Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
Π. ΙΩΑΝΝΟΥ-ΑΜΑΡΑΝΤΙΔΟΥ
ΚΑΘ. ΧΗΜΕΙΑΣ
ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ
ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΣΠΟΥΔΩΝ
ΑΘΗΝΑ 2003
2
ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ (LUMINESCENCE)
ΠΗΓΗ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΕΙΔΟΣ ΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ
ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΡΕΥΜΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(ELECTROLUMINESCENCE)
ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ
ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ
ΡΑΔΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(RADIOLUMINESCENCE)
EΝΕΡΓΕΙΑ ΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(CHEMILUMINESCENCE)
ENΕΡΓΕΙΑ ΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ
ΣΕ ΖΩΝΤΑΝΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ
ΒΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(BIOLUMINESCENCE)
ΘΕΡΜΟΤΗΤΑ ΘΕΡΜΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(THERMOLUMINESCENCE)
ENΕΡΓΕΙΑ ΤΡΙΒΗΣ ΤΡΙΒΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(TRIBOLUMINESCENCE)
ENEΡΓΕΙΑ ΦΩΤΟΝΙΩΝ ΦΩΤΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ
(PHOTOLUMINESCENCE)
ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ
(FLUORESCENCE)
ΦΩΣΦΟΡΙΣΜΟΣ
(PHOSPHORESCENCE)
EΠΙΒΡΑΔ. ΦΘΟΡ
DELAYED FLUOR.
1 – 10-4 s
10-6 – 10-9 s1 – 10-4 s
3
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΦΩΤΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ
Μήκος κύματος, λnm
Φθ
ορ
ισμ
ός,
σχ.
μο
νάδ
ες
ΑπορρόφησηΦωσφορισμός
Φθορισμός
Eπιβραδ. φθορισμός
4
M1
M0
M1
M0
M1
M0
S1
S0
S1
S0
S1
S0
ISC
ISC
ISC
ISC
ET
ET
PhFL
CT-L
FL
Ph
M1
M0
S1
S0
Abs
Abs
Abs
Abs
Mεταφορά Ενέργειας
Λανθανίδες (Τb, Sm, Dy, Eu)
Στοιχεία Μετάπτωσης
(Pd και Pt με πορφυρίνες)
Mεταφορά Φορτίου
Ru, Os, Ir + N-ετεροκυκλικοί
υποκαταστάτες
(συλλέκτες ηλιακής ενέργειας)
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ
Τ1
Τ1
Τ1
Τ1
ΕΝ
ΕΡ
ΓΕ
ΙΑ
5
ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΙΔΡΟΥΝ ΣΤΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟ
ΧΗΜΙΚΗ ΔΟΜΗ
pH
ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ
ΔΙΑΛΥΤΕΣ
ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ
6
CH3
CH3
CH3
CH2OH
CH3CH
3
ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΚΑΙ ΔΟΜΗ
Ύπαρξη π- ηλεκτρονιακού συστήματος (λex>220nm)
Εκτεταμένο π- ηλεκτρονιακό σύστημα συνεπάγεται
Φθορισμός
Φωσφορισμός
Μεγάλα μήκη κύματος
Vitamin A1
λex= 333nm, λem= 500nm
Bενζόλιο
S1 263 nm, T1 340 nm
Aνθρακένιο
S1 376 nm, T1 680 nm
Χαμηλότερη διεγερμένη απλή κατάσταση
(αντιδεσμικά) π* - π (δεσμικά) Ισχυρός φθορισμός (φωσφ.)
(αντιδεσμικά) π*- n (μη δεσμικά) Ασθενής φθορισμός, ισχυρός φωσφορισμός
(περιβ. υψηλού ιξώδους)
7
O
COO-
O O
COO-
O
N NH
π* - nΔε φθορίζει
(μη πολικ. διαλ)
Ναφθαλίνιο ΙνδόλιοΚινολίνη
π* - πΦθορισμός
Φωσφορισμός
π* - πΦθορισμός
Φωσφορισμός
ο – p –υποκαταστάτες αύξηση φθορισμού
m – υποκαταστάτες ελάττωση φθορισμού
Δε φθορίζει Φθορίζει
Αύξηση μοριακής ακαμψίας αύξηση φθορισμού
ΦΑΙΝΟΛΟΦΘAΛΕΪΝΗ
(ΔΕ ΦΘΟΡΙΖΕΙ)
ΦΛΟΥΟΡΕΣΚΕΪΝΗ
(ΦΘΟΡΙΖΕΙ)
+
-NO2
-COOH
-CH2COOH
-Cl, -Br, -I
-O-
-NH3+
OHNH
2 -OH
-O-CH3
-NH2
-NHCH3
-F
8
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑΣ
ΥΨΗΛΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ (zero background technique)
ΜΕΓΑΛΗ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ (multiparameter technique)
ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ:
λex, λem, τ , λphosph., P, μη ειδικές παράμετροι
ΑΠΛΗ ΚΑΙ ΣΧΕΤΙΚΑ ΧΑΜΗΛΟΥ ΚΟΣΤΟΥΣ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ
9
ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ
Συντελεστής
κβαντικής απόδοσης
Ισχύς απορροφούμενης
ακτινοβολίας
Ισχύς εκπεμπόμενης
ακτινοβολίας
Σε πολύ αραιά διαλ. (εbc < 0.05)
Ισχύς φθορισμού σε χρόνο t μετά
τη διέγερση
Xρόνος ζωής φθορισμού
Πόλωση φθορισμού
fnonf
f
Fkk
k
ί
ί
..
..
bc
otoA ePPPP 303,21
bc
oFAF ePPF 303,21
cKbcPF oF 303,2
nFF
/t
ot eFF
HVHV FFFFP
10 F
!.3/303,2!2/303,2303,232
bcbcbc
10
ΠΗΓΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΕΠΙΛΟΓΕΑΣ ΜΗΚΟΥΣ
ΚΥΜΑΤΟΣ ΚΥΨΕΛΙΔΑ
ΕΠΙΛΟΓΕΑΣ ΜΗΚΟΥΣ
ΚΥΜΑΤΟΣ
ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ
ΕΝΙΣΧΥΤΗΣΟΡΓΑΝΟ ΜΕΤΡΗΣΗΣ
ΣΧΗΜΑΤΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΦΑΣΜΑΤΟΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟΥ
ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ
-Φθορισμόμετρα
-Φασματοφθορισμόμετρα
-Φθορισμόμετρα για ειδικές εφαρμογές
11
ΠΗΓΕΣ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ-Λυχνίες τόξου υδραργύρου [υψηλής (366nm) και χαμηλής πίεσης (254nm)]
-Λυχνίες τόξου αερίου ξένου (συνεχές φάσμα, 250-600nm)
α) συνεχούς εκπομπής
β) στιγμιαίας εκπομπής
-Λέιζερ (ενισχυτές φωτός εξαναγκασμένης εκπομπής)
α) μονοχρωματικοί
β) λέιζερ χρωστικών με επιλογή μήκους κύματος
ΕΠΙΛΟΓΕΙΣ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ-Φίλτρα (υάλου αποκοπής ή συμβολής)
-Μονοχρωμάτορες (πρίσματος, φράγματος)
ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ-Φωτοπολλαπλασιαστές (PMT)
-Aνιχνευτές ζεύξης φορτίου (Charge-coupled detectors)
ΚΥΨΕΛΙΔΕΣ
12
ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΤΩΝ
ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ
ΣΚΕΔΑΣΗ (SCATTERING)
Rayleigh (μόρια διαλύτη, <<λ)
Tyndall (μικρά σωματίδια, < λ)
Raman (δονητικές και περιστροφικές κινήσεις μορίων διαλύτη)
ΕΝΔΟΓΕΝΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ
ΑΠΟΣΒΕΣΗ (QUENCHING)
ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΦΙΛΤΡΟΥ
(INNER FILTER EFFECT)
13
370 455 555
λ, nm
370 400 435
λ, nm
400 500 600
λ, nm
Φάσμα εκπομπής θειικής κινίνης (λex=366nm)
και παρεμπόδιση από σκέδαση Raman
A- H20; B- 0,1μg/ml κινίνης (σε ίδια ευαισθησία)
C, D- 0,1 μg/ml κινίνης (υψηλή ευαισθησία)
Φάσμα εκπομπής ανθρακενίου σε κυκλοεξάνιο
και παρεμπόδιση από σκέδαση Raman
A- διαλύτης
Β, C, D- ανθρακένιο σε διάφορες συγκεντρώσεις
1
2
3
1. Φυσιολογικός ορός
2. Αιμολυμένος ορός
3. Υκτερικός ορός
14
ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΟΤΗΤΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑΣ
Φάσματα
Πόλωση
φωτός
Χρόνος
ζωής
Ειδικό
μέρος
- Φθορισμός
- Φωσφορισμός
(χρόνος ή-φάση)
- διέγερσης
- εκπομπής
- σύγχρονης σάρωσης
-σε χαμηλές θερμοκρασίες
Φθορισμομετρία :
- Πολωμένου φωτός
- Κυκλικά πολωμένου
φωτός.
- Κυκλικού
διχρωισμού
- Απόσβεση
- Επιφανειοδραστικά
- Σχηματισμός φθοριζόντων
παραγόντων
- Χρωματογραφία ανίχνευσης
Φθορισμός
15
λ
ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣ
(Δλ=const)
Βασικά χαρακτηριστικά φάσματος:
-Ελάττωση ημιεύρους κορυφής
-Απλοποίηση φάσματος
-Ελάττωση φασματικής περιοχής αναλυτικού ενδιαφέροντος
1
2
3
Κλασική
φθορισμομετρία
Φθορισμομετρία
σύγχρονης
σάρωσης
Mex Mem
Mex
Mex Mem
Mem
% I
f%
If
% I
f
λ
λ
λ
Δλ
16
17
18
19
Φαιναθρένιο
Πυρυλένιο
Ανθρακένιο
20
ΦΑΣΜΑΤΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΔΙΑΙΘΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΛΥΣΕΡΓΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (LSD), λex= 325 nm
ΦΑΣΜΑΤΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ, Δλ = 110 nm
1) 1 ng/ml 2) 0.3 ng/ml 3) H2O
DOL= 0.1 ng/ml DOL= 2 ng/l
21
ΧΡΟΝΟΣ ΖΩΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ
22
ΑΡΧΗ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΧΡΟΝΙΚΑ ΔΙΑΧΩΡΙΖΟΜΕΝΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ
(Time-resolved Fluorimetry)
EΦΑΡΜΟΓΕΣ:
-Ελάττωση ακτινοβολίας υποβάθρου
-Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί
-Μέδοθοι υβριδοποίησης DNAAπόσβεση φθορισμού συμπλόκων ενώσεων λανθανιδών
Chelate Excitation(nm) Emission (nm) Fluorescence
Lifetime ()
(µsec)
Suggested Emission Filter
Europium (Eu) 340 615 730 620/40
Samarium (Sm) 340 642 50 645/40
Terbium (Tb) 320 545 1050 545/40
*(Dyprosium (Dy) 320 572 16 575/15
*Ruthenium (Ru) 459 620 0.4 620/40
Χρήση ιχνηθετών μεγάλου χρόνου ζωής φθορισμού (ιόντα λανθανίδων)
Διέγερση δείγματος με βραχύ παλμόακτινοβολίας
Μέτρηση μετά απόσβεση βραχύβιου φθορισμού υποβάθρου
23
ΙΟΝΤΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΥΡΩΠΙΟΥ ΚΑΙ ΤΕΡΒΙΟΥ
24
ΑΡΧΗ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΦΑΣΙΚΑ ΔΙΑΧΩΡΙΖΟΜΕΝΟΥ
ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (Phase- resolved Fluorimetry)
EΦΑΡΜΟΓΕΣ:
-Προσδιορισμός χρόνου ζωής φθορισμοφόρων
- Ανάλυση μίγματος ουσιών
25
ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΠΟΛΩΜΕΝΟΥ ΦΩΤΟΣ
(FLUORESCENCE POLARIZATION)
D
D F + Ab
Ab
Ab
D
D F
Μη πολωμένος
φθορισμός Πολωμένος
φθορισμός
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ
-Προσδιορισμός μεγέθους και ολικών διαστάσεων μακρομορίων επισημασμένων με φθορισμοφόρα
-Ανοσοφθορισμομετρικοί προσδιορισμοί συναγωνιστικού τύπου
HVHV FFFFP
26
ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
ΑΜΕΣΕΣ
(Ενδογενής φθορισμός)
-ΒΙΤΑΜΙΝΕΣ
-ΦΑΡΜΑΚΑ
-ΑΜΙΝΟΞΕΑ
-ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ
-ΠΟΛΥΑΡΩΜΑΤΙΚΟΙ
ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ
ΕΜΜΕΣΕΣ
(Μετατροπή σε φθορίζον προϊόν)
α) Σχηματισμός φθορίζοντος
παραγώγου με σύνδεση με
φθορίζουσες ουσίες (δανσυλο-
χλωρίδιο για αμινοξέα και φαινόλες,
ο-φθαλαλδεϋδη για πρωτοταγείς
αρυλαμίνες, αρυλυδραζίνες)
β) Μετατροπή του αναλύτη σε
φθορίζον προϊόν μέσω χημικών
αντιδράσεων
γ) Σχηματισμός φθορίζοντος
συμπλόκου για τον προσδιορισμό
μεταλλοϊόντων ή οργανικών μορίων
δ) Με απόσβεση ή ενίσχυση
φθορισμού
27
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΕΜΜΕΣΩΝ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ
Μέθοδοι διαχωρισμού με ανιχνευτή φθορισμού
(Χρωματογραφικές τεχνικές, τριχοειδής ηλεκτροφόρηση)
Ενζυμική ανάλυση
α) Προσδιορισμός ενεργότητας ενζύμων
β) Προσδιορισμός υποστρωμάτων
Προσδιορισμός μεγέθους και ολικών διαστάσεων μακρομορίων επισημασμένων με φθορισμοφόρα
(Φθορισμομετρία πολωμένου φθορισμού)
Μελέτη σύνδεσης μικρομορίων, π.χ. φαρμάκων με πρωτεΐνες
(Τεχνική φθορίζοντος ιχνηθέτη)
Μετρήσεις αποστάσεων μεταξύ ομάδων μακρομορίου με βάση το φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας
Μικροσκοπία φθορισμού
(Χρώση κυττάρων, χρήση επισημασμένων αντισωμάτων ειδικών για τα συστατικά του κυττάρου)
Φθορισμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί
Μέθοδοι υβριδοποίησης DNA
28
29
30
BIBΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. Parker CA, Photoluminescence of Solutions, Elsevier, Amsterdam, 1968
2. Hemmila IK, Applications of Fluorescence in Immunoassays, John Wiley & Sons,
New York, 1991
3. Warner IM, Patonay G, Thomas MP, “Multidimensional Luminescence
Measurements”, Anal Chem, 57, 463 A, 1985
4. Rubio S, Gomez-Henz A, Valcarcel M, “Analytical applications of synchronous
fluorescence spectroscopy”, Talanta, 33, 633-640, 1986
5. Seitz RW, “Fluorescence derivatization”, CRC (Critical Reviews in Analytical
Chemistry), p. 367, 1980
6. Georges J, “Lanthanide-sensitized Luminescence and applications to the
determination of organic analytes”, Analyst, 118, 1481-1486, 1993
7. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA, Principles of Instrumental Analysis, Brooks/Cole
Pub Co; 5th edition, 1997
8. Bright FV, “Bioanalytical Applications of Fluorescence Spectroscopy”, Anal Chem,
60, 1031A, 1988
9. Gudgin Dickson EF, Pollak A, Diamandis EP, “Time-resolved detection of lanthanide
luminescence for ultrasensitive bioanalytical assays”, J Photochem Photobiol, B:
Biology, 27, 3-19, 1995