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1
医薬品、検査薬に利用できる
標的膜タンパク質特異的ペプチドの創製技術
産業技術総合研究所
バイオメディカル研究部門
研究部門付 久保泰
副部門長・グループリーダ 亀山仁彦
主任研究員 木村忠史
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研究背景
・創薬ターゲットの多くは、イオンチャネル、受容体、トランスポータ等の膜タンパク質である。
・その多くは配列が類似するファミリーを形成し、創薬ではそれらを識別できることが求められる。
・天然物(低分子化合物、ペプチド、糖など)には、特異的に識別するものが存在。
・生理活性ペプチドの分子骨格を利用したランダムペプチドライブラリー作製と膜タンパク質を標的とする進化工学技術のノウハウを蓄積。
Copyright © 2012 AIST
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天然の生理活性物質に学ぶ
● 構造と活性相関や生理機能を探る分子ツールとして利用
bungarotoxin → ニコチン性アセチルコリン受容体
charybdotoxin → K+チャネル
TTX, STX → Na+チャネル
● 治療薬や検査・診断薬、それらのシード化合物として利用
morphine, curare, atropine, etc
conantokins, chrolotoxin, etc
天然は既に標的特異分子を
創り出すことに成功している 分泌腺・毒腺から新たな
生理活性ペプチドを探索 Copyright © 2012 AIST
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Three-finger型ペプチドの進化系統樹
Nucleotide Substitutions (x100) 0
265.2
50 100 150 200 250
P01391 P01389 P25670 α-Bgt kappa BTx MicTx 7 P81783 P15818
MicTx 2 Q9YGI1 P29180 P29179 P01410 P17696 TXM2 TXM1 TXM3 MicTx 11 MicTx 3 MicTx 4 mLy-6Ab mLynx1 P81782 MicTx 5 MicTx 6 MicTx 1 MicTx 9 MicTx 8 P01443 P24778 MicTx 10 erabutoxin A P80548 P01427 P80958 P01414 P01413 P01403
Long α-neurotoxins
Bungarus homologues
Weak neurotoxins
Synergic toxins
Muscarinic toxins
Lynx family
Bucandin
Cardiotoxins
Short α-neurotoxins
L-type Ca2+ channel blocker Platelet inhibitor Fasciculin
nAChR
mAChR
cholinergic functions
Ca2+ Ch
protease
多様な標的を認識
Copyright © 2012 AIST
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a-Bgt MicTx1 MicTx2 MicTx3 MicTx4 MicTx5 MicTx6 MicTx7 MicTx8 MicTx9 MicTx10 MicTx11 MicTx12 mLynx1 Cardiotoxin 7 TMX1 TXM2 ErabutoxinB Toxin DaF 8
< Loop I > < Loop II > < Loop III >
Three Finger Peptide Library
10 20 30 40 50 60 70 80 --C------+--------C+------C--+---------+-------C-+-C-------+--------CC----C----+----
IVCHTTATSP---ISAVTCPPG-ENLCYRKMWCDAFCSSRGKVVELGCAATCPSKKPY------EEVTCCSTDKCNPHPKQRPG
LECHVCAYNGDNCFKPMRCPAM-ATYCMTTRTYFT---PYRMKVRKSCVPSCFETVYDGYSKHASATSCCQYYLCNG LKCN-KLVPLF----YKTCPAG-KNLCYKM-FMMS---NKTVPVKRGCIDVCPKNSAL------VKYVCCNTDRCN
LTCVTSKSIFG--ITTENCPDG-QNLCFKKWYYIV---PRYSDITWGCAATCPKPTNV-----RETIRCCETDKCNE
LTCVTTKSIGG--VTTEDCPAG-QNVCFKRWHYVT---PKNYDIIKGCAATCPKVDNN------DPIRCCGTDKCND
RICFNHQSSQP--QTTKTCSPG-ESSCYHKQWSD----FRGTIIERGCG--CPTVKPG------IKLSCCESEVCNN
MICYSHKTPQP--SATITCEEK---TCYKKSVRK----LPAIVAGRGCG--CPSKEML------VAIHCCRSDKCNE
進化の速い領域(=標的認識と親和性に関与)にランダム配列を導入
3本指型分子骨格のペプチドが示す標的分子多様性に着目
Copyright © 2012 AIST
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遺伝子情報 (genotype)と タンパク質機能 (phenotype)を 一対一対応させる・・・進化工学
DNA/タンパク質ライブラリーからの試験管内分子進化 directed evolution in vitro
RNA
DNA
選択 タンパク質合成
遺伝子の増幅
Copyright © 2012 AIST
● 進化工学‐1: 結合 ピューロマイシン リボゾーム・ディスプレイ StrepTag
● 進化工学‐2: 物理的に隔離 細胞・ファージ リポソーム エマルジョン
DNA RNA
タンパク質
DNA/RNA
タンパク質
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転写/mRNA
回収
PCR 増幅 翻 訳
ランダム配列
活性評価 ・解離定数 ・IC50 ・細胞アッセイ
選 択
この過程で標的分子や特性を自由に設定することができる
MicTx 3ペプチド
(約 7 kDa) 3FペプチドcDNAライブラリー
IL-6受容体を標的とするペプチドの指向的分子進化技術
IL-6受容体
(進化工学-1)
Copyright © 2012 AIST
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インターロイキン6受容体(IL-6R)標的ペプチドの評価
受容体結合活性
細胞増殖調節活性
Peptide IC50 (mM)
R10-13
R10-14
R10-15
R10-17
Stimulation
1.4
No inhibition
No inhibition
monoclonal Ab 0.67
Ligand/Peptide IC50 (nM)
R10-13 113 ± 7
R10-14 164 ± 9
R10-15 102 ± 13
IL6 80 ± 3
R10-17 No inhibition
選択ペプチド
positive control
(as an antagonist)
選択ペプチド
positive control
拮抗的
拮抗的
拮抗的
非拮抗的
アンタゴニスト様活性
アゴニスト様活性
IL6と拮抗的・非拮抗的ペプチドを取得
IL6受容体に
アゴニスト
あるいは
アンタゴニスト
として作用 Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1)
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L1 L2 L3
3本指から1本指へ
活性のある3Fについて1本指(1F)毎の活性を調べた結果、L1(24アミノ酸)が結合活性および生理活性を保持することが判明。
70アミノ酸から24アミノ酸へのダウンサイジングに成功
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1)
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プラスミド
外膜
内膜
ペプチド
大腸菌の構造: 本発明における 膜タンパク質とペプチドの発現様態
Bacteria display
Library
生理活性ペプチドcDNAにランダム配列を導入
Selection
Amplification 選択されたcDNA配列情報をPCRにより増幅
標的分子と相互作用する
ペプチドをタグを介して選択
ペリプラズム
膜タンパク質
ペプチド発現と標的分子の相互作用空間としてperiplasmを利用
Intra Periplasm Secretion & Selection(PERISS)法
(進化工学-2)
Copyright © 2012 AIST
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Randomize
SS bond
SS結合が維持できるようにCys残基を残し、ループ部分とC末端をランダム化
配列中の12アミノ酸残基をランダム化 2012種=1015種
クモ毒ペプチドを鋳型としたランダムペプチドライブラリーの構築
DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF
3 aa 4 aa 3 aa 2 aa
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-2)
GTx1-15
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DNA library
DNA-peptide library m2-peptide complex
Amplification
Selection
Expression
cDNA上の部分配列をランダム化
理論上約1015のバリエーション
Magnetic
beads
ICK peptide
cDNA
m2受容体を標的とするペプチドの指向的分子進化技術
peptide
plasmid
m2 receptor
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-2)
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★ m2受容体との結合親和性
ムスカリン性アセチルコリン受容体 標的ペプチドの評価
★ ペプチドR6-Cのムスカリン受容体サブタイプ選択性
Inhibition (%) Conc. (nM)
m1 subtype 6.0 438
m2 subtype 37.6 365
m3 subtype 10.4 438
m4 subtype 6.2 438
Peptide Inhibition (%) Conc. (mM)
R6-A1 54.6 6.0
R6-A2 46.0 5.4
R6-C 37.6 0.37
6サイクルの選択過程で、濃縮されてくるペプチドの種類と割合
Peptide A (25%), B (17%), C (13%), D (4%), E (4%), F (2%), ・・・・・
[3H]-NMSとの拮抗阻害
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-2)
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PERISS法の特徴
①細胞膜に組込まれた膜タンパク質そのものを 用いてスクリーニングする。
②大腸菌内膜上に提示できる様々なタンパク質 に適用できる。
③様々なscaffoldのペプチドを鋳型として用いる ことが可能である。
④大腸菌を扱う技術のみで実施できる。
⑤安価である。 Copyright © 2012 AIST
(進化工学-2)
新技術の特徴・従来技術との比較
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加速進化型ペプチドscaffoldを鋳型とした指向的進化技術の特長
(1) 低分子量: 抗体分子の50分の1以下 (4-7kDa) ・・・ 生産コスト
(2) プロテアーゼ耐性: S-Sを含むコンパクトで堅固な三次構造
(3) 水溶性: 分泌性ペプチドが基本形で、また選択過程で可溶性ペプチドを選択する
(4) ターゲット分子及び評価系設定の高い自由度
標的がビースなどに固定化できればHTS化が可能
(5) 高い構造、化学特性、生理特性レパートリー
ex. 10アミノ酸残基のランダム化では,理論上1013通りのバリエーション
(6) 1stスクリーニングを結合で評価する場合、正・負両生理特性を持つものが取れる可能性
ex. Agonist/Antagonist、Blocker/Activator、Inhibitor/Stimulator
(7) scaffoldに多数の選択肢
天然のペプチドとその標的分子の組み合わせが参考になる場合がある
(8) 低抗原性
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1 & 2)
新技術の特徴・従来技術との比較
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「加速進化型」生理活性ペプチドのscaffoldを鋳型とした
ペプチドライブラリーからの試験管内分子進化
公開中 ・特許出願 2006-140197 「スリーフィンガー様蛋白質ライブラリ」 ・特許出願 2007-030883 「IL-6受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト活性を有するポリペプチド」 ・特許出願 2009-57114 「ポリペプチドライブラリーを調製する方法」 ・特許出願 2009-57211 「膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法」 論文 ・Directed evolution of a three-finger neurotoxin by using cDNA display yields antagonists as well as agonists of interleukin-6
receptor signaling. Molecular Brain (2011) 4: 2
・Characterization of voltage-dependent calcium channel blocking peptides from the venom of the tarantula Grammostola rosea.
Toxicon (2011) 58: 265
・ Display of disulfide-rich proteins by cDNA display and disulfide shuffling assisted by protein disulfide isomerase. Analytical
Biochemistry (2011) 419: 33
Three-finger (3F) scaffold
in vitro evolution IL-6R
疾患マーカー
イオンチャネル
soluble protein
in vitro evolution
muscarinic AChR
イオンチャネル
membrane protein
(特許出願 2006年,2007年)
(特許出願 2009年)
ICK motif
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1 & 2)
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創薬・検査薬 ・健康・疾患診断バイオマーカー検出 ・抗体医薬の代替 ・治療・診断薬開発のリード化合物 ・オーファンGPCRの脱オーファン化 ・薬剤とのコンジュゲイトによるDDS ・安全検査薬・キット (微生物・アレルゲン・毒素など特定成分の検出)
・家畜・養殖用の抗生物質の代替
想定される用途(1) ・バイオ研究用試薬 業界
・医薬・検査薬・農薬 業界
・農業・畜産・水産・食品 産業
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1 & 2)
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バイオ研究用分子ツール・バイオマーカー ・標的タンパク質の 標識用タグ、マーカー 精製用のタグ、アフィニティー担体 ・生理特性、構造機能相関 解析の分子ツール ・生体情報の流れ・代謝パスの解析ツール ・三次元構造解析のツール
想定される用途(2)
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1 & 2)
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想定される業界
受容体・イオンチャネル・トランスポーターなどの膜タンパク質を創薬ターゲットとする製薬企業
ペプチドからin silico創薬を目指す製薬企業
バイオマーカーなどによる臨床診断・検査の試薬・キットを開発する企業
生化学試薬・キット(ELISA、標識試薬、精製担体、イメージング試薬など)を開発する企業
医薬品、食品、環境の安全性検査試薬・キットを開発する企業
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(進化工学-1 & 2)
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膜タンパク質・・・例えば、Gタンパク質共役受容体(GPCR)ヒトでは約1200種類(全遺伝子の約5%) 創薬ターゲットとして注目度が高い.リガンド不明の「オーファン受容体」も多数. タンパク質の構造は一部を除き解明されていない.そのため構造予測に基づく創薬が困難
750億ドル 世界の医薬品市場の10%強 (2007年) 大型医薬品市場上位10品目中、バイオ医薬品の件数 1品目 2000年 4品目 2007年 8品目 2014年予測 (METI バイオ・イノベーション研究会報告書2010年6月より)
市場規模 バイオ医薬品の世界市場は? タンパク医薬(ホルモンなど)、抗体医薬 (半分以上が抗癌剤)、ペプチド医薬、核酸医薬 570億ドル(2006年)、CAGR(年平均成長率) 約10% 2014年は1030億ドルと予測(Nair, 2011)
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実用化に向けた課題
• 標的膜タンパク質と選択ペプチドの立体構造情報を基にドッキングシミュレーションを行い、標的膜タンパク質のpharmacophoreを明らかにする方向性を思考中
• 選択されてきたペプチドのサイズ縮小化やアミノ酸修飾により、元のペプチドを更に高機能化・安定化するための条件を検討中
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1 & 2)
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企業への期待
• 膜タンパク質を創薬ターゲットにしている企業、抗体作製に難航 or 抗体に代わる標的認識分子を探索している企業との共同研究
• ファージ等のランダムペプチドライブラリーや化合物ライブラリー以外のライブラリーからの探索を思案している企業、ペプチド医薬分野への展開を考えている企業との共同研究
• FS連携も可能
Copyright © 2012 AIST
(進化工学-1 & 2)
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :ポリペプチドライブラリーを調製する方法
• 出願番号 :特願2011-503843
• 出願人 :産業技術総合研究所
• 発明者 :久保泰、木村忠史、小野世吾
• 発明の名称 :膜タンパク質を特異的に認識するポリペ
プチドの調製方法
• 出願番号 :特願 2011-503844
• 出願人 :産業技術総合研究所
• 発明者 :久保泰、木村忠史、小野世吾
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(進化工学-2)
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お問い合わせ先
産業技術総合研究所
産学官連携コーディネーター 小高 正人
TEL 029-861- 6683
FAX 029-862- 6048
e-mail m.kodaka@aist.ac.jp