OPERACIONES UNITARIAS
Objetivo final El proceso bsico a utilizar en este caso es
obtener un explante (es un tejido vivo separado de su rgano propio
y transferirlo a un medio artificial de crecimiento) de el pin y
ponerlo en un medio de cultivo rompiendo las uniones intercelulares
del tejido del explante donde obtendremos clulas individuales, as
podremos cultivar estas clulas y multiplicarlas para extraer el
aceite de las mismasMateria prima Para la produccin industrial del
aceite de pin, inicialmente necesitamos las semillas previamente
secadas y despus de haber pasado por un proceso de despulpado
(retiro mecnico de la pulpa del fruto).Podemos dividir el
tratamiento de las semillas hasta la extraccin del aceite en 6
pasos:
1. DESINFECCIONLas semillas se someten a una desinfeccin inicial
usado etanol, (alcohol etlico, C2H5OH) este es un agente contra las
formas vegetativas de las bacterias, los hongos y los virus con
envoltura lipdica, pero no contra las esporas. Su accin sobre los
virus sin envoltura lipdica es variable. Para conseguir la mxima
eficacia deben utilizarse en concentraciones acuosas de
aproximadamente un 70% (v/v): las concentraciones ms altas o ms
bajas pueden no tener tanto poder germicida. Una de las grandes
ventajas de las soluciones acuosas de etanol es que no dejan
residuo alguno en las semillas tratadas.
Una vez se realiza la desinfeccin inicial las semillas deben ser
hidratadas a travs de un proceso muy simple y econmico que consiste
en envolver las semillas en papel mojado con agua destilada (de
preferencia un papel con una alta capacidad absorbente) es
importante dejar las semillas en el papel hasta que ste este seco
por lo que el tiempo oscilara entre 6 y 48 horas como mximo
(teniendo en cuenta las variables climticas el tiempo podra ser
mayor o menor pero despus de 48 horas no es recomendable que la
semilla contine envuelta en el papel)
Una vez se termina el proceso de hidratacin la semilla debe ser
sometida a una desinfeccin ms profunda y para esto usamos
hipoclorito de sodio al 3 % El hipoclorito de sodio (NaOCl) es un
compuesto oxidante de rpida accin utilizado a gran escala para la
desinfeccin de superficies, es letal para varios microorganismos,
virus y bacterias vegetativas Entre sus muchas propiedades incluyen
su amplia y rpida actividad antimicrobiana, relativa estabilidad,
fcil uso y bajo costo. Es muy importante que el reactor en donde se
realice la desinfeccin con hipoclorito sea de un material
antioxidante pues el hipoclorito es un potente oxidante y puede
deteriorar con facilidad los equipos metlicos sensibles a la
oxidacin
2. EXTRACCION DE COTILEDON
Una vez tengamos la semilla previamente desinfectada, con un
bistur retiramos las capas externas de la semilla (tegumento) y
luego la piel hasta dejar expuesto el cotiledn (este es un trabajo
manual relativamente complejo y requerir de mano de obra
calificada)
Del cotiledn cortaremos lminas de 1 x 2 milmetros estas sern el
explante para el cultivo, estas laminas deben ser tratadas con
extremo cuidado y en condiciones ptimas de asepsia adems para cada
100 ml de medio de cultivo debemos tener entre 1 y 7 gramos de
explante
3. MEDIO DE CULTIVO Y CONDICIONES DE LOS EQUIPOS
i. Medio de cultivo
El medio de cultivo debe contener al menos NH4NH3, CaNO3, CuSO4,
MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaCl2, CaCO3,
NaC6H7O7 (citrato de sodio), MgSO4, K2SO4, tiamina, glicina,
inositol, acido nicotnico, piridoxina, biotina, glutamina, cido
naftalenactico, zeatina y una fuente de carbono que puede ser
sacarosa, fructosa o glucosa.Adems se puede seleccionar una hormona
entre cido indoloactico, naftalenactico o indolbutrico y otra entre
kinesina, benciladenina, zeatina, gibrelina.
Celulasa, pectinasa y hemicelulasa se aaden al medio de cultivo
para que rompan las uniones intercelulares del tejido de los
explantes.
El pH del medio de cultivo debe estar entre 4.8 y 6.5.
Tabla tomada de Method for celular tissue multiplication from
Jatropha curcas
ii. Condiciones de los equipos
Biorreactor
El medio de cultivo es incubado bajo agitacin constante, a
temperatura ambiente y en la oscuridad durante 15
das.Posteriormente se re-inocula a las mismas condiciones durante
otros 10 das.Las condiciones ambientales de un biorreactor (flujo
de gases, temperatura, pH, oxgeno disuelto y velocidad de
agitacin), deben ser controladas cuidadosamente.
La agitacin es importante debido a que facilita la transferencia
de oxgeno, un factor difcilmente alcanzable a condiciones ptimas,
ya que este se disuelve poco en agua y no es suficientemente
abundante en el aire (20,8 %). Adicionalmente, la agitacin es til a
la hora de mezclar los nutrientes para as mantener un medio
homogneo. Sin embargo, uno de los principales problemas en este
tipo de procesos es el estrs de cizalla ocasionado por la agitacin.
Las clulas vegetales a diferencia de las clulas bacterianas son muy
sensibles a la tensin de cizallamiento ya que tienen gran volumen.
Para proporcionar un ambiente de cizallamiento suave se usan
reactores con sistemas de agitado por aire tipo airlift o columnas
de burbujas, lo que a la vez hace que haya un aumento de biomasa y
del dimetro de las clulas.La propagacin celular dentro del
biorreactor puede afectar la esterilidad y eficiencia del equipo.
Para evitarlo, este debe ser fcil de limpiar, por esto los bordes
son redondeados
Sonificador
La mezcla entre el solvente y el medio de cultivo se somete a la
sonicacin durante 90 minutos.
Centrifuga
La mezcla es centrifugada a 2500 rpm por 30 minutos.
Evaporador
Luego de pasar por la centrfuga, resultan dos fases. La fase
superior, se separa y se transfiere a un rotaevaporador a 70 C y a
180 rpm y posteriormente se pone en una estufa durante 1 hora a
75C.
4. PERIODO DE INCUBACION
Corte transversal de un cotiledn a 48 horas de la hidratacin
El periodo de incubacin debe ser entre mnimo 3 das y mximo 14,
las condiciones ptimas del entorno deben ser bajo constante
agitacin, esto nos asegura que las clulas no se depositaran en el
fondo de los reactores ya que si estas se posan en el fondo las
condiciones de anaerobiosis pueden ser perjudiciales para el
crecimiento celular. La temperatura ideal es la temperatura
ambiente (aproximadamente entre 22 y 26 C) deben estar en ausencia
de luz, aunque la incubacin tambin pueda darse en condiciones de
luz con determinada longitud de onda, como por ejemplo bajo luz
infrarroja que ha demostrado acelerar el proceso de multiplicacin
celular.5. RE-INOCULACIONUna vez las uniones intercelulares del
explante de pin se han roto despus de por lo menos 3 das de
incubacin en el medio de cultivo, usamos esta fuente de clulas para
re-inocularlas en un nuevo medio de cultivo. Debemos repetir este
proceso lo ms que nos sea posible para posibilitar la multiplicacin
de clulas individuales.
La cantidad ideal de clulas individuales para iniciar la
re-inoculacin en un medio de cultivo fresco es de 2x105 clulas por
milmetro, despus de esto debemos incubar hasta que las clulas
entren en una fase de multiplicacin estacionaria, Durante la fase
estacionaria, la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia
del agotamiento de nutrientes y la acumulacin de productos txicos.
Esta fase se alcanza cuando las clulas empiezan a agotar los
recursos que estn disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza
por un valor constante del nmero de clulas a medida que la tasa de
crecimiento de las clulas se iguala con la tasa de muerte
celular.
6. EXTRACCIN DEL ACEITE
Una vez se tenga una poblacin significativa de clulas incubadas
se aade hexano que es un solvente orgnico, (tambin pueden ser
usados el isopropanol y el etanol, su uso depende de la variedad en
los costos pues los 3 son aptos para el uso que se les va a dar)
este rompe las paredes celulares liberando el aceite. Despus de
esto se somete a sonicacin, (es el acto de aplicacin de la energa
del sonido -generalmente ultrasonidos- para agitar las partculas de
una muestra) lo que ayuda a la separacin de las clulas y el
aceite.
Despus de esto se lleva a centrifugacin, de esta forma se hacen
visibles dos fases una superior y otra inferior, la superior
contiene el solvente y el aceite obtenido, y la inferior el restos
de las clulas cultivadas. Estos restos pueden ser reutilizados como
abono orgnico despus separamos las fases a travs de un filtrado
simple.
Despus de esto pasamos la mezcla de solvente y aceite de pin al
evaporador y as los separamos por lo que podemos reutilizar el
solvente en futuras separaciones.As llevamos el aceite a una zona
de empacado y embarque para su posterior distribucin.
