有機アニオン系薬剤のトランスポーターを

介した輸送機構と薬物相互作用

2007 年

萩原 里絵

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目次

緒言 ······························································································································· 5 第1章 新規アンジオテンシン II 拮抗薬オルメサルタンの肝胆系輸送に関与する

トランスポーターの検討 ············································································· 9

序文 ····························································································································· 9

1-1. オルメサルタンの肝取り込み機構··················································································11

実験材料および方法···························································································· 11

第 1 項 材料および試薬····································································································11

第 2 項 動物···························································································································11

第 3 項 ヒト肝細胞による取り込み実験 ························································ 11

第 4 項 アフリカツメガエル卵母細胞（oocytes）の調製········································12

第 5 項 OATP1B1 および OATP1B3 遺伝子の調製 ·································· 12

第 6 項 Oocytes への遺伝子導入 ····························································· 13

第 7 項 遺伝子導入された oocytes を用いた放射性リガンドの取り込み

実験···························································································································13

第 8 項 NTCP 発現 HEK-293 細胞による取り込み実験 ···························· 13

第 9 項 速度論パラメーター ·········································································· 14

第 10 項 統計解析··························································································· 14

結果 ······················································································································· 16

第 1 項 ヒト肝細胞によるオルメサルタンの取り込み ··································· 16 第 2 項 ヒト肝 polyA-mRNA、OATP1B1 cRNA および OATP1B3 cRNA をインジェクションした oocytes によるオルメサルタンの取り込み · 17

第 3 項 OATP1B1 および OATP1B3 発現 oocytes によるオルメサルタン の取り込みおよび速度論解析 ························································· 17 第 4 項 NTCP 発現 HEK-293 細胞によるオルメサルタンの取り込み ·······20

1-2. オルメサルタンの胆汁排泄機構 ·································································· 21

実験材料および方法 ·························································································· 21

第 1 項 材料および試薬················································································ 21

第 2 項 ラット胆汁および尿中排泄実験 ······················································· 21

第 3 項 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによる取り込み

実験 ·································································································· 21

結果 ······················································································································· 22

第 1 項 ラットにおけるオルメサルタンの胆汁排泄 ······································· 23 第 2 項 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによるオルメサ

1

ルタンの取り込み ············································································· 25 考察 ························································································································· 27 小括 ························································································································· 29

第 2 章 プラバスタチンの輸送機構と薬物相互作用 ················································ 30

序文 ····························································································································· 30

2-1. プラバスタチンの腎取り込み機構と薬物相互作用 ······································ 32

実験材料および方法. ··························································································· 32

第 1 項 材料および試薬················································································ 32

第 2 項 OATs 発現 S2 細胞作成および培養 ··············································· 32

第 3 項 OATs 発現 S2 細胞による取り込み実験········································· 33

第 4 項 速度論パラメーター ·········································································· 33

第 5 項 統計解析··························································································· 34

結果····························································································································································35

第 1 項 OATs 発現 S2 細胞によるプラバスタチンの取り込み··························35 第 2 項 OAT3 および OAT4 発現 S2 細胞によるプラバスタチンの

取り込みの速度論解析 ···································································· 35 第 3 項 ゲムフィブロジルおよび代謝物による OAT3 を介したプラバスタ チンの取り込み阻害 ········································································· 35

2-2. プラバスタチンの肝取り込み機構と薬物相互作用 ······································ 39

実験材料および方法 ···························································································· 39

第 1 項 材料および試薬················································································ 39

第 2 項 動物 ·································································································· 39 第 3 項 ヒト肝細胞による取り込み実験 ························································ 39

第 4 項 アフリカツメガエル卵母細胞（oocytes）の調製 ······························· 39

第 5 項 Oatp1a4 および OATP1B1 遺伝子の調製····································· 39

第 6 項 Oocytes への遺伝子導入 ······························································· 39

第 7 項 遺伝子導入された oocytes を用いた放射性リガンドの取り込み

実験 ·································································································· 39

第 8 項 速度論パラメーター ·········································································· 40

第 9 項 統計解析··························································································· 41

結果·····················································································································································42

第 1 項 Oatp1a4 によるプラバスタチン取り込み ········································· 42 第 2 項 ゲムフィブロジルおよび主代謝物によるヒト肝細胞によるプラバ スタチン取り込み阻害実験 ······························································ 43 第 3 項 ゲムフィブロジルおよび主代謝物による OATP1B1 を介したプラ

バスタチン取り込み阻害実験··························································· 45

2

2-3. プラバスタチンの胆汁排泄機構と薬物相互作用·························································46

実験材料および方法 ···························································································· 46

第 1 項 材料および試薬················································································ 46

第 2 項 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによる取り込み 実験 ·································································································· 46

結果·····················································································································································47

第 1 項 ヒト胆管側膜ベシクルによるプラバスタチン取り込み実験·············· 47 第 2 項 ゲムフィブロジルおよび主代謝物による MRP2 を介したプラバス

タチン取り込み阻害実験 ·································································· 48 考察 ························································································································ 49

小括 ·························································································································· 53

総括 ····························································································································· 54

参考文献 ····················································································································· 55

謝辞 ····························································································································· 62

主査、副査名 ·············································································································· 63

3

略語/略号一覧

AUC area under the plasma concentration-time curve ABC ATP-binding cassette BCRP breast cancer resistance protein B-DMEM 0.2％牛血清アルブミン含有 Dulbecco’s modified Eagle’s

medium BSEP bile salt export protein CLbile 胆汁クリアランス cMOAT canalicular mutispesific organic anion transporter cRNA complementary RNA CYP Cytochrome P450 E2-17G estradiol-17b-D-glucuronide EHBR Eisai hyperbilirubinemic rats Gem-glu ゲムフィブロジルグルクロン酸抱合体 Gem-M3 ゲムフィブロジルカルボン酸体 HEK human embryonic kidney HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A MDR multidrug-resistance MRP multidrug resistance-associated protein NTCP Na+-dependent taurocholate co-transporting peptide OATP organic anion transporting polypeptide OAT organic anion transporter Pdif non-specific uptake clearance; P-gp P-glycoprotein SDR Sprague-Dawley rats SNP single nucleotide polymorphism TCA taurocholate UGT UDP グルクロン酸抱合酵素 Vmax maximum uptake rate V0 initial uptake rate

4

緒言

薬効は、薬が投与されてから吸収・分布・代謝・排泄によって血中濃度や薬効標的

部位濃度が決定される薬物動態学的な要因と、薬効標的に薬物が作用する薬力学

的な要因により規定される。近年、薬物動態を決定する多様な代謝酵素やトランスポ

ーターの分子メカニズムの解明に伴い、種々の in vitro 実験系を用いて分子の機能を

定量的に求めることが可能となった。また、これら in vitro 実験から得られた情報を元

に、ヒトの薬物動態を予測することが可能になりつつある。これらの情報を用いて、薬

物動態の種差、ヒト薬物動態の個体差、これら分子を介した薬物相互作用の予測を

行い、臨床へ情報提供するとともに創薬段階へフィードバックすることは、薬の安全性

を高め、薬の開発効率を高めるための重要なアプローチとなる。 薬物を含む生体異物およびその代謝物の多くが有機アニオンであることから、肝

臓・腎臓に発現する有機アニオントランスポーター（Fig.）の薬物解毒排泄系における

役割が注目されてきた。1990 年代に入り、代謝酵素に続き薬物トランスポーターの

分子レベルでの研究が進み、多くのトランスポーターの性質が明らかにされた。薬物

の尿細管分泌を担うトランスポーター群については、腎スライス、膜ベシクル、単離尿

細管潅流法等により能動的な輸送の存在が明らかとされていた。近位尿細管上皮細

胞の血液側底膜を介して尿細管細胞への有機アニオンの取り込みを媒介するトラン

スポーターは、パラアミノ馬尿酸（PAH）を高親和性の基質とすることから、PAHトラン

スポーターとして知られていたが、1997 年にPAHの取り込み活性を指標とした発現ク

ローニング法によりヒトOrganic anion transporter 1(OAT1)が単離された[1]。現在ま

でにOAT1-5 が単離されており[2]、OATファミリーは有機アニオン系薬剤の尿細管細

胞への取り込みに大きく寄与していると考えられている。肝臓についても、肝細胞、膜

ベシクル、肝潅流法等により薬物の能動的な取り込み輸送があることが明らかとなっ

ていた。1994 年にJacquiminらはブロモスルホフタレインの取り込み活性を指標とし

た発現クローニング法によりNa+-非依存的有機有機アニオントランスポーター

Organic anion transporter polypeptide 1a1(Oatp 1a1, Oatp1))をラット肝臓より単

離した[3]。その後、AbeらによりOatp1a4(Oatp2)およびOatp1a5(Oatp3)が相次いで

単離され[4]、中でも、Oatp1a4 は肝臓に多く発現していることが示された[5]。また、

Abeらはヒト肝臓に特異的に発現するNa＋-非依存的有機アニオントランスポーター

OATP1B1 をクローニングした[6]。同時期に他のグループからもOATP1B1 のクロー

ニングが報告されている[7]。一方、肝臓の排泄トランスポーターとしてはABCトランス

ポ ー タ ー フ ァ ミ リ ー の canalicular mulitispecidfic organic anion transpoter （cMOAT/MRP2, ABCC2）が単離され、ビリルビンや抱合体などの排泄を担っている

ことが報告されている [8]。また、MRP2 以外にもP-glycoprotein(P-gp, MDR1, ABCB1), bile salt export protein (BSEP, ABCB11) お よ び breast cancer

5

resistance protein (BCRP, ABCG2）が肝臓に発現する排泄トランスポーターとしてこ

れまでに報告されている[9]。 著者は、脂溶性の低い有機アニオン系薬剤である高脂血症治療薬プラバスタチン

の肝取り込みにトランスポーターが関与していることに注目し、研究を進めてきた。

1999 年には、プラバスタチンの肝取り込みにラット Oatp1a4 が寄与していることを示

す報告をした（第 2 章）。同年、Hsiang らによりプラバスタチンが OATP1B1 により輸

送されることが報告された[7]。2001 年、著者らは、ヒト肝細胞および OATP1B1 アン

チセンスを用いた検討により、OATP1B1 がプラバスタチンのヒト肝細胞取り込みを主

に担う分子であることを示唆したが[10]、近年、OATP1B1 の 1 塩基多型（SNPs）を有

する健常人においてプラバスタチンの血漿中濃度が上昇することが報告され[11, 12, 13]、OATP1B1 がプラバスタチンの体内動態を支配する重要な因子であることが直

接的に示された。 ヒトにおけるプラバスタチンの体内からの消失については、肝臓からの消失と腎臓

からの消失が同等であることが知られており[14]、腎臓においても糸球体ろ過に加え、

分泌があることがその腎クリアランスの大きさより明らかとなっていた[15]。プラバスタ

チンは腎臓に発現する OAT3 の基質となることがこれまでに知られていたが[16]、本

研究の中で OAT3 が腎臓でのプラバスタチンの分泌を担っていることを示した（第 2章）。

一方、抗高血圧薬であるオルメサルタンメドキソミルは、吸収後小腸で速やかに分

解されオルメサルタンに活性化されるプロドラッグである。オルメサルタンはその後代

謝を受けず、オルメサルタンとして肝臓から約 6 割、腎臓から約 4 割排泄される[17]。オルメサルタンもプラバスタチンと同様に脂溶性が低く細胞の脂質二重膜を通過し難

いことから、その体内動態にはトランスポーターの関与が推測されていた。著者はオ

ルメサルタンの体内動態、特にその肝胆系輸送に関与するトランスポーターについて

検討した（第 1 章）。 トランスポーターの関与する体内動態研究が進む中で、トランスポーターを介する

薬物相互作用について注目されてきている。安全性の理由から 200１年に市場から

撤退したセリバスタチンをゲムフィブロジルと併用すると、セリバスタチンの副作用で

ある横紋筋融解症の発症率が上昇すること[18, 19]、およびセリバスタチンの血漿中

濃度が約 4 倍上昇することが報告されている[20]。セリバスタチンの血漿中濃度上昇

の主要因は、ゲムフィブロジルとそのグルクロン酸抱合代謝物がセリバスタチンの

CYP2C8 を介した代謝を阻害するためと考えられているが、一部、セリバスタチンの

OATP1B1 による輸送をゲムフィブロジルとゲムフィブロジルグルクロナイドが阻害す

ることも関与すると考えられている[21, 22]。 プラバスタチンでは横紋筋融解症の症例はほとんど報告されていないが、ゲムフィ

ブロジルと併用することによりその血漿中濃度が約 2 倍上昇すること、および腎クリア

6

ランスが約 40％減少することが明らかとなっているが[23]、そのメカニズムは明らか

ではなかった。プラバスタチンはセリバスタチンと異なり CYP による代謝をほとんど受

けないため、著者は肝臓および腎臓に発現するプラバスタチン輸送に関与するトラン

スポーターに対するゲムフィブロジルおよびその代謝物の阻害能を検討し、臨床にお

ける相互作用のメカニズムについて考察した（第 2 章）。 本研究では、有機アニオン系薬剤である高血圧治療薬オルメサルタン（第 1 章）お

よび高脂血症治療薬プラバスタチン（第 2 章）をモデル化合物として、これら薬剤の薬

物動態における有機アニオントランスポーターの重要性を明らかにするとともに、有

機アニオントランスポーターを介した薬物相互作用について検討した。

7

（A）

Rat Human

sinusoidalmembrabe Sinusoidal

memnrane

Bile

canalicularmembrane

Oat2

Oatp1

Oatp2

Oatp4

Oat3

Ntcp

Mdr1

Mdr2

Bsep

Mrp2

MDR1

MDR3

Bsep

Mrp2BCRPBcrp

NTCP

OATP1B1

OATP1B3

OATPB

OAT2

MRP4

MRP6

MRP3

Bile

canalicularmembrane

Oat2

Oatp1

Oatp2

Oatp4

Oat3

Ntcp

Mdr1

Mdr2

Bsep

Mrp2

MDR1

MDR3

Bsep

Mrp2BCRPBcrp

NTCP

OATP1B1

OATP1B3

OATPB

OAT2

MRP4

MRP6

MRP3

（B）

epithelium epithelium

Oat1

Oat3

Oat2

Oatp1a3

Oat-K2

Oatp1a1

Npt1

Mrp2

Mrp4

Bcrp

brush border membrane

basolateralmembrane

basolateralmembrane

OAT1

OAT3

OAT2

OATP-R

OAT4

NPT1

URAT1

MRP4

BCRP

Rat Human

MRP2

Fig. Schematic diagram of transporters expressed in the liver (A) and kidney (B). Abbreviations are: OAT, organic anion transporter; OATP, organic anion transporting polypeptide; MRP, multidrug resistance associated protein; MDR, multidrug resistance; BSEP, bile salt export protein; BCRP, breast cancer resistance prtein; NPT, sodium phosphate co-trasnporter; NTCP, Na+-dependent bile salt transporter; URAT, urate transporter

8

第 1 章 新規アンジオテンシンII拮抗薬オルメサルタンの肝胆系輸送に関与するトラ ンスポーターの検討

序文 オルメサルタンメドキソミルは抗高血圧薬として臨床で使用されている新規アンジオ

テンシン II 拮抗薬である。オルメサルタンメドキソミルはプロドラッグとして開発され、

投与後消化管内で速やかに加水分解され、活性本体であるオルメサルタンとなる

[17]。臨床データよりオルメサルタンは更なる代謝を受けず、約 6 割が胆汁を介した

糞中に、約 4 割が尿中にオルメサルタンとして排泄されることが明らかとなっている

[17]。オルメサルタンは LogD7.0 が-1.2(in house data)と水溶性が高く、pKa が

4.3(in house data)と pH7.4 ではイオン型で存在していることから受動拡散による細

胞の膜透過が制限されると考えられるため、その高い胆汁を介した糞中排泄はトラン

スポーターを介した肝細胞への取り込みおよびそれに続く胆汁排泄によるものである

と考えられていた。実際、胆汁排泄に関しては胆管側膜に発現している有機アニオン

トランスポーターの一つである multidrug resitance-associted protein 2（mrp2）を遺

伝的に欠損している Eisai hyperbilirubinemic rats (EHBR)において、正常な

Sprague-Dawley rats（SDR）と比較してオルメサルタンの胆汁排泄が低下すること

からラットにおいては mrp2 がオルメサルタンの胆汁排泄に関与していることが示され

ている[24]。しかしながら、ヒトにおいてはオルメサルタンの肝胆系輸送機構について

これまで検討されていなかった。 肝細胞の血管膜側に存在するNa+-依存的およびNa+-非依存的輸送システムは多

くの内因性および外因性化合物の体内からの消失に寄与していることが知られてい

る 。 Na+- 非 依 存 的 ト ラ ン ス ポ ー タ ー OATP1B1 （ LST-1 、 OATP-2 、 OATP-C 、

SLC21A6）[6]およびOATP1B3（LST-2、OATP-8、SLC21A8）[25]はヒト肝細胞の血

管膜側に特異的に発現し、多様な内因性および外因性物質のトランスポーターとして

良く知られている。一方、Na+-依存的胆汁酸トランスポーター（NTCP）はヒト肝細胞

の血管膜側に発現しているNa+-依存的トランスポーターとしてこれまでにもっとも研究

されているトランスポーターである[26]。胆汁排泄に関与するトランスポーターとして

はこれまでにMRP2、P-gp、BSEP、BCRPが胆管側膜に主として発現していることが

報告されている[9]。 薬物の肝胆系輸送に関与するトランスポーターを研究することは、トランスポーター

阻害に基づいた薬物のトランスポーターを介した薬物相互作用および主として肝臓か

ら消失する薬物肝取り込みおよび胆汁排泄に関与するトランスポーターの SNPs の

薬物動態に対する影響を考える上で有用な情報になる。実際、著者らは以前の研究

から、OATP1B1 が 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A （HMG-CoA）還元酵

9

素阻害剤であるプラバスタチンの肝選択薬理作用を支持する薬物動態面の重要な因

子が OATP1B1 であることを明らかとしてきた[10]。そしてこのことはプラバスタチンを

モデル化合物として SNPs のプラバスタチンの薬物動態に対する影響[11,12,13]が多

く研究されることに繋がった。 本章では、ヒト肝細胞および多様なトランスポーター発現系およびヒト胆管側膜ベシ

クルを用いた in vitro 実験を実施した。また、EHBR をモデル動物として in vivo 実験

を実施し、オルメサルタンの肝胆系輸送に関与するトランスポーターを検討した。

10

1-1 オルメサルタンの肝取り込み機構 実験材料および方法 第 1 項 材料および試薬 14C-オルメサルタン (specific activity: 1.3 MBq/mg) および 3H-オルメサルタン

(specific activity: 79 Ci/mmol) (Fig.1-1-1)は Amersham Pharmacia Biotech Ltd. (Tokyo, Japan) にて、 非標識オルメサルタンは 三共有機合成株式会社にて (Tokyo, Japan) 合成された。 ヒト凍結肝細胞は In Vitro Technologies Inc. (Baltimore, MD, USA)、 パーコール は Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)、 Collagenase A はRoche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany)、 ヒト肝全polyA mRNA はBD Biosciences (Palo Alto, CA, USA)、 Pentobarbital (Nembutal®) は大日本試薬株式会社(Osaka, Japan)より購入した。その他の試薬

は全て市販特級を用いた。 (A) (B) (C)

NN

N NH

N

N

H3C CH3

OH

COOCH2O

O

CH3

O

NN

N NH

N

N

T3C CH3

OH

COOH

NN

N NH

N

N

H3C CH3

OH

COOH

*

Fig.1-1-1 Structure of olmesartan medoxomil(A), 3H-olmesartan (B) and 14C-olmesartan (C) T and * denote position of tritium and carbon label, respectively. 第 2 項 動物

成熟した雌性アフリカツメガエル（Xenopus laevis）は浜松教材株式会社 . （Shizuoka, Japan） より購入し 18℃に設定された恒温室内の水槽で飼育した[27]。 第 3 項 ヒト肝細胞による取り込み実験

ヒト凍結肝細胞は融解後、15 ml遠沈管に細胞懸濁液を移した。細胞に 37℃に温

めたL-15 培地を加えた後、50 g で 3 分間 4℃で遠心し細胞を沈殿させた。上清を除

去後、生細胞と死細胞を分離するために、37℃に温めた 36％パーコール含有

11

Krebs-Henseleit buffer (118 mM NaCl、5 mM KCl、1.1 mM MgSO4、2.5 mM CaCl2、1.2 mM KH2PO4、25 mM, NaHCO3、10 mM glucose、10 mM HEPES, pH 7.4, KHB) を添加し、100 g で 10 分間、4℃で遠心した。上清を除去後、KHBに懸濁

した。パーコール遠心後のviabilityはトリパンブルー染色法でいずれも 85％以上であ

った。取り込みのNa+-依存性を調べる場合にはNaClおよびNaHCO3をそれぞれ

choline chlorideおよびcholine bicarbonateに置換したbufferを用いた。上記の方法

で融解した細胞懸濁液をあらかじめ 5 分間プレインキュベーション後、放射性リガンド

を添加することで取り込みを開始した。反応は遠心分離法で細胞と培地を分離するこ

とにより止めた。遠心分離法は以下に従って行った。50 µlの 3M KOHにシリコンオイ

ルとミネラルオイルの混合液（25.1/4.9 (v/v)）150 µlを重層した 400 µlのチューブに、

細胞懸濁液 150 µlを加え、卓上遠心機で遠心した。遠心後、50℃の恒温槽にチュー

ブを一晩放置し、沈殿した細胞を溶解する。上層 10 µlおよびカッターを用いてオイル

層で切り落とした細胞側をチューブごとシンチレーションバイアルに移した。バイアル

にシンチレーションカクテル ハイオニックフロー (Packard) 10 mlを加え、放射活性

を液体シンチレーションカウンター（Packard TriCarb 2200 CA）を用いて測定した。 第 4 項 アフリカツメガエル卵母細胞（oocytes）の調製 カエルを氷冷 0.1% MS-222/0.3% KHCO3溶液に浸し麻酔した。腹部を 8 mm程度

切開し、片側の卵巣を適当量取り出した後、OR2 Buffer（82.5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、5 mM HEPES, pH 7.5)を浸したシャーレに入れ、oocytes 20 個

から 30 個程度に細切した。OR2 Bufferで 5 回洗浄し、破裂した細胞を取り除いた。

15 mlの遠沈管にoocytesを 3 ml分入れ、2％コラゲネース（OR2 Buffer）溶液で 10 mlに用量を調整した。18℃で 30 分間ゆっくり振とうした後、新しいコラゲネース溶液

に交換し、ほとんどのoocytesがバラバラになるまでさらに 18℃で 60 分から 90 分間

ゆっくり振とうした。コラゲネース溶液をアスピレーターで吸い取り、OR2 Bufferで 5 回、

modified Barth’s solution (88 mM NaCl、1 mM KCl、2.4 mM NaHCO3、0.3 mM Ca(NO3)2、 0.41 mM CaCl2、 0.82 mM MgSO4、10 mM HEPES、50 µg/ml gentamicin、10 unit/ml penicillin、10 µg/ml streptomycin、2.5 mM pyruvate、Filter sterilized、 pH 7.4)で 2 回洗浄することにより反応を止めるとともに、卵巣の皮膜や

未成熟な小さい細胞を取り除いた。OocytesをBarth’s solutionを浸したシャーレに入

れ、実体顕微鏡下、Stage VおよびStage VIのoocytesを選別した。 第 5 項 OATP1B1 および OATP1B3 遺伝子の調製 OATP1B1およびOATP1B3は、発現ベクターpGEM-HENのマルチクローニングサ

イトに挿入されている。OATP1B1/pGEM-HEN および OATP1B3/pGEM-HEN を制

限酵素 Not I で切断し、T7 polymerase を用いて cRNA を合成した。[6,24 ]。反応に

12

は mCAP RNA Capping kit (Strategene)を用いた。紫外吸収およびアガロースゲル

電気泳動により反応の確認を行った。cRNA は-80℃で保存した。 第 6 項 Oocytes への遺伝子導入 Oocytes を調製した翌日、傷んだ oocytes を取り除き、マイクロインジェクション法に

よる遺伝子導入に供した。合成 cRNA を 65℃で 2 分間加熱し、wet ice 中で急冷した

後、10,000 rpm で 3 分間遠心し、使用するまで氷中に静置した。マイクロディスペン

サー (10 µl、Drummond)に先端を引き伸ばし細くしたガラス管を装着し、マイクロマ

ニピュレーター(MN-153、Narishige)にセットした。ガーゼを張り付けたシャーレに

Barth’s solution を満たし、50 個程度の oocytes を入れ、実体顕微鏡下、マイクロマ

ニピュレーターを用いて1 mg/mlのcRNAを50 nlずつoocytesに注入した。Oocytesを Barth’s solution を満たした 20 mｌのガラスバイアルに移し、3 日間 18 ℃で培養し

た。毎日、Barth’s solution を交換し、傷んだ oocytes を取り除いた。 第 7 項 遺伝子導入された oocytes を用いた放射性リガンドの取り込み実験 実験当日、RI取り扱い施設内に設置された 18℃の低温恒温槽にoocytesを移した。

OocytesをBarth’s solutionを満たした栄研チューブに 5-8 個ずつ移し、室温（21℃～

22℃）に静置した。Barth’s solutionをアスピレーターを用いて取り除いた後、は放射

性リガンドを含有したUptake solution（100 mM choline chloride、 2 mM KCl、 1 mM CaCl2、 1 mM MgCl2、10 mM HEPES、 pH 7.5）を添加して取り込み反応を開

始した。Uptake solution 5 µlを濃度測定のためにサンプリングした。設定した一定時

間の室温でのインキュベーション後、氷冷したUptake solution 3 mlでoocytesを 5 回

洗浄することにより反応を停止した。水をマイクロインジェクションしたoocytesをコント

ロールとした。Oocytesを一つずつシンチレーションバイアルに移し、10％ SDS溶液

を 500 µlで可溶化した後、シンチレーションカクテル ピコフロー (Packard) 4 mlを加え、放射活性を液体シンチレーションカウンター（Packard TriCarb 2200 CA）を用

いて測定した。

第 8 項 NTCP 発現 HEK-293 細胞による取り込み実験 クローニングしたヒトNTCPをHEK-293 細胞にトランスフェクションした後、コラーゲ

ンコートディッシュ(BD Biosciences)に 1.0 x 105 cells/ml/well で播種し 37°C、

O2/CO2 (95/5)条件化で 3 日間培養した。その後、細胞を 0.2％牛血清アルブミン含

有Dulbecco’s modified Eagle’s medium（B-DMEM）により 2 回洗浄し、放射性リガ

ンドを含んだ 0.8 ml B-DMEMを加え 37°C でインキュベーションすることにより反応

を開始した。インキュベーション後 5、15、30 分後に氷冷したphosphate- buffered saline 1 mlで 3 回洗浄することにより反応を停止した。細胞は 0.5％NaOH水溶液に

13

溶解し、シンチレーションカクテル ハイオニックフローを 10 mｌを加え、細胞内に取り

込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（Packard TriCarb 2200 CA）を

用いて測定した。 第 9 項 速度論パラメーター

ヒト肝細胞を用いたオルメサルタン取り込みの速度論パラメーターは取り込みに線

形の成り立つ時間を選択し、その時間における取り込みを測定し、以下の式に従って

算出した。 V0 = Vmax•S/(Km + S)+ Pdif•S (1)

ここで V0は取り込みの初速度(pmol/min/106 cells)、Vmax は最大取り込み速度

(pmol/min/106 cells)、 Km はMichaelis-Menten 定数 (µM)、Pdifは 非特異的取り

込みクリアランス (ml/min/106 cells)、S は緩衝液中の放射標識された オルメサル

タ ン 濃 度 (µM) を 示 す 。 Km 、 Vmax 、 Pdif は WinNonlin (version 4.01, Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)を用いて直線回帰することにより算出した。

OATP1B1 または OATP1B3 を介したオルメサルタンの取り込み量は線形の成り立

つ時間における OATP1B1 または OATP1B3 を打ち込んだ oocytes への取り込み量

から水を打ち込んだoocytesへの取り込み量をさし引いたものとした。OATP1B1また

はOATP1B3を介したオルメサルタン取り込みの速度論パラメーターは以下の式に従

って算出した。 V0 = Vmax•S/(Km + S) (2)

こ こ で V0 は 取 り 込 み の 初 速 度 (pmol/h/oocyte) 、 Vmax は 最 大 取 り 込 み 速 度

(pmol/h/oocyte)、 Km はMichaelis-Menten 定数 (µM)、S は緩衝液中の放射標

識された オルメサルタン濃度(µM)を示す。KmとVmaxはWinNonlinを用いて直線回帰

することにより算出した。全ての速度論パラメーターは平均値±標準偏差として示し

た。 ラットにおける胆汁クリアランス(CLbile)は以下の式に従って算出した。 CLbile = Abile(0-2h) /AUC(0-2h) (3)

ここでAbile(0-2h) は投与後 2 時間までに胆汁中に排泄されたオルメサルタンの量を、 AUC(0-2h) はWinNonlin を用いて台形法により算出した 0-2 時間までの血漿中濃度

時下曲線面積を示す。

第 10 項 統計解析 平均値と標準偏差は Microsoft Excel 2003 (Microsoft, Redwood, WA, USA)を用

いて計算した。また、2 つのグループ間における統計量の有意差検定は平均値を用

いて 95％信頼区間（p<0.05）において Student’s t-test により検定した。有意差の判

定は p<0.05 であった場合とした。

14

結果 第 1 項 ヒト肝細胞によるオルメサルタンの取り込み

ヒト肝細胞による3H-オルメサルタンの取り込みは 2 分まで直線的に増加した（data not shown）。従って、取り込み初速度は 0.5 分と 2 分の取り込み値を用いて直線回

帰により求めた。Table1-1-1 に示すようにオルメサルタンの肝細胞による取り込みは

緩衝液中のNa+をCholine+に変換することにより減少した。

Table1-1-1 Effect of ion substitution on initial uptake rate of 3H-olmesartan (12.5 µM) by human hepatocytes

Uptake rate Donor Na+ Choline+

pmol/min/106 cells No. 1 63.08 ± 12.39 41.35 ± 7.11 No. 2 20.56 ± 2.82 11.32 ± 2.83

ドナー2 の肝細胞におけるNa+-存在下およびNa+-非存在下でのオルメサルタンの

取り込みには有意差が認められた。一方、ドナー1 の肝細胞においては両条件下に

おけるオルメサルタンの取り込みに統計的な有意差は認められなかったが

（P<0.058）、ドナー2 と同様にNa+-存在下のほうがオルメサルタンの取り込みが大き

い傾向が認められた。

0

50

100

150

200

250

0 50 100 150 200 Conc. (μM)

V0 (p

mol

/min

/106 ce

lls)

Transporter-mediated

Non-specific diffusion

Fig.1-1-2 Concentration dependency of initial uptake of 3H-olmesartan by human hepatocytes. 3H-Olmesartan was incubated in a concentration range from 3.13 to

200 µM at 37℃ up to 2 min. Experiments were conducted using hepatocytes from three

different donors. Data show one representative result. The solid line represents the least-squares

fit of the data to Equation 1.

15

また、Fig.1-1-2 に示すようにNa+-存在下において3H-オルメサルタンは濃度依存的に

取り込まれその取り込みには飽和性が認められた。その時の速度論パラメーターは

Km 値が 29.3 ± 9.9 µM, Vmax が 72.9 ± 65.8 pmol/min/106 cells、非特異的取り込

みクリアランスであるPdifが 0.6 ± 0.4 µl/min/106 cellsであった。 第 2 項 ヒト肝 polyA-mRNA、OATP1B1 cRNA および OATP1B3 cRNA をインジェ

クションした oocytes によるオルメサルタンの取り込み Fig.1-1-3 に示すようにヒト肝polyA-mRNA をインジェクションしたoocytesによる3H-

オルメサルタン、3H-taurocholate、3H-estradiol-17β-D-glucuronide (E2-17G)の取り

込みは水をインジェクションしたoocytesより高い取り込みを示した。3H-E2-17Gの

Na+-存在下およびNa+-非存在下における取り込みは同等であり、3H-E2-17G の取

り込みがNa+-非依存的であることが示唆された（Fig.1-1-3B）。Na+-非存在下におけ

るヒト肝polyA-mRNAをインジェクションしたoocytes による3H-taurocholate の取り

込 み は 水 を イ ン ジ ェ ク シ ョ ン し た oocytes に よ る 取 り 込 み と ほ ぼ 同 等 で あ り

（Fig.1-1-3C）、3H-taurocholate の取り込みは全体的にNa+-依存的であることが示

唆された。3H-オルメサルタンの取り込みはNa+-非存在下でその取り込みは一部減少

し、オルメサルタンがNa+-依存的およびNa+-非依存的に取り込まれることが示唆され

た（Fig.1-1-3A）。

第 3 項 OATP1B1 および OATP1B3 発現 oocytes によるオルメサルタンの取り込み

および速度論解析 OATP1B1 および OATP1B3 を発現させたoocytesによる3H-オルメサルタン（10

µM ）の取り込みは水をインジェクションしたoocytesの取り込みと比較し各々2.9 ± 1.0 および 15.6 ± 10.0 倍高かった(Fig.1-1-4)。OATP1B1 および OATP1B3 を

発現させたoocytesによる3H-オルメサルタンの取り込みは各々30分および60分まで

線形が確認された（data not shown）。OATP1B1 および OATP1B3 を介した取り込

みは濃度依存的および飽和性が認められ、各々のKm 値は 42.6 ± 28.6 µM およ

び 71.8 ± 21.6 µM (Fig.1-1-5 )であった。

16

(A) (B)

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Water poly ARNA

Water poly ARNA

Upt

ake

(pm

ol/2

h/o

ocyt

e)

Na+(-) Na+(+)

0.00

0.30

0.60

0.90

1.20

1.50

Water poly ARNA

Water poly ARNA

Upt

ake

(pm

ol/2

h/o

ocyt

e)

Na+(-) Na+(+)

(C)

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

Water poly ARNA

Water poly ARNA

Upt

ake

(pm

ol/2

h/oo

cyte

)

Na+(-) Na+(+)

Fig.1-1-3 Effect of Na+ on uptake of 3H-olmesartan (2 µM) (A), 3H-estradiol-17ß-D-glucuronide (14.6 µM) (B) and 3H-taurocholate (320 µM) (C) in oocytes injected with human liver polyadenylated mRNA. Uptake was

measured in medium containing choline chloride (Na+(-)) or sodium chloride (Na+(+)) (see

Materials and Methods). Human liver polyadenylated mRNA was pre-incubated for 15 min at

42℃ before the injection. Uptake was measured after 2h-incubation. Data are expressed as

the mean ± S.E. of five to six uptake measurements. E2-17G: estradiol-17ß-D-glucuronide.

Poly A RNA: human liver polyadenylated RNA. TCA: taurocholate.

17

(A) (B)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Water OATP1B1

Upt

ake

(pm

ol/3

0 m

in/o

ocyt

e)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Water OATP1B3U

ptak

e (p

mol

/60

min

/ooc

yte)

Fig.1-1-4 Na+-independent uptake of 3H-olmesartan OATP1B1 (A) and OATP1B3 (B) cRNA-injected oocytes. 3H-olmesartan at 3 µM was incubated for 30 min

or 60 min for OATP1B1 or OATP1B3 cRNA-injected oocytes, respectively. Data are expressed

as the mean±S.E. of five to six uptake measurements in the one representative preparation of

the three separate oocyte preparations. Water represents water-injected oocytes.

(A) (B) (a)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 50 100 150 200 250 300

Οlmesartan (μM)

Upt

ake

( pm

ol/3

0 m

in/o

ocyt

e)

(b)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.06.0

7.0

0 50 100 150 200 250 300

Οlmesartan (μM)

Upt

ake

( pm

ol/6

0 m

in/o

ocyt

e)

Fig.1-1-5 Concentration-dependent uptake of 3H-olmesartan by OATP1B1 (A) and OATP1B3 (B) cRNA-injected oocytes. Olmesartan was incubated in a

concentration range from 1 to 300 µM.○: uptake in OATP1B1 or OATP1B3 cRNA-injected

oocytes. □: uptake in water-injected oocytes. ●: OATP1B1- or OATP1B3-mediated uptake.

Uptake was measured in the medium without sodium chloride. Uptake was measured after 30

min- and 1h- incubation for OATP1B1- and OATP1B3-injected oocytes, respectively. Data are

expressed as the mean±S.E. of five to six uptake measurements in the one representative

preparation of the three separate oocyte preparations.

18

第 4 項 ヒト NTCP 発現 HEK-293 細胞によるオルメサルタンの取り込み NTCPの代表的基質である3H-taurocholate (75 nM)のヒトNTCP発現HEK-293 細

胞による 30 分間インキュベーション後の取り込みは、vector発現細胞と比較し 30 倍

高かったのに対し、3H-オルメサルタン(7.5 nM)ではヒトNTCP発現HEK-293 細胞に

よる取り込みは認められなかった(Fig.1-1-6)。 (A) (B)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 10 20 300

200400600800

10001200

0 10 20 30Time (min)

Upt

ake

(mL/

mgP

)

Time (min)

Upt

ake

(mL/

mgP

)

Fig.1-1-6 Time-dependent uptake of 3H-olmesartan (a) and 3H-taurochorate by human NTCP-transfected cells. 7.5 nM of 3H-olmesartan or 75 nM of 3H-taurocholate was incubated in vector-transfected cells (○) or human NTCP-trasnfected cell

(●) for 5, 15 and 30 min. Each point represents mean±S.D. of three uptake measurements

19

1-2 オルメサルタンの胆汁排泄機構 実験材料および方法

第 1 項 材料および試薬 3H-Estradiol 17ß-D-glucuronide (E2-17G) は Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (Boston, MA, USA) 、 ヒ ト 胆 管 側 膜 ベ シ ク ル (hCMVs) は Tissue Transformation Technologies Inc. (Edison, NJ, USA)、MRP2 発現ベシクルは SOLVO Technologies Inc. (Budapest, Hungary). MK-571 は Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA)より購入した。その他の試薬は 1-1 実験

材料および方法第 1 項に記したもの、または市販特級を用いた 第 2 項 ラット胆汁および尿中排泄実験

胆汁を採取する為に、雄性 SDRおよび EHBR にnembutal (50 mg/kg)を腹腔内

投与することにより麻酔し、ポリエチレンチューブ（PE10）を胆管にカニューレーション

した。胆管カニューレーションしたラットに 14C-オルメサルタン (1 mg/kg) を大腿静

脈より静脈内投与後、頚静脈より採血し、遠心分離後血漿サンプルを得た。胆汁は

投与後 0-0.25、 0.25-0.5、 0.5-1.0、 1.0-1.5 および 1.5-2.0 時間ごとに採取し、尿

サンプルは投与 2 時間後に膀胱から採取した。血漿、胆汁および尿中の総放射活性

は液体シンチレーター（Packard TriCarb 2200 CA）を用いて測定した。血漿、胆汁お

よび尿中からエタノールにより抽出した14C-オルメサルタンの放射活性はthin-layer chromatography（TLC）およびBio-Image Analyzer (BAS-2000, Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いて測定した。

第 3 項 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによる取り込み実験

ベシクルを用いた輸送実験はIshikawaら[28]が報告している迅速濾過法を用いて

行った。試験化合物を含む輸送用緩衝液（10 mM Tris、250 mM sucrose、10 mM MgCl2、pH 7.4)を 37 °Cでプレインキュベーションした後、5 mM ATP およびATP再

生成系存在下(10 mM creatine phosphate、100 µg/ml creatine phosphokinase)および非存在下で膜ベシクル懸濁液（約 10-50 µg protein）を添加し取り込み実験を開

始した。一定時間 37°Cでインキュベーションした後、氷冷した 1 mlの反応停止用緩衝

液（250 mM sucrose、 0.1 M NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.4）を添加して反応を停

止した。反応液を 0.45-µm GVWP filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA)を通し

てすばやくろ過し、5 mlの反応停止用緩衝液で 2 回洗浄した。Filterをシンチレーショ

ンバイアルに移し、10 mlのシンチレーション溶液(ピコフロー)を添加し、Filterを完全

に溶解させた後、放射活性を液体シンチレーションカウンター（Packard TriCarb

20

2200 CA）を用いて測定した。

21

結果

第 1 項 ラットにおけるオルメサルタンの胆汁排泄 胆管カニューレーションしたSDRおよびEHBR に 1 mg/kg の用量で14C-オルメサ

ルタンを投与後の血漿中濃度はSDRと比較しEHBRのほうが高かった（Fig.1-2-1A）。

その時のEHBRのAUC(0–2h) はSDRのAUC(0–2h) の約 2 倍であった（Table 1-2-1）。

投与後 2 時間までにSDRの胆汁中に排泄された放射活性は投与量の 68.12 ± 11.81% であり、EHBRの胆汁中に排泄された放射活性(11.45 ± 3.73%)と比較し有

意に高かった。また、EHBRの胆汁クリアランスはSDRの約 1/10 程度であった

（Table1-2-1）。オルメサルタンのみ（総放射活性の 94％以上）が胆汁中に存在する

ことがTLCによって確認された (data not shown)。

Table1-2-1 Pharmakocinetic parameters after intravenous administration of 14C-olmesartan to SDR and EHBR at a dose of 1 mg eq. of 14C-olmesartan/kg Strain AUC0-2 h Cumulative biliary excretion 0-2h CLbile

a (mg eq.・hr/ml) (% of dose) (ml/min/kg) SDR 5.58 ± 1.48 68.12 ± 11.81 2.22 ± 0.94 EHBR 8.34 ± 0.86 11.45 ± 3.73 0.24 ± 0.09

a:CLbile was calculated according to Equation 3.

22

(A)

0

5

10

15

20

25

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Time (h)

Pla

sma

conc

entra

tion

of 14

C-o

lmes

arta

n

(mg

eq. o

f 14C

-olm

esar

tan/

ml)

(B)

0

20

40

60

80

100

0 0.5 1 1.5 2

Time (h)

Cum

ulat

ive

excr

etio

n of

tota

l rad

ioac

tivity

in b

ile a

nd u

rine

(% o

f dos

e)

Fig.1-2-1 Plasma concentrations of SDR ( ○ ) and EHBR (∆) (A) and cumulative biliary and urinary excretion (B) of total radioactivity after intravenous administration of 14C-olmesartan to SDR.(○: bile, ●: urine) and EHBR (∆: bile, ▲: urine). Dose was set at 1 mg eq. of 14C-olmesartan/kg. Each

point represents the mean ± S.D. (N=4).

23

第 2 項 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによるオルメサルタンの取

り込み ATP存在下におけるヒト胆管側膜ベシクル（hCMV）による3H-オルメサルタン

(0.021 µM) および MRP2 の代表的基質として知られている3H-E2-17G (0.25 µM) の取り込みはATP非存在下と比較し有意に高かった。 ATP依存的な両化合物の取

り込みは 30 分までほぼ線形であった（Fig.1-2-2）。MRP2 発現ベシクルにおいても

ATP依存的な3H-オルメサルタン (0.021 µM) および 3H-E2-17G (0.25 µM) の取り

込みが認められた（Fig.1-2-3）。 また、MRP特異的な阻害剤として知られるMK-571 (50 µM), はhCMVにおける 3H-オルメサルタン (0.021 µM) および3H-E2-17G (0.25 µM) の取り込みを完全に阻害した（Fig.1-2-4）。 (A) (B)

0

5

10

15

20

0 10 20 30Time (min)

Olm

esar

tan

upta

ke (u

L/m

gP)

0

30

60

90

120

150

0 10 20 30Time (min)

E2-1

7G u

ptak

e (u

L/m

gP)

Fig.1-2-2 Time courses of uptake of 14C-olmesartan (A) and 3H-estradiol-17ß-D-glucuronide (B) by human canalicular membrane vesicles. Membrane vesicles (50 µg of protein for olmesartan and 10 µg for E2-17G) were

incubated at 37℃ for 30 min in 200 µl of transport buffer containing 14C-olmesartan (50 µM) or

0.25 µM 3H-E2-17G with (●) or without (○) 5 mM ATP and an ATP-generating system. The data

represent the mean of duplicate uptake measurements using vesicles of a single donor.

E2-17G: estradiol-17ß-D-glucuronide.

24

(A) (B)

0

200

400

600

800

1000

ATP(-) ATP(+) ATP(-) ATP(+)

MK-571(-) MK-571(+)

Olm

esar

tan

upta

ke(m

L/m

g pr

otei

n/30

min

)

0

200

400

600

800

1000

ATP(-) ATP(+) ATP(-) ATP(+)

MK-571(-) MK-571(+)

E2-

17G

upt

ake

(ml/m

g pr

otei

n/30

min

)

Fig.1-2-3 Uptake of 3H-olmesartan and 3H-estradiol-17ß-D-glucuronide by MRP2-expressing vesicles. MRP2-expressing vesicles were incubated at 37℃ for 30

min in 200 µl of transport buffer containing 3H-olmesartan (0.021 µM) and 3H-E2-17G (0.25 µM)

with (ATP(+)) or without (ATP(-)) 5 mM ATP and an ATP-generating system. The data represent

the mean of duplicate uptake measurements. E2-17G: estradiol-17ß-D-glucuronide

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

ATP(-) ATP(+) ATP(-) ATP(+)

Olmesartan E2-17G

Upt

ake

(l/m

g pr

otei

n/30

min

)

Fig.1-2-4 Uptake of 3H-olmesartan and 3H-estradiol-17ß-D-glucuronide by MRP2-expressing vesicles. MRP2-expressing vesicles were incubated at 37℃ for 30

min in 200 µl of transport buffer containing 3H-olmesartan (0.021 µM) and 3H-E2-17G (0.25 µM)

with (ATP(+)) or without (ATP(-)) 5 mM ATP and an ATP-generating system. The data represent

the mean of duplicate uptake measurements.E2-17G: estradiol-17ß-D-glucuronide

25

考察

オルメサルタンのヒト肝細胞による取り込みは飽和性を示し、そのKm値は 29.4 µMであった。健常成人にオルメサルタンメドキソミルを 10 mgから 160 mgを単回投与し

た際のオルメサルタンの最高血漿中濃度の範囲は 0.22 mgから 2.1 mg/l（0.49 µM から 4.7 µM）であり、本検討で得られたオルメサルタン肝取り込みのKm値以下であっ

た。従って、オルメサルタンメドキソミル治療域においてオルメサルタンの肝取り込み

にトランスポーターが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。また、ヒト肝細

胞によるオルメサルタンの取り込みにはNa+-依存的およびNa+-非依存的画分が存在

することが、Na+をCholine+に置換した際にヒト肝細胞によるオルメサルタンの取り込

みが減少したこと、およびNa+-非存在下での取り込みが受動拡散より高いことより示

された。この事実はヒト肝臓全polyA-mRNAを打ち込んだoocytesへの取り込みにも

Na+-依存的およびNa+-非依存的画分が存在する結果からも支持された。 OATP1B1 およびOATP1B３によるオルメサルタンの取り込みは飽和性を示し、そ

のKm値はそれぞれ 42.5 µMおよび 70.1 µMであった（Fig.1-1-5）。この結果はヒト肝

細胞より得られたKm値と同等であり、オルメサルタンのNa+-非依存的肝取り込みに

は少なくとも一部、OATP1B1 およびOATP1B3 が寄与していることを示している。一

方、肝細胞血管側膜に発現する唯一のNa+-依存的トランスポーターとして単離されて

いるNTCP[29]発現HEK293 細胞によるオルメサルタン輸送は認められなかった。こ

れまでに薬物がNTCPの基質となるという報告もなく、Na+-依存的なオルメサルタン

の肝取り込みに関しては、未知の肝細胞血管側膜トランスポーターにより輸送される

可能性があることが示された。Akhterzzuamanら[30]もアニオン性シクロペプチドであ

るBQ123 がNa+-依存的に肝に取り込まれるが、NTCPでは輸送されないことを報告

している。 オルメサルタンの胆汁排泄に関しては、mrp2 を遺伝的に欠損しているEHBRにお

けるオルメサルタンの静脈内投与後の胆汁クリアランスが正常ラットのSDRと比較し

て 1/10 であったこと、およびEHBRのAUC0-2hがSDRの約 2 倍となっていたことより

（Table 1-2-1, Fig. 1-2-1）、ラットにおいてはmrp2 がオルメサルタンの胆汁排泄を主

に担っていることが明らかとなった。ただし、EHBRにおいて尿中クリアランスが変化

しないにも関わらず、胆汁クリアランスの減少と比較し、血漿中濃度上昇が大きくなか

った。その理由の一つとして、EHBRにおいてはオルメサルタンの肝取り込み後、肝

臓に蓄積しているためであると推測している。一方、ヒトにおいては、オルメサルタン

のMRP2 発現ベシクルによる輸送が確認された（Fig.1-2-4）。Takayanagiらはオルメ

サルタンがP-gpの基質になることを示唆していたが[24]、ヒト胆管側膜ベシクルによ

るオルメサルタンの輸送はMRP阻害剤として知られるMK-571[31, 32]により完全に

阻害され、胆管側膜に発現しているMRPがMRP2 のみであること[33]を考慮すると、

26

ヒトにおいてもMRP2 がオルメサルタンの胆汁排泄に主に寄与していると考えられ

た。 以上の結果から水溶性が高く、代謝を受け難いオルメサルタンの肝胆系輸送には

肝取り込み・胆汁排泄ともにトランスポーターが関与していることが明らかとなり、オ

ルメサルタンの体内動態決定因子としてトランスポーターが重要な役割を果たしてい

ることが示された。 本研究により、オルメサルタンの肝胆系輸送にトランスポーターが関与していること

が明らかとなったため、トランスポーターの SNPs がオルメサルタンの体内動態に及

ぼす影響について考慮する必要があると考えられた。近年、OATP1B1[11, 12, 34, 35]および MRP2[36, 37, 38]の SNPs に関する多くの研究がなされ、これらのトランス

ポーターの SNPs が輸送活性を変動させるということが発現系を用いて実証されてい

る[38, 39]。例えば、Dubin-Johnson 症候群の患者では MRP2 コード領域の変異が

多数見つかっており、その中には MRP2 の機能が消失するものがある[40, 41]。従っ

て、MRP2 遺伝子欠損がオルメサルタンの体内動態に影響を与える可能性があり、

臨床においては MRP2 欠損患者のモニタリングが必要になるかもしれない。 一方、OATP1B１に関してはNiemらがOATP1B1 のSNPsがプラバスタチン[12,13]

やレパグリニド[42]の体内動態に影響を与えることを報告している。プラバスタチンの

場合にはOATP1B1＊15B（388A＞Gおよび 521T>C遺伝子変異）を有する患者にお

いてプラバスタチンの最大血漿中濃度が 2 倍上昇することが報告されている[12]。し

たがって、OATP1B1 のSNPsがオルメサルタンの体内動態に影響を与える可能性は

あるが、以下の理由からOATP1B1 のSNPsがオルメサルタンの体内動態に与える影

響は大きくないと考える。オルメサルタンはプラバスタチン同様に 2 つの消失経路、即

ち、胆汁排泄および尿中排泄を有している。さらにプラバスタチンはNa+-非依存的な

OATP1B1 を介した一つの肝取り込み経路しか有していないが、オルメサルタンはNa＋-依存的およびNa+-非依存的な 2 つの肝取り込み経路を有している。従って 1 つの

消失経路が障害を受けたとしても他の消失経路が補完的に働くことが考えられ、

OATP1B１のSNPsによるオルメサルタンの体内動態への影響は少ないと予測され

る。

27

小括 抗高血圧薬であるオルメサルタンの肝胆系輸送に関与するトランスポーターについ

て検討した。 ・ オルメサルタンの肝取り込みには未知のトランスポーターが関与するNa+-依存

的およびOATP1B1 およびOATP1B3 が関与するNa+-非依存的画分が存在し

た。 ・ オルメサルタンの胆汁排泄には主に MRP2 が関与していることが明らかとなっ

た。

以上のことから、ヒトにおけるオルメサルタンの肝胆系輸送機構が明らかとなり、今

後、上記トランスポーターの関与する薬物相互作用あるいは SNPs を有する患者

への投与を考える上で有用な情報となり得ると考えられた。

28

第 2 章 プラバスタチンの輸送機構と薬物相互作用 序文

HMG-CoA 阻害剤であるスタチン系薬剤とフィブレート系薬剤の併用投与は臨床

上汎用されている治療法である。これまでにフィブレート系薬剤であるゲムフィブロジ

ルがスタチンの体内動態に影響を与え[43]、併用投与によるスタチンの副作用の危

険度を増すという事例が報告されている[18, 19, 44]。スタチンは安全性の高い薬剤

とされており、その副作用の頻度も非常に少ないが、稀にミオパシイや横紋筋融解症

を含む筋障害が起こることが知られている。2001 年には重篤な筋毒性を理由にセリ

バスタチンが市場から撤退し、その結果、ゲムフィブロジルとセリバスタチンの相互作

用機作について様々な研究が行われた。セリバスタチンはゲムフィブロジルと併用す

ることにより約 4 倍血漿中濃度が上昇することが知られているが[20]、その相互作用

の主な原因としてゲムフィブロジルグルクロナイドによる CYP2C8 を介したセリバスタ

チンの代謝阻害が提唱されている[21, 22]。一方、シンバスタチン、ロバスタチン、アト

ルバスタチンなどのその他の脂溶性の高い薬物は主に CYP3A４により代謝を受け、

一部は UDP グルクロン酸抱合酵素（UGT）を介した抱合を受けることが知られている。

また、ゲムフィブロジルが CYP3A４や UGT を阻害することも報告されているが[45]、現在までにセリバスタチン以外の脂溶性の高いスタチンとゲムフィブロジルの詳しい

相互作用機作は明らかになっていない。 上記のスタチンとは異なり水溶性が高いプラバスタチンにおいても臨床上でゲムフ

ィブロジルとの併用投与によりプラバスタチンの血漿中濃度が約 2 倍上昇すること、

および腎クリアランスが約 40％減少することが報告されている[23]。プラバスタチンは

CYP による代謝を受けず、腎臓および肝臓からの消失が同等であることが知られて

いる[14, 15]ことからプラバスタチンの消失にはトランスポーターが関与していること

が考えられた。ヒトにおけるプラバスタチンの腎クリアランスは 380 ml/hr/kg であり、

全身クリアランスの 47％を占めている[15]。プラバスタチンのタンパク非結合分率が

約 50％であり、非結合分率で補正した腎クリアランスは 760 ml/hr/kg と見積もられる

が、この値は、ヒトの糸球体ろ過（107 mｌ/hr/kg、[46]）の約 7 倍高い値になることから、

プラバスタチンの腎クリアランスには尿細管分泌の寄与が推測される。これまでに

Organic anion transporter 3 (OAT3)がヒト腎臓におけるプラバスタチンの取り込み

に関与しているという報告がある。Takeda らは OAT3 を発現させた S2 細胞（第 2 近

位尿細管細胞）によりプラバスタチンが輸送されることを報告している[16]。また、

Hasegawa らはラットでは Oat3 がプラバスタチンの腎取り込みに主に寄与しているこ

とを示している[47]。しかしながら、これまでに OAT3 を介したプラバスタチンの速度論

的な解析は行われていなかった。一方、Hsiang ら[7]、共同研究者である Abe ら[4]、

29

Nakai ら[10]、並びに 本研究により、プラバスタチンは、oocytes に発現させたラット

Oatp1a1、Oatp1a4、Oatp1a5 およびヒト OATP1B1 により輸送されることが明らかに

されている。また、ヒト肝細胞および OATP1B1 アンチセンスを用いた検討により、

OATP1B1 がプラバスタチンのヒト肝細胞取り込みを主に担う分子であることが示され

ている。一方、プラバスタチンの胆汁排泄に関してはラットにおいては mrp2 が重要な

役割を果たしていることが[48]、ヒトにおいては MRP2[49]、P-gp[50]、BCRP[50]、BSEP[51]の基質になることが報告されている。 本章では臨床で報告されているプラバスタチンとゲムフィブロジルとの薬物相互作

用機構を明らかにする目的で、プラバスタチンの肝取り込み、胆汁排泄、腎排泄過程

におけるトランスポーターの寄与を検討し、さらに、トランスポーターを介したプラバス

タチンの取り込みに対するゲムフィブロジルおよびその主代謝物であるゲムフィブロ

ジルのカルボン酸体、ゲムフィブロジルグルクロナイドの阻害効果を検討した。

30

2-1.プラバスタチンの腎取り込み機構と薬物相互作用 実験材料および方法 第 1 項 材料および試薬 14C-プラバスタチン (specific activity: 14.3 mCi/mmol)は Amersham Pharmacia Biotech Ltd. (Tokyo, Japan) にて、 ゲムフィブロジルグルクロナイド（gem-glu）お

よび ゲムフィブロジルカルボン酸体（gem-M3）はケムテックラボ株式会社(Tokyo, Japan) にて合成された（Fig.2-1-1）。 ゲムフィブロジルはSigma chemical Co.より

購入した。その他の試薬は全て市販特級を用いた。

CH3

H3C

O COOHCH3H3C

CH3

H3C

OCH3

CO

O O

OH

COOHOH

OH

CH3

HOOC

O COOHCH3H3C

(a) (b)

(c) (d)

CH3H

HO

O H

HOOCHO

OH

H3CCH3

O

(A) (B)

(C) (D)

CH3

H3C

O COOHCH3H3C

CH3

H3C

OCH3

CO

O O

OH

COOHOH

OH

CH3

HOOC

O COOHCH3H3C

(a) (b)

(c) (d)

CH3H

HO

O H

HOOCHO

OH

H3CCH3

O

(A) (B)

(C) (D)

Fig.2-1-1. Chemical structures of pravastatin (A), gemfibrozil (B), gemfibrozil-M3 (C) and gemfibrozil-glucuronide (D)

第 2 項 OATs 発現 S2 細胞作成および培養 OAT1、OAT2、OAT3 およびOAT4 発現S2 細胞の作成および培養は以前の方法

[52] に 従 っ た 。 OAT1 か ら OAT4 の 完 全 長 の cDNA を 発 現 ベ ク タ ー で あ る

pcDNA3.1(Invitrogen,SanDiego, CA, USA) に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し 、 Tfx-50 (Promega, Madison, WI, USA)を用いたリポソーム法によりtemperature- sensitive simian virus 40 large T抗原遺伝子を持つトランスジェニックマウスの近位尿細管中

間部S2 細胞をmicrodissectionにより株化したS2 細胞にトランスフェクトした。Vectorのみを発現させた細胞をコントロールとして用いた。細胞はRITC80-7 培地（5% fetal bovine serum、10 mg/ml transferring、0.08 U/ml insulin、10 ng/ml recombinant

31

epidermal growth factor、400 mg/ml geneticin含有）中で 33℃ 、O2/CO2 (95/5)条件化で培養した。

第 3 項 OATs 発現による取り込み実験 細胞は24well細胞培養ディッシュ（Corning International K.K. ）に1.0 x 105

cells/ml/well で播種しRITC80-7 培地中で33℃ 、O2/CO2 (95/5)条件化で2日間培

養した。細胞はDulbecco's phosphate buffered saline （DPBS）で2回洗浄後、37℃

で10分間インキュベーションした。輸送実験は14C-pravastatin(25 μM)を含んだ1 mｌ

のDBSPを添加することにより開始し、OAT3およびOAT4の取り込みがほぼ線形であ

る2分間37℃でインキュベーションした（Fig.2-1-2）。その後、細胞を氷冷した（DPBS）

で3回洗浄することにより反応を停止した。0.5N NaOHで細胞を溶解後、シンチレー

ションカクテルを加え、細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウン

ター（Aloca LSC6100）を用いて測定した。 （A） （B）

02040

6080

100

0 5 10 15

Time (min)

Upt

kake

(pm

ol/m

g pt

otei

n)

0

10

20

30

0 5 10 15

Time (min)

Upt

kake

(pm

ol/m

g pt

otei

n)

Fig.2-1-2. Time-dependent uptake of 14C-pravastatin by S2 cells expressing OAT3 (A) and OAT4 (B). Uptake of 14C-pravastatin in OATs-expressing (●)

and vector-transfected (○) S2 cells are shown. The cells were incubated in medium containing 14C-pravastatin (25 μM) from 1 to 15 min at 37°C. Each value represents the mean ± s.d.

derived from three determinations.

第 4 項 速度論パラメーター OAT3およびOAT4発現S2細胞による14C-プラバスタチン取り込みの速度論パラメ

ーターは取り込みに線形の成り立つ時間を選択し、その時間においての取り込みを

測定し、以下の式に従って算出した。 V0 = Vmax•S/(Km + S)+ Pdif•S (1)

ここで V0は取り込みの初速度(pmol/min/mg protein)、Vmax は最大取り込み速度

32

(pmol/min/mg protein)、 Km はMichaelis-Menten 定数 (µM)、Pdifは 非特異的取

り込みクリアランス (pmol/min/mg protein)、S は緩衝液中の放射標識された プラ

バスタチン濃度(µM)を示す。Km、Vmax、PdifはWinNonlinを用いて直線回帰すること

により算出した。 阻害定数(IC50)はMicrosoft Excel 2003を用いて50％阻害に一番近い2点を直線

回帰することにより求めた。

第 5 項 統計解析 平均値と標準偏差はMicrosoft Excel 2003を用いて計算した。また、2つのグルー

プ間における統計量の有意差検定は平均値を用いて95％信頼区間（p<0.05）におい

てStudent’s t-testおよびDunnett’s testにより検定した。有意差の判定はp<0.05で

あった場合とした。

33

結果

第1項 OATs 発現 S2 細胞によるプラバスタチンの取り込み Fig.2-1-3に示すように、OAT3 およびOAT4発現細胞のよる14C-プラバスタチン取り

込みはvector細胞と比較し各々5.1 倍および 1.6 倍と有意に高かった(p<0.05)。また、

過剰量の非標識プラバスタチン（2000 µM）はOAT3 およびOAT4 を介した14C-プラバ

スタチンの取り込みを完全に阻害した。一方、 OAT1 およびOAT2 発現細胞のよるプ

ラバスタチン取り込みはvector細胞と同等であり、プラバスタチンはこれら２つのトラ

ンスポーターでは輸送されないことが示唆された。 第2項 OAT3 および OAT4 発現 S2 細胞によるプラバスタチンの取り込みの速度論

解析 OAT3 およびOAT4 発現S2 細胞によるプラバスタチンの取り込みは 2 分まで直線的

に増加した（Fig.2-1-2）。従って取り込み初速度の計算には 2 分による取り込みによ

り計算した。Fig.2-1-4 に示すように、OAT3 およびOAT4 発現S2 細胞によるプラバス

タチンの取り込みには濃度依存性および飽和性が認められ、そのKm値は各々27.7 μMおよび 257 μM であった。

第3項 ゲムフィブロジルおよび代謝物による OAT3 を介したプラバスタチンの取り込

み阻害 Fig.2-1-5 に示すように、ゲムフィブロジル、gem-glu、gem-M3 は濃度依存的にプ

ラバスタチン取り込みを有意に阻害した（p<0.05）。また、求められたIC50値は各々

6.8 μM, 19.7 μMおよび 5.4 μMであった。

34

（A） （B）

0

5

10

15

20

Vector OAT1

Upt

ake

(pm

ol /2

min

/mg

prot

ein)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Vector OAT2

Upt

ake

(pm

ol /2

min

/mg

prot

ein)

（C） （D）

0

10

20

30

40

50

60

excess

Vector OAT3

Upt

ake

(pm

ol /2

min

/mg

prot

ein)

0

5

10

15

20

Vector excess

OAT4

Upt

ake

(pm

ol /2

min

/mg

prot

ein)

* *

Fig.2-1-3 Uptake of 14C-pravastatin by S2 cells expressing OAT1 (A), OAT2 (B), OAT3(C) and OAT4 (D). Uptake of 14C-pravastatin in OATs-expressing (■)

and vector-transfected (□) S2 cells are shown. The cells were incubated in medium

containing 14C-pravastatin (25 μM) for 2 min at 37°C. An asterisk indicates a significant

difference from vector-transfected S2 cells shown by a student’s t-test (P<0.05). Uptake of

positive control compounds in OATs-expressing cells are higher than those in vector-

transfected cells by 49.6 ± 1.8, 3.3 ± 0.2, 19.6 ± 0.3 and 27.9 ± 0.6 times in OAT1

(14C-p-aminohippurate, 5 μM), OAT2 (3H-prostaglandinF2, 50 nM), OAT3 (3H-estrone-sulfate,

50 nM) and OAT4 (3H-estrone-sulfate, 50 nM), respectively. Each value represents the mean

± s.d. derived from three determinations.

35

（A）

0

20

40

60

80

0 20 40 60 80 100

Pravastatin conc. (μM)

Upt

ake

(pm

ol /m

in /m

g pr

otei

n)

Transporter mediated

Non-specific diffusion

（B）

0

50

100

150

200

250

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Pravastatin conc. (μM)

Upt

ake

(pm

ol /m

in /m

g pr

otei

n)

Non-specific diffusion

Transporter mediated

Fig.2-1-4 Concentration-dependency of the initial uptake of 14C-pravastatin by S2 cells expressing OAT3 (A) and OAT4 (B). 14C-pravastatin was incubated in a concentration range from 5 to 100 μM for OAT3 and 25 to

800 μM for OAT4 at 37°C for 2 min. The solid thin line represents the least-squares fit of the

data to eq.1, and the solid bold line and dotted line represent transporter- mediated uptake and

non-specific diffusion calculated by eq.1, respectively.

36

(A) (B)

020406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

IC50(μM):6.8

****

****

**020406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

020406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

IC50(μM):6.8

****

****

**0

20406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

IC50(μM):19.7

****

**

*

020406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

020406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

IC50(μM):19.7

****

**

*

(C)

020406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

IC50(μM):5.4

****

******0

20406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

00

20406080

100120

0.001 0.1 10 1000

ihhibitor conc (μM)

% o

f con

trol

0

IC50(μM):5.4

****

******

Fig.2-1-5 Inhibitory effects of gemfibrozil (A), gemfibrozil-glucuroide (B), and gemfibrozil-M3 (C) on the uptake of 14C-pravastatin (20 μM) by S2 cells expressing OAT3. The results are expressed as a percentage of the control value

(in the absence of inhibitors). An asterisk indicates a significant difference shown by a

Dunnett’s test (*, P<0.05; **, P<0.01). Data are shown as the mean ± s.d. derived from three

determinations.

37

2-2 プラバスタチンの肝取り込み機構と薬物相互作用

実験材料および方法 第 1 項 材料および試薬

材料および試薬は第 1 章 1-1 の実験材料および方法第 1 項および第 2 章 2-1 の

実験材料および方法第 1 項に記したもの、または市販特級を用いた。 第2項 動物

第 1 章 1-1 の実験材料および方法第 2 項と同様の方法で入手し飼育した。 第3項 ヒト肝細胞による取り込み実験

ヒト肝細胞による取り込み実験は第 1 章 1-1 の実験材料および方法第 3 項に示し

た方法と同様に行った。ヒト肝細胞におけるプラバスタチンの取り込みは 5 分まで線

形[10]であることから取り込み初速度は 4 分までの 3 点の取り込み値を用いて直線回

帰により求めた。

第4項 アフリカツメガエル卵母細胞（oocytes）の調製 アフリカツメガエル卵母細胞（oocytes）の調製は第 1 章 1-1 の実験材料および方法

第 4 項に示した方法と同様に行った。 第5項 Oatp1a4 および OATP1B1 遺伝子の調製

Oatp1a4 および OATP1B1 遺伝子の調製は第 1 章 1-1 の実験材料および方法

第 5 項に示した方法と同様に行った。 第6項 Oocytes への遺伝子導入

Oocytes への遺伝子導入は第 1 章 1-1 の実験材料および方法第 6 項に示した方

法と同様に行った。 第7項 遺伝子導入された oocytes を用いた放射性リガンドの取り込み実験

遺伝子導入された oocytes を用いた放射性リガンドの取り込み実験は第 1 章 1-1の実験材料および方法第 7 項に示した方法と同様に行った。OATP1B1 発現 oocyteによるプラバスタチンの取り込みは 60 分まで線形[10]であることから取り込みはイン

キュベーション開始後 60 分後に測定した。

38

第 8 項 速度論パラメーター Oatp1a4 を介したプラバスタチンの取り込み量は線形の成り立つ時間における

Oatp1a4 打ち込んだ oocytes への取り込み量から水を打ち込んだ Oocyte への取り

込み量をさし引いたものとした。Oatp1a4 を介したプラバスタチン取り込みの速度論

パラメーターは以下の式に従って算出した。 V0 = Vmax•S/(Km + S) (1) ここで V0 は取り込みの初速度 (pmol/h/oocyte)、Vmax は最大取り込み速度

(pmol/h/oocyte)、 Km はMichaelis-Menten 定数 (µM)、S は緩衝液中の放射標

識された プラバスタチン濃度(µM)を示す。KmとVmaxはWinNonlinを用いて直線回帰

することにより算出した。 ヒト肝細胞を用いたプラバスタチン取り込みに対する阻害定数（Ki）は取り込みに線

形の成り立つ時間を選択し、その時間においての取り込みを測定し、以下の式（2）、

（3）の同時あてはめにより算出した。 阻害剤非存在下

V0 = Vmax·S/(Km + S)+ Pdif·S (2) 阻害剤存在下

V0 = Vmax·S/(Km (1 + i/Ki) + S)+ Pdif·S (3). ここで V0は取り込みの初速度(pmol/min/106 cells)、Vmax は最大取り込み速度

(pmol/min/106 cells)、 Km はMichaelis-Menten 定数 (µM)、Pdifは 非特異的取り

込みクリアランス (ml/min/106cells)、S は緩衝液中の放射標識されたプラバスタチ

ン濃度(µM)、iは阻害剤濃度（µM）を示す。Km、Vmax、Pdif、KiはWinNonlinを用いて直

線回帰することにより算出した。 OATP1B1 発現oocytesを用いたプラバスタチン取り込みに対する阻害定数（Ki）

は取り込みに線形の成り立つ時間を選択し、その時間においての取り込みを測定し、

以下の式（4）、（5）の同時あてはめにより算出した。OATP1B1 を介したプラバスタチ

ン取り込み量はOATP1B1 を打ち込んだoocytesへの取り込み量から水を打ち込んだ

oocytesへの取り込み量をさし引いたものとした。 阻害剤非存在下:

V0 = Vmax·S/(Km + S) (4) 阻害剤存在下

V0 = Vmax·S/(Km (1 + i/Ki) + S) (5) ここで V0は取り込みの初速度 (p mol/h/oocyte)、Vmaxは最大取り込み速度

(pmol/h/oocyte)、Km はMichaelis-Menten 定数 (µM)、Sは緩衝液中の放射標識さ

れたプラバスタチン濃度 (µM)、 iは阻害剤濃度（µM）を示す。Km 、Vmax 、Ki は

WinNonlinを用いて直線回帰することにより算出した。

39

第 9 項 統計解析 平均値と標準偏差は Microsoft Excel 2003 を用いて計算した。また、2 つのグルー

プ間における統計量の有意差検定は平均値を用いて 95％信頼区間（p<0.05）にお

いて Student’s t-test により検定した。有意差の判定は p<0.05 であった場合とした。

40

結果

第 1 項 Oatp1a4 によるプラバスタチン取り込み ラットOatp1a4 による14C-プラバスタチンの取り込みは 60 分まで直線的に増加した

（data not shown）。 また、Fig.2-1-1 に示すようにプラバスタチンのOatp1a4 を介し

た取り込みには濃度依存性および飽和性が認められ、そのKm値は 37.5 ± 9.9 µMであり、以前報告されているラット肝細胞によるプラバスタチン取り込みのKm値（29.1 ± 5.8 µM）とほぼ同等であった[53]。

0

1

2

3

4

5

6

7

0 20 40 60 80 100

Concentration (μmol/L)

Upt

ake

(pm

ol/o

ocyt

e/h)

:Water: oatp2

0

1

2

3

4

5

6

7

0 20 40 60 80 100

Concentration (μmol/L)

Upt

ake

(pm

ol/o

ocyt

e/h)

:Water: oatp2

0

1

2

3

4

5

6

7

0 20 40 60 80 100

Concentration (μmol/L)

Upt

ake

(pm

ol/o

ocyt

e/h)

:Water:Water: oatp2: oatp2

Fig.2-2-1 Concentration dependency of oatp1a4-mediated 14C- pravastatin uptake in oatp1a4-cRNA (●)- and water (○)- injected oocytes. Date is expressed as the mean ± s.e. of three to five uptake measurements. The solid line is

the least-squares fit of data to Eq.1

41

第 2 項 ゲムフィブロジルおよび主代謝物によるヒト肝細胞によるプラバスタチン取り

込み阻害 Fig.2-2-2 に示すようにゲムフィブロジル（300 µM）は有意にヒト肝細胞による14C-

プラバスタチン取り込みを阻害した。また、gem-glu（300 µM）は統計的な有意差は

つかなかったもののプラバスタチンの取り込みを阻害した（P=0.07）。一方、gem-M3（300 µM）はプラバスタチン取り込みを阻害しなかった。Fig.2-2-3 にゲムフィブロジ

ルあるいはgem-glu存在下および非存在下における14C-プラバスタチン取り込みに

対するEadie-Hofstee plotを示した。ゲムフィブロジルおよびgem-gluは濃度依存的

に肝細胞による14C-プラバスタチンの取り込みを阻害し、そのKi値は各々35.8 μM お

よび 9.3 μM (n=1)であった。

0

5

10

15

20

25

30

none +gem +gem-glu +gem-M3

Inhibitor

Upt

ake

(pm

ol/m

in/1

06 ce

lls)

Fig.2-2-2 Inhibitory effects of gemfibrozil-glucuronide (gem-glu) and gemfibrozil-M3 (gem-M3) on 14C-pravastatin uptake by cryopreserved human hepatocytes. The uptake of 14C-pravastatin (10 μM) for 2 min in the absence (□)

and presence (■) of inhibitors (300 μM) is shown. Each value represents the mean ± s.d of

three uptake measurements obtained from three different donors. An asterisk indicates a

significant difference from the uptake without an inhibitor (none) (*: p<0.05).

42

(A)

(B)

0.0

0.5

1.0

1.5

0 20 40 60 80 100 120

V0 (pmol/min/106 cells)

V0/S

(ml/m

in/1

06 cel

ls)

none+Gem

0.0

0.5

1.0

1.5

0 20 40 60 80 100 120

V0 (pmol/min/106 cells)

V0/S

(ml/m

in/1

06 cel

ls)

none+Gem-glu

Fig.2-2-3. Eadie-Hofstee plot of 14C-pravastatin uptake by cryopreserved human hepatocytes in the presence of gemfibrozil (A) and gemfibrozil -glucuronide (B). The uptake of 14C-pravastatin in the absence of inhibitors (○), in the

presence of gemfibrozil (Gem) ( ■ ) and gemfibrozil-glucuronide (Gem-glu) (●) is

shown.14C-pravastatin was incubated in a concentration range from 5 to 200 μM at 37°C

within 4 min. The concentrations of gemfibrozil and gemfibrozil-glucuronide were set at 20 μM.

The solid and dot line represents the least-squares fit of the data to Equations (2) and (3)

described in Materials and Methods, without and with an inhibitor, respectively. The data were

obtained from hepatocytes from a single donor and represent one replicate determination at

each data point.

43

第 3 項 ゲムフィブロジルおよび主代謝物による OATP1B1 を介したプラバスタチン取

り込み阻害 Fig.2-2-4 にはゲムフィブロジルあるいはgem-glu存在下および非存在下における

OATP1B1 発現oocytesによる14C-プラバスタチン取り込みのEadie-Hofstee plotを示した。ゲムフィブロジルおよびgem-gluは濃度依存的にOATP1B1 発現oocytesに

よる14C-プラバスタチンの取り込みを阻害し、そのKi値は各々15.5 μM および 7.9 μM （mean、n=2）であった。これらの値はヒト肝細胞取り込み試験より得られた値と

同等であった。 （A） （B）

0.00

0.05

0.10

0.15

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

V0 (pmol/min/106 cells)

V0/S

(ml/m

in/1

06 cel

ls) none

+Gem

0.00

0.05

0.10

0.15

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

V0 (pmol/min/106 cells)

V0 /S

(ml/m

in/1

06 cel

ls) none

+Gem-glu

Fig.2-2-4. Eadie-Hofstee plot of 14C-pravastatin uptake by OATP1B1-exprssing oocytes in the presence of gemfibrozil (A) and gemfibrozil -glucuronide (B). The uptake of 14C-pravastatin in the absence of

inhibitors (○), in the presence of gemfibrozil (Gem) (■) and gemfibrozil-glucuronide (Gem-glu)

(●) is shown. 14C-pravastatin was incubated in a concentration range from 2 to 100 μM at

37°C for 60 min. The concentration of gemfibirozil and gemfibrozil-glucuronide was 20 μM.

Data are expressed as the mean ± s.d. of three to seven uptake measurements in the one

representative preparation of two separate oocyte preparations. The solid and dot line

represents the least-squares fit of the data to Equations (4) and (5) described in Materials and

Methods, without and with an inhibitor, respectively.

44

2-3 プラバスタチンの胆汁排泄機構と薬物相互作用

実験材料および方法 第 1 項 材料および試薬

材料および試薬は第 1 章 1-2 の実験材料および方法第 1 項および第 2 章 2-1 の

実験材料および方法第 1 項に記したもの、または市販特級を用いた。

第 2 項 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによる取り込み実験 ヒト胆管側膜ベシクルおよび MRP2 発現ベシクルによる取り込み実験は第 1 章 1-2

の実験材料および方法第 2 項に示した方法と同様に行った。

45

結果 第1項 ヒト胆管側膜ベシクルによるプラバスタチン取り込み

ATP存在下および非存在下におけるヒト胆管側膜ベシクル（hCMVs）による14C-プラバスタチン(70 μM)取り込みをFig.2-3-1 に示した。ATP存在下におけるhCMVsによ

るプラバスタチン取り込みは 30 分まで直線的であった為(data not shown)、取り込み

はインキュベーション開始後 30 分後に測定した。プラバスタチンはhCMVs により

ATP依存的に取り込まれ、その取り込みはATP非存在下と比較し約 1.5 倍高かった。

さらに、hCMVsによるプラバスタチン取り込みはMRP阻害剤であるMK-571 (50 μM)により完全に阻害された。

0102030405060

+MK-571

ATP(-) ATP(+) ATP(+)Upt

ake

(mL/

mg

prot

ein/

30 m

in)

Fig.2-3-1. Inhibitory effect of MK-571 on the uptake of 14C-pravastatin by human canalicular membrane vesicles (hCMVs). hCMVs were incubated at 37 °C

for 30 min in 20 μl of transport buffer containing 14C-pravastatin (70 μM ) with (ATP (+),■) or

without (ATP (-),□) 5 mM ATP and ATP generating system. The data represent the mean of

duplicate determination from single donor. + MK-571 indicates the uptake in the presence of

MK-571 (50 μM), a typical MRP inhibitor.

46

第2項 ゲムフィブロジルおよび主代謝物による MRP2 を介したプラバスタチン取り込

み阻害 Fig.2-2-2 に示すように、MRP2 発現ベシクルにおいてもATP依存的な14C –プラバ

スタチン(50 μM)の取り込みが認められ、その取り込みは過剰量の非放射標識プラ

バスタチン（1000 μM）およびMK-571(50 μM)により完全に阻害された。一方、ゲムフ

ィブロジル、gem-gluおよびgem-M3 は 100 μMの濃度において、MRP2 を介したプラ

バスタチンの取り込みを阻害しなかった。

0.00.51.01.52.02.53.03.54.0

100 µM 100 µM 100 µM 1000 µM 50 µM

none none +gem +Gem-M3

+Gem-glu

+PVA +MK-571

ATP(-) ATP(+)

Upt

ake

(ml/m

g pr

otei

n)

Fig.2-3-2. Inhibitory effect of MK-571 on the uptake of 14C-pravastatin by human MRP2-expressing membrane vesicles. Human MRP2-expressing

membrane vesicles were incubated at 37°C for 30 min in 20 μl of transport buffer containing

14C-pravastatin (50 μM ) with (ATP (+),■) or without (ATP (-),□) 5mM ATP and ATP generating

system. The data represent the mean ± s.d. of triplicates. + gem,gem-M3, gem-glu, +PVA and

+MK-571 indicates the presence of gemfibrozil (100μM), gemfibrozil-M3 (100 μM), gemfibrozil-

glucuronide (100 μM), excess amount of pravastatin (1000 μM) and MK-571 (50 μM) in the

transport buffer.

47

考察

今回の検討で、著者はトランスポーターを介したプラバスタチンの腎取り込みおよ

び肝取り込みに対するゲムフィブロジルおよびその主代謝物の阻害が臨床で報告さ

れている両薬剤の相互作用の一因となっていることを明らかにした。ヒト腎臓におけ

るプラバスタチンの取り込み関してはこれまでにOAT3 がプラバスタチンを輸送するこ

とは報告されていたが、速度論的な解析は行われていなかった。そこで本研究にお

いて、腎臓に発現するOAT1-4 の発現細胞を用いてプラバスタチン輸送の検討を行っ

た。プラバスタチンのOAT3 による取り込みは飽和性を示し、そのKm値は 27.7 µMで

あった。プラバスタチン 20 mgを健常成人男性に単回投与後のプラバスタチンの最大

血漿中濃度は 38.4 ng/ml (0.09 µM)であり[15]、今回の実験より得られたOAT3 を介

したプラバスタチン取り込みのKm値と比較し非常に小さかった。OAT3 は腎臓の血管

側膜に高発現しており、臨床用量においてもOAT3 は腎臓におけるプラバスタチン分

泌に寄与していると考えられた。我々はOAT4 によるプラバスタチンの取り込みも濃

度依存的でかつ飽和性を有することを示した。OAT４は腎臓の尿細管側膜に発現し

ており、有機アニオンの再吸収を担っていると考えられている[54]。今回の実験から

はOAT4 のプラバスタチンの腎臓での再吸収への関与が示唆されたが、そのKm値は

257 µMとプラバスタチンに対する親和性は小さく、プラバスタチンの再吸収をどの程

度担っているかについてはさらなる検討が必要であると考えられた。一方、OAT1 お

よびOAT2 による取り込みでは典型的基質の取り込みは認められたものの、両トラン

スポーターによるプラバスタチンの取り込みは認められなかったことから、腎臓におけ

るOAT1 およびOAT2 を介したプラバスタチンの分泌はほとんどないと考えられた。 現在までの研究では OAT3 が腎臓の血管側膜に発現しているトランスポーターの

中で唯一プラバスタチンを輸送するトランスポーターであることが知られており[16]、さ

らにラットにおいても発現系や腎スライスを用いて主に Oat3 が腎臓におけるプラバス

タチンの取り込みに寄与していることが明らかにされている[46]。また OAT3 は Oat3 に対してアミノ酸レベルで 89%の相同性を有していることが知られており [55]、 プラバスタチンが Oat3 および OAT3 を介した estrone sulfate の取り込みに対して同

等の阻害効果を示すことも明らかとなっている [56]。一方、Nishizato らはヒト OAT3の SNPｓ(T723A および Ala389Val)がプラバスタチンの動態に影響を与えない[11]としているが、これらの二つの SNPs が OAT3 の機能に影響を与えるという直接的な

事実は未だない。従って、OAT3 の SNPs がプラバスタチンの体内動態に影響を与え

るかについては更なる検討が必要であると考えられた。 さらに、腎臓の血管側膜に

発現する別のタイプの有機アニオントランスポーターOATP4C1 が近年クローニング

されたがこれについてはプラバスタチンを輸送しないという報告がされている [57]。こ

れらの報告にある事実は今回の実験で我々が明らかにした OAT3 が主にプラバスタ

48

チンの腎臓での分泌を担っているということとよく合っていると考えられた。 OAT3 がヒトにおいてプラバスタチンの腎臓における取り込みを主に担っていることが

明らかとなったが、今回の検討で、ゲムフィブロジルおよびその主代謝物である gem-glu およびgem-M3 がOAT3 発現したS2 細胞によるプラバスタチンの取り込み

を阻害することが示され、そのIC50は各々 6.8 µM, 19.7 µM, および 5.4 µM であっ

た。我々は放射活性測定感度不足のため、今回の阻害試験においてはプラバスタチ

ンの濃度を 20 µM に設定したが、この濃度はほぼOAT3 を介したプラバスタチンの

取り込みのKm値に相当する。競合阻害を仮定した場合、IC50 値は(1 + S/Km)/Kiとし

て計算される。ここでS は基質濃度、Ki値は阻害定数を示す。 今回は基質であるプ

ラバスタチン濃度がほぼKm値であるためKi 値はIC50/2 として計算され、ゲムフィブロ

ジル、gem-gluおよびgem-M3 の Ki 値は各々 3.4 µM, 9.9 µM および 2.7 µMと計

算された。 一方、プラバスタチンの肝取り込みに関しては、著者らは以前にプラバスタチンの

肝取り込みが飽和性を示し、その肝取り込みは主に OATP1B1 が担っていることを明

らかにしている[10]。さらにその後、プラバスタチンを単回経口投与（10 mg または 40 mg）時の最大血漿中濃度の平均値は OATP1B1 の SNPs（388A>G および

521T>C）を有するヒトにおいて SNPs 有さないヒトと比較し約 2 倍高いことが報告さ

れている[11]。消失の約 50％が肝クリアランスと考えられるプラバスタチンにおいて、

このことは理論上肝クリアランスが完全に抑えられたことを意味し、OATP1B1 が肝ク

リアランスの大部分を担っていることを示唆している。 今回の検討で著者はゲムフィブロジルおよびgem-gluがプラバスタチンのヒト肝細

胞による取り込みを阻害し、そのKiは各々35.8 µMおよび 9.3 µMであることを示した。

上記のようにプラバスタチンの肝取り込みの大部分がOATP1B1 によるものであるこ

とから、OATP1B1 発現oocytesによるプラバスタチンの取り込みに対する両化合物

の阻害能を検討したところ、両化合物ともにプラバスタチンの取り込みを阻害し、その

Ki値は各々15.2 µMおよび 7.4 µMであった。OATP1B1 発現oocytesの試験により得

られたKi値はヒト肝細胞を用いた試験により得られたKi値とほぼ同等であった。従っ

て、両化合物のヒト肝細胞へのプラバスタチンの取り込み阻害はOATP１B1 を阻害し

たことによるものと考えられた。 プラバスタチンの胆汁排泄は mrp2 が主に担っていることがラットの研究から明らか

となっている。また、ラットにおいてゲムフィブロジルは主として肝臓で代謝され、主に

gem-glu および gem-M3 のグルクロン酸抱合体として胆汁に排泄されることが報告さ

れている。このことは、ゲムフィブロジルとその代謝物が胆管側膜に発現している排

泄トランスポーターによるプラバスタチンの輸送を阻害する可能性を示唆している。そ

こで、本研究においてヒトにおけるプラバスタチンの胆汁排泄を担うトランスポーター

について検討した。その結果、プラバスタチンは ATP 依存的にヒト胆管側膜ベシクル

49

により取り込まれ、その取り込みは MRP 特異的阻害剤として知られている MK-571により完全に阻害された。MK-571 は MRP1、MRP2 および MRP4 の阻害剤として知

られているが[31, 32]、胆管側膜に発現している MRP が MRP2 のみであること[32]から、MRP2 がヒトにおけるプラバスタチンの胆汁排泄を主に担っていることが明らか

となった。次に、MRP2 発現ベシクルを用いてゲムフィブロジルおよび gem-glu、

gem-M3 の MRP2 を介したプラバスタチン取り込みに対する阻害効果を検討した結

果、いずれの化合物もプラバスタチン取り込みを阻害しなかった。このとき MK-571 お

よび過剰量の非標識プラバスタチンは完全にプラバスタチンの取り込みを阻害してい

た 。 ま た 、 Yamazaki ら は [58] 、 ゲ ム フ ィ ブ ロ ジ ル が MRP2 を 介 し た

estradiol-17ß-glucronide の輸送を阻害しないことを報告しており、このことはゲムフ

ィブロジルが MRP2 に対する阻害活性がないことを示しており、我々の実験結果を支

持するものであると考えている。また、ヒトではゲムフィブロジルはグルクロン酸抱合

体として主に尿中に排泄されることが知られている[59, 60]。以上のことを考えあわせ

ると、現在までに、gem-glu の肝臓からの排泄に寄与しているトランスポーターは明ら

かになっていないが、ラットと比較しゲムフィブロジルやその代謝物の MRP2 に対す

る親和性がヒトでは非常に低い可能性が考えられる。 上述のように、ゲムフィブロジルおよびその代謝物がプラバスタチンのトランスポー

ターを介した腎取り込みおよび肝取り込みを阻害することが明らかとなった。そこで、

その阻害が臨床で用いられている用量においてどの程度影響するかを考察した。ゲ

ムフィブロジル 600 mgを 1 日 2 回投与した時のゲムフィブロジルおよびgem-glu最大

血漿中濃度(Cmax)は 100 µM および 20 µMであった[61]。また、ゲムフィブロジル

450mgを 1 日 2 回投与したときのgem-M3 のCmaxは約 18 µMであった（in house data）。ゲムフィブロジル、gem-gluおよびgem-M3 の非結合型分率は各々約 1、12 および 1% [21]であることから、臨床におけるゲムフィブロジル、gem-gluおよび

gem-M3 の非結合型の最大血漿中濃度は各々1 µM, 2.4 µM および 0.2 µMと見積

もられた。さらに、ゲムフィブロジルと併用したときのプラバスタチンのCmaxは 66.3 ng/ml (0.16 µM)と報告されている[23]。基質濃度がKm値より小さい場合は固有クリ

アランスの減少の割合（Ri）はRi = 1/ (1+I/Ki)として計算される。ここでIは阻害剤濃度

を示す。この式にしたがって計算されたゲムフィブロジル、gem-gluおよびgem-M3 の

腎クリアランスに対するRi値（Ri,renal）および肝クリアランスに対するRi値（Ri,hepazは下

表に示す通りである。

50

--0.932.75.40.2Gem-M3

0.767.60.819.919.72.4Gem-glu

0.9415.10.763.46.81.0 Gem

(μM)(μM)(μM)(μM)(μM)(μM)

Ri,hepaKi,OATP1B1Ri,renalKi,hOAT3IC50,hOAT3Cmax,free

--0.932.75.40.2Gem-M3

0.767.60.819.919.72.4Gem-glu

0.9415.10.763.46.81.0 Gem

(μM)(μM)(μM)(μM)(μM)(μM)

Ri,hepaKi,OATP1B1Ri,renalKi,hOAT3IC50,hOAT3Cmax,free

また、3 つの阻害剤が同時に存在した場合にはRi,renal値は 1/(1+I/Ki (gem)+I/Ki

(gem-glu)+ 1+I/Ki (gem-M3))で見積もられ、ゲムフィブロジル、gem-gluおよび

gem-M3 が同時に存在した時のRi,renal値は 0.63 と計算された。2 つの阻害剤が同時

に存在した場合も同様に見積もると、ゲムフィブロジルおよびgem-gluが同時に存在

した時のRi,hepa値は 0.72 と見積もられた。これらのことはゲムフィブロジルと併用投与

した場合にはプラバスタチンの腎クリアランスが最大約 37％、肝クリアランスが最大

約 28％減少することを示唆している。上記の結果は臨床におけるプラバスタチンとゲ

ムフィブロジル併用時にプラバスタチンの腎クリアランスが約 40％減少することを非

常に良く説明していた。また、プラバスタチンは腎臓からの消失と腎臓以外の消失が

半々であることから、上述のクリアランスの減少はプラバスタチンAUCを約 1.5 倍上

昇させることにつながり、臨床で報告されている 2 倍のAUC上昇の大部分がゲムフィ

ブロジルおよび主代謝物によるOAT3 およびOATP1B1 を介したプラバスタチン取り

込み阻害によるものであることを示唆していた。

51

小括 ・ OAT3 が腎臓におけるプラバスタチン分泌に大きく寄与していることが示唆さ

れ、ゲムフィブロジルおよびその代謝物であるグルクロン酸抱合体、ゲムフィ

ブロジルカルボン酸体が OAT3 を介したプラバスタチンの取り込みを阻害する

ことが明らかとなった。 ・ ラットにおけるプラバスタチン肝取り込みに Oatp1a4 が関与していることがあ

きらかとなった。 ・ ゲムフィブロジルとそのグルクロン酸抱合体が OATP1B1 を介したプラバスタ

チンの肝取り込みを阻害することが明らかとなった。 ・ ヒトにおけるプラバスタチンの胆汁排泄には主に MRP2 が寄与していることが

明らかとなった。 ・ ゲムフィブロジルおよびその主代謝物であるグルクロン酸抱合体、ゲムフィブ

ロジルカルボン酸体は MRP2 を介したプラバスタチンの輸送を阻害しないこと

が明らかとなった。 ・ ゲムフィブロジルおよびその主代謝物の臨床上の非結合型最大血漿中濃度

からゲムフィブロジル併用時にプラバスタチンの肝クリアランスは最大 28％、

腎クリアランスは最大 37％減少すると見積もられた。

以上のことからゲムフィブロジル併用時に観察されたプラバスタチンの血漿中濃度

上昇の一因としてゲムフィブロジルおよびその代謝物による腎、肝臓におけるトラン

スポーターを介したプラバスタチン取り込み阻害が考えられた。

52

総括

1. 高血圧治療薬オルメサルタンのヒト肝胆系輸送に関与するトランスポーターに

ついて検討した。オルメサルタンのヒト肝取り込みにはNa+-非依存的な画分と

Na+-依存的な画分が存在していた。Na+-非依存的取り込みにはOATP1B1 およ

びOATP1B3 が関与していることが明らかとなった。Na+-依存的な取り込みには

未知のトランスポーターの関与が示唆された。また、肝臓からの排泄には主に

MRP2 が関与していることが示された。オルメサルタンの肝取り込みには少なく

とも三種のトランスポーターが関与しており、オルメサルタンが薬物相互作用を

受けにくい薬物であることを示唆している。 2. 高脂血症治療薬プラバスタチンとゲムフィブロジルの薬物相互作用メカニズム

について検討した。ゲムフィブロジルおよびその主代謝物である gem-gluおよび

gem-M3 は腎臓に発現する OAT3 を介したプラバスタチンの輸送を阻害した。

非結合型血漿中濃度を用いて算出した併用時のプラバスタチン腎クリアランス

は約６割に減少すると見積もられ、臨床におけるプラバスタチン腎クリアランス

の減少と一致した。また、ゲムフィブロジルと gem-glu は OATP1B1 を介したプ

ラバスタチンの肝取り込みを阻害した。非結合型血漿中濃度を用いて算出した

併用時のプラバスタチン肝クリアランスは約７割に減少すると見積もられた。プ

ラバスタチンの消失に占める腎クリアランスと肝クリアランスの割合がほぼ同等

であることを考慮すると、OAT3 を介した腎クリアランス減少と OATP1B1 阻害に

よる肝クリアランス減少により、ゲムフィブロジル併用時にプラバスタチン AUCが 1.5 倍上昇すると推定された。これは、臨床で認められたプラバスタチン AUCの 2 倍の上昇をほぼ説明しうるものであった。

3. 本研究ではヒト肝細胞、ヒト胆管側膜ベシクル、トランスポーター発現系の in

vitro 試験系およびトランスポーター欠損ラットの in vivo 試験系を用いることに

より有機アニオン系薬剤のオルメサルタンおよびプラバスタチンの薬物動態に

関与するトランスポーターを明らかにした。さらにトランスポーターを介したプラ

バスタチンの薬物相互作用について定量的に解析し、臨床に与える影響につい

て考察した。これらの知見は、オルメサルタンおよびプラバスタチンを用いた適

切な薬物療法に対して重要な基礎情報を与えるものと考えられた。また、近年

の創薬スクリーニングシステム、特に物性および代謝安定性スクリーニングの

拡充に伴い、代謝を受け難く未変化体として挙動する化合物が選択される傾向

があり、本研究で得られた知見は創薬基盤情報としても有用であると考えられ

た。

53

参考文献

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主論文目録 本学位論文内容は下記の発表による。 1. Rie Nakagomi-Hagihara, Daisuke Nakai, Kenji Kawai, Yasushi Yoshigae, Taro Tokui, Takaaki Abe and Toshihiko Ikeda. (2006) OATP1B1, OATP1B3 and MRP2 are involved in hepatobiliary transport of olmesartatn, a novel angiotensin II blocker Drug Metab Dispos 34:862-869 2. Rie Nakagomi-Hagihara, Daisuke Nakai and Taro Tokui (2007) Inhibition of human organic anion transporter 3 mediated pravastatin transport by gemfibrozil and the metabolites in humans Xenobiotica 37:416-426 3. Rie Nakagomi-Hagihara, Daisuke Nakai, Taro Tokui, Takaaki Abe and Toshihiko Ikeda (2007) Gemfibrozil and its glucuronide inhibit the hepatic uptake of pravastatin mediated by OATP1B1. Xenobiotica 37:474-486 4. Tokui T, Nakai D, Nakagomi R, Yawo H, Abe T, Sugiyama Y. (1999) Pravastatin, an HMG-CoA reductase inhibitor, is transported by rat organic anion transporting polypeptide, oatp2. Pharm Res. 16:904-908.

60

謝辞

本研究を通じ、終始御懇篤なるご指導、御鞭撻を賜りました千葉大学薬学研究院薬

物学教室 千葉寛教授に謹んで感謝の意を表します。 本研究に際し、有益なご助言およびご指導を賜りました東北大学病院腎高血圧内分

泌科 阿部高明助教授に深謝いたします。 本研究は第一三共株式会社薬物動態研究所で行われたものであり、研究の機会を

与えていただくとともに、終始御懇篤なるご指導および多数の有益なご助言を賜りま

した前三共株式会社薬剤動態研究所長 池田敏彦博士に厚く御礼申しあげます。 本研究全般に渡り、終始直接のご指導、ご助言、激励を賜りました Daiichi Sankyo Pharma Development 徳井太郎博士および第一三共株式会社薬物動態研究所 中

井大介博士に心より感謝申し上げます。また、本研究に協力してくださった河合賢司

博士、吉ヶ江 泰志博士をはじめ支援してくださった多くの皆様に深く御礼申し上げま

すいたします。 最後に私事ですが、これまで私を支え、かつ激励してくれた家族に心より感謝いたし

ます。

61

主査、副査名

本学位論文の審査は千葉大学大学院薬学研究科で指名された下記の審査委員によ

り行われた。

主査 千葉大学薬学部 薬学博士 千葉寛 教授

副査 千葉大学薬学部 医学博士 上田志朗 教授

副査 千葉大学医学部 薬学博士 上野光一 教授

副査 千葉大学医学部 薬学博士 北田光一 教授

副査 千葉大学薬学部 薬学博士 堀江利治 教授

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