitis (JE)virus strains, Nakayama-RFVL, Beijing 1 and Kamiyama, twenty-five JE virus strains isolatedbetween 1935 and 1979 were classified into four or five serotypes. In the present study, monoclonalantibodies against Muar and 691004 strains which showed different reactivities from the three abovestrains were produced to analyze immunological characteristics of JE virus in detail and identifyisolated viruses accurately. The ten anti-Muar (MUAMA 1-10) and the fourteen anti-691004 (69-MA1-14) monoclonal antibodies which reacted specifically with the JE virus by the hemagglutinationinhibition (HI) test were obtained. In order to clarify the immunological characteristics of MUAMAsand 69-MAs, the HI reactivity of each was tested against the twenty-five JE virus strains . Of the tenMUAMAs, one strain-specific (MUAMA 1), two intermediately reactive and seven JE species-specificantibodies were recognized. Of the fourteen 69-MAs, five intermediately reactive and nine JE species-specific antibodies were recognized, but 691004 strain-specific antibody was not obtained . Theserological classification of the 25 JE virus strains using MUAMAs and 69-MAs basically correspondedwith our previous results. However, 691004 strain would be classified into a subtype of Nakayamaserotype according to the reactive pattern. Consequently, the 25 JE virus strains all fell into fourserotypes: Nakayama, Beijing 1, Kamiyama and Muar. All twenty-four monoclonal antibodies

produced in this study showed neutralization activities and belonged to the IgM class, kappa type.

感染症学雑誌 第68巻 第4号