Opération BiopucesOpération Biopuces

Resp : Pr. J.R. MartinResp : Pr. J.R. Martin

Site en cours de constructionSite en cours de construction

Version du 15/12/2003Version du 15/12/2003

Axes de recherche du groupe BiopucesAxes de recherche du groupe Biopuces

Fonctionnalisation & optimisation des supports Fonctionnalisation & optimisation des supports Conception & réalisation de biopucesConception & réalisation de biopuces Puces à oligonucléotidesPuces à oligonucléotides Puces à protéinesPuces à protéines Mise en oeuvre des biopucesMise en oeuvre des biopuces Nouvelles méthodologiesNouvelles méthodologies

Fonctionnalisation & optimisation des supports Fonctionnalisation & optimisation des supports

Chimie de surface sur support verre ou Chimie de surface sur support verre ou silicium silicesilicium silice

Silanisation et fonctionnalisation pour :Silanisation et fonctionnalisation pour :

- Immobilisation des oligonucléotides- Immobilisation des oligonucléotides

- Synthèse in situ- Synthèse in situ Approche physicochimiqueApproche physicochimique Approche physiqueApproche physique

Conception, fabrication & mise en œuvre Conception, fabrication & mise en œuvre de biopucesde biopuces

Sélection de sondes par bioinformatiqueSélection de sondes par bioinformatique Développement des protocoles de matériel biologiqueDéveloppement des protocoles de matériel biologique Fabrication de puces de validation par synthèse in situFabrication de puces de validation par synthèse in situ Lecture dynamique de puces à ADNLecture dynamique de puces à ADN Deux applications :Deux applications :

• GénotypageGénotypage

• Expression de gènesExpression de gènes

Conception automatisée de séquences sondes pour le génotypage sur puce

Analyse d’image pour l’interprétation de biopuces de génotypage

Outils informatiques pour la conception, l’analyse et la validation expérimentale

de biopuces de génotypage

Puces à oligonucléotides (1/5)Puces à oligonucléotides (1/5)

Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de réactifs.réactifs.

Deux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitresDeux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitres

Deux procédés :Deux procédés :• Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solideImmobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide• Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solideSynthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide

Puces à oligonucléotides (2/5)Puces à oligonucléotides (2/5)Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiquesImmobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques

Dispositif expérimentalDispositif expérimental

½ Batterie avec 128 ½ Batterie avec 128 moyens de microprojectionmoyens de microprojection

Grande vitesse de Grande vitesse de fabrication (50 puces/h)fabrication (50 puces/h)

Absence de contaminationAbsence de contamination

Fabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masseFabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masse

Optimisation de la densité de greffage des sondes / processus d ’évaporation d’une goutte projetée : nano-mouillage

T ambiante : 22.5°C Humidité : 43%RH

Puces à oligonucléotides (3/5)Puces à oligonucléotides (3/5)Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiquesSynthèse in situ de sondes oligonucléotidiques

basse à moyenne intégrationbasse à moyenne intégration

Dispositif Dispositif expérimentalexpérimental

Chimie des Chimie des phosphoramiditesphosphoramidites

Projection des Projection des nucléotides (5nl)nucléotides (5nl)

Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires :Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires :conception de biopuces, mise au point de protocoles biologiquesconception de biopuces, mise au point de protocoles biologiques

Puces à oligonucléotides (4/5)Puces à oligonucléotides (4/5)Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des

phosphoramidites : adaptation du cycle de synthèsephosphoramidites : adaptation du cycle de synthèse

Couplage localisé par Couplage localisé par microprojection de la microprojection de la base et de l’activateurbase et de l’activateur

Autres réactions non Autres réactions non localisées par localisées par microfluidiquemicrofluidique

Réacteur anhydre et saturé en solvant Réacteur anhydre et saturé en solvant

Puces à oligonucléotides (5/5) :Puces à oligonucléotides (5/5) :synthèse in situ synthèse in situ haute intégrationhaute intégration

Dispositif expérimental en cours de développementDispositif expérimental en cours de développement

Chimie des phosphoramiditesChimie des phosphoramidites

Projection des nucléotides (3 picolitres)Projection des nucléotides (3 picolitres)

Biopuces pour la protéomique (1/2)Biopuces pour la protéomique (1/2)Fixation contrôlée de peptides Fixation contrôlée de peptides

sur support plan : sur support plan : • peptides synthétiques fixés par peptides synthétiques fixés par

couplage covalent orienté sur couplage covalent orienté sur support support

• Objectif : réalisation d’édifices Objectif : réalisation d’édifices dendrimériquesdendrimériques

Applications :Applications :• Reconnaissance de protéines pour Reconnaissance de protéines pour

diagnostic immunologiquediagnostic immunologique Programmes :Programmes :

• CNRS “Protéomique” ; Région RA CNRS “Protéomique” ; Région RA ”Méthodologies analytiques” ; ”Méthodologies analytiques” ;

Partenaires Partenaires • Rosatech, Université Lyon I (LBASB, Rosatech, Université Lyon I (LBASB,

LBCP), EFS, Protéine’XpertLBCP), EFS, Protéine’Xpert

Peptides fixés

solvant

Peptides non activés

Validation de la chimie de couplage

(fluorescence, IR)

Objectif : immobilisation de

dendrimères peptidiques

NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2

NH2

COOH

COOH

COOHCOOH

COOHCOOH

COOH

COOHCOOH

Support fonctionnalisé

Dendrimère

Peptides synthétiques

0.0E+00

1.0E+04

2.0E+04

3.0E+04

4.0E+04

Solvant Peptideactivé

peptide nonactivé

Type de dépôt

Fluo

resc

ence

-bg

Biopuces pour la protéomique (2/2) :Biopuces pour la protéomique (2/2) :

Synthèse Synthèse « in-situ »« in-situ » localisée d’oligopeptides localisée d’oligopeptides

Schéma de couplageSynthèse des Fmoc

AA -Fmoc Activateur(DCC)

Etape 1

Rinçage

Etape 2

Déprotection du Fmoc

Etape 3

Rinçage

Etape 4

N-alpha-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-Alanine

OO

nO

O

NH

2n

Principe: adapter le procédé de synthèse in situ de biopuces du LEOM à la

chimie des Fmoc

Nouvelles méthodologiesNouvelles méthodologies Optimisation de l’hybridation des biopuces : micromélange Optimisation de l’hybridation des biopuces : micromélange

& microfluidique, étude cinétique des interactions & microfluidique, étude cinétique des interactions cibles/sondes sur support solidecibles/sondes sur support solide

Lecture dynamique des puces à ADNLecture dynamique des puces à ADN

Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées

Etude du comportement de biomolécules sur support solideEtude du comportement de biomolécules sur support solide

BiocapteursBiocapteurs

Etude du comportement de Etude du comportement de biomolécules sur support solide biomolécules sur support solide

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300 350 400Temps (s)

Flu

ore

scen

ce r

ela

tive (

%)

Hybridation

séquences non complémentaires

modèle 1er ordre

Analyse cinétique de reconnaissance entre biomolécules

Détection de SNP sur support solide : discrimination de deux

cibles à un nucléotide prêt

fluor

esce

nce

Position X

Biocapteurs d’ADNBiocapteurs d’ADN

Cartographie d’impédance optoélectrochimique pour la

reconnaissance biomoléculaire

Principaux programmes de recherchePrincipaux programmes de recherche

20032003 Outils de conception et de fabrication de biopuces pour la protéomique, Programme de Recherche Région Rhône-Alpes, Thématique

Prioritaire : Sciences Analytiques Appliquées (2003/2005) Puces ADN : étalement de gouttes avec évaporation et mécanismes réactionnels, modélisation mathématique et numérique , PIR CNRS :

Microfluidique et Microsystèmes fluidiques (2003/2004) Micro-mélangeur à advection chaotique pour une hybridation optimisée des biopuces, FITT (2003/2004)

20022002 Puces à ADN pour le diagnostic génétique, Programme GENHOMME (2002/2004) Conception et Validation d’une biopuce à PNA pour la traçabilité génétique des agents pathogènes, développement de l’équipement

d’analyse associé, Programme MENRT (2002/2004) Autofluorescence & système moléculaire autofluorescent pour l'étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées,

ACI Nouvelles méthodologies analytiques et capteurs (2002/2004) Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (“Multiple Antigen Peptide”), Programme Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (“Multiple Antigen Peptide”), Programme

CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003)CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003) Micro-mélangeur à advection chaotique pour l’hybridation des biopuces, Bonus Qualité Recherche 2002 (2002/2003)

20012001 Machine de production de puces à ADN 256 sondes par microdéposition, Programme ANVAR de transfert de technologie (2001/2003) Réalisation d’une puce à ADN pour l’étude du transcriptome de Buchnera Aphidicola, Bonus Qualité Recherche 2001 (2001/2002)

Principaux programmes de recherchePrincipaux programmes de recherche

20002000 Projet ROSA2 (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme Puces à ADN du CNRS (2000-2002)Projet ROSA2 (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme Puces à ADN du CNRS (2000-2002)

19991999 Faisabilité d'un réacteur pour la fabrication de réseaux d'oligonucléotides par synthèse chimique parallèle localisée par microdéposition,

Programme CNRS MICROSYSTEMES (1999/2000)

19971997 Projet ROSA (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme GENOME du CNRS (1997-2000)Projet ROSA (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme GENOME du CNRS (1997-2000)