土壌由来カビ分析におけるMS技術の新展開～揮発性代謝物 MVOCのプロファイル解析～

第16回日本水環境学会シンポジウム

○竹内孝江, 鈴木孝仁(奈良女大), 中村義隆(ダイナコム),

菅井俊樹(東邦大), 木内正人(産総研), 紅 朋浩(名古屋大)

9 November, 2013琉球大学農学部キャンパス

New Developments in Mass Spectrometric Analysis of Soil-derived Fungi～Profile Analysis of Microbial Volatile Organic Compounds (MVOCs)～

Takae TAKEUCHI, Takahito SUZUKI (Nara Women's Univ.), Yoshitaka NAKAMURA (Dynacom Co., Ltd.), Toshiki SUGAI (Toho Univ.),

Masato KIUCHI (AIST) and Tomohiro AKASHI (Nagoya Univ.)

揮発性物質MVOCs(microbial volatile organic compounds)

抗菌、抗ダニ作用、

同種細胞間での信号伝達

マイコトキシン（分子量が250～500で不揮発性）

種々の分解酵素などの高分子物質

高松塚古墳など文化財の微生物による劣化が問題

目視できる段階: 10万～100万個の分生子

眼に見えないうちから、カビからは多様な二次代謝産物を放出している⇒ MVOCによるカビのモニタリング

Guido Fischer et al. (1999) “Species-specific production of microbial volatile organic compounds (MVOC) by airborne fungi from a compost facility.” Chemosphere 39, 795-810.

Takamatsuzuka Tumulus Mural Painting, Asuka, Nara, Late 7th～8th Century

http://www.bunka.go.jp/takamatsu_kitora/gaiyo_photo/west_joshi.html

http://www.asahi.com/kansai/event/kitora/OSK200904280035.html

Kitora Tumulus Mural Painting, Asuka, Nara, Late 7th～8th Century

http://www.asukanet.gr.jp/kitora/jpg/p001.jpg

2竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

aカビ臭分析によるカビ種推定ソフトウェアの開発

文化財保全への応用

遠隔操作

科学技術振興機構 産学イノベーション加速事業【先端計測分析技術・機器開発】機器開発タイプ「文化財保全環境モニター開発 ―土壌由来のカビの検出」 （平成19～21年度）

同 ソフトウェア開発タイプ 「ＩＭＳによる土壌由来カビ検出データベースの構築」（平成21～23年度）(チームリーダ 竹内孝江)

3竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

文化財の現場

Aspergillus nidulansFGSC4

Penicillium paneumKT138

Fusarium solaniNBRC31093

Aspergillus fumigatusKT176IFM40822

Contamination of Cultural Properties

Fungal Strains

Disease, Medical ResearchContamination of Cultural Properties

Investigation of the Gene for MVOC Production

Fusarium species(Lascaux Cave, France)

Penicillium species(Takamatsuzuka and Kitora Tumuli in Nara, Japan)

4竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

無機塩とグルコースからなるCzapek-Dox agar

クエン酸ナトリウム 0 . 5 g硝酸ナトリウム 3 gリン酸二カリウム 1 g硫酸マグネシウム(7水和物) 0 .5g塩化カリウム 0.5g硫酸(Ⅱ)第一鉄(7水和物) 0 . 0 1 gグルコース 3 0 g寒天 1 5 g蒸留水 1 ℓ

クエン酸ナトリウム 0 . 5 g硝酸ナトリウム 3 gリン酸二カリウム 1 g硫酸マグネシウム(7水和物) 0 .5g塩化カリウム 0.5g硫酸(Ⅱ)第一鉄(7水和物) 0 . 0 1 gグルコース 3 0 g寒天 1 5 g蒸留水 1 ℓ

窒素源

炭素源

炭素源

合成培地↓

バックグラウンドの単純化

5竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

Day1 Day10

seal vial with cap

24h

Pasteurization 60~80℃

Collection of MVOCs

CZ agar

MVOC

2~4 ml CZ agar in a 20ml-vial

Fungus+CZ agar

培養日数1~10日

ca.300 conidiospores in a vial

Cultivation of fungi and Collection of MVOCs

*1 培養温度A. fumigatusA. nidulans

⇒ 37℃

F. solaniP. Paneum

⇒28℃

*1

合成培地

貧栄養培地改変型

Czapek-Dox(CZ)および

富栄養培地Potato

Dextrose(PD)

6竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

Analysis of MVOCs emitted from soil-derived fungi using Head Space Solid-Phase Microextraction Gas Chromatography/Mass Spectrometry (HS-SPME-GC/MS)

MS

Solid-Phase MicroextractionCultivation period (1~10 days)

24 hour collection

・ Identification of MVOCs

・Quantitative Analysis of MVOCs

*3

*4

*4

*2 Modified Czapek-Dox agar

*3 Divinylbenzene/Carboxen/ Polydimethylsiloxane(DVB/CAR/PDMS) (film thickness 50/30 mm),

In Tube Extraction（ITEX II）

7竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0(x1,000,000)

Day 10

Day 8Day 7

Day 6

Day 4

Day 3

Day 2

Retention time/min

Day 1

2Ethyl1hexanol

1Octen3ol2Undecanone

(-)-..-Elemene

-Caryophyllene

1-Heptadecene

Penicillium paneum(KT138)

Total-ion current chromatogram of volatiles in the head space of vials of Penicilliumpaneum (KT138) specimens during the 1 to 10 day incubation periods measured by SPME/GC/MS.

O

OH

3OctanoneOH

OH

T. Takeuchi et al. Sur. Interface Anal.(2012)8竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

MVOCs

MVOCs emitted from Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Fusarium solani and Penicillium paneum T. Takeuchi et al, Surf. Interface Anal. (2012)

(KT-176) (IFM40822)

○: detected in every sample△: detected－: not detected

9竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

Quantitative Analysis of MVOC (2-undecanone) from F. solani

Quantitative Analysis of MVOC (2-undecanone)from P. paneum

Quantitative Analysis of MVOC (1-octen-3-ol) from A. nidulans

Quantitative Analysis of MVOC (α-farnesene)from A. nidulans

Quantitative Analysis of MVOC (β-caryophyllene)from P. paneum

Quantitative Analysis of MVOC (-bergamotene)from A. fumigatus

T. Takeuchi et al, Surf. Interface Anal. (2012)

10竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

The amount of 3-octanone emitted relative tothe number of spores of P. paneum.

×106

I.D. 0.60 cm I.D. 1.40 cm I.D. 1.80 cm I.D. 2.20 cm

The amount of 3-octanone emittedrelative to the area of P. paneum.

Area of P. paneum / cm2

T. Takeuchi et al, Surf. Interface Anal. (2012)

11竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

CAM - Chemical Agent Monitor

‘Mobile Trace’, which can spot substances that are just billionths of a gram, expands the range of explosives and narcotics that can be identified in a single sample.

M90-D1 Chemical Warfare Agent Detector

12竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

Fusarium solani, Penicillium paneum, Aspergillus fumigatus and Aspergillus nidulans

1 L Cultivation FlaskIMS Spectrometer

Incubation period: 4, 10 and 16 days

A challenge to monitor MVOCs at cultural sites

Ion Mobility Spectrum (IMS) 測定

SPME 濃縮

13竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

T. Takeuchi et al., Proc. 61st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2013

Ion Source： Tritium radiation Drift Voltage：2.0 kVLength of Drift Cell：5.4 cm Temperature in Drift Cell: 60～70 ℃Drift Gas：N2+O2 (79:21) Gas Flow：200 mL/min

Tritium 軟radiation

Filter

Drift Gas

Air + MVOC

ManifoldThree-way Valve × 3

Sampling SequenceCleaning SequenceMeasurement Sequence

Particle Filter

Sample Gas Storage

DiaphragmPump

Rotary Valve Pump

Internal Gas Circulation Gas Inlet Dosing System

Analysis Gas

Drift Cell

CPulserHigh

Voltage Amplifer A/D-Converter

Computer

DisplayCBatteryRe-charger

14竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

T. Takeuchi et al., Proc. 61st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2013

IMS driftgram of MVOCs from A. nidulans and MVOC standard samples(d) Aspergillus nidulans, (e) 1-Octen-3-ol, (f) 2-Octen-1-ol, (g) 3-Octanone, (h) Phenylacetaldehyde, (i) Bisabolene

Drift time / ms

(d) A. nidulans

Patent Applications No. 2012-254179, 20.Nov., 2012.

15竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013T. Takeuchi et al., Proc. 61st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2013

90%以上

90%以上

16竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

T. Takeuchi et al., Proc. 61st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2013

未知試料のIMS PLS plotT. Takeuchi et al, ASMS (2013)

17竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

T. Takeuchi et al., Proc. 61st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2013

1. 2-Ethyl-1-hexanol, 3-Octanone, Benzaldehyde および2-Undecanoneが、多くの土壌カビの培養早期で観測された。

Conclusions

カビ生育の指標の候補

2. カビの揮発性代謝物のうち、有機酸、ケトン、アルデヒド、アルコール・・・カビ共通テルペン・・・カビ種に特有 カビ種の情報

3. MVOCにおける温度効果、熱刺激

4. 培地の影響。

胞子形成時期と一致

5. 大気環境条件におけるIMSのイオン移動度予測計算プログラムの開発

6. カビ種判定プログラム“MVOC Finder”の開発

カビ試料のIMSおよびGC/MSデータの多変量解析により4種の土壌カビのカビ種同定するプログラム

A. nidulans, A. funigatus, F. solani, P. paneum のMVOCIMSおよびGC/MSデータベース構築

18竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

謝 辞

文化財保全技術・イオンモビリティースペクトロメトリー

株式会社ソダ工業 大久保衛博士

大阪大学 志水隆一名誉教授

JST 吉井淳治開発総括 故 高木 誠開発総括

株式会社エックスレイプレシジョン 細川好則氏

新日本電工株式会社 橋本良夫博士

東京文化財研究所 佐野千絵博士

カビ（真菌）培養・遺伝子探索

奈良女子大学理学部

鈴木孝仁教授

金子幸代氏

木内葉子氏

岩口伸一准教授

カビ臭物質(MVOC) の質量分析・IMS分析

奈良女子大学理学部 田中春菜氏

木村知子氏 長谷川美穂氏

産業技術総合研究所 岩松雅子氏

ソフトウェア開発

株式会社ダイナコム

藤宮 仁氏 青木良晃氏

橘 亜友子氏 多田智史氏

19竹内孝江他, 第16回日本水環境学会シンポジウム, 那覇, 2013

科学技術振興機構 産学イノベーション加速事業【先端計測分析技術・機器開発】機器開発タイプ「文化財保全環境モニター開発―土壌由来のカビの検出」 （平成19～21年度）

科学技術振興機構 産学イノベーション加速事業【先端計測分析技術・機器開発】ソフトウェア開発タイプ

「ＩＭＳによる土壌由来カビ検出データベースの構築」（平成21～23年度）

科学研究補助金 基盤研究(C) 「真菌の分泌物質を大気中で検出するための可搬型イオンモビリ

ティー分析法の開発」(Grant No. 21500988,(2009～2011)) , 「カビ代謝ペプチドの解析のための

フラグメンテーション理論の新展開」(Grant No. 24619003 (2012～2014))